UNIVERSIDAD ALFONSO X EL SABIO

FACULTAD DE FARMACIA

BIOQUÍMICA CLÍNICA Y HEMATOLOGÍA

GUION DE PRÁCTICAS
Esquema

DíaDía
1: 1: Práctica
Práctica11.y Hemostasia.
Práctica 2

DíaDía
2: 2: Práctica
Práctica22. Hematología.

DíaDía
3: 3: Práctica
Práctica33. Bioquímica en sangre

DíaDía
4: 4: Práctica
Práctica 34.(finalización)
Lípidos y lipoproteínas
y Práctica 4del plasma

DíaDía
5: 5: Examen
Examen

2
 PRÁCTICA 1
HEMOSTASIA
Etimológicamente la palabra hemostasia procede del griego hemo (sangre) y stasi (parada). Fisiológicamente
se da el nombre de hemostasia al conjunto de mecanismos que el organismo pone en marcha para inhibir las
hemorragias.

FASES
1. Hemostasia primaria

Se desarrolla en un período de tiempo comprendido entre los 3 y los 5 minutos desde el inicio de la
hemorragia. La aproximación de las paredes vasculares que ocasiona la vasoconstricción, y el taponamiento de
la luz vascular originado por el agregamiento plaquetario, producen una hemostasia provisional que es
suficiente para cortar la hemorragia producida por ruptura de un vaso sanguíneo de pequeño calibre. En el
caso de que el vaso sea de mayor calibre, el agregado plaquetario, para que sea efectivo, tiene que ser
consolidado con una red de fibrina que le hace ser capaz de parar la hemorragia.

2. Coagulación

La coagulación es un proceso que conduce a un cambio en el estado físico del plasma, este cambio consiste en
una gelificación, es decir el plasma pasa de su estado líquido a un estado de gel. La gelificación del plasma se
produce debido a la transformación de una de las proteínas solubles que contiene, el fibrinógeno, en otra
insoluble, la fibrina.

La fibrina se estructura en forma de red, que consolida el agregado plaquetario, dando lugar al coágulo. La
formación de la fibrina es el punto final de una reacción en cadena, las sustancias que intervienen en esta fase
de la hemostasia reciben el nombre de factores de coagulación. La coagulación del plasma finaliza entre los 5 y
10 minutos desde el comienzo de la hemorragia.

3. Fibrinólisis

Es un proceso que tiene como objetivo la disolución del coágulo de fibrina, después de que éste ha cumplido
su función hemostática. La destrucción de la fibrina consiste en una degradación enzimática, llevada a acabo
por la plasmina.

La fibrinólisis permite un tránsito libre de la sangre a través del vaso dañado, al cabo de las 40 y 72 horas
desde el inicio de la hemorragia. Durante este tiempo se produce una reparación de la integridad vascular.

1. EXPLORACIÓN DE LA HEMOSTASIA PRIMARIA

Tiempo de Hemorragia o de sangría (TS)

Es el tiempo que transcurre desde la sección de un grupo de capilares hasta la formación de un trombo blanco
plaquetario. Se determina efectuando una pequeña punción con una lanceta en el lóbulo de la oreja y
seguidamente midiendo el tiempo que tarda en cesar de manar sangre a través de esta herida. El tiempo de
hemorragia indica la capacidad constrictora de los capilares y el número y capacidad adherente y agregante de
las plaquetas.

El tiempo de hemorragia normal es de unos 3 minutos con esta técnica.

El tiempo está alargado en las trombocitopenias, en las trombopatías congénita, en la enfermedad de Von
Willebrand y en los sujetos que han tomado ácido acetil salicílico.

3
FACTORES DE COAGULACIÓN

El grado de extensión de la coagulación resulta de la confluencia entre los mecanismos de activación y de

inhibición que actúan sobre ella.

1. Factores activadores

Son aquellos que estimulan el proceso de la coagulación o constituyen el soporte estructural de ésta. Se
nombran, generalmente, con números romanos. Cuando el factor está activado, al número romano que le
designa, le sigue una letra a en minúscula. Además, algunos factores tienen su nombre propio.

Factores activadores: I o fibrinógeno; II o protrombina; III o tromboplastina hística o F3p; IV o calcio V; VII; VIII;
IX; X; XI; XII o factor Hageman; XIII; PK; HMWK.

2. Factores inhibidores

Son aquellos que neutralizan las formas activadas de los factores de coagulación: Proteína C, Proteína S,
Antitrombina III, 2-macroglobulina, 1-antitripsina, 2-antiplasmina, C1 inhibidor y otros inhibidores
patológicos.

DINÁMICA DE LA COAGULACIÓN

Vías no comunes

El inicio del proceso coagulatorio puede

desarrollarse por dos vías. Una de ellas
llamada intrínseca, es un sistema
exclusivamente sanguíneo; mientras que la
otra, denominada extrínseca, requiere la
entrada en la circulación sanguínea de
sustancias procoagulantes que proceden de
los tejidos dañados. La vía extrínseca es
mucho más rápida que la intrínseca. Sin
embargo, ambas vías no son excluyentes,
pueden desarrollarse a la vez, y, además,
existen interrelaciones entre ellas.

A. Vía intrínseca o endógena

1. Activación del factor XII

1ª fase el factor XII cambia de

conformación molecular, tras contactar
con superficies que tienen cargas
negativas, sensibilizándose a la acción
proteolítica. En la segunda, el factor XII
preactivado sufre la acción proteolítica
de la calicreína y se activa
transformándose en factor XIIa. La
calicreína procede de la activación de la
precalicreína, y ésta es llevada a cabo
por el propio factor XIIa, con ayuda del
HMWK.

4
 2. Activación del factor XI

Se activa por la acción proteolítica del factor XIIa en colaboración con el quininógeno.

3. Activación del factor IX

Se activa por la acción proteolítica del factor XIa con la colaboración del Ca2+ y del f3p.

4. Activación del factor X

Se activa, por la vía intrínseca, debido a la acción proteolítica del factor IXa en colaboración con el Ca2+,
y el f3p y el factor VIIICa.

B. Vía extrínseca o exógena

1. Activación del factor VII

Puede ser activado por la acción proteolítica

del factor Xa o de la trombina.

2. Activación del factor X

Se activa, por vía extrínseca, debido a la acción

proteolítica del factor VIIa con la colaboración
del Ca2+ y de la Tromboplastina Hística (TH).

Vía común

A. Formación de la trombina

Se forma por la activación de la protrombina y

ésta se produce por la actuación de la
protrombinasa (factor Xa, factor Va y Ca2+)
fijada sobre factor III (f3p o TH).

5
B. Formación del coágulo de fibrina

1. Degradación del fibrinógeno

El fibrinógeno es degradado por la trombina rompiendo sus cadenas A y B . Como consecuencia se

desprenden fibrinopéptidos A y B y se forman monómeros de fibrina.

2. Polimerización de la fibrina

Los monómeros de fibrina se unen formando puentes de hidrógeno y dando origen a los cordones de
fibrina que constituyen el coágulo soluble.

3. Estabilización de la fibrina

Se lleva a cabo por el factor XIIIa. Este factor es previamente activado por la trombina y el Ca 2+. La
estabilización del coágulo de fibrina lo hace más insoluble y resistente a la acción de la plasmina.

4. Retracción del coágulo

Se produce por la acción de la trombostenina liberada por los trombocitos.

6
2. EXPLORACIÓN DE LA COAGULACIÓN

1. Tiempo de Quick o de protrombina (TP): estudio de la vía extrínseca

Es el tiempo necesario para la coagulación de un plasma pobre en plaquetas (PPP), en presencia de calcio y de
tromboplastina hística. Analiza fundamentalmente la vía extrínseca de la coagulación (factores V, VII y X).
Suele emplearse para la detección de déficits de factores de esta vía, para el control de pacientes sometidos a
terapias con anticoagulantes orales y para la vigilancia de la evolución de enfermos con algunos trastornos
hepáticos.

Material
- Plasma pobre en plaquetas (PPP) obtenido a partir de sangre recogida en citrato sódico 0,1 mol/L, en la
proporción de 1 volumen de citrato por 9 volúmenes de sangre
- Solución de cloruro cálcico (CaCl2) 0,025 mol/L
- Tampón citratado pH 7,35.
- Suspensión de tromboplastina hística

Índice internacional de sensibilidad (ISI). La tromboplastina hística (TH) se prepara a partir de extractos de
cerebro o pulmón humanos o de tejidos animales (conejo o vaca). Las THs fabricadas por los distintos
laboratorios comerciales no suelen tener la misma sensibilidad, es decir, son más activas unas que otras.
Debido a ello, la Organización Mundial de la Salud (OMS) elaboró, en 1977, un patrón de referencia
internacional a partir de cerebro humano, que es actualmente considerado como un patrón primario.
Posteriormente, en 1979, se elaboró un patrón a partir de tejido bovino y de conejo. Ambos patrones deben
utilizarse para verificar la calidad y sensibilidad de los diferentes preparados comerciales, en los que debe, a su
vez, venir indicado su índice internacional de sensibilidad (ISI), calculado en relación con la del patrón de
referencia internacional que se considera de 1,0. Cuanto más cercano a este valor es el ISI de una TH
comercial, mayor es su concordancia con el patrón.

Método
1. En dos tubos de hemólisis se introducen 0,2 ml de tromboplastina cálcica preincubada a 37 OC.
2. A cada uno de ellos añadir 0,1 mL de PPP (control y paciente, respectivamente), al mismo tiempo
que se dispara el cronómetro.
3. Medir el tiempo en segundos que tarda en aparecer el coágulo.

Interpretación de los resultados. Los valores de TP están comprendidos, entre los 11 y los 15 segundos.

Curva de actividad de la protrombina

Estos resultados también se pueden expresar en forma de porcentaje de actividad.

Método
1. Preparar una batería de diluciones a partir de un PPP control normal.
2. Medir el TP del PPP control no diluido y de cada una de las diluciones preparadas.
3. Se asigna el 100% de actividad al número de segundos medidos en la determinación del TP del
PPP control puro, y se calcula el % que, proporcionalmente, les corresponde a los valores de TP
de cada una de las diluciones del PPP control.
4. Determinar el valor, en segundos, del TP del PPP del paciente e interpolar en la gráfica para
calcular el % de actividad que le corresponde.

7
Interpretación de los resultados. El % de actividad de la protrombina de un PPP normal oscila entre el 70 y el
100%.

Cociente internacional normalizado (INR)

Además, los resultados también pueden expresarse en forma de proporción (ratio) entre el valor, en
segundos, del TP del PPP del paciente y el PPP control no diluido. Cuando se pretende hacer un control de
anticoagulación, se calcula el cociente corregido con el ISI, con el fin de evitar el error que implica el uso de
diferentes TH.

Este cociente corregido que permite relacionar los resultados obtenidos con distintos reactivos comerciales,
recibe el nombre de INR (International Normalized Ratio) y se calcula con la siguiente fórmula:

Interpretación de los resultados

La ratio de protrombina normal está comprendida entre 0.9 y 1.15.

Como regla general, para un correcto tratamiento con anticoagulantes orales el INR debe de fluctuar entre los
valores de 1.5 y de 4.5. De forma que, si es menor de 1.5, el paciente está escasamente anticoagulado, y, si es
mayor de 4.5, está excesivamente anticoagulado.

2. Tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA): exploración de la vía intrínseca

El TTPA es el tiempo que se necesita para que coagule un PPP, tras su recalcificación y en presencia de un
sustituto f3p.

Se añade al plasma citratado un complejo fosfolipídico como sustituto de las plaquetas y un activador soluble.
Se utiliza principalmente para detectar deficiencias en los factores VIII, IX, XI, XII y precalicreína. También se
utiliza para monitorizar tratamientos de heparina.

Método
1. En 2 tubos de hemólisis, uno para el paciente y otro control, se introducen 0,1 ml de PPP.
2. A continuación se añaden 0,1 ml del reactivo. Incubar durante 5 minutos a 37 OC.
3. Terminada la incubación, se añaden 0,1 ml de CaCl2 (equilibrado a 37 OC) y mediante un
cronómetro se mide el tiempo necesario para el inicio de la formación del coágulo.

Interpretación de los resultados

El tiempo normal generalmente, oscila entre 22 y 38 segundos. Un alargamiento de 8 segundos respecto al

control expresa una alteración de los factores antihemofilícos (VIII y IX), o de los del sistema contacto (factor
XI y factor XII) o de los factores pertenecientes a la vía común.

8
 PRÁCTICA 2
HEMATOLOGÍA

1. IDENTIFICACIÓN DE CÉLULAS SANGUÍNEAS

Objetivo: identificar los tipos de células sanguíneas en frotis de sangre teñidos con Giemsa para luego realizar
un recuento diferencial leucocitario.

Eritrocitos (glóbulos rojos, normocitos, hematíes): discos bicóncavos de 6-8 m de diámetro, en frotis
teñidos se presentan como corpúsculos circulares de borde liso se tiñen de color rosa asalmonado, el
color es menos intenso en el centro.

Plaquetas (trombocitos): se presentan como discos irregulares de 1-4 m de diámetro de color violeta,
son fragmentos del citoplasma de los megacariocitos, a menudo suelen adherirse unas a otras.

Leucocitos: presentan diferentes tipos celulares:

a) Polimorfonucleares, granulocitos:

Los neutrófilos presentan el núcleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulación de
un color violeta rojizo.

Los eosinófilos se observan con el núcleo azul violeta, el citoplasma azul y los gránulos de
color rojo anaranjado.

Los basófilos presentan un núcleo de color púrpura y granulación de color azul oscuro.

b) Mononucleares

Linfocitos se observan con un núcleo sin segmentar teñido color violeta y el citoplasma escaso
de color azul, tamaño variable de forma redonda u ovalada.

Monocitos forma redonda u ovalada, pueden presentar pseudópodos, más grandes que los
neutrófilos, núcleo redondo o en forma de riñón de color violeta, citoplasma azul

2. RECUENTO DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS (RDL). FÓRMULA LEUCOCITARIA.

Proporción presente en sangre de cada tipo de leucocito. La formula leucocitaria puede verse alterada por
causas fisiológicas o patológicas. En los laboratorios el RDL se realiza en autoanalizadores automáticos, la
observación de leucocitos en frotis queda como método de referencia cuando los analizadores dan resultados
anómalos.

Para saber el recuento diferencial de leucocitos en valor absoluto se multiplica el nº de células de un tipo por
el número total de leucocitos en sangre por microlitro y se divide por el nº de células contadas.

Realiza un recuento de 100 leucocitos indicando el número de cada uno de los 5 tipos y calcula el nº absoluto
de cada tipo de leucocito.

Valores normales

Nº absoluto de leucocitos en un adulto (4,5-11 x 103 / l)

9
 Neutrófilos: 1,8-7,7x 103 / l (45-70%)
Eosinófilos: 0,0-0,4 x103 / l (1-3%)
Basófilos: 0,0- 0,2 x103 / l (0-0,5%)
Linfocitos: 1,0-4,8 x103 / l (20-40%)
Monocitos: 0,0-0,8 x103 / l (3-7%)

3. RECUENTOS CELULARES. CITOMETRÍA HEMÁTICA MANUAL.

Las técnicas de recuento de células de la sangre reciben el nombre de citometría hemática o hemocitometría,
pueden realizarse mediante métodos manuales (recuentos en cámara) o automáticos (recuentos en
contadores electrónicos). Las técnicas de recuento manual, aunque en algunos casos siguen siendo los
métodos de referencia, hoy en día prácticamente no se utilizan, cómo uno de los objetivos de la práctica es
aprender el manejo del material básico del laboratorio, usaremos cámaras de recuento para el contaje y
pipetas diluidoras.

Objetivo: determinar el número de cada uno de los tipos celulares que están comprendidos en una unidad de
volumen de sangre (1 mm3 = 1 l).

1. Dilución de la muestra

Muestra: sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA. Esta sangre se utilizará convenientemente diluida.

Para ello usaremos pipetas de Thoma. Formadas con un tubo capilar que termina en punta, en uno de sus
extremos, y se continúa con el bulbo, en el otro de sus extremos. Además, está dividido en 10 partes iguales, y
en su superficie están especialmente bien marcadas la 5a división (con un 0,5) y la 10a (con un 1).

El bulbo contiene una perla de vidrio para facilitar la mezcla de la sangre con el líquido de dilución, y acaba en
un tubo capilar corto. La perla de vidrio es roja en las pipetas empleadas para el recuento de hematíes, y
blanca en las usadas para el recuento de leucocitos. Además, en las pipetas para hematíes la capacidad del
bulbo es 100 veces superior a la del tubo capilar largo, por lo que en el tubo capilar corto hay una marca de
101, y en las pipetas para leucocitos la capacidad del bulbo es 10 veces mayor que la del tubo capilar largo,
por lo que en el tubo capilar corto hay una marca de 11.

10
Líquidos de dilución. Su composición varía según el tipo de células que se pretenden contar.

Los que se utilizan para el recuento de hematíes contienen cloruro sódico para hacerlos isotónicos con
respecto al plasma y evitar, de esta forma, la hemólisis. Pero algunos incorporan también anticoagulantes
como el citrato de sodio, e incluso antisépticos como la formalina.

Los que se emplean para el recuento de leucocitos contienen ácido acético glacial, que rompe los
hematíes y un colorante, como el violeta de genciana, que tiñe el núcleo de los leucocitos.

Los que se usan para el recuento de plaquetas pueden incorporar una sustancia hemolítica y un
antiagregante plaquetario.

Los líquidos diluyentes más utilizados son el de Hayem, para el recuento de hematíes, y el de Türck, para el
recuento de leucocitos.

Método
1. Aspirar la sangre hasta la señal de 0,5 o hasta la de 1. En el caso de que se sobrepase algo el enrase, se hace
descender la columna de sangre tocando la punta de la pipeta con un algodón,
2. Limpiar cuidadosamente el exterior de la pipeta con un algodón y sin hacer bajar el nivel de sangre.
3. Aspirar líquido diluyente hasta la señal 101 o a la 11.
4. Desenganchar el tubo de goma de la pipeta y homogeneizar el contenido del bulbo. Para ello se sujeta la
pipeta por sus extremos, con los dedos pulgar e índice, y se agita suavemente en sentido horizontal durante
2 ó 3 minutos.
5. Desechar las 3 primeras gotas emitidas por la pipeta.
6. Depositar la siguiente gota entre la cámara y el cubre, esto se realiza ubicándola en uno de los bordes no
adheridos del cubre y dejándola que penetre por capilaridad, en el espacio existente entre ambas
estructuras, evitar que se formen burbujas y que rebose la sangre diluida por fuera de los bordes del cubre.
Para ello se coloca la pipeta en posición casi vertical, se sitúa la punta de la pipeta en el borde apropiado, se
disminuye algo la presión ejercida por el dedo índice sobre el otro extremo de la pipeta y se retira ésta
justo antes de que se llene completamente el espacio comprendido entre el cubre y la cámara.
7. Dejar reposar la sangre diluida, contenida en la cámara, durante unos minutos, para que las células
presentes en ella puedan sedimentarse.

2. Contaje

Cámara de recuento, también se llama cámara cuentaglóbulos o hemocitómetro. Hay varios tipos de cámaras,
de las cuales las más utilizadas son la de Bürker, Thoma y sobre todo la de Neubauer.

11
 Recuento de hematíes (RBC)

Contar los hematíes presentes en 4 o 5 cuadrados medianos del cuadrado grande central, dependiendo del
modelo de cámara.

Calcular el número de hematíes que hay en un cuadrado grande. Como la longitud de cada uno de los lados
del cuadrado grande central es de 1 mm, y la longitud del espacio comprendido entre éste y el cubre es de 0,1
mm, hay que multiplicar por 10 el resultado anterior, para determinar así el número de hematíes existentes,
no en 0,1 mm3, sino en 1 mm3.

Tener en cuenta la dilución hecha anteriormente, multiplicar el resultado anterior por 100, si se ha partido de
la sangre entera contenida hasta el enrase de 1, o por 200, si se ha partido de la sangre entera contenida hasta
el enrase de 0,5.

RBC=H x 10x D
3
RBC = recuento de hematíes (número de hematíes por mm de sangre)
H = hematíes contados en el cuadrado grande
D = factor de dilución (100 ó 200)
El margen de error de esta técnica es alto (20%)

Interpretación clínica de los resultados obtenidos

La disminución del RBC se produce en las anemias y su aumento se da en las policitemias. Se considera normal
un RBC comprendido entre los 4 y los 5,5 millones/mm3 en las mujeres, y entre los 4,5 y los 6 millones / mm 3
en los varones.

Recuento de leucocitos (WBC)

Contar los leucocitos presentes en los 4 cuadrados grandes de las esquinas del retículo (cada uno de ellos está
dividido a su vez en 16 cuadrados medianos). Si los leucocitos se ven bien, se pueden contar con el objetivo de
10x.

Como se cuentan los leucocitos presentes en 4 cuadrados grandes, hay que dividir por 4 la cifra obtenida en el
recuento, para calcular el número de leucocitos que hay en 1 cuadrado grande. Al igual que en el caso
anterior calcular los leucocitos/mm3 teniendo en cuenta la dilución.
12
WBC = L/4 x 10 x D
3
WBC = recuento de leucocitos (número de leucocitos por mm de sangre).
L = leucocitos contados en 1 cuadrado grande.
D = factor de dilución (10 ó 20).

Interpretación clínica de los resultados

La disminución del WBC se produce en las leucopenias, su aumento se da en las leucocitosis. Se considera
normal un WBC comprendido entre 5.000 y 11.000/ mm3.

2. DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA EN SANGRE

La determinación de la hemoglobina en sangre es un paso fundamental en el diagnóstico de las anemias. El

Comité Internacional para la estandarización de la Hematología recomienda el método colorimétrico de la
cianmetahemoglobina.

Fundamento

Se basa en la transformación de la hemoglobina en cianmetahemoglobina al tratar la sangre con una solución

de ferricianuro potásico y cianuro potásico (Reactivo de Drabkin). La cianmetahemoglobina es un compuesto
estable, de color rojo, con un pico de absorción máximo a 540 nm y cuya concentración puede ser
determinada por métodos colorimétricos empleando un patrón de concentración conocida.

Método: la muestra será sangre total anticoagulada con heparina o EDTA.

Mezclar bien en una cubeta semimicro 4 l de muestra 1ml de reactivo de Drabkin, dejar incubar 10 minutos a
temperatura ambiente. Hacer la lectura de absorbancia a 540 nm frente a un blanco de 1 ml de reactivo.

Calcular la concentración de la muestra en gr/dl utilizando la absorbancia obtenida de un estándar de 20 gr/dl.

Valores de referencia:
Hombres: 14-18 g/dl.
Mujeres: 11-16 g/dl.
Niños: 10-14 g/dl.

3. DETERMINACION DEL VALOR HEMATOCRITO MEDIANTE EL MICROMÉTODO

El hematocrito (HTO, HTC o HCT) representa la proporción de eritrocitos en el volumen total de sangre
expresado en porcentaje.

Este valor no es exactamente igual en todas las zonas vasculares del organismo. Así pues, el HCT obtenido con
sangre capilar es algo superior al logrado a partir de sangre venosa.

Método

El HCT puede determinarse por métodos manuales o por métodos automáticos. Los métodos manuales
consisten en la centrifugación de la sangre, aplicándola una fuerza de 2.000 a 5.000 g (macrométodo) o de
12.000 a 15.000 g (micrométodo).

13
Los métodos automáticos pueden basarse en 2 principios:

El cálculo matemático del HCT a partir de los valores de RBC y de volumen corpuscular medio, obtenidos
electrónicamente con anterioridad.

El análisis de la sombra que produce la población eritrocitaria, al reflejarse en un campo oscuro.

Con los métodos manuales también se cuentan, junto con el volumen de los hematíes, el de los leucocitos, el
de las plaquetas y el del plasma que queda atrapado entre los hematíes. Por ello, el valor de HCT conseguido
con métodos automáticos es más exacto y suele ser 1 ó 2 unidades más bajo que el logrado con métodos
manuales.

Material
Tubos capilares de vidrio de 7 a 7,5 cm de longitud y 1 mm de diámetro interno. Deberán estar heparinizados si
la muestra es de sangre capilar (tienen una franja roja en uno de sus extremos).
Plastilina
Algodón o gasas
Una centrífuga de microhematocrito (12.000 a 15.000 g)
Muestra: Sangre capilar o venosa, ésta última debe ser recogida en tubos con EDTA.
1. La determinación ha de hacerse por duplicado.
2. Llenar por capilaridad cada tubo capilar con la sangre, hasta las 3/4 partes de su longitud.
3. Limpiar el exterior de cada tubo con un trozo de algodón o gasa.
4. Sellar el extremo de cada tubo por el que ha entrado la sangre con plastilina.
5. Colocar, debidamente equilibrados, los tubos en la centrífuga. En ella los tubos se sitúan con su extremo tapado
hacia afuera, ajustados al borde exterior y adecuadamente encajados en sus surcos.
6. Centrifugar los tubos a unas 12.000 g durante 5 minutos.

Lectura de resultados

14
4. ÍNDICES ERITROCITARIOS

Son una serie de parámetros que expresan diferentes características de los hematíes. Los autoanalizadores
hematológicos son capaces de proporcionar los índices tradicionales, y además, suministran otros nuevos.

1. Volumen corpuscular medio (VCM).

Es el valor medio del volumen de los hematíes, expresado en femtolitros. Se calcula a partir del hematocrito
(HCT) y del recuento del número de hematíes (RBC).

3 3
Su valor normal está comprendido entre 80 y 100 (1 = 1 femtolitro = 10-15 litros).

Si es menor de 80 fI, se dice que hay una microcitosis, y si es mayor de 100 fI, se habla de macrocitosis.

La microcitosis se da en la ferropenia y en la talasemia, y la macrocitosis en las carencias de B12 o ácido fólico,

en las hepatopatías crónicas y en la reticulocitosis.

2. Hemoglobina corpuscular media (HCM)

Es el contenido medio en pg de hemoglobina en cada eritrocito. Se calcula a partir de la concentración de

hemoglobina (Hb) y del número de hematíes. Es directamente proporcional a la cantidad de Hb y también al
tamaño de los eritrocitos:

Su valor normal está comprendido entre 27 y 31 picogramos (1 pg = 10-12 g).

Si es menor de 27 pg, se dice que hay una hipocromía asociada a microcitosis, y si es mayor de 31 pg, se habla
de hipercromía relativa asociada a macrocitosis.

3. Concentración hemoglobínica corpuscular media (CHCM)

Es el valor de la cantidad de hemoglobina (en g) contenida en 1 dl de hematíes. Se calcula a partir de la

concentración de hemoglobina y del hematocrito.

Su valor normal está comprendido entre 32 y 36 g/dl. Si es mayor de 36 g/dl se habla de hipercromía absoluta.

La disminución de la CHCM se da en la hidrocitosis o estomatocitosis congénita, por dilución del contenido

hemoglobínico eritrocitario. El aumento de la CHCM se produce en la esferocitosis hereditaria (por
disminución de la relación entre la superficie y el volumen eritrocitario) y en la deshidratación eritrocitaria o
xerocitosis (por pérdida excesiva de agua por parte del hematíe).

15
PRÁCTICA 3
BIOQUÍMICA EN SANGRE

Los parámetros que se estudian en una rutina de bioquímica en sangre son la concentración de varias
sustancias químicas que se encuentran en la sangre en el momento del análisis y su determinación sirve al
médico para:
Confirmar un diagnóstico en un paciente con síntomas de cierta enfermedad.
Controlar la respuesta al tratamiento de la enfermedad.
Para el diagnóstico precoz en personas que no presentan síntomas, pero que pueden tener algún factor de
riesgo para diferentes enfermedades.

TÉCNICA DE REALIZACIÓN

Para realizar este análisis se precisa estar en ayunas al menos las 6 horas previas, ya que la ingesta de
alimentos altera numerosos parámetros bioquímicos como las concentraciones en sangre de glucosa (azúcar),
colesterol, ácido úrico y triglicéridos, no siendo así en otros como la urea. Pero como se realiza con la misma
muestra de sangre en el laboratorio es mejor el estar en ayunas para realizar todos ellos de una misma
extracción sanguínea.

PRINCIPALES PARÁMETROS BIOQUÍMICOS

Para estudiar la función renal se estudian los valores de urea, creatinina, cistatina, y electrolitos y
proteínas en orina.

Para la valorar la función hepática se solicitan las transaminasas, las fosfatasas alcalinas, la
gammaglutamiltranspeptidasa, la bilirrubina.

Para el diagnóstico y control de la diabetes se solicita la glucemia, la hemoglobina glicosilada (HbA1c), el

colesterol, el colesterol HDL y el colesterol LDL, los triglicéridos y la creatinina.

1. ESTUDIO DE LA FUNCIÓN RENAL

CREATININA

La creatinina se forma en el músculo como producto del metabolismo de la fosfocreatina, ésta permite que el
ADP que sobra de la contracción muscular se convierta en ATP para que el músculo pueda contraerse de
nuevo. De ésta forma el fosfato de creatina actúa como un almacén de "energía instantánea" en el músculo.

Dado que la creatinina corporal es eliminada casi totalmente por filtración glomerular, su determinación es
una forma práctica de estimar la función renal.

La producción diaria de creatinina es constante en un individuo sano, y depende de la modificación de la masa

muscular, por lo que los niveles son muy estables, ya que varía poco. En los varones y los atletas musculosos
los niveles suelen ser superiores a mujeres, niños y ancianos.

Valores normales: en los hombres son entre 0,7 y 1,3 mg/dl. En las mujeres entre 0,5 y 1,2 mg/dl. En los niños
pequeños se aceptan valores de 0,2 y 1 mg/dl. Los valores más altos de 4 mg/dl se deben a un fallo renal
importante. Puede aparecer la creatinina disminuida en pacientes con atrofia muscular.

16
Método de Jaffé sin desproteinizar

La creatinina en solución alcalina forma un complejo coloreado rojo-naranja con el ácido pícrico. La
absorbancia a 492 nm de este complejo es directamente proporcional a la concentración de creatinina en la
muestra.
Muestra/estándar 100 µl
Reactivo 1000 µl
Mezclar, después de 30 sg. Leer absorbancia = A1, leer absorbancia A2 dos minutos después.

A2 - A1= Δ absorbancia de la muestra o estándar. Concentración del estándar = 2 mg/dl

Calcular la concentración de la muestra en mg/dl utilizando el Δ absorbancia obtenido del estándar.

UREA

La urea es el resultado final del metabolismo de las proteínas, el nitrógeno de los aminoácidos es eliminado en
forma de urea en la orina. En general es un parámetro que indica la función renal, aunque puede estar
alterado en enfermedades del hígado o en la deshidratación, su concentración sérica también refleja tanto la
ingesta como el catabolismo de proteínas.

Valores normales

En los adultos son entre 7 y 20 mg por decilitro. En los niños pequeños se aceptan valores de 5 a 18 mg/dl. Los
valores más altos de 100 mg/dl se deben a un fallo renal importante.

Puede aparecer la urea elevada en sangre (uremia) en procesos en los que esté dañada la función renal y
dietas con exceso de proteínas

Puede aparecer la urea disminuida en: dietas pobres en proteínas y fallo hepático.

Método

La urea es inicialmente hidrolizada por la ureasa para dar amoniaco y dióxido de carbono. El amoniaco
producido reacciona con el 2-oxoglutarato y NADH en presencia de glutámico deshidrogenasa (GLDH) para
producir L-glutamato y NAD+. La oxidación del NADH causa una disminución de la absorbancia a 340 nm la cual
es directamente proporcional a la concentración de urea en la muestra.
ureasa
Urea + 2H2O -------------> 2 NH4+ + 2HCO-3
GLDH
2-oxoglutarato + 2 NH4+ + NADH ---------------------> L-glutamato + NAD+ + H2O

Muestra/estándar 20 µl
Reactivo 1 2000 µl
Reactivo 2 500 µl

Mezclar, incubar 1 minuto a 25-30 oC y leer absorbancia a 340 nm = A1; leer absorbancia A2 un minuto
después.

A1 – A2 =Δ absorbancia de la muestra o Δ absorbancia del estándar.

Calcular la concentración de la muestra en mg/dl utilizando el Δ absorbancia obtenido del estándar.

17
2. ESTUDIO DE LA FUNCIÓN HEPÁTICA

Se pueden dividir las pruebas de detección de la enfermedad hepática en tres grupos:

Las que estudian la capacidad funcional y excretora hepática: la bilirrubina

Las que estudian la capacidad sintética del hígado: la concentración de proteínas totales desciende
cuando hay una pérdida considerable de la capacidad de síntesis hepática. El tiempo de protrombina
mide la vía extrínseca de la coagulación y su valor depende de una serie de proteínas de síntesis hepática
como son la protrombina, los factores VII, X y V, y el fibrinógeno. También depende de la vitamina K, la
cual requiere sales hepáticas para su absorción. Por tanto, un tiempo de protrombina prolongado puede
ser debido a una síntesis defectuosa de los factores por el hígado o bien a una obstrucción biliar. El grado
de prolongación del tiempo de protrombina en un paciente con enfermedad hepática es una medida de la
gravedad de la lesión.

Las que estudian la integridad hepática: las transaminasas; aspartato aminotransferasa (ASAT, GOT) y la
alanina aminotransferasa (ALAT, GPT), catalizan la conversión de α-cetoácidos en aminoácidos por
transferencia de grupos amino. Se encuentran en cantidades elevadas en el hígado y son liberadas a la
sangre tras la lesión o muerte celular hepática. El grado de elevación refleja la magnitud de la necrosis
hepática.

ASPARTATO AMINOTRANSFERASA: ASAT-GOT

La transaminasa Glutámico Oxalacética (GOT) es una enzima con gran concentración en el corazón, en el
hígado y los músculos. Cuando hay una lesión de estos órganos la enzima es liberada a la sangre y aparece
elevada en los análisis.

Se realiza junto con otras pruebas hepáticas (Gamma GT, LDH, Bilirrubina, fosfatasa alcalina) y se utiliza para
evaluar problemas o alteraciones del hígado. Su elevación es directamente proporcional al daño celular y
puede servir como indicativo de la evolución de la enfermedad.

También se utiliza como parámetro indicador de lesión cardiaca junto con otros parámetros cardiacos (CPK,
LDH). Su valor máximo se alcanza a las 24 horas tras el infarto, y tiende a bajar en 3 a 4 días si la lesión
cardiaca cede. Si persiste elevada es que el infarto está progresando a peor.

Valores normales GOT= 5 a 32 U/L

Método

La enzima aspartato amino transferasa (ASAT-GOT) cataliza la reacción entre el L-aspartato y el -

cetoglutarato, dando oxalacetato y L-glutamato. El oxalacetato formado reacciona inmediatamente con el
NADH en presencia de la enzima malatodeshidrogenasa (MDH) para dar L-malato y NAD+. La velocidad de
consumo del NADH se determina espectrofotométricamente a 340 nm y es proporcional a la actividad de la
GOT en la muestra.
ASAT-GOT
L-aspartato + -cetoglutarato -------------------> oxalacetato + L-glutamato
MDH
oxalacetato + NADH+H+ --------------------------> L-malato + NAD+

Muestra/estándar 300µl
Reactivo 1 1500 µl (incubar 5 min)
Reactivo 2 375 µl

18
Mezclar y leer la absorbancia a 340 nm después de 1 min. Leer de nuevo 3 minutos después y calcular el Δ
Abs/min medio.

Actividad de la muestra [U/L]= Δ Abs/min x Factor

ALANINA AMINOTRANSFERASA: ALAT-GPT

La Transaminasa Glutámico Pirúvica (GPT) es una enzima con gran concentración en el hígado y en menor
medida en los riñones, corazón y músculos. Cuando hay una lesión de estos órganos la enzima es liberada a la
sangre y aparece elevada en los análisis.

Valores normales GPT= 7 a 33 U/L

Método

La enzima alanina amino transferasa (ALAT-GPT) cataliza la reacción entre la L-alanina y el -cetoglutarato,
dando piruvato y L-glutamato. El piruvato formado reacciona inmediatamente con el NADH en presencia de la
enzima lactato dehidrogenasa (LDH) para dar D-lactato y NAD+. La velocidad de consumo del NADH se
determina espectrofotométricamente a 340 nm y es proporcional a la actividad de la GPT en la muestra.
ALAT- GPT
L-alanina + -cetoglutarato -----------------------> piruvato + L-glutamato
LHD
Piruvato + NADH+H+ --------------------------------> D-lactato + NAD+

Muestra/estándar 300 µl
Reactivo 1 1500 µl (incubar 5 min)
Reactivo 2 375 µl

Mezclar y leer la absorbancia a 340 nm después de 1 min. Leer de nuevo 3 minutos después y calcular el Δ
Abs/min medio.

Actividad de la muestra [U/L]= Δ Abs/min x Factor

Niveles elevados de aminotransferasas

Los niveles elevados de aminotransferasas en suero pueden deberse a un gran número de enfermedades e
incluso a diversas situaciones terapéuticas o fisiológicas.

La ASAT-GOT aumenta en lesiones hepatocelulares, cirrosis, alcoholismo, tumores hepáticos, hepatitis…..,

determinadas patologías musculares, así como en el infarto de miocardio.

La ALAT-GPT, que se encuentra primordialmente en el hígado, se eleva en la necrosis de células hepáticas de

cualquier causa como por ejemplo la hepatitis aguda vírica o tóxica. En algunas patologías hepáticas como la
colestasis biliar o la cirrosis los niveles de GPT pueden no estar elevados.

La comparación de los niveles las transaminasas puede ayudar a establecer el tipo de lesión hepática y su
evolución. Por ejemplo el cociente GPT/GOT es mayor de 1 en hepatitis, será menor de 1 en cirrosis hepáticas,
congestiones o tumores hepáticos.

19
FOSFATASA ALCALINA (FA)

La fosfatasa alcalina es una enzima que se encuentra en todos los tejidos. Los tejidos con concentraciones
particularmente altas son, entre otros: el hígado, los conductos biliares, la placenta y el hueso. Sus niveles en
sangre aumentan por enfermedad ósea o hepática. No obstante, la fosfatasa alcalina en suero también se
eleva en algunas circunstancias normales (por ejemplo, durante el crecimiento normal del hueso) o como
respuesta a diversas drogas. Si el aumento es debido a una enfermedad hepática también estarán elevadas
otras enzimas como transaminasas, -glutariltransferasa, así como la bilirrubina. Los niveles de la FA
(hipofosfatasemia) inferiores a los normales pueden indicar desnutrición.

Valores normales. El rango normal es de 44 a 147 UI/L.

Los niveles de FA varían según la edad y el sexo. Es normal que los niños jóvenes que experimentan un rápido
crecimiento y las mujeres embarazadas tengan niveles elevados de esta enzima.

Método

La fosfatasa alcalina hidroliza el p-nitrofenil fosfato para formar el cromógeno p-nitrofenol. El incremento en
la absorbancia a 405 nm debido a la formación del p-nitrofenol es proporcional a la actividad de la fosfatasa
alcalina.
FA
p-nitrofenilfosfato -------------> p-nitrofenol + fosfato

Muestra/estándar 20 µl
Reactivo 1 1000 µl (incubar 1 min)
Reactivo 2 250 µl

Mezclar y leer la absorbancia a 405 nm después de 1 min. Leer después de 3 minutos y calcular el Δ Abs/min
medio.

Actividad de la muestra [U/L]= Δ Abs/min x Factor

3. NIVELES DE AZUCAR EN SANGRE

GLUCOSA

El análisis de la glucosa sobre todo se realiza para estudiar la posible presencia de una diabetes mellitus. Como
es una enfermedad muy compleja y con grandes repercusiones de salud es un análisis muy discriminativo y útil
que se realiza de forma bastante rutinaria.

Valores normales

Los valores normales glucosa en ayunas son entre 70 y 105 mg por decilitro.
Los valores más bajos de 40-50 mg/dl se consideran bajos (hipoglucemia).
Los valores más altos de 128 mg/dl se consideran altos (hiperglucemia).

Puede aparecer la glucemia aumentada (hiperglucemia) en: diabetes mellitus, pancreatitis aguda, síndrome
de Cushing, enfermedades renales

Puede aparecer la glucemia disminuida (hipoglucemia) en: dietas excesivas, exceso de insulina en diabéticos,
insulinoma

20
Método

La glucosa se determina después de la oxidación enzimática en presencia de glucosa oxidasa. El peróxido de

hidrógeno formado reacciona bajo la catálisis de peroxidasa con fenol y 4-aminofenazona formando un
complejo rojo-violeta usando la quinoneimina como indicador.
GOD
Glucosa + O2 + H2O -------------> ac. Glucónico + H2O2
POD
2 H2O2 + 4-aminofenazona + fenol -------------> quinoneimina + 4 H2O

Muestra/estándar 10 µl
Reactivo 1000 µl

Mezclar, incubar 10 minutos a 25-30 oC. Medir la absorbancia a 500nm del estándar (Δ Aestándar) y las muestras
(Δ Amuestra) frente a un blanco.

Calcular la concentración de la muestra en mg/dl utilizando el Δ absorbancia de un estándar (100 mg/dl)

21
 PRÁCTICA 4

LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS DEL PLASMA

Los lípidos como el colesterol y los triglicéridos son insolubles en plasma, por ello, se incorporan a
lipoproteínas que los transportan a diversos tejidos para la obtención de energía, depósito de lípidos,
producción de hormonas esteroideas y formación de ácidos biliares.

LIPOPROTEÍNAS

Las lipoproteínas están compuestas de colesterol (Ch) libre y esterificado, triglicéridos (TG), fosfolípidos (FL) y
proteínas, éstas denominadas apoproteínas. Su función es el transporte de los distintos lípidos por el
organismo, también colaboran en el transporte de aminoácidos.

Las diferentes lipoproteínas se clasifican principalmente por su densidad y tamaño, cuanto mayor es el
porcentaje de triglicéridos presente menor es la densidad.
Quilomicrones
Lipoproteínas baja densidad o VLDL (very low density lipoprotein)
Lipoproteínas de densidad intermedia o IDL (intermediate density lipoprotein)
Lipoproteínas debaja densidad o LDL (low density lipoprotein)
Lipoproteínas de alta densidad o HDL (high density lipoprotein)

TRANSPORTE EXÓGENO Y ENDÓGENO DE LÍPIDOS MEDIADO POR LIPOPROTEÍNAS

La vía exógena se inicia con la absorción intestinal del colesterol y los ácidos grasos (AG) de la dieta, éstos
forman parte de la principal lipoproteína del intestino, los quilomicrones, éstos se vierten a la linfa, que los
transporta hasta la sangre, llegando a los tejidos periféricos donde la lipoproteína lipasa plasmática hidroliza
los TG, liberando ácidos grasos libres, que entran junto con el glicerol en las células de los tejidos para ser
usados como fuente de energía o almacenados en forma de TG. Los quilomicrones remanentes (pobres en
TG), son retirados por el hígado, suministrándole FL, Ch, AG y aminoácidos.

La vía endógena se inicia con la síntesis de VLDL en el hígado, se encargan del transporte de TG endógenos a
los tejidos periféricos, una vez asimilados los lípidos por los tejidos se generan las IDL o VLDL remanentes ricas
en Ch; éstas lipoproteínas son retiradas por el hígado. Las IDL se pueden se pueden enriquecer aún más en Ch
por la acción de la proteína transportadora de Ch esterificado (CEPT), transformándose en LDL, fuente de Ch
para los tejidos periféricos. Las HDL, de origen principalmente hepático, recogen el exceso de Ch depositado
en los tejidos y lo devuelven al hígado.

22
1. TRIGLICÉRIDOS

Los niveles de triglicéridos varían con la edad. El valor normal es de 150 mg/dL. Si el colesterol tiene un valor
normal, un nivel elevado de triglicéridos no parece ser un factor de riesgo de enfermedad cardiaca, pero sí
puede ser peligroso al asociarse con diabetes y pancreatitis.

Método
LPL
Triglicéridos -------------------------> glicerol + ac. grasos
GK
Glicerol + ATP ----------------------> glicerol-3- fosfato + ADP
GPO
Glicerol-3-fosfato + O2-------------> Dihidroxiacetona-fosfato + H2O2
POD
H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol-------------> Quinonaimina + 4H2O

Muestra/estándar 10 µl
Reactivo 1000 µl

Mezclar, incubar 5 minutos a 25-30 oC. Medir la absorbancia a 500 nm del estándar (Δ Aestándar) y las muestras
(Δ Amuestra) frente a un blanco.

Calcular la concentración de la muestra en mg/dl utilizando el Δ absorbancia de un estándar (145 mg/dl)

2. COLESTEROL

Nivel de colesterol total:

Menos de 200 mg/dl: concentración de colesterol sanguíneo deseable.
Entre 200 y 239 mg/dl: cifras en el límite de lo aceptable.
De 240 mg/dl para arriba: colesterol sanguíneo elevado.

Método
esterasa
Ester de colesterol ----------------> colesterol + ac. grasos
oxidasa
colesterol + O2 --------------------> colesterol-3-ona + H2O2
POD
H2O2 + 4-aminoantipirina + 4-clorofenol ------------> Quinonaimina + 4H2O2

Muestra/estándar 10 µl
Reactivo 1000 µl

Mezclar, incubar 5 minutos a 25-30 oC. Medir la absorbancia a 500 nm del estándar (Δ Aestándar) y las muestras
(Δ Amuestra) frente a un blanco.

Calcular la concentración de la muestra en mg/dl utilizando el Δ absorbancia de un estándar (156 mg/dl)

Cálculo de lípidos totales= 400 + TG + Colesterol total

23
3. LIPOPROTEÍNAS

Aunque la medición de colesterol total es útil para determinar el riesgo de la enfermedad cardiovascular, las
fracciones de lipoproteínas del colesterol, pueden ser útiles indicadores del riesgo, estudios epidemiológicos
han demostrado que el riesgo de infarto de miocardio se relaciona íntima y directamente con los niveles de
LDL en la sangre mientras que las HDL son reconocidas como factor protector contra la ateroesclerosis.
Algunos estudios sugieren que el mejor determinante de riesgo cardiovascular es la relación Ch total/HDL
“índice aterogénico”, siendo deseable que este cociente sea inferior a 4,5.

HDL-COLESTEROL

El método de referencia para la medición de HDL es la ultracentrifugación, el cual, debido a su laboriosidad,

solo es usado en investigación. El HDL-Colesterol SP de Gernon es un método homogéneo para la medida
directa de los niveles de HDL-Colesterol en suero o plasma sin necesidad de tratamiento previo.

Método
Muestra/estándar 10 µl
Reactivo 1 450 µl (incubar 5 min.)
Reactivo 2 150 µl

Mezclar, incubar 30 sg minuto a 25-30 oC y leer absorbancia a 600 nm = A1; leer absorbancia A2 tres minutos
después. A2 – A1 =Δ absorbancia de la muestra o Δ absorbancia del estándar.

Calcular la concentración de la muestra en mg/dl utilizando el Δ absorbancia obtenido del estándar.

Valores normales: 30-80 mg/dl

LDL-COLESTEROL

Se estima a través de la fórmula Friedewald

Colesterol LDL = Colesterol total - Colesterol HDL – VLDL (VLDL = triglicéridos / 5)
(Sólo sirve hasta triglicéridos de 400 mg/dl)

Valores de colesterol LDL

Valores deseables 100-129 g/dl
Límite de riesgo 130-159 mg/dl
Alto riesgo 160 mg/dl

4. DISLIPEMIAS

Enfermedades caracterizadas por el acúmulo o falta de alguna lipoproteína en el plasma. Cuando se produce
un acúmulo hablamos de hiperlipoproteinemias.

Hiperlipoproteinemias más comunes: Lipoproteína Lípido

acumulada elevado
HIPERCOLESTEROLEMIA FAMILIAR LDL Colesterol

HIPERBETAPROTEINEMIA FAMILIAR LDL + VLDL Colesterol

HIPERTRIACILGLICEROLEMIA VLDL Triglicéridos

24