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ESPECIFICIDAD Y RAPIDEZ DE LOS MEDIOS CROMOGENICOS EN LA

DETECCION DE Listeria monocytogenes FRENTE A LOS MEDIOS


SELECTIVOS TRADICIONALES.

Mengoni Graciela B. (1)


(1)
Carrera de Tecnologa de Alimentos y Acuicultura. Universidad Nacional del Centro de la
Provincia de Bs. As. - Tandil. Laboratorio LISTER La Plata. (1900). Argentina.
E-mail: gmengoni@speedy.com.ar

INTRODUCCION

El incremento del comercio internacional de alimentos en los ltimos aos hizo


necesario el uso de medios de diagnstico microbiolgicos cada vez ms
rpidos y eficientes. Es as, que las empresas productoras de medios para
deteccin y recuento de microorganismos han desarrollado una gran variedad
de medios de cultivos, kits y equipos que permiten un diagnstico cada vez
ms rpido y sumamente eficaz, que conducen a obtener resultados sobre la
presencia de determinado patgeno en tan solo 24 a 48 horas, frente a
mtodos tradicionales que requieren de entre 5 a 7 das para obtener un
resultado. Una de estas nuevas herramientas con que cuentan los
microbilogos actualmente son los medios de cultivo cromognicos, basados
en reacciones de color frente al patgeno buscado, y hasta permiten poner de
manifiesto la produccin de hemolisinas en tan solo 24 a 48 hs mostrando una
sensibilidad cercana al 100%.

OBJETIVO

El presente trabajo fue realizado para comparar la selectividad de los nuevos


medios cromognicos para la deteccin de L.monocytogenes, frente a los
medios selectivos tradicionales, en cuanto a rapidez en la obtencin de
resultados, la selectividad, especificidad y productividad de los mismos.

MATERIALES y MEDIOS:

La matriz utilizada fue helado con 10%, 6% y 1,5 % de materia grasa

Los medios de cultivo usados:


Caldo Half Fraser (Biokar-Francia)
Caldo Fraser (Biokar-Francia)
Suplemento para caldo Half Fraser (Biokar-Francia)
Palcam agar (Biokar-Francia)
Suplemento de agar Palcam (Biokar-Francia)
Medio cromognico para Listeria (CHROMagar Francia)
Medio SIM (Merck-Alemania)
Agar tripteina soja (Biokar-Francia)
Agar sangre equina al 5% (Lab. Gutierrez-Argentina)
Agar sangre ovina al 5% (Lab. Gutierrez-Argentina)
Cepa de referencia L.monocytogenes ATCC 7644 (Microbiologics Inc.-USA)
Cepa de L.inocua ATCC 814. (Microbiologics Inc.-USA)

METODO

Se inocularon 38 muestras de helado, dejando 2 muestras para control blanco,


sin inocular.
Se utiliz el mtodo UNE-EN ISO 11290 para la deteccin de L.monocytogenes
en helados, con concentraciones de materia grasa de 10%, 6% y 1,5%.
La inoculacin de los helados se realiz con cultivos de 24 hs. de
L.monocytogenes ATCC 7644 y Listeria sp., en niveles de 100 ufc, 10 ufc y < 5
ufc. por 25 gr. de helado. Cada muestra de diferente contenido graso fue
inoculada con cada uno de los niveles de L.monocytogenes y Listeria sp.
conjuntamente. Se llevaron a freezer, y a las 18-24 hs. se inici el ensayo.

Inoculacin de muestras
Microorganismos Blanco Nivel bajo Nivel Nivel alto
(en 25 g) medio
L.monocytogenes - 1-4 10 99-100
Listeria sp. - 1-4 10 100-150
Flora autctona + + + +

Siguiendo las recomendaciones de la Norma ISO mencionada, como


enriquecimiento primario se utiliz caldo Fraser a la mitad de la concentracin
el cual se incub a 30C por 24 hs. 2 hs. El medio secundario, caldo Fraser
a la concentracin normal, se incub a 35C por 48 hs. y luego se realiz el
aislamiento en agar Palcam (uno de los recomendados por la Norma), y en el
agar cromognico CHROMagar Listeria, en reemplazo del medio ALOA.
Ambos medios slidos se incubaron a 35C por 24 hs.- 48 hs.
Las colonias sospechosas de ser Listeria fueron sometidas a pruebas de
identificacin: coloracin de Gram, reaccin de catalasa, movilidad a 22C,
hemlisis en sangre equina, fermentacin de azcares: ramnosa y xilosa, y test
de CAMP.

RESULTADOS

Las muestras blanco resultaron negativas en los dos medios, puesta de


manifiesto por la falta de crecimiento.
El medio CHROMagar Listeria present mayor sensibilidad (100%) frente al
medio Palcam (86%). Un 14% de las placas de Palcam presentaron cultivos
puros de colonias atpicas. (Ver fotos 1 y 2)
Foto 1: Se observa cultivo puro de colonias atpicas sobre fondo fucsia oscuro
Microscpicamente: bacilos Gram (-), anchos, muy largos.

Foto 2: Se observa cultivo puro de colonias atpicas en Palcam agar, mucosas, verdosas, sobre
fondo fucsia oscuro. Microscpicamente: bacilos Gram (-), anchos, con esporas.

Del mismo modo muchas de las placas de Palcam que resultaron positivas
para Listeria sp, presentaban abundante flora acompaante y debieron ser
incubaras por 24 hs. adicionales para poder observar las caractersticas de las
colonias que nos hiciera sospechar de la presencia de Listeria.
Se observ el detalle de la diferente coloracin del fondo de las placas (Ver foto
3). Las que presentaron el cultivo puro de bacilos largos mostraba un fondo
fucsia muy oscuro, las placas que presentaron Listeria a las 48hs se vean con
fondo marrn negruzco, y las placas que presentaron colonias tpicas en poca
cantidad a las 24 hs. se presentaron con fondo negro y naranja-mbar. En
este ultimo caso, dado el escaso crecimiento, las colonias son
aproximadamente de 2 mm. con las caractersticas bien tpicas de Listeria en
este medio: grisceas o verdosas con depresin central negra sobre fondo
fucsia-naranja, debido a que no fermenta el manitol que contiene el medio (Ver
foto 4)

Foto 3: Se observan los distintos colores de fondo en el agar Palcam. Abajo a la izquierda, se
ve una muestra negativa en ambos medios: CHROMagar Listeria sin desarrollo y Palcam agar
colonias amarillas.
Foto 4: colonias tpicas en agar Palcam.

Las colonias tpicas de Listeria sp deben observarse en CHOMagar Listeria a


las 24 hs. de incubacin. El halo que presentan las cepas hemolticas de
L.monocytogenes o L.ivanovii, crece aproximadamente 5 mm. en 24 hs. y esto
hace que si se dejan ms de 24 hs., y el crecimiento es abundante, cubra toda
la placa y puede prestarse a confusin en tcnicos no muy experimentados,
pensando que se trata de colonias no hemolticas. Algunas placas con
abundante crecimiento se encontraban totalmente cubiertas pasadas las 24
hs., dejando solo una pequea porcin sin halo.
El medio cromognico no present ningn falso positivo ni falso negativo para
la presencia de Listeria sp. El color de las colonias se presentaban celestes
de 2 mm. para L.monocytogenes y ms azules y pequeas para L.inocua (Ver
foto 5). Esta ltima, en muchos casos queda cubierta por el halo.
Foto 5: Colonias tpicas de Listerias hemolticas (L.monocytogenes y L.ivanovii) y no
hemolticas, azules en el trazo.
Nota: en esta foto, la placa se ve oscura pero en realidad es transparente como en las fotos
anteriores.

Para la identificacin de L.monocytogenes en colonias tpicas y en placas con


halo total, se realizaron pruebas de identificacin de acuerdo con el siguiente
cuadro:

Diferenciacin de las especies de Listeria:


Ensayo L.monocytogenes Linocua Livanovii
Ramnosa + + -
Xilosa - - +
Hemlisis -hemlisis No-hemlisis Doble -hemlisis

Si la hemlisis no es neta, es conveniente realizar el test CAMP en agar


sangre ovina.

CONCLUSIONES

En este estudio, el patgeno fue eficazmente detectado con el medio


cromognico.
An en las muestras con 10% de grasa, inoculadas con el nivel ms bajo del
microorganismo, en donde la cantidad de materia grasa del alimento acta
como protectora del mismo, la que favorece la capacidad psicrotofa de Listeria
que le permite sobrevivir y reproducirse a bajas temperaturas, el medio
cromognico funcion de manera muy eficaz.
Dados los resultados obtenidos y la fcil deteccin de L.monocytogenes
mediante este medio, se concluye que el mismo tiene una buena performance,
rpidez y eficiencia en la deteccin de este patgeno, y puede ser utilizado con
confianza como medio alternativo frente a los medios tradicionales.

BIBLIOGRAFIA

1. AFNOR CHROMagarTM Listeria. Certificado de Validation como Mtodo


alternativo de acuerdo al Standard EN-ISO 11290-1 A1- 2004.

2. AFNOR. 2006. ATTESTATION DE VALIDATION OF METHODE ALTERNATIVE


DANALYSE SUIVANT LA NORME NF EN ISO 16140:2003. Estudio
colaborativo interlaboratorios. Vencimiento de la validacin: Diciembre del 2009

3. El Marrackchi A, Boumhandi N y Hamama A. 2005. Performance of a ner


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6. Mengoni G, Narvaiz P, Veronesi P, Gomez F. 2005. Control de Listeria


monocytogenes y otros patgenos mediante radiaciones gamma en tartas de
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Internacional de Energa Atmica (IAEA) y Laboratorio LISTER

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