MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA (PV - 343)

Práctica Nª 1
A. Técnicas para la preparación de materiales
y métodos de esterilización
I.- OBJETIVOS: Logros que deben alcanzar al término de la Práctica.

 Conocer las técnicas básicas utilizadas para la preparación y esterilización de

materiales de vidrio y posteriormente la utilización de las mismas.
 Conocer los principios generales de las diferentes técnicas de esterilización.
 Adquirir habilidades y destrezas en el uso del autoclave.

II.- ASPECTOS GENERALES:

El material que se emplea en microbiología debe estar perfectamente limpio y estéril.

La limpieza es importante ya que restos de sustancias que permanecen en los tubos, placas
y demás elementos, pueden impedir el posterior desarrollo de los microorganismos; la
esterilización es fundamental para evitar la presencia de microorganismos extraños o
contaminantes. Para ello el material deberá ser acondicionado de tal forma que mantenga
estas condiciones por tiempo indeterminado.

2.1.- MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN:

a) Calor Directo o flameado.- Consiste en el quemado de ciertos materiales a la

llama de un mechero, como por ejemplo asas de kolle, pinzas y boca de tubos.

Flameado

b) Ebullición.- Consiste en hacer hervir en agua algunos materiales por un tiempo de

10 a 15 minutos, como tapones de jebe.

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Ebullición
c) Vapor sin presión (Tindalización).- La esterilización se produce por el calor
liberado durante la evaporación del agua que posteriormente se condensa. Este
método es empleado para la esterilización de algunos medios que sufren hidrólisis
en temperaturas elevadas. Para realizar este proceso se emplea el autoclave sin
presión (espita abierta).

ESPITA

Autoclave con espita abierta

d) Vapor saturado a presión.- Se emplea el autoclave. Sirve para esterilizar medios

de cultivo, equipos y material de vidrio.

Uso de autoclave para esterilizar

e) Calor seco.- Se emplea el horno o estufa, es utilizado para la esterilización de

material de vidrio y equipo metálico. Los materiales son sometidos a 160°C por 2
horas ó 180°C por 30 minutos.

Horno o Estufa

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f) Gases.- La esterilización por gases es recomendada para los materiales que no

pueden ser esterilizados por otros métodos, como algunos equipos quirúrgicos. Los
gases empleados son el óxido de etileno y el formaldehído.

Cámara de óxido de Etileno

g) Radiaciones.- Se utiliza los rayos ultravioleta que destruyen principalmente los

ácidos nucleicos, matando los microorganismos. Se utiliza para esterilizar
ambientes de trabajo y sala de operaciones.

Cámara de radiaciones ultravioleta

h) Desinfecciones.- Son productos químicos que actúan ya sea como bactericida

(matan microorganismos) o como bacteriostáticos (inhiben el desarrollo de los
microorganismos). Se emplean para desinfectar la piel y ambientes de trabajo.
Entre los desinfectantes que más se utilizan tenemos: fenoles, alcoholes, yodo,
detergentes y colorantes.

2.2.- ESTERILIZACIÓN EN AUTOCLAVE CON VAPOR SATURADO A PRESIÓN:

a) Uso.- Se emplea para esterilizar medios de cultivo, materiales de vidrio y otros

materiales resistentes a la acción del calor y presión, en una atmósfera saturada de
vapor de agua.

b) Fundamento.- El vapor a presión proporciona temperaturas superiores a la que se

obtiene por ebullición, además de tener otras ventajas como calentamiento rápido,
penetración y humedad en abundancia, lo que facilita la coagulación de las
proteínas de los microorganismos causando la muerte.

c) Descripción.- El autoclave consiste en un cuerpo cilíndrico que está dividido, por

una placa perforada, en dos partes:

a) La inferior, denominada reservorio de agua.

b) La superior denominada cámara de vapor.

A este cuerpo cilíndrico va adaptado por la parte superior una tapa que se fija a la
misma mediante una serie de bulones que permiten un cierre hermético. En la misma tapa
se dispone de un manómetro que indica la presión y de un termómetro que indica la

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temperatura, además de una espita para la purga del aire y de una válvula de seguridad. En
la parte inferior puede o no estar colocado el sistema de calefacción (que puede ser
eléctrico, gas, etc.) que permite calentar el agua.
CAMARA VÁLVULA
SALIDA
DE DE VÁLVULA
DE
VAPOR SEGURIDAD MANÓMETRO DE
VAPOR
CONTRO
L

VAPOR PUERTA
CAMARA
DE
VAPOR

AIRE

ESTANQUE
FILTRO

CAMISA DE VAPOR
TERMOMETRO

VÁLVULA DE EJECUCIÓN DE
VAPOR AUTOMATICA CUANDO EL REGULADOR DE PRESIÓN
AIRE ESTA AGOTADAO

SALIDA SUMINISTRO DE VAPOR

Dispositivos de un autoclave

III.- MATERIALES:

 Tubos de ensayo.
 Placas petri.
 Pipetas.
 Matraces.
 Papel kraft.
 Algodón.
 Pabilo.
 Autoclave.
 Asa de kolle.
 Pinzas.
 Mechero.
 Medios de cultivo.

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Cada estudiante preparará correctamente una pipeta, un matraz y una placa Petri
para ser esterilizada.

4.1.- CONFECCIÓN DE TAPONES DE ALGODÓN:

 Tomar un trozo rectangular.

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 Practicar a lo largo, el dobles en tres y enrollarlo transversalmente hasta darle la

medida y diámetro necesario.
 El tampón en los tubos de ensayo, matraces u otros recipientes, deben quedar
introducidos en sus terceras partes, no muy ajustadas, ni muy flojos, para evitar la
contaminación y dificultar el manipuleo.

Esquematice sus observaciones

4.2.- PREPARACIÓN DE TUBOS DE PRUEBA:

 Para su uso deben estar perfectamente limpios.

 Colocar a cada tubo tapones de algodón confeccionados de acuerdo a lo explicado
anteriormente.
 Amarrar con un pedazo de pabilo entre 05 a 06 tubos, luego todo el paquete, cubrir
con papel kraft y sujetar con pabilo.

Esquematice sus observaciones

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4.3.- PREPARACIÓN DE PIPETAS:

 Colocar tapones de algodón a manera de filtro moderadamente ajustadas en la

boquilla de las pipetas, luego quemar el algodón sobrante.
 Colocar oblicuamente la pipeta en una tira de papel, haciendo doblez de éste en un
extremo y cubrir la punta de la pipeta.
 Deslizar el papel en espiral sobre la longitud de la pipeta hasta la boquilla, hacer
torsión de la tira de papel para permitir la protección completa.
 Marcar en el papel datos de medidas de las pipetas.

Esquematice sus observaciones

4.4.- PREPARACIÓN DE PLACAS PETRI:

 Las placas se envuelven con trozos rectangulares de papel kraft.

 Colocar las placas sobre el papel en posición invertida y doblar los márgenes uno
sobre otro a manera de cubrirla.
 Completar el doble con los extremos del papel sobrante, asegurando bien. Los
bordes de la placa deben quedar íntimamente adheridos al papel, para evitar
vacíos.

Esquematice sus observaciones

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4.5.- PREPARACIÓN DE MATRACES, BALONES, ETC:

 Colocar tapones de algodón, preparados de acuerdo a la indicación anterior.

 En seguida cubrir cada material con una capucha de papel kraft y sujetarlo con
pabilo. Cuando se trata de matraz kitasato, se procede como si se preparara un
matraz corriente, pero no se debe olvidar de taponar también la tubuladura lateral y
cubrir la misma con un trozo de papel y asegurar con pabilo.

Esquematice sus observaciones

4.6.- MANEJO DE AUTOCLAVE:

 Verificar que el agua del reservorio alcance el nivel de la placa perforada.

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 Colocar los materiales y medios de cultivo preparados en una canastilla y ésta

sobre la placa perforada. Los materiales no deben estar muy juntos para evitar se
obstaculice el libre paso de vapor de agua.
 Cerrar la autoclave constatando que la tapa quede perfectamente acoplada.
 Ajustar los bulones en cruz sin apretarlos demasiado.
 Calentar la autoclave, manteniendo abierta la espita (válvula de pura) con la
finalidad de purgar el aparato (expulsar el aire contenido en la autoclave) que se
manifiesta por la salida de un chorro continuo de vapor de agua.
 Cerrar la espita y esperar que el manómetro indique 15 libras de presión
equivalente a 121°C.
 Cuando el manómetro indique 15 libras se debe mantener esta presión durante 15
a 20 minutos.
 Transcurrido este tiempo se interrumpe la calefacción. Se espera que la presión
descienda a 0. Es en este momento cuando debe abrirse la espita que restablece
el equilibrio de las presiones interior y exterior. Después de desajustar los bulones,
abrir la tapa de la autoclave, esperar que los materiales se enfríen un poco para
luego proceder a descargar el aparato.

VI.- OBSERVACIONES:

 Esquematice sus observaciones:

VII.- CUESTIONARIO:

1. Explique qué es bioseguridad

Es el conjunto de medidas preventivas destinados a mantener en control de
factores de riesgo laboral procedentes de agentes biológicos, físicos o
químicos logrando la prevención de impacto nocivos.

2. Indique por qué los materiales de laboratorio deben ser acondicionados antes
de ser esterilizados
Para que la esterilización y desinfección no sean inusables, esto se debe a
que las sociedades contenidas en las superficies crean una barrea que
impide la acción de los agentes desinfectantes y esterilizados. Después de
ser acondicionados recién se procede a la esterilización, la contaminación
microbiana se reduce entre 3-5 logaritmos.
3. Indique una diferencia entre esterilización y desinfección
 Esterilización. - proceso mediante el cual se elimina todas las formas
de vida microbiana.
 Desinfección. – elimina microorganismos, patógenos totales o
parcialmente.
4. Después de haber realizado la esterilización, ¿Cómo estás seguro que el
material está realmente estéril?
Debe verificarse los materiales antes de realizarse de manera tal de asegurar
la perfecta esterilización del mismo en todos sus puntos y evitar la posterior
contaminación.

VII.- BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:

www. htpp/ materiales- de- laboratorio antes- de – ser- estelarizados.

Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiología. Manual de Métodos Generales (2ª
edición). Facultad de Farmacia. Universidad Central de Venezuela.

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B. Preparación de Medios de Cultivo

I.- OBJETIVOS: Logros que deben alcanzar al término de la Práctica.

 Conocer la clasificación, preparación, esterilización y distribución de los medios de

cultivo.
 Adquirir conciencia de la importancia que tiene la correcta preparación del medio
de cultivo en la práctica microbiológica.
 Adquirir práctica en el preparado de algunos medios de cultivo a partir de sus
componentes individuales.

II.- ASPECTOS GENERALES

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. La diversidad metabólica de los microorganismos es muy amplia; por ello,
la variedad de medios de cultivo es también muy grande, no existiendo un medio de cultivo
universal adecuado para todos ellos.

Para estudiar debidamente los microorganismos se necesita cultivarlos en condiciones

de laboratorio, utilizando medios de cultivo. Un medio de cultivo es formulado en base a las
necesidades nutricionales del microorganismo.

2.1.- CLASES DE MEDIOS DE CULTIVO:

SEGÚN SU ORIGEN:

 Naturales. - empleo de tejidos animales o vegetales como, por ejemplo: leche,

sangre, jugo de frutas, etc.

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 Artificiales Sintéticos. - de composición química definida, por ejemplo: NaCl,

PO4K2, etc.
 Artificiales complejos. - de composición química no definida por ejemplo peptona,
levadura, etc.

SEGÚN SU NATURALEZA:

 Líquidos. - no tiene agar en su composición.

 Sólidos. - tienen en su composición agar que le da dureza y consistencia deseada.

SEGÚN SU USO:

 Medios básicos. - Son medios que permiten el desarrollo de los microorganismos

más comunes.
 Medios enriquecidos. - Son medios básicos, enriquecidos con sustancias como
sangre, extracto de tejidos de animales y plantas.
 Medios selectivos. - Son medios que presentan ciertas sustancias químicas
específicas que no permiten el desarrollo de un grupo de microorganismos.
 Medios diferenciales. - Son medios que se emplean para demostrar algunas
propiedades bioquímicas de las bacterias, que permiten una rápida identificación
de los microorganismos.

2.2.- PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

Los microorganismos son seres ubicuos que han colonizado todos los tipos de
ecosistemas: el agua, el suelo, el aire, el resto de organismos.

Por ello todas las manipulaciones para conseguir cultivos puros se deben realizar en
un ambiente estéril que impida el acceso al medio de otros microorganismos diferentes a los
que deseamos aislar.

Deben crecer dentro de recipientes y medios de cultivo previamente esterilizados. Los

recipientes más utilizados en el crecimiento de microorganismos son los tubos de ensayo,
los matraces (ambos para los medios líquidos) y las placas de Petri (para los cultivos
sólidos).

En la actualidad, la mayoría de los medios de cultivo se encuentran comercializados,

normalmente bajo la forma de liofilizados que es preciso rehidratar. En general, la
preparación de un medio de cultivo se reduce simplemente a pesar la cantidad deseada del
mismo, disolverlo en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las
instrucciones del fabricante y esterilizarlo.

Las sustancias termolábiles se esterilizan por filtración y se añaden al resto de

componentes previamente esterilizados en autoclave. Antes de su esterilización, los medios
líquidos en caldo se distribuyen en los recipientes adecuados (tubos o matraces); en ningún
caso el volumen del líquido en el recipiente debe exceder un tercio del volumen total del
recipiente.

Si es un medio sólido, habitualmente se procede a fundir el agar en un baño maría

antes de esterilizarlo. Una vez fundido, se distribuye en caliente en tubos o matraces (no en
placas de Petri), se tapa y se esteriliza.

Finalizada la esterilización en la autoclave:

 Los medios líquidos se dejarán enfriar a temperatura ambiente.

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 Los medios sólidos contenidos en tubos deben inclinarse para que al solidificarse
adopten la forma de agar inclinado, si tal es su finalidad.
 Las placas de Petri pueden también ser preparadas ahora, vertiendo el medio aún
fundido y estéril dentro de ellas en un ambiente aséptico (p.e. en la proximidad de
la llama de un mechero Bunsen). Es posible asimismo conservar el medio
destinado a placas solidificado y estéril en tubos o botellas, que se fundirán al baño
maría en el momento de prepararlas.
 Caldos y medios sólidos pueden conservarse, una vez esterilizados, a temperatura
ambiente. Sin embargo, para reducir su deshidratación y el consiguiente cambio de
las concentraciones de los componentes es preferible conservarlos a 4°C.

Medios de cultivo deshidratados

2.3.- PLAQUEADO:

El plaqueado consiste en verter el medio de cultivo esterilizado en placas de Petri

tomando en cuenta las siguientes recomendaciones o precauciones:

 Desinfectar la zona de trabajo y manos del operador.

 Trabajar cerca de la llama de un mechero.
 Quemar la boca del frasco antes y después del uso.
 Evitar hablar y corrientes de aire.

2.4.- CONTROL BACTERIOLÓGICO:

Después de realizar el plaqueado se debe colocar las placas en estufa a 30°C. Por 24
horas, con la finalidad de permitir que las bacterias que hayan contaminado el medio de
cultivo al realizar el proceso de plaqueado, puedan desarrollar y formar colonias. Las placas
contaminadas deben ser descartadas. Las placas sin contaminación serán utilizadas para
los aislamientos.

III.- MATERIALES:

 Tubos de ensayo.
 Placas petri.
 Pipetas.
 Matraces.
 Balones.
 Autoclave.
 Algodón.
 Levadura manitol agar (LMA).
 Medio YCDA
 Agar Mac Conkey
 Agua destilada.

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IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Los medios que prepararemos en prácticas son los siguientes:

4.1.- PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN FORMA GENERAL:

 Pesar la cantidad de sustancias indicadas en la fórmula e ir disolviendo una a una

con l ayuda del calor si es necesario.
 Completar el volumen de agua destilada
 Distribuir los medios preparados en recipientes adecuados (resistentes a la
esterilización) y proceder a la esterilización en el autoclave.

4.2.- MEDIO LEVADURA MANITOL AGAR (LMA):

Este medio se emplea para el aislamiento de bacterias de los géneros Rhizobium y

Bradyrhizobium que viven en simbiosis con plantas leguminosas, formando estructuras
llamadas nódulos.

Composición:
Manitol 10. 0 gr.
Agua de levadura 100.0 ml
ó Extracto de levadura 1.0 gr.
H2PO4 0.5 gr.
MgSO4. 7H2O 0.2 gr.
NaCl 0.1 gr.
Agar 18.0 gr.
Rojo Congo 1 / 400 10.0 ml.

Preparación del agua de levadura: Disolver 10 gr. de levadura seca en 100 ml. de agua
destilada, luego se esteriliza en autoclave por 30 a 60 minutos a 15 libras de presión, dejar
reposar unos días y decantar el sobrenadante (líquido amarillento).

Preparación:

 En un recipiente adecuado se coloca 900 ml. de agua destilada, se disuelve 10 gr.

de manitol y luego se añade los diferentes reactivos mas los 100 ml. de agua de
levadura. Si se utiliza extracto de levadura se debe utilizar 1 lt. de agua destilada.
 A todo este conjunto se le aplica el agar y se somete a fuego lento, hasta que el
agar quede completamente disuelto.
 Repartir el medio en matraces o balones y esterilizar en autoclave por 20 minutos a
15 libras de presión.
 Después de la esterilización agregar 10 ml. de la solución de rojo congo y proceder
a plaquear el medio.

4.3.- MEDIO YCDA:

Este medio se emplea para el aislamiento de bacterias que atacan plantas. Ejm.
Xanthomonas, Pseudomonas, Erwinia, Agrobacterium, etc.

Composición:
Extracto de levadura 10 gr.
Dextrosa 20 gr.
Carbonato de Calcio 20 gr.
Agar 18 gr.
Agua destilada Completar hasta 1 lt.

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Preparación:

 Disolver el agar y luego agregar el extracto de levadura y la dextrosa, al final se

agrega el carbonato de calcio.
 Esterilizar en autoclave durante 20 a 30 minutos a 15 libras de presión
 Al momento de plaquear mover el medio para que se distribuya uniformemente el
carbonato de calcio.

4.4.- MEDIO AGAR MAC CONKEY:

Este medio se emplea para el aislamiento de coliformes (Shiguella y Salmonella) de

leche, agua y otras sustancias contaminadas con heces.

Composición:
Medio comercial Mac Conkey 50 gr.
Agua destilada 1 lt.
Preparación:

 Disolver 50 gr. del medio en 1 lt. de agua destilada tibia.

 Repartir el medio en balones o matraces de capacidad requerida.
 Esterilizar durante 15 ó 20 minutos a 15 libras de presión.
 Distribuir el medio estéril en placas a razón de 20 a 25 ml.

4.5.- MEDIO DE CULTIVO AGAR PAPA DEXTROSA PARA EL AISLAMIENTO DE

HONGOS:

Composición:
Trozos de papa pelada 250 gr.
Azúcar (sacarosa) 10 gr.
Agua destilada 1000 ml.
Agar 18 gr.
Preparación:

 Hierva la papa en 500 ml de agua por 30 minutos, mientras disuelve el agar e otros
500 ml, filtre el caldo de papa con pedazo de algodón.
 Junte las dos preparaciones, agregue y disuelva el azúcar y sustituya el agua hasta
completar 1000 ml., esterilice y distribuya en placas de Petri.

4.7.- PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS:

COMPOSICIÓN:

 Maízena 1.0 gr.

 Azúcar blanca 20.0 gr.
 Agua de levadura 200.0 mL.
 Agar 18.0 gr.
 Agua destilada 1.0 Lt.

PREPARACIÓN:

1. Disolver el agar en 700 ml de agua destilada.

2. Luego añadir cada uno de los componentes según el orden indicado en la
composición.
3. Ajustar el pH a 5.
4. Esterilizar en autoclave por 20 minutos y plaquear.

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V.- RESULTADOS:

 No existen resultados en esta práctica, por ser expositivo.

VI.- OBSERVACIONES:

 Esquematice sus observaciones.

VII.- CUESTIONARIO:

1. Mencione medios de cultivo para el aislamiento de microorganismos que causan

enfermedades en plantas.
 Aislamiento de microorganismos de suelo.
 Aislamiento de microorganismos de agua
 Aislamiento de microorganismos de Aire
2. Explique por qué los medios de cultivo deben ser sometidos a un control
bacteriológico antes de su uso
Con la finalidad que las bacterias que hayan han contaminado el medio de cultivo
al realizar el proceso de plaqueado, pueden desarrollarse por formar colonias.

3. ¿Qué medios de cultivo se utilizarían para el aislamiento de microorganismos del

suelo?
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. La diversidad metabólica de estos es tan grande que la variedad
de medios de cultivo es enorme, no existiendo un medio de cultivo universal
adecuado para todos ellos, ni siquiera refiriéndonos a las bacterias con
exclusividad.
 Medio azobader (Az)
 Medio asospiridum (Azp)
 Medio mínimo con hidroxiapalito (hp)
4. ¿En qué casos se utiliza medio semisólido o medio líquido?

Sólido. - Contiene Agar a concentración 1.5 – 2%. Es la forma más conocida de

medio de cultivo, que se pone en las Placas de Petri. Es común utilizar este tipo de
medio para aislar colonias o analizar las características de las colonias.

Semisólido. - Contiene Agar al 0.5% o menos. Tienen una consistencia como de

crema y son útiles para cultivos de microaerófilos o para determinar motilidad.

VIII.- BIBLIOGRAFÍA CONSULTADA:

https://microbiologiaparahumanos.wordpress.com/medios-de-cultivo/
https://www.ugr.es/~cjl/medios%20de%20cultivo.pdf

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