MP Microbiologia ITSCS

MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGIA
CONTENIDO
RECOMENDACIONES GENERALES 1. EMPACADO DE MATERIAL Y ESTERILIZACIN POR CALOR 2. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO 3. SEMBRADO EN PLACA DE MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE 4. METODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS 5. MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES 6. MANEJO Y USO DEL MICROSCPIO PTICO COMPUESTO 7. MORFOLOGIA BACTERIANA Y TINCIN DE GRAM 8. TINCIN DE ESTRUCTURAS BACTERIANAS 9. MORFOLOGIA GENERAL DE LEVADURAS Y MOHOS 10. EFECTO DE LA PRESION OSMTICA SOBRE LA VIABILIDAD Y EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS 11. EFECTO DE LOS AGENTES QUIMICOS: FENOL, ALCOHOL, JABON, ANTISPTICO COMERCIAL, METALES PESADOS Y COLORANTES. 12. ANTIBIOSIS EXPERIMENTAL Y USO DE ANTIBIOTICOS COMERCIALES
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MANUAL DE PRCTICAS DE MICROBIOLOGA
RECOMENDACIONES GENERALES
Los alumnos tienen 10 minutos de tolerancia a la hora de la entrada, despus de este tiempo, no se permitir al acceso al laboratorio Al entrar al laboratorio, el alumno deber ponerse su bata (blanca y de manga larga) y abotonrsela completamente, slo podr quitrsela al salir del laboratorio. Las mesas debern estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas debern ser colocadas en el espacio designado para ellas. No comer en el laboratorio, no introducirse ningn objeto a la boca. Ocultar el cabello dentro de la cofia y usar cubre bocas para efectuar el trabajo de laboratorio. Llevar siempre a laboratorio alcohol, algodn, papel aluminio, cerillos, magitel, bote de hojalata y escobilln para tubos de ensaye. Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de usarla. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deber efectuarse sentado y en su equipo de trabajo. Hablar slo lo necesario con los compaeros. Das antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar, si no entiende pregunte al profesor. Si hay necesidad de llevar material biolgico para la realizacin de la prctica, es necesario conseguirlo de lo contrario la practica se suspender para todo el equipo. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deber esterilizarse en la flama del mechero, antes y despus de su uso. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra. En caso de derramar material que contenga microorganismos, cbralo con fenol o benzal y deje actuar diez minutos. Avise al profesor. Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio indicado por el profesor. Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo, grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin del material para eliminar microorganismos que pudieran hacernos dao a nuestra salud. Lvese las manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio. Es obligacin de cada equipo entregar todo el material limpio. El supervisor asignado ser responsable de la realizacin de la prctica y de la limpieza del laboratorio.
Prctica 1 EMPACADO DE MATERIAL Y ESTERILIZACIN POR CALOR INTRODUCCION

La esterilizacin es el proceso de eliminacin de toda forma de vida, incluidas las esporas. La esterilizacin es un trmino absoluto que implica prdida de la viabilidad o eliminacin de todos los microorganismos contenidos en un objeto o sustancia, acondicionando de tal modo que impida su posterior contaminacin. Existen diferentes mtodos de esterilizacin, estos pueden ser mtodos qumicos, mecnicos o fsicos. Los mtodos qumicos incluyen el uso de xido de etileno, aldehdos y perxido de hidrgeno, los mecnicos la microfiltracin y dentro de los fsicos tenemos el empleo de calor y radiaciones ionizantes y UV.
OBJETIVO
El alumno aprender el procedimiento para empacar diversos materiales de uso en microbiologa as como las ventajas y desventajas de los procedimientos de esterilizacin por calor seco y calor hmedo.
FUNDAMENTO
A) CALOR HMEDO.- La temperatura elevada, combinada con una humedad elevada, es uno de los mtodos ms efectivos para matar microorganismos. El calor hmedo mata a los microorganismos coagulando sus protenas. Es mucho ms rpido y efectivo que el calor seco. El vapor a presin proporciona temperaturas por encima de las que se pueden obtener al hervir. Tiene la ventaja de un calentamiento rpido, as como penetracin rpida y abundante humedad.. El aparato a esterilizar que utiliza vapor de agua a presin regulada se denomina autoclave. Consta de una cmara de doble pared que se llena de vapor saturado libre de aire y se mantiene a la temperatura indicada y a la presin establecida durante un periodo de tiempo determinado. Generalmente el autoclave funciona a una presin de 15 libras/ pulgada cuadrada a 121 C ( 249F). El tiempo de funcionamiento para lograr la esterilidad depende de la naturaleza del material que se va a esterilizar, del tipo de envase y del volumen del material. Una temperatura de l00 C es la suficiente para matar a todas las formas bacterianas en 2 o 3 minutos, excepto a las esporas, para matar a estas se requiere una temperatura de 121C durante 15 minutos y a una presin de 15 libras. Este mtodo es adecuado para esterilizar aparatos que tienen hule, jeringas que contienen metal, para medios de cultivo que contienen un azcar especial dextrosa. El autoclave se puede sustituir por la olla de presin. B) CALOR SECO.- En este tipo de esterilizacin existe una destruccin de los microorganismos oxidando sus constituyentes qumicos, desnaturalizando las protenas y los cidos nucleicos de las clulas as como fragmentando las membranas celulares. Para materiales que deben permanecer secos
como ciertos instrumentos de vidrio de laboratorio tales como: cajas de Petri, pipetas, as como aceites, polvos ( por ser impermeables al vapor), los materiales que no se pueden esterilizar por calor seco son: Material textil (algodn, sedas, lino, etc.), gomas y materiales sintticos. Todo material que se altere a la temperatura de trabajo se dispone de hornos elctricos por los que circula aire caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se acostumbra a aplicar una temperatura de 160C a 170C durante una hora o ms. Para materiales de vidrio de laboratorio es suficiente una exposicin de dos horas de duracin a 160C ( 320 F) para que quede esterilizado. Otras formas tiles de calor seco incluyen incineracin para objetos que deben ser destruidos y flameados por pasaje de agujas o pequeos instrumentos a travs de la llama de un mechero Bunsen
MATERIAL Y EQUIPO
1 Matraz Erlenmeryer 250ml 4 Tubos de ensaye 1 Pipeta de 1 ml 4 Cajas Petri Papel Estraza Algodn Escobillones Servitoallas Reloj Termmetro Autoclave u olla de presin Horno a 170C
REACTIVOS
Agua destilada Detergente Extran Agua de la llave
PROCEDIMIENTO
LAVADO Prepare la solucin de Extran al 2% en agua si existe una suciedad normal, al 5% si la suciedad es muy acentuada y al 20% si la suciedad es muy persistente. Coloque el material sucio en un traste y deje reposar entre 2 y 24 horas. Si se quiere acelerar la reaccin es conveniente hervir la solucin. Despus del tiempo requerido saque del bao, enjuague con agua corriente y despus con agua destilada. Secar al aire o estufa. EMPACADO DEL MATERIAL 1. Lava el material de laboratorio, principalmente la cristalera con detergente Extran o Alkox (Fcilmente se contamina con esporas difciles de eliminar) enjuaga con abundante agua de la llave y enseguida con agua destilada. 2. Secar el material utilizando papel absorbente para acelerar el secado 3. Empaca el material correctamente A) CAJAS DE PETRI Corta el papel estraza, en forma de rectngulos adecuados para la cantidad de 2 a 3 cajas. Colcalas en la parte central y envulvelas segn te indique tu profesor.:Se toman los extremos de papel y se unen, se hace un nuevo doblez recargando ligeramente en la caja para marcarlo, Los extremos se doblan en forma triangular .Ya en forma triangular se doblan hacia atrs quedando listas para esterilizar.
B) PIPETAS Introduce una pequea porcin de algodn en el cuello de la pipeta, procurando que quede lo suficientemente apretada. Con tiras de papel de 3 cm de ancho envulvelas, comenzando por la punta y en forma de espiral gira hacia arriba hasta el final de la pipeta. C) TUBOS DE ENSAYE. Se toma el tubo con la mano izquierda y con la derecha el tapn de algodn. Coloca algodn en la boca del tubo a 1/5 parte de la longitud del mismo procurando que quede bien apretado, depostalos en recipientes adecuados, tpalos con papel estraza y talos. D) MATRACES. Tapa el cuello del matraz con algodn, lo suficientemente apretado para evitar que se destape (se tapa en la misma forma que el tubo). Como proteccin coloca un gorrito de papel estraza y talo con cinta. E) MATERIAL METLICO El asa de platino, tijeras, bistur, material quirrgico no es necesario empacarlo para su esterilizacin. ESTERILIZACIN POR CALOR SECO 1. Las normas de Procedimiento de la Institucin establecern las condiciones de trabajo segn la carga, volumen, peso, resistencia trmica del material. Es imprescindible respetar los parmetros obtenidos en la validacin del procedimiento. La temperatura de esterilizacin por calor seco deber estar entre 160C a 170 C. y el tiempo de aplicacin ser de una hora o ms. 2. El material a esterilizar se deber cargar con el esterilizador fro, teniendo en cuenta las siguientes recomendaciones: cada unidad deber quedar separada de las vecinas Los materiales no debern estar en contacto con las paredes, piso y techo del esterilizador. La carga del esterilizador ser homognea y no deber superar el 80% de la capacidad total de la cmara 3. Colocar el material dentro del esterilizador. Encender el Esterilizador, verificar que los instrumentos de control de ciclo, tiempo (2 horas) y temperatura( 170C) se encuentren en la posicin correcta. Esperar hasta que los instrumentos de medicin alcancen la temperatura seleccionada para el ciclo. 4. Cuando se alcance la temperatura seleccionada, se comenzar a descontar el tiempo de esterilizacin. Cumplido el tiempo de exposicin se apagar el esterilizador. La descarga del esterilizador se efectuar una vez que el material se haya enfriado. 5. Durante el ciclo de esterilizacin no deber abrirse la puerta del esterilizador porque ello implicara abortar el ciclo, debiendo en este caso recomenzarlo, adems de que el cambio de temperatura rompera la cristalera. ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO 1. Lava el material que te proporcione tu profesor con mezclas adecuadas como extran o mezcla crmica con concentraciones adecuadas tomando en cuenta lo sucio del material, seca en estufa o en forma manual con papel absorbente y empcalo. Tenlo listo para su esterilizacin.
2. Coloca el agua necesaria en la autoclave u olla de presin hasta la marca e introduce unas gradillas metlicas que servirn de base al material a esterilizar. Coloca el material a esterilizar dentro de la autoclave u olla de presin, evitando que el material toque las paredes. 3. Cierra la autoclave u olla de presin, cuidando de dejar abierta la vlvula de salida de vapor que ayudar a expulsar el aire contenido dentro y que ste es desplazado por el vapor que se produce, si el aire no fue eliminado totalmente de la autoclave, el manmetro aumentar a 15 libras. Pero la temperatura no habr alcanzado los 12lC. Por esto se debe medir el tiempo cuando la temperatura llegue a l12C. 4. Cierra la vlvula cuando el vapor sea continuo. La temperatura de l05 C indica que est libre de aire. Vigila el termmetro. Cuando vaya en 120 C, mantenla durante 15 minutos para que se efecte la esterilizacin (15 libras de presin). Transcurrido este tiempo se corta la fuente de calor 5. Deja enfriar hasta que el manmetro marque cero. Abre la vlvula de salida de vapor, para expulsar el vapor restante. Abre el autoclave y retira el material 6. Si el material no est en estado lquido la vlvula se puede abrir rpido a la salida de vapor, pero si est en estado lquido la rpida prdida de presin las hace hervir o bien saltar los tapones. Por lo tanto se espera unos minutos a que se enfre perfectamente
OBSERVACIONES
Realiza los dibujos correspondientes del procedimiento de empacado que realizaste para cada tipo de material de laboratorio. As mismo dibuja el horno en donde realizaste la esterilizacin por calor seco.
CUESTIONARIO
1. Por qu antes de una esterilizacin es necesario lavar y desinfectar el material?
2. Qu finalidad tiene el empacado antes de la esterilizacin?
3. Qu finalidad tienen los tapones de algodn que se colocan en los extremos de las pipetas y de los matraces Erlenmeyer?
4. Qu desventaja tiene el utilizar la esterilizacin por calor seco en este laboratorio?
5. Cmo acta la esterilizacin por calor seco en los microorganismos? 6. A que temperatura y cuanto tiempo tendrs que emplear para esterilizar por calor seco el material de laboratorio para asegurar la destruccin de microorganismos patgenos y esporas? 7. Qu tipo de material se puede esterilizar por calor seco y por qu? 8. Que tipo de material se puede esterilizar por calor hmedo?
9. A qu condiciones de temperatura y presin se destruyen todas las formas vegetativas? 10. A qu condiciones de temperatura y presin se destruyen las esporas?
11. Cules son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor seco?
12. Cules son las condiciones necesarias de tiempo y temperatura para esterilizar por calor hmedo?
13. Cmo acta la esterilizacin por calor seco en los microorganismos?
14. Cmo acta la esterilizacin por calor hmedo en los microorganismos?
15. Qu tipo de esterilizacin es ms recomendable y por qu?
CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
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BIBLIOGRAFIA
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Prctica 2 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIN

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el medio de cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Los medios de cultivo preparados pueden ser clasificados por su aspecto en: lquidos, semislidos y slidos. Por su uso se clasifican en : Medios de cultivos bsicos y medios de cultivos especiales (mejorados, selectivos, diferenciales y de transporte).
OBJETIVO
Al terminar la prctica el alumno debe estar capacitado en cmo y por qu se de debe esterilizar el material empleado en microbiologa, as como los nutrientes y las condiciones fsicas que se requieren para cultivar los microorganismos.
FUNDAMENTO
CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: Para el aislamiento, estudio y clasificacin de los microorganismos, es necesario utilizar un medio de cultivo en el que dispongan de las sustancias orgnicas e inorgnicas necesarias indispensables para el normal desarrollo de su metabolismo. En estos medios, los microorganismos adems de poder
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multiplicarse, pueden manifestar caractersticas de crecimiento y propiedades bioqumicas; aspectos de gran importancia para su clasificacin. Estos preparados estriles que poseen los elementos necesarios para el desarrollo de un microorganismo, se denominan medios de cultivos y pueden dividirse por su aspecto en: Medios lquidos. Se emplean fundamentalmente para:- cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la produccin de metabolitos especficos La multiplicacin bacteriana en los medios de cultivos lquidos se manifiesta generalmente por el enturbiamiento de ste;.estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen. E identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioqumicas. Medios semislidos.- Se utilizan para identificaciones bioqumicas y averiguar si el germen estudiado es mvil. Los medios semislidos tienen una consistencia blanda.
Medios slidos.- Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios slidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiologa. , En los medios de cultivos slidos la multiplicacin bacteriana se manifiesta por una formacin macroscpica denominada colonia bacteriana, que es el resultado de la multiplicacin de una sola clula bacteriana.
MATERIAL Y EQUIPO
1 Esptula o cuchara 1 Vaso de precipitado 1 Matraz Erlenmeyer de 250ml 4 Tubos de ensayo 4 Cajas de petri Agitador Probeta de 100 ml 1 Vidrio de reloj Mechero Autoclave u olla de presin Parrilla Balanza granataria
REACTIVOS
Agua destilada Agar nutritivo Agar papa-dextrosa Caldo nutritivo Caldo triptona
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO SLIDOS 1. Primeramente se desinfecta el rea de trabajo con fenol al 5% o alcohol 2. Leer las instrucciones del fabricante para cada medio de cultivo y pesar la cantidad necesaria segn el volumen requerido. 3. Colocar el medio en un vaso de precipitado que contenga el agua destilada en el volumen requerido, agitar y calentar a ebullicin para disolver el agar. En el ltimo paso se debe tener cuidado ya que el recipiente se calienta en exceso y el producto tiende a hervir y proyectarse, lo cual puede producir serias quemaduras. El agar disuelto hace transparente al medio que originalmente estaba turbio. Puede utilizarse un bao mara para aumentar la solubilidad. 4. Si se va a envasar en cajas de Petri, es necesario conservar el medio en un matraz y esterilizarlo a 121C durante 15 minutos. Al terminar, es conveniente mantener el mechero encendido para formar un rea de esterilidad al momento del vaciado en las cajas de Petri aproximadamente de 15 ml a 20 ml de agar por caja procurando que no se forman burbujas. Tapar la caja inmediatamente
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5. Si se desea que el agar quede en tubos, entonces se esterilizar el agar directamente en ellos a 121C durante 15 minutos tapados con algodn, gasa y papel estraza. Si desea que solidifiquen inclinados, colocarlos en una superficie lisa inclinndolos en un ngulo de 20a 30 sobre una varilla de vidrio. 6. Dejar solidificar a temperatura ambiente. Las cajas de Petri colocarlas dentro de bolsas y guardarlas en el refrigerador. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO LQUIDOS 1. Leer las instrucciones del fabricante y pesar la cantidad necesaria segn el volumen de medio de cultivo requerido. 2. Disolver el medio en agua destilada agitando el recipiente 3. Envasar el volumen necesario en matraces, tubos u otros recipientes. Procurar que el volumen del medio no rebase la mitad de la capacidad del recipiente, pues de otra manera el medio se puede regar 4. Tapar el recipiente con algodn, gasa y papel estraza. 5. Esterilizar en autoclave a 121durante 15 minutos, a menos que se indique otra cosa. 6. Antes de usar el medio de cultivo, se debe someter a una prueba de esterilidad, para lo cual se debe meter a una estufa a 37C durante 24 horas. El medio debe permanecer libre de crecimiento.
OBSERVACIONES
Dibuja todos los pasos realizados en la preparacin de los medios de cultivo.
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CUESTIONARIO
1. Qu es un medio de cultivo?
2. Qu es un cultivo de microorganismo?
3. Qu finalidad tiene utilizar medios de cultivo slidos?
4. Escribe el nombre de 5 medios de cultivo que pueden ser empleados en el laboratorio de microbiologa
5. Por qu la base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y peptona?
6. Escribe la composicin qumica de los siguientes medios de cultivo: Caldo nutritivo PDA YPD MRS SABORAUB
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CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFIA
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Prctica 3 SEMBRADO EN PLACA DE MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE INTRODUCCIN

La poblacin microbiana existente en nuestro entorno es grande y compleja. Cientos de especies microbianas habitan normalmente en distintas partes de nuestro cuerpo, incluidas la boca, el tracto intestinal y la piel. Al nacer, los microbios inmediatamente empiezan a colonizar nuestros cuerpos, as como a casi todos los objetos del mundo. Ellos flotan alrededor hasta que entran en contacto con una superficie que ofrezca comida y resguardo. Se encuentran ms frecuentemente en la oscuridad, en objetos hmedos que a menudo entran en contacto con la comida, la suciedad o la vegetacin. Las superficies del bao, los cepillos para el cabello, los refrigeradores, los lavaplatos y las tablas de cocina tienen a menudo muchos microbios. Las manijas y las paredes tienen menos porque son pobres en nutrientes y secos. Por eso, demostracin de microorganismos en el medio ambiente va estrechamente relacionada a los mtodos de esterilizacin y a las tcnicas necesarias para mantener libre de microorganismos un lugar determinado, a esta serie de tcnicas se le llama asepsia.
OBJETIVO
Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente, determinando las diferentes morfologas de colonias que se obtienen.
FUDAMENTO
Al multiplicarse los microorganismos, forman colonias que se hacen visibles a simple vista. Las colonias son de diferentes formas, tamaos, color, bordes, elevacin y superficie. FORMA: puntiforme, circular, rizoide, irregular y filamentosa. TAMAO: grande (ms de 3 Mm.), mediana (2-3 Mm.) y pequea (1-2 Mm.) COLOR: generalmente blancas a bige BORDE: entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado ELEVACIN: plana, elevada, convexa, pulvinada y umbonada
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SUPERFICIE: suave, brillante, rugosa, plegada, seca y polvorienta
MATERIAL Y EQUIPO
2 Cajas Petri con agar nutritivo 2 Cajas Petri con agar papadextrosa 2 Tubos de ensaye con caldo nutritivo estril Hisopos estriles Masking tape Marcador permanente Toallas de papel Mechero Incubadora
PROCEDIMIENTO
VACIADO EN CAJAS DE PETRI 1. Primeramente se desinfecta el rea de trabajo con fenol al 5% o alcohol y posteriormente se enciende el mechero 2. Retirar los medios de cultivo que ya estn preparados y esterilizados del refrigerador. Sin destaparlos, llevarlos a calentamiento en olla de presin a 121 C durante 5 min, hasta que los medios slidos se fundan y posteriormente enfriar hasta que alcancen una temperatura de 45C. 3. No destapar las cajas de Petri, sino hasta el momento que vayan a ser utilizadas. Es conveniente colocarse un cubre bocas la persona que va a realizar el vaciado y evitar hablar en todo momento para no contaminar el medio de cultivo. 4. Es conveniente mantener el mechero encendido y trabajar cerca del rea estril al momento del vaciado en las cajas de Petri. Levantar la tapadera de la caja Petri con la mano izquierda , sin soltarla y sin retirarla demasiado de la base de la misma caja mientras que con la mano derecha tomar el matraz que contiene el medio de cultivo y realizar el vaciado de aproximadamente 15 ml. A 20 ml de agar por caja procurando que no se forman burbujas, se procede a tapar la caja inmediatamente 5. Si se forman burbujas, tomar el mechero, flamear el medio de cultivo sobre la superficie de la caja de petri y de manera rpida.. Tapar la caja. 6. Esperar a que el medio solidifique, se rotulan los medios de cultivo, anotando la fecha y con iniciales el tipo de medio de cultivo. Si las placas no se van a utilizar el mismo da se sujetan con cinta y se colocan en el refrigerador de manera invertida para evitar que el vapor condensado caiga sobre el medio de cultivo y lo pueda contaminar 7. Cuando se vayan a utilizar los medios de cultivo preparados, ser necesario secar las placas invertidas en estufa a 37 C. Antes de realizar el sembrado de microorganismos. En esta actividad escogers un fomite (cualquier objeto inanimado que pueda causar enfermedad en los organismos por contener microorganismos como: la manija, el marco, el control remoto de la televisin, una moneda) y un lugar que del laboratorio o escuela. Este fomite ayudar a confirmar la
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presencia de microbios y los efectos de un desinfectante por medio del crecimiento de colonias de bacterias en un medio de cultivo en cajas de Petri. 1. Lava tus manos y limpia t rea de trabajo frotando suavemente, con la solucin desinfectante en una toalla de papel. Saca tus cajas de Petri pero no abras las cajas hasta que se te indique. 2. Escoge un objeto del saln de laboratorio (la manija, el marco, el control remoto de la televisin, una moneda, etc.). Toma una caja de Petri sin abrir y con t lpiz de cera o marcador, divide la base de la caja en cuatro secciones iguales. Escribe el nombre del objeto al otro lado y designa las secciones de 1 hasta 4. Abre el frasco con hisopos de algodn y escoge uno con cuidado para no tocar la punta. Limpia tu objeto escogido con todos los lados de la punta del hisopo voltendolo y retorciendo el hisopo a medida que lo mueves por la superficie del objeto. 3. Ahora abre la tapa de la caja y suavemente haz cuatro siembras sobre la superficie de la caja como se muestra en la ilustracin, empezando en la seccin designada "1" y continuando en el orden de las secciones, de manera que la ltima siembra est en la seccin 4. Presiona firme pero suavemente y no retias las siembras anteriores. Tus siembras slo deben dejar una impresin muy ligera en el Agar. Cierra la caja y sllala con dos pedazos de cinta. No cubras la caja con cinta o no podrs verla bien. 4. Repite el paso nmero 2, pero esta vez sumerge la punta del hisopo en los tubos de caldo nutritivo estriles. 5. Esteriliza los hisopos usados con desinfectante y descrtalos. 6. La segunda caja de Petri, colcala en el sitio que hayas seleccionado y exponla al aire por 30 minutos, cierre la caja despus de este tiempo y sllala con dos pedazos de cinta. 7. Pon las cajas a incubar a la temperatura de 37 C durante 24 a 48 horas. Limpia tu rea de trabajo con la solucin desinfectante y lava tus manos. 8. Repite todo el experimento utilizando cajas de cultivo con agar papa-dextrosa slo que ahora selecciona otro fomite que no hayas empleado. 9. Despus de que hayan pasado dos das, observa las cajas de Petri, sin abrirlas.
OBSERVACIONES
Dibuje y describa sus observaciones tanto de la caja como del tubo. AGAR NUTRITIVO Muestra:___________________________ Lugar:__________________________
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AGAR PAPA-DEXTROSA Muestra:___________________________ Lugar:__________________________
Muestra:______________________
CALDO NUTRITIVO Muestra:______________________
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CUESTIONARIO
1. Dibuja las formas de las colonias en la siguiente tabla:
Forma
Puntiforme
Borde
Entero
Elevacin
Plana
Circular
Ondulado
Elevada
Fusiforme
Lobulado
Convexa
Rizoide
Filamentoso
Pulvinada
Irregular
Crenado
Umbonada
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Filamentosa
Ondeado
Qu tipo de tcnica empleaste para la siembra de microorganismos?
Cmo podemos controlar la contaminacin microbiana?
4. Qu tipo de microorganismos podemos encontrar en el ambiente?
5. Cul es la importancia de trabajar en condiciones aspticas?
6. Qu es un fomite y en donde los podemos encontrar?
7. Por qu se utilizaron dos tipos de medio de cultivo? Cul es la diferencia entre ellos?
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CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
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BIBLIOGRAFIA
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Prctica 4 METODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE CULTIVOS PUROS INTRODUCCION

En general, en microbiologa se trabaja con cultivos puros de microorganismos. Un cultivo puro es aqul en que todas las clulas provienen de una sola clula inicial. Una colonia de cualquier microorganismo es un cultivo puro, ya que todas sus clulas proceden de una inicial; por lo tanto, cuando se desea aislar un microorganismo de una muestra cualquiera, es preciso ver colonias del mismo, lo que implica que el aislamiento ha de realizarse en medio slido en placa. Los pasos de un proceso de aislamiento de una especie microbiana se pueden resumir en los siguientes: 1. Siembra en placa de la muestra de partida. 2. Tomar una colonia de la placa una vez incubada, resuspenderla en agua estril y sembrar una segunda placa, en la que todas las colonias que crezcan deben ser idnticas. 3. A partir de la segunda placa se puede resuspender una de las colonias en medio lquido, consiguindose ya un cultivo puro. Para la conservacin de los cultivos puros de un microorganismo existen diversos mtodos, el ms simple es la resiembra peridica en tubos inclinados que se mantienen normalmente refrigerados, durante 3-6 meses o en la preservacin de cultivos con una capa de aceite mineral.
OBJETIVO
Al terminar la prctica el alumno sabr obtener cultivos de microorganismos puros empleando diferentes tcnicas de siembra.
FUNDAMENTO
Uno de los problemas ms frecuentes en microbiologa es el aislamiento de un cultivo puro de una especie bacteriana dada. A pesar de que es muy difcil aislar una sola clula, existen tcnicas capaces de aproximar este ideal. Todas las manipulaciones deben ser llevadas a cabo de modo que se impida cualquier tipo de contaminacin en el rea de trabajo. Los procedimientos utilizados par conseguirlo se conocen con el nombre de tcnica asptica, y se citan a continuacin: Las asas deben esterilizarse antes de utilizarlas y enfriarse sobre el agar o el material de vidrio (en zonas estriles) antes de tomar la muestra de microorganismos, con objeto de no destruirlos por calor. Despus de utilizarlas, las asas se vuelven a esterilizar. Las bocas de los tubos y matraces de vidrio se flamean ligeramente una vez destapadas, y despus de la inoculacin. Durante la inoculacin, los tapones se mantienen en la mano sujetndolos por la parte que no entra en contacto con tubos y matraces. Los tubos abiertos deben mantenerse en posicin inclinada para que el riesgo de contaminacin sea mnimo. Las tapas de las placas Petri no deben colocarse nunca sobre la mesa de trabajo.
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Tcnicas de siembra La siembra de microorganismos puede realizarse en medios lquidos o en medios slidos. En el primer caso, para la inoculacin se utilizar asa estril si el medio de partida es slido, o pipeta estril (Pasteur o graduada) si es lquido. En el segundo caso, cuando se parte de otro medio slido, se utiliza el asa de platino normal para siembra en placa o tubo inclinado y el asa recta para siembra en picadura en tubos rectos o, en general, cuando se quiere introducir el microorganismo en el seno del medio de cultivo slido; cuando el medio de partida es lquido, se puede pasar al medio slido con un asa de platino calibrada, con la que se extiende la muestra directamente, o con pipeta (Pasteur o graduada), depositando la muestra que luego se extender sobre la placa con un asa con una varilla doblada. Aislamiento de un cultivo puro: Existe una gran variedad por las cuales las diferentes especies microbianas pueden ser aisladas ya sea en su entorno natural o de un cultivo mixto para ser desarrolladas como cultivo puro. Una de las tcnicas ms comnmente empleadas para lograr un cultivo puro es el mtodo llamado siembra en estra, ste se logra tomando una pequea cantidad de material microbiano con el asa y luego se desliza muy suavemente sobre la caja Petri, rayando tanta superficie como sea posible. Esto permite que las bacterias, al desprenderse del asa, queden espaciadas individualmente. Se da por hecho que cada clula individual da origen a una colonia. La tcnica de sembrado por estra tiene numerosas variantes pero el mismo fundamento. Hay que tener en cuenta que los microorganismos no se encuentran enterrados en el agar, por lo que cuando se saca una muestra de cultivo o se siembre no se debe enterrar el asa en el agar. La creencia de que para que la siembra sea exitosa tomando gran cantidad de material de cultivo es errnea, pues una colonia de bacterias del tamao de una cabeza de alfiler puede contener varios millones de microorganismos. Otra tcnica es la llamada de placa vertida o por dilucin. Se basa en hacer diluciones a partir de una suspensin original de microorganismos y transferirla con una asada, en primer trmino, aun tubo con agar estril (fundido y enfriado) y de ste a un segundo tubo (tambin con agar estril fundido y enfriado). Cada tubo as sembrado individualmente se vertern dentro de cajas Petri estriles. Se espera que una vez incubadas las cajas Aun cuando en la mayora de los mtodos de conservacin de cultivos se necesiten condiciones especiales para preservarlos, los mtodos ms sencillo empleados son aquellos se basan en la resiembra peridica a medios frescos o en la preservacin de cultivos con una capa de aceite mineral.
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MATERIAL Y EQUIPO
5 Tubos de ensaye con 9 ml de agua peptonada 2 Pipetas de 1 ml estril 6 Cajas Petri estril 4 Cajas Petri estriles con agar nutritivo 1 Tubos de ensaye inclinados con agar nutritivo 1 Tubos de ensaye con agar nutritivo Asa bacteriolgica Varilla de vidrio L Frasco con agua peptonada estril Autoclave Estufa de incubacin Mechero
REACTIVOS
Alimento contaminado Agar nutritivo Agar papa-dextrosa Peptona de casena Cloruro de sodio 1 litro de Agua destilada Solucin de NaOH
PROCEDIMIENTO
1. Llenar los 5 tubos de ensaye con 9 ml de agua peptona. 2. Llenar hasta la mitad el frasco con agua peptonada. 3. Esterilizar antes del da de la prctica. VERTIDO EN PLACA Y ESTENSIN EN SUPERFICIE 1. En condiciones aspticas coloca una porcin de la muestra en el frasco con agua estril temperatura ambiente. 2. Homogeniza y toma una muestra para hacer diluciones decimales hasta 10 -5. Reserve la muestra para la siguiente tcnica. 3. Slo vas a necesitar las ltimas dos diluciones es decir: 10-4 , 10 5 las dems se desecharn. 4. Rotula 4 cajas de Petri (2 cajas estriles y vacas y 2 cajas con agar nutritivo) con el nombre del medio de cultivo agar nutritivo en una anota la dilucin 10-4, y en la otra anota la dilucin 10-5 5. Cuando hayas terminado de hacer la dilucin 10-4 toma un ml para la realizar la dilucin 10-5, adiciona 1 ml en la caja vaca para sembrar por vertido en placa y 0.1ml en la caja con medio de cultivo para la siembra por extensin en superficie. 6. Para la siembra en vertido en placa: flamear la boca del matraz con cultivo estril y verter sobre la caja petri con la muestra, rotar la caja para su distribucin. 7. Para la siembra por extensin en superficie: Vierte una o dos gotas de alcohol al 70% sobre el brazo ms corto de la varilla de vidrio y con el mechero enciende el alcohol que se encuentra en la varilla . Permite que arda hasta que se queme todo el alcohol. Deja que la varilla de vidrio se enfre por un minuto. Utiliza el brazo corto de la varilla para dispersar uniformemente la gota de cada dilucin girando la varilla. 8. Incubar las cajas invertidas 24-48 horas a 37 C.
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9. Hacer observaciones y mostrar las cajas al profesor AISLAMIENTO POR ESTRIAS 1. Esterilizar el asa a la flama y dejar que enfre, introducir al frasco con la muestra para tomar una asada. 2. Cuidadosamente y sin volver a tomar inculo, sembrar las dos cajas Petri restante con agar nutritivo procurando hacer una estra, en ambos medios de cultivo. 3. Incubar 24 horas a 37 C. 4. Hacer observaciones indicando las colonias aisladas. CONSERVACION DE CULTIVOS 1. Seleccionar una colonia que se encuentre perfectamente aislada y sembrar por estra el tubo inclinado con agar nutritivo. 2. Enderezar el asa y sembrar por puncin el tubo restante. 5. Incubar 24 horas a 37 C. 3. Hacer observaciones 4. Guardar en refrigeracin ambos tubos de ensaye PRECAUCIONES 1. Quemar el asa 2. Quitar el tapn de algodn con el meique y la palma de la mano y flamear la boca del tubo 3. Tomar inculo 4. Sembrar 5. Quemar la boca del tubo y poner el algodn 6. No enterrar el asa en el medio 7. Tomar una cantidad muy pequea del inculo (una colonia) 8. Asa al rojo y enfriar 10-15 seg 9. Flamear la boca de los tubos antes y despus de usar 10. Incubar la caja invertida
OBSERVACIONES
Muestra:_______________________________
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Esquematice los pasos para realizar la siembra por vertido en placa
Dibuje las colonias observadas mediante esta tcnica: Dilucin 10-4 Dilucin 10-5
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Esquematice los pasos para realizar la siembra de extensin en superficie
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Esquematice los pasos para realizar la siembra por estra
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CUESTIONARIO
1. Resuma en un cuadro los mtodos que existen para aislar los cultivos puros
2. Porqu se recomienda enfriar el asa de platino en el medio de cultivo ya preparado antes de realiza el sembrado por estras de los microorganismos?
3. Qu mtodo de preservacin de microorganismos son comnmente empleados?
4. De qu manera puede aislarse un solo microorganismo?
5. Con qu tipo de siembra se pudo aislar mejor los microorganismos? Por qu?
6. En cul caja crecieron ms y ms grandes las colonias?
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CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFIA
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
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Prctica 5 MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y DIFERENCIALES INTRODUCCIN

Un estudio adecuado de microorganismos que hay en los diferentes hbitats requiere tcnicas que permitan conocer y ordenar la compleja poblacin mixta o cultivo mixto, separndole en sus distintas especies como cultivos puros. Un cultivo puro consta de una poblacin de clulas derivadas todas ellas de una clula parental. Los microorganismos se cultivan en el laboratorio sobre materiales nutritivos denominados medios. Se dispone de una gran cantidad de medios y la clase que se debe de utilizar depende de muchos factores, uno de los cuales es la clase de microorganismos que se va a cultivar. El material que se inocula sobre el medio se denomina inculo mediante alguna tcnica (siembra por estra en placa o siembra en masa en placa). Durante la incubacin a 37:C , las clulas microbianas individuales se reproducen tan rpidamente que en un lapso de 18 a 24 horas producen masas visibles de clulas denominadas colonias. Una colonia es visible a simple vista. Cada colonia diferente es presumiblemente un cultivo puro de una sola clase de microorganismo. Si dos clulas microbianas procedentes del inculo original quedan muy cerca una de otra sobre el medio de agar, la masa de clulas observables no ser un cultivo puro.
OBJETIVO
Que el alumno compruebe experimentalmente cual es un medio selectivo y cual uno diferencial.
FUNDAMENTO
Los medios de cultivo segn su uso se pueden clasificar como a continuacin se mencionan. Medios de cultivos bsicos. Se caracterizan por ser pobres en material nutritivo, de manera que su uso es muy restringido, constituyen la base para la preparacin de otros medios. Como ejemplo el caldo peptonado y el agar-agar corriente. Medios de cultivos especiales. Entre estos se encuentran: a) Medios mejorados. En general son los mismos medios bsicos a los que se les agrega una sustancia enriquecedora como sangre, suero, etc. El uso de estos medios es universal y est orientado especialmente a obtener buen desarrollo de cualquier tipo de bacteria, se utilizan en primera instancia en el aislamiento bacteriano, ya sea a partir de otros cultivos o de productos patolgicos. Los medios de este tipo de uso ms frecuente son: agar tripticasa-sangre, caldo tripticasa, agar chocolate, medio de Mueller-Hinton. b) Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden o limitan el crecimiento de algunas especies microbianas y permiten el desarrollo de otras. Consiste en aislar un microorganismo de un sustrato que contiene numerosas otras especies. Se incluyen en este grupo el agar cristal violeta para el aislamiento de bacterias Gram(-) y el agar telurito de potasio para el aislamiento de bacterias Gram(+). c) Medios de cultivos diferenciales . Se emplean para demostrar alguna propiedad bioqumica de la bacteria como degradacin de hidratos de carbono, protenas, hidrlisis de la urea, etc., contienen
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indicadores de cido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de las colonias el estudio en estos medios debe realizarse empleando cepas bacterianas puras. Existen numerosos medios de este tipo, de uso preferencial en la bioidentificacin de bacilos Gram(-) ya que ellos no tienen caractersticas muy distintivas en las colonias o cultivos en general. Entre los de uso ms corriente se encuentran: Agar fierro-triple-azcar (TSI) agar medio de SIM, Caldo glucosado fosfatado, Voges-Proskauer o del rojo de metilo, Medio agar-citrato de sodio (Medio de Simmons) d) Medios de transporte. Sirven para transportar los especimenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporcin original de la flora microbiana en los especimenes.
MATERIAL Y EQUIPO
4 Cajas Petri Asa de platino Mechero Incubadora
MATERIAL BIOLOGICO
Cultivo de E. Coli Cultivo de Staphylococcus aureus Cultivo de Salmonella sp. Cultivo de Lactobacillus sp
REACTIVOS
Agar Salmonella-Shigella Agar eosina y azul de metileno Agar verde brillante Agar bilis y rojo violeta
PROCEDIMIENTO
1. Divida cada caja en cuatro sectores y marque la caja Petri con el nombre de los microorganismos que va a sembrar 2. Con el asa de platino, siembre por estras un sector de cada caja con el microorganismo correspondiente. 3. Deje un sector sin sembrar para que sea su testigo 4. Invierta las cajas petri, incbelas por 24-48 horas. Precauciones.- Utilice muy poco material bacteriano, con el fin de lograr colonias aisladas. Procure realizar siembras en zona estril, cerca del mechero con asa estril (esperar 15 segundos despus de quemada el asa). Procurar al sembrar no invadir otro sector.
Medio de cultivo Escherichia coli Otras coliformes
Agar EMB Colonias oscuras brillo metlico
Agar S-S con Colonias rojas
Verde brillante Colonias verdes
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Salmonella Shigella Proteus Pseudomonas
Colonias blancas
Colonias blancas
Colonias rojas
OBSERVACIONES
MEDIO DE CULTIVO:____________________ MEDIO DE CULTIVO:____________________ 1 1
1.
1.
2.
2.
3.
3.
4.
4.
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MEDIO DE CULTIVO:____________________ MEDIO DE CULTIVO:____________________ 1 1
1.
1.
2.
2.
3.
3.
4.
4.
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CUESTIONARIO
1. Escribe dos ejemplos de medios selectivos encontrados en el laboratorio en donde puedan desarrollarse los microorganismos
2. Se pueden considerar como sintticos los medios selectivos y diferenciales? Fundamente su respuesta.
3. Las diferencias que se presentan entre las colonias en un medio diferencial, bsicamente a qu se deben?
4. Cmo identifica cuando un medio acta como diferencial?
5. De los medios de cultivo que utiliz Cules son diferenciales y cules selectivos?
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CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFIA
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
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Prctica 6 MANEJO Y USO DEL MICROSCPIO PTICO COMPUESTO INTRODUCCION.

El microscopio es el instrumento ms frecuentemente utilizado y el ms til en un laboratorio de microbiologa, proporciona la amplificacin o agrandamiento que nos permite ver organismos y estructuras invisibles a simple vista. Los microscopios permiten una amplia gama de amplificaciones, desde cien veces a cientos miles de veces. Las dos categoras de microscopios disponibles son los microscopios pticos y los microscopios electrnicos. Los microscopios pticos utilizan un sistema de lentes pticas y comprenden los microscopios de campo claro, campo oscuro, fluorescencia y contraste de fases. Los microscopios electrnicos emplean haces de electrones en lugar de ondas de luz para producir una imagen ampliada.
OBJETIVO
El alumno reconocer el microscopio compuesto, identificar cada una de sus partes y lo manejar correctamente observando la presencia de microorganismos en muestras biolgicas
FUNDAMENTO
La gota pendiente o las preparaciones hmedas permiten examinar organismos vivos suspendidos en un fluido. Las preparaciones hmedas se hacen colocando una gota del fluido que contiene el organismo sobre una lmina de vidrio y cubrindola con una fina pieza de vidrio (cubreobjetos): para reducir la tasa de evaporacin y eliminar corrientes de aire, generalmente se rodea la gota con vaselina. Cuando se examinan las preparaciones hmedas por microscopa de campo claro, es importante ajustar la fuente de luz de forma adecuada. Es posible disminuir la intensidad de la luz mediante la utilizacin de filtros especiales. Las formas de las bacterias pueden ser esfricas (cocos), cilndrica (bacilos), de comas (vibrios) o helicoidal (espirilos). La forma de las bacterias viene determinada principalmente por la estructura de su pared celular y es una de las caractersticas que sirven para identificarlas. Las bacterias pueden presentarse como clulas aisladas o formando grupos. Esta caracterstica es tambin importante para poder identificarlas. En algunos casos la aparicin de las bacterias formando agrupaciones no es una caracterstica de estas in vivo sino un efecto de ciertas tcnicas de tincin (como en el caso del gnero Staphylococcus que aparece formando racimos slo en preparaciones fijas y teidas; pero no en muestras vivas.
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MATERIAL Y EQUIPO
1 Esptula o cuchara 1 Vaso de precipitado o frasco 1 Pipeta pasteur 1 Portaobjetos 1 Cubreobjetos
MATERIAL BIOLOGICO
Muestra de alimento o agua descompuesta Sarro dental
REACTIVOS
Sol. salina. NaCl al 0.85% Azul de metileno Agua Alcohol 96% Xilol
METODOLOGIA
TECNICAS DE MONTAJE HMEDO (PREPARACIONES HUMEDAS) Utilizada para estudiar la movilidad de las bacterias 1. En el centro de un portaobjetos coloca una gota de solucin salina 2. Toma de muestra: a) Con un hisopo toma muestra de sarro dental de un compaero que no se haya lavado los dientes y colcala en la solucin salina mezclando cuidadosamente. b) Tomar con la cuchara una pequea muestra del alimento o de agua contaminada y colocarla en un vaso de precipitado con solucin salina. Con una pipeta Pasteur tomar una gota de la muestra diluida y colocarla en el centro del portaobjetos. 3. Cubrir la gota con el cubreobjetos, con cuidado de no dejar gotas de aire. 4. Examinar con objetivos de 10X y 40X. TECNICA DE PREPARACIONES SECAS (FROTIS) 1. Tome una gota de la solucin salina con la muestra alimenticia y siguiendo la tcnica asptica con un asa bacteriolgica extindala sobre un portaobjeto, agrguele una gota de azul de metileno y deje secar al aire. 2. Ponga una gota de aceite de inmersin y observe la muestra con el objetivo 100X. MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO PTICO 1. Colocar el objetivo de menor aumento en posicin de empleo y bajar la platina completamente. Si el microscopio se recogi correctamente en el uso anterior, ya debera estar en esas condiciones. 2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 3. Comenzar la observacin con el objetivo de 10x (ya est en posicin) o colocar el de 40 aumentos (40x) si la preparacin es de bacterias.
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Para realizar el enfoque: 4. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. Mirando, ahora s, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el macromtrico y, cuando se observe algo ntida la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino. 5. Pasar al siguiente objetivo. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca distancia de la preparacin y por ello es fcil que ocurran dos tipos de percances: incrustarlo en la preparacin si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con aceite de inmersin si se observa una preparacin que ya se enfoc con el objetivo de inmersin. 6. Empleo del objetivo de inmersin: 7. Bajar totalmente la platina. 8. Subir totalmente el condensador para ver claramente el crculo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habr que echar el aceite. 9. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre ste y el de x40. 10. Colocar una gota mnima de aceite de inmersin sobre el crculo de luz. 11. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de inmersin. 12. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente. 13. Enfocar cuidadosamente con el micromtrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de inmersin y la preparacin es mnima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de accidente es muy grande. 14. Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3. 15. Una vez finalizada la observacin de la preparacin se baja la platina y se coloca el objetivo de menor aumento girando el revlver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. 16. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo 40x est perfectamente limpio. LAVADO DE PREPARACIONES DE DESECHO 1. 2. Prepare la siguiente solucin: Agua de la llave, alcohol al 96% y xilol (1:1:1) Colocar los portaobjetos, cubreobjetos, pipetas, tubos de ensayo y cajas de Petri en esta mezcla durante 24 horas 3. Despus se lava con agua destilada y por ltimo se pueden mantener por tiempo indefinido en un recipiente con alcohol al 70 % o 96% 4. Puede proceder a secar el material en horno para llevarlo a esterilizar
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MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES a. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en posicin de observacin, asegurarse de que la parte mecnica de la platina no sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda. b. Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va a usar de forma prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del polvo. c. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de ptica. d. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se est utilizando el microscopio. e. Despus de utilizar el objetivo de inmersin, hay que limpiar el aceite que queda en el objetivo con pauelos especiales para ptica o con papel de filtro (menos recomendable). En cualquier caso se pasar el papel por la lente en un solo sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo, hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso se pueden daar las lentes y su sujecin. f. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macromtrico, micromtrico, platina, revlver y condensador). g. El cambio de objetivo se hace girando el revlver y dirigiendo siempre la mirada a la preparacin para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de objetivo agarrndolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se est observando a travs del ocular. h. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algn lquido, secarlo con un pao. Si se mancha de aceite, limpiarla con un pao humedecido en xilol. i. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesin prctica y, al acabar el curso, encargar a un tcnico un ajuste y revisin general de los mismos.
OBSERVACIONES Haga los dibujos en color tanto del montaje hmedo como del frotis de las observaciones realizadas, explicando o describiendo lo que apreci.
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Sarro Dental
10X
40X
100X
Muestra:_______________
10X
40X
100X
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CUESTIONARIO
1. Qu es poder de resolucin?
2.
Menciona el nombre que reciben los lentes objetivos 10X, 40X Y 100X
3.
Cul es la diferencia entre la movilidad verdadera y el movimiento Browniano?
4.
Qu tipo de microorganismos pudiste observar en las muestras que se estudiaron?
5.
Escribe las partes del microscopio que forman parte del a) sistema de soporte, b) sistema de ajuste, c) sistema ptico y d) sistema de iluminacin.
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6.
Escribe el nombre de cada una de las partes del microscopio compuesto
CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFIA
__________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ Practica 7
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MORFOLOGIA BACTERIANA Y TINCIN DE GRAM

INTRODUCCION
Tincin empleada en microbiologa para la visualizacin de bacterias en muestras clnicas y como primer paso en la diferenciacin bacteriana. El examen con microscopio ptico de preparacin con tincin de Gram se emplea de rutina para determinar la forma de las bacterias. Las bacterias pueden diferenciarse con esta tincin en dos grupos. Los microorganismos Gram. positivos se tien de azul, mientras que aproximadamente un tercio de los cocos, la mitad de los bacilos y todos los organismos espirilos se tien de rojo y se dice que son Gram negativos. Las aplicaciones ms comunes de la coloracin de Gram son las siguientes: La presencia de cocos G(+) agrupados sugiere estafilococos; en cadenas sugiere estreptococos; en forma de lanceta a los diplococos La presencia de diplococos G(-) son caractersticas de especies de Neisseria Los bacilos G(+) grandes sugieren especies de Bacillus o Clostridium, los bacilos G(+) pequeos sugieren especies de Listeria o una de las corineiformes Los bacilos G(-) son las bacterias mas comunes halladas en los laboratorios clnicos e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentadores y especies de Haemophilus. El valor diagnstico de esta tincin es variable; normalmente permite una buena orientacin al microbilogo para seleccionar las tcnicas de cultivo ms adecuadas y tambin tiene valor en orientar hacia un diagnstico etiolgico, en especial para instaurar un tratamiento inicial.
OBJETIVO
El alumno aplicar una tcnica de coloracin diferencial para la identificacin de bacterias Gram positivas y Gram negativas, adems sabr distinguir las diferentes formas y estructuras bacterianas.
FUNDAMENTO
Estructuras bacterianas La clula bacteriana presenta estructuras definidas tanto dentro como fuera de su pared celular, algunas estructuras solo la presentan algunas especies, otras son mas caractersticas de otras especies, no obstante, estructuras tales como la pared celular y el citoplasma, son por naturaleza comunes a casi todas las bacterias. PRINCIPALES ESTRUCTURAS INTERNAS Citoplasma. Material celular contenido dentro de la membrana citoplasmtica Material celular. Informacin gentica de la clula (DNA, cromosomas bacterianos) Plsmidos. Macromolculas circulares de DNA que complementa la informacin gentica esencial del cromosoma. Ribosomas. Partculas de protena-RNA Grnulos. Depsitos de concentrados de ciertas sustancias, como grnulos de almidn. Mesosomas. Infusiones membranosas y sistemas de membranas
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Endosporas. Cuerpo resistente de sobrevivencia que se forma dentro de la bacteria. PRINCIPALES ESTRUCTURAS EXTERNAS Pared celular. Membrana celular de gran rigidez que le confiere su forma caracterstica a la bacteria. Flagelos o cilios. Apndice flexible, largos y delgados libres por un extremo y unidos a la pared celular por el otro. Fimbrias, vellos o pelos. Apndices filamentosos diferentes de los flagelos. Cpsulas y capas mucoides o mucilaginosas. Envoltura gelatinosa o capa limosa que envuelve la pared celular. Pednculos. En las bacterias deslizantes, son agrupaciones de clulas formando montculo de forma caracterstica. TINCIN DE GRAM Los fundamentos de la tcnica de tincin de Gram se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias. La pared celular de las bacterias Gram-positivas posee una gruesa capa de pptidoglicano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglicano (tambin conocido como murena) Por el contrario, la capa de peptidoglicano de las Gram-negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram-positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram-negativas La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram-negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram-positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.
MATERIAL Y EQUIPO
MATERIAL
REACTIVOS
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BIOLOGICO
1 Portaobjetos Asa bacteriolgica Piseta Mechero Puente de coloracin Pipeta 1 ml Portaobjetos Microscopio Cronmetro Cultivo de E. Coli Cultivo de Staphylococcus aureus Cultivo de Lactobacillus ssp a) Cristal violeta b) Bicarbonato de sodio al 5% c) Lugol d) Alcoho-acetona e) Safranina f) Aceite de inmersin g) Agua destilada
PROCEDIMIENTO
REALIZACIN DEL FROTIS A) Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima gota de agua, que resulta suficiente. B) Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una pequea cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua. Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado. Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre el portaobjetos. C) Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaucin de no calentar demasiado el porta pues las clulas pueden deformarse o romperse. TINCIN DE GRAM 1. Hacer un frotis del cultivo problema, en un portaobjetos limpio y fijarlo con calor. 2. Cubrir la preparacin con el colorante cristal violeta, ms dos gotas de bicarbonato de sodio al 5% de 30 segundos a1 minuto 3. Lavar con agua corriente, escurrir, secar al aire. 4. Adicionar la solucin mordiente de yodo-ioduro (lugol) por espacio de 1 minuto 5. Escurrir el colorante, lavar, secar al aire. 6. Decolorar con alcohol-acetona por espacio de 30 segundos. 7. Agregar safranina por espacio de 30 segundos. 8. Lavar y secar al aire. Examinar al microscopio con aceite de inmersin y fijndose sobre todo en el color de cada preparacin.
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INTERPRETACIN Clulas violetas: Gram positivas (+) Clulas rojas: Gram negativas (-) PRECAUCIONES El mtodo en general es sencillo pero muy engaoso, ya que al aplicar el mtodo de tincin de GRAM se pueden cometer errores que hacen variar el resultado inicial y consecuentemente la interpretacin errnea al observar la preparacin al microscopio. Estos errores son con frecuencia: 1. 2. 3. 4. 5. La falla de fijacin por calor del frotis pueden ocasionar que al lavar la preparacin con agua corriente, sta arrastre las bacterias. El lavado excesivo con agua corriente puede afectar, eliminando el colorante o el complejo yodocolorante La aplicacin del agente decolorante es la fase ms crtica; si el decolorante se deja actuar mucho tiempo, la clula bacteriana dejar escapar por completo el colorante primario. La aplicacin del colorante de contraste debe de hacerse con minucioso cuidado, ya que si se deja demasiado tiempo de exposicin sustituir al colorante primario en los organismos Gram positivos. La edad del cultivo tambin es determinante en el resultado final de la tincin de Gram. La tincin de Gram es vlida cuando se realiza a partir de cultivos jvenes) de 18-24h de incubacin
OBSERVACIONES
Dibuje los pasos para realizar las tinciones de Gram .
Dibuje lo que observ al microscopio y describa los dibujos.
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Muestra:
Muestra:
Muestra:
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CUESTIONARIO
1. Qu es un frotis?
2. Con qu finalidad se fija la muestra de microorganismos en el porta objetos?
3. Qu importancia tiene teir las muestras bacterianas?
4. Porque es necesario emplear aceite de inmersin para la observacin de los microorganismos?
5. De los reactivos que utilizaste para la tincin de Gram, cul es el que funciona como colorante primario?
6. Qu funcin tiene el yodo en la tincin de Gram?
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7. Menciona tres bacterias que tien Gram positivas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas
8. Menciona tres bacterias que tien Gram negativas y escribe la enfermedad que causa cada una de ellas
CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
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BIBLIOGRAFIA
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Prctica 8 TINCIN DE ESTRUCTURAS BACTERIANAS

INTRODUCCIN En la microbiologa el examen microscpico es generalmente el primer paso que se da para la identificacin de un organismo desconocido; pero el tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resulta difcil ver con el microscopio ptico, principalmente por la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea. Se ha hablado de preparaciones de bacterias vivas, no coloreadas, que no permiten observar la movilidad, pero que sobre otros hechos morfolgicos de importancia como tamao, formas, agrupacin de las clulas, posesin de estructuras especiales, como endosporas, flagelos, cpsulas y grnulos intracelulares, no arroja resultados importantes. La forma ms simple de aumentar el contraste entre las clulas y el medio que las rodea es por medio de la utilizacin de colorantes, de acuerdo con su morfologa y las reacciones tintoriales de un organismo se pueden ver los grupos en los que estn clasificadas las bacterias. COLORANES Y MTODOS DE TINCIN Los colorantes estn compuestos por grupos cromforos y auxcromos. Un cromforo es todo grupo qumico que da un color especfico a un compuesto ligado a un grupo auxcromo para formar un tinte y un grupo auxcromo es el grupo qumico que suministra la propiedad de formar sales y transfiere el color de un tinte a una sustancia o material sobre el cual acta. De acuerdo al tipo de auxcromo, los colorantes se clasifican en: Catinicos (Bsicos). Por ejemplo, azul de metileno, cristal violeta y safranina. Aninicos (cidos). Por ejemplo, rojo congo, fucsina cida y eosina. Neutros. Por ejemplo, eosinato de azul de metileno. Las coloraciones pueden ser positivas o negativas segn sea el lugar donde acta el colorante: Coloraciones positivas (+). Son aquellas que tien directamente a la muestra. Coloraciones negativas (-). Son aquellas que tien el medio y no a la muestra, sta se ve por contraste. Mtodos de tincin: Tincin simple.- Es la aplicacin de una solucin colorante simple en preparaciones fijas y teidas. Tinciones directas o positivas.- Procedimientos ms elaborados donde se utilizan ms de un colorante. a) Tinciones diferenciales. Por ejemplo, tincin de Gram, tincin de Ziehl Neelsen. b) Tinciones selectivas. Por ejemplo, tincin de cpsulas, endosporas, flagelos, grnulos metacromticos, citoplasma, etc. Tinciones indirectas o negativas.- Soluciones que tien el medio y no al microorganismo, los cuuales se ven por contraste. Por ejemplo, tincin negativa de cpsulas, tincin negativa de espiroquetas.
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TINCIN DE LA CPSULA BACTERIANA INTRODUCCION

La cpsula bacteriana es una capa de material viscoso o mucoide. El tamao de estas cpsulas est influenciado por el medio en el que crece la bacteria. En algunos casos el grosor de la cpsula es slo una fraccin del dimetro de la clula, en otros casos la cpsula es mucho mayor que la clula. Las cpsulas bacterianas son importantes tanto para la bacteria como para otros organismos. A las bacterias les proporcionan una cubierta protectora y adems sirven de reservorio de alimento almacenado. Tienen Propiedad Antifagocitaria: Dificulta o impide la fagocitosis, lo cual potencia su virulencia ya que favorece la multiplicacin y facilita la invasin. Brinda proteccin frente a Fagos: Dificulta la fijacin de bacterifagos e impide el pasaje que puedan afectar a la bacteria Las cpsulas de ciertas bacterias productoras de enfermedades aumentan la capacidad infectiva de las bacterias. Si la bacteria pierde totalmente su cpsula, puede perder su virulencia y por lo tanto su capacidad de producir enfermedad Algunos ejemplos de bacterias productoras de cpsulas son: Neumococcus, Klebsiella, aunque tambin puede estar presente en bacterias Gram positivas y Gram negativas Las cpsulas tiene diversas propiedades como: Induce la produccin de anticuerpos protectores (esto es til en la produccin de algunas vacunas) y permite la diferenciacin de tipos serolgicos dentro de la misma especie por aglutinacin con sueros
OBJETIVO
El alumno aprender diversas tcnicas para la tincin de la cpsula bacteriana en distintos cultivos bacteriolgicos.
MATERIAL Y EQUIPO
Portaobjetos Cubreobjetos Asa bacteriolgica Piseta Mechero Puente de coloracin Microscopio Cronmetro
Cultivo de 24 h de Staphylococcus aureus en manitol sal agar. Cultivo de 24 h de Escherichia coli caldo E. coli.
MATERIAL BIOLOGICO
REACTIVOS
Aceite de inmersin Rojo congo Mordente de cpsula Tinta china (Todos en frascos con gotero)
PROCEDIMIENTO
A) METODO DE DUGUID 1. Poner con el asa una gota pequea de tinta china en el centro de un portaobjetos limpio. 2. Poner una gota de agua del mismo tamao junto a la gota de tinta china 3. Tomar con el asa bacteriolgica un pequeo fragmento del cultivo de bacterias 4. Hacer una suspensin (sin extenderla) en la gota de agua
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5. Mezclarla con la tinta china 6. Colocar un cubreobjetos sobre la suspensin, evitando que queden burbujas 7. Observar la preparacin al microscopio con el objetivo seco fuerte y de inmersin. La cpsula se observa como una zona brillante alrededor de la bacteria en un campo oscuro. B) METODO DEL ROJO CONGO 1. Poner una gota pequea de rojo congo en el centro de un portaobjetos limpio 2. Tomar con el asa bacteriolgica un pequeo fragmento de crecimiento de colonia bacteriana 3. Suspender la muestra en la gota de rojo congo y hacer un frotis 4. Cubrir el frotis (sin fijarlo a la flama del mechero) con una gotas del mordente de cpsula y dejarlo actuar durante un minuto. 5. Lavar el frotis con agua destilada y dejarlo secar al aire 6. Observar la preparacin al microscopio con el objetivo de inmersin La cpsula se observa como una zona brillante alrededor de la bacteria de color rojo en un campo de azul oscuro.
OBSERVACIONES
Dibuja ambos procedimientos de tincin de cpsulas
METODO DE DUGUID METODO DEL ROJO CONGO
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Dibuja y describe lo que observaste al microscopio
Cultivo: Procedimiento:
Objetivo:
Objetivo:
Objetivo:
Objetivo:
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CUESTIONARIO
1. Qu importancia mdica tiene la cpsula bacteriana?
2. Qu caractersticas presenta la cpsula en las bacterias?
3. Qu importancia tiene la presencia de la cpsula en las bacterias?
4. Qu sucede con las bacterias cuando estas llegan a perder la cpsula?
5. Investiga de que est compuesta la capa de material mucosa que forma la cpsulas
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TINCIONES SELECTIVAS INTRODUCCIN

PARED CELULAR Debajo de las sustancias extracelulares tales como las cpsulas o capas mucosas y externas a la membrana citoplasmtica est la pared celular que es una estructura muy rgida y que da forma a la clula. El espesor de la pared celular oscila entre 10 y 35 nm, sin embargo algunas paredes celulares son considerablemente ms gruesas. Las paredes celulares bacterianas son esenciales para el crecimiento y la divisin. Todas las bacterias poseen paredes celulares rgidas que protegen a la clula de explotar en medios de baja presin osmtica. Composicin qumica de las paredes celulares: Los peptidoglicanos proporcionan a la pared celular una estructura rgida. Estos grandes polmeros, estn compuestos de tres clases de bloques estructurales: N-acetil-glucosamina, cido N-acetilmurmico y un pptido que consta de cuatro o cinco aminocidos que son: L-alanina, D-alanina, Dcido glutmico y lisina. Adems contiene protenas con polisacridos, lipoprotenas y lipopolisacridos Propiedades y Funciones: Brinda proteccin y resistencia a la bacteria frente a los posibles cambios de presin osmtica del medio en el que se encuentra y a la accin de ciertos agentes externos. Presenta poros que actan como filtros, permitiendo el pasaje de agua y metabolitos esenciales. Presenta antgenos de tipo y grupo especficos. Participa en la divisin (multiplicacin) bacteriana (se invagina junto con la membrana plasmtica) En las bacterias Gram .negativas tiene poder patgeno debido a que presenta endotoxinas. Es el sustrato donde actan algunas bacteriocinas y otros antimicrobianos. La tincin para la pared celular se aprovecha del hecho de que los contenidos citoplasmticos se pueden hidrolizar diferencialmente con cido fosfomolbdico, dejando la pared sin afectar. Despus de teir se puede observar la pared celular con citoplasma como ahuecado ESPORAS Son elementos de reproduccin y/o de resistencia a un medio adverso que presentan algunas bacterias, especialmente del gnero bacilar. Su forma, tamao y ubicacin vara segn la especie. Estos cuerpos son producidos en el ltimo estado del crecimiento celular, que bajo condiciones apropiadas, germinan y producen la clase original de clula en crecimiento o vegetativa. Las esporas son resistentes a muchos agentes qumicos y fsicos. Existen dos tipos de esporas: Endosporas: espora presente en el interior de la bacteria, destinada a germinar originando la forma vegetativa de la que deriva. Es un cuerpo de pared gruesa muy refringente y sumamente resistente. Son
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producidas por especies Bacillus y Clostridium. Las endoesporas resisten las condiciones ambientales adversas de desecacin, calor y mal suministro de nutrientes ( agentes qumicos como desinfectantes) Exosporas: esporo que permanece libre en el ambiente, constituyendo la forma de resistencia bacteriana ante condiciones adversas o desfavorables (nutricin, desecacin, temperatura, presencia de agentes qumicos, presiones, etc.)
OBJETIVO
El alumno aplicar la tcnica de tincin especfica para lograr observar en el microscopio la pared celular y endoesporas en distintas muestras bacteriolgicas
MATERIAL Y EQUIPO

Portaobjetos Cultivo de 12-18 h de Bacillus subtilis en agar Cubreobjetos nutritivo. Asa bacteriolgica Piseta Mechero Puente de coloracin Microscopio Cronmetro Vaso de precipitado de 500 ml Parrilla
MATERIAL BIOLOGICO
REACTIVOS
Aceite de inmersin Solucin de cido fosfomolbdico (1%) Solucin acuosa de verde de metilo (1%) Verde malaquita (solucin acuosa al 5%) Safranina (solucin acuosa al 5% ) Todos en sus respectivos frascos goteros
PROCEDIMIENTO
TINCIN DE LA PARED CELULAR 1. Prepara un frotis hmedo relativamente concentrado de Bacillus subtilis sobre un portaobjetos limpio. NO LO FIJES A LA FLAMA. 2. Antes de que la suspensin bacteriana se seque sobre el portaobjetos, adicinale la solucin del cido fosfomolbdico cubrindola por completo. 3. Djalo reaccionar 4 minutos. 4. Inclina completamente el portaobjetos sobre el fregadero para eliminar totalmente el cido fosfomolbdico 5. Agrega el verde de metilo directamente sobre el frotis hmedo y djalo reaccionar 5 minutos. 6. Lava suavemente en la llave. Es inevitable que al lavar en la llave, algo del material se desprenda del frotis, trata de minimizar el desprendimiento pero al mismo tiempo lava bien, hasta que el agua ya no arrastre colorante.
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7. Seca al aire y despus examina con aceite de inmersin 8. Si se ti correctamente, las paredes celulares aparecern de verde oscuro o azul, mientras que el citoplasma se ver de un verde claro o incoloro TINCIN DE ESPORAS (TCNICA DE SHEAFFER Y FULTON) 1. Prepare un extendido del microorganismo aislado de Bacillus subtilis. 2. Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solucin de verde de Malaquita. 3. Calentar hasta emisin de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.) 4. Lavar con agua y cubrir con solucin de Safranina. Dejar actuar 30 segundos. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersin. El colorante Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.. La Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas. Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas con el segundo colorante
TINCIN DE ESPORAS (TCNICA DE COLORACIN DE GRAM) 1. Hacer un frotis de B. subtilis de la forma usual. 2. Teir con la coloracin de Gram 3. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin Las esporas se pueden observar sin teir o si se encuentra dentro del bacilo, la espora no se tie y el citoplasma se ve de color morado
Localizacin y morfologa de las esporas en Bacillus
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OBSERVACIONES
Dibuja el procedimiento que seguiste para teir la pared celular y lo que observaste al microscopio
Cultivo:
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Dibuja el procedimiento de Sheaffer y Fulton) que seguiste para teir las endosporas y lo que observaste al microscopio
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CUESTIONARIO
1. Menciona dos funciones que tiene la pared celular en las bacterias
2. Cules son los principales compuestos orgnicos de las paredes celulares?
3. Qu caracterstica y que color tieron las paredes celulares de las bacterias que lograste observar?
4. Describe dos diferencias para distinguir a una endospora de una exospora
5. Qu caracterstica y que color tieron las esporas observadas en las distintas muestras microbiolgicas?
6. Menciona algunos microorganismos capaces de producir esporas
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CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFIA
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Prctica 9 MORFOLOGIA GENERAL DE HONGOS Y LEVADURAS INTRODUCCION

Aun cuando los trminos moho y levadura no tienen significacin taxonmica, suelen denominarse de esta manera a una de las formas de hongos que no pueden definirse netamente. Se definen a las levaduras como hongos cuya forma corriente y dominante de crecimiento unicelular. Son de forma esfrica, elpticas y cilndricas, cuyas dimensiones oscilan de 2 a 8 m de dimetro, por 3 a 15 m de longitud para la levadura Saccharomyces cerevisiae. Aunque algunas otras especies llegan incluso a los 100 m. Debido a su tamao hay cierta facilidad para observarlas al microscopio ptico y poder conocer algunas estructuras con ayuda de colorantes. A los mohos se les suele describir cono hongos filamentosos multicelulares en que los filamentos llamadas hifas se ramifican y a veces se unen para formar una masa enmaraada; cualquier parte grande de la misma se conoce como micelio. Las clulas de mohos suelen ser cilndricas y su tamao es variable. El dimetro de las clulas de algunos mohos va de 2 a 5 m y puede ser 2 a 4 veces ms largos que anchos. La morfologa general de los mohos, no requieren tincin alguna, basta con montarlas en un portaobjetos observarlas directamente al microscopio; an cuando existe el riesgo de desbaratar o desorganizar algunas de sus delicadas estructuras. La importancia que tiene el estudio de levaduras y mohos son numerosas, no solo desde el punto de vista morfolgico sino por todas las actividades en las que ellos intervienen, ya sea como agentes de contaminacin y descomposicin en los diferentes procesos naturales o aprovechando sus diferentes productos de utilidad al hombre.
OBJETIVO
Al concluir la prctica, el alumno conocer la morfologa general de levaduras y mohos.
FUNDAMENTO
Levaduras: consiste en hidrolizar con etanol e hidrxido de potasio el citoplasma de la levadura para que permita una buena tincin de las estructuras internas con ayuda de un colorante. Mohos: Consiste en observar al microscopio un cultivo de mohos en un sustrato natural.
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MATERIAL Y EQUIPO
Portaobjetos Cubreobjetos Asa bacteriolgica Mechero Pinzas Microscopio
MATERIAL BIOLOGICO
Cultivo fresco de Saccharomyces cerevisiae Cultivo de mohos de pan, tortillas, ctricos, etc.
REACTIVOS
Aceite de inmersin Etanol 10% Hidrxido de potasio (0.1M) Azul de metileno de Loeffler Lugol
PROCEDIMIENTO
MORFOLOGA DE LEVADURAS A) Montaje seco 1. Haga un frotis de regular densidad con el cultivo de levaduras 2. Deje secar al aire 3. Bae el portaobjetos con una solucin de etanol al 40% por 1 minuto aproximadamente. 4. Lave con agua corriente, escurra. 5. Bae con solucin de KOH y djelo reaccionar una hora aproximadamente. Si se empieza a deshidratar, agregue ms KOH. 6. Lave con agua corriente y escurra 7. Cubra con l colorante azul de metileno por espacio de 2 minutos 8. Lave con etanol al 10%, sacuda el exceso de alcohol y seque al aire 9. Observa el frotis con el objetivo de inmersin; dibuje sealando las estructuras internas. Los ncleos se tien de azul oscuro o rosa y el citoplasma de un rosa mucho mas claro B) Montaje hmedo 1. Coloque una pequea gota de cultivo de levaduras cobre el portaobjetos. Agregue sobre la muestra una gota pequea de solucin de lugol y mezcle con el asa. 2. Observar con objetivo seco fuerte y despus con inmersin de aceite (Cubriendo previamente la muestra con el cubreobjetos). Trate de detectar estructuras internas como grandes vacuolas y dibujelas. MORFOLOGA DE HONGOS A) Observacin de mohos desarrollados en un sustrato especfico. 1. Con las pinzas y con mucho cuidado, desprenda pequeas porciones de los micelos de las colonias representativas, 2. Haga un montaje hmedo con cada una de las colonias, colocando a cada una de ellas una pequea gota de agua de la llave. Sin mezclar ni destruir la colonia.
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3. Coloque el cubreobjetos. 4. Observe con seco dbil y seco fuerte, indicando los nombres de las estructuras bsicas.
OBSERVACIONES
MONTAJE SECO DE LEVADURAS
MONTAJE HUMEDO DE LEVADURAS
40x
100x
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MONTAJE HUMEDO DE MOHOS SECO DBIL
Muestra:
SECO FUERTE
Muestra:
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CUESTIONARIO
1. Investigue que medios de cultivo comerciales existen para el cultivo de levaduras
2.
Qu distingue a una levadura de un moho?
3.
Cules son las formas de reproduccin de las levaduras?
4.
Esquematice una levadura sealando sus principales estructuras morfolgicas
5.
Qu tipo de reproduccin presentan los mohos?
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6.
Investigue y escriba brevemente la importancia que tiene el gnero Rhizopus
7.
De qu especie de mohos es obtenida la penicilina?
CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFIA
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Prctica 10 EFECTO DE LA PRESION OSMTICA SOBRE LA VIABILIDAD Y EL CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS INTRODUCCIN
La osmosis es la difusin a travs de una membrana semipermeable que separa a dos soluciones con distintas concentraciones de sustrato. El proceso tiende a igualar la concentracin de soluto a ambos lados de la membrana. Cuando a ciertas clulas bacterianas se les suspende en una solucin que contiene una concentracin elevada de cloruro de sodio (20%), el agua pasar desde la regin de menor concentracin de sustancia disuelta (el interior de la clula tiene una baja concentracin salina) a travs de la membrana citoplasmtica que es semipermeable a la solucin que rodea a la clula. As la clula se deshidrata producindose plasmlisis. Si las bacterias se colocan en una solucin que contiene menos del 1% de cloruro de sodio, el flujo de agua se invertir, es decir ocurrir la difusin, ya que fluir el agua desde la solucin externa al interior de la clula y originar la plasmotipsis. Dentro de la clula se establece una presin osmtica a causa de la gran cantidad de agua que se acumula all, esta presin har que se hinchen e incluso las clulas pueden reventar. El mecanismo de inhibicin microbiana es la plasmlisis: las clulas se deshidratan y por lo tanto son incapaces de metabolizar o crecer, pueden morir o permanecer vivas pero en condiciones durmientes. Sin embargo tambin existen microorganismos que requieren altas concentraciones salinas y son denominadas halfilos, y los que requieren presiones osmticas elevadas se les conoce como osmfilos. La mayor parte de las bacterias pueden tolerar una amplia gama de presiones osmticas externas y fuerzas inicas debido a su capacidad de regular la osmolaridad interna y la concentracin inica. La osmolaridad est regulada por el transporte activo de iones potasio al interior de la clula
OBJETIVO
El alumno observar el efecto de la presin osmtica que ejerce el cloruro de sodio y la sacarosa sobre el crecimiento microbiano
FUNDAMENTO
Medios hipotnicos (con una aw>aw del citoplasma) es la pared celular la que ejerce todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la membrana citoplsmica tienda a sufrir una presin de turgor excesiva. Medios hipertnicos (cuando la aw del exterior es menor que la del citoplasma). Las bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la concentracin de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamado genricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles mecanismos:
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Bombeando iones al interior; Sintetizando una molcula orgnica osmticamente activa; Bombeando sustancias osmoprotectoras.
MATERIAL Y EQUIPO
8 Tubos de ensaye de 16 X Escherichia Coli 150 Staphylococcus aureus 2 Pipetas estriles de 1 ml
MATERIAL BIOLOGICO
REACTIVOS
Caldo nutritivo Cloruro de sodio Sacarosa
MATERIAL:
3 Tubos de 16X 150 . En cada uno 10 ml de caldo nutritivo adicionado con: 2ml de cloruro de sodio al 1%, 2ml de cloruro de sodio al 10%, 2ml de cloruro de sodio al 20% 3 Tubos de 16X 150. En cada tubo 10 ml de caldo nutritivo adicionado con: 2ml de Sacarosa al 1%, 2 ml de Sacarosa al 10%, 2 ml de Sacarosa al 20% Nefelmetro de Mac Farland Pipetas de 5 ml , y de 1 ml estriles Agua destilada estril
PROCEDIMIENTO
PREPARACIN DE LA CEPA A ESTUDIAR Suspender la cepa bacteriana en un tubo con caldo nutritivo estril e incubar a 37 logrado obtener una gran turbidez. PREPARACIN DE SOLUCIONES DE SACAROSA Y CLORURO DE SODIO 1. Prepare un tubo ensayo con 10 ml de caldo nutritivo al 1% de sacarosa, otro al 3% y el ultimo al 5%.. 2. Rotularlas de acuerdo a la concentracin y el soluto adicionado 3. Repita lo mismo pero ahora con cloruro de sodio 4. Esterilice A) EFECTO DEL CLORURO DE SODIO 1. Colocar en una gradilla en orden creciente de concentracin una serie de 3 tubos con10 ml cada uno 2. ( al 1%, 3% y 5 % de NaCl) 3. Rotularlas de acuerdo a la concentracin y nombre de la cepa que se va a inocular en ellos
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4. Inocular en cada tubo 0.l ml de la suspensin bacteriana correspondiente 5. Incubar los tubos a 37C durante 24- 48h 6. Homogenizar el cultivo y leer el resultado de cada tubo en base a su turbiedad. B) EFECTO DE LA SACAROSA 1. Repetir el mismo procedimiento anterior, pero ahora en caldo de cultivo con sacarosa.
OBSERVACIONES
EFECTO DEL NaCl Microorganismo:________________________ 24 horas 48 horas
1%
72
3%
5%
73
EFECTO DE LA SACAROSA 24 horas 48 horas
1%
3%
74
5%
CUESTIONARIO
1. Cmo se define la smosis?
2. Qu es plasmlisis y cuando ocurre?
3. Qu sucedi con las bacterias al incrementar la concentracin del NaCl y sacarosa en el caldo nutritivo? 4. Qu nombre reciben las bacterias que soportan grandes presiones osmticas?
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5. Quin es el responsable en la clula bacteriana controlar la presin en medios hipotnicos?
6. Cuando se establece un medio hipotnico?
7. Cuando se establece un medio hipertnico?
CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFIA
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Prctica 11 EFECTO DE LOS AGENTES QUIMICOS FENO, ALCOHOL, JABON, ANTISPTICO COMERCIAL, METALES PESADOS Y COLORANTES. INTRODUCCION
Existen ciertas sustancias qumicas que influyen negativamente sobre las bacterias, pudiendo ejercer dos tipos de efectos diferentes: bacteriostticos, cuando impiden el crecimiento bacteriano y bactericidas, cuando destruyen (matan) las bacterias. En general, si no slo nos referimos a las bacterias, sino a cualquier tipo de microorganismos, hablamos respectivamente de agentes microbiostticos y microbicidas. Ahora bien, para una misma sustancia qumica, la lnea de demarcacin entre un efecto microbiosttico y otro microbicida depende muchas veces de la concentracin de dicha sustancia y del tiempo durante el que acta. Cmo podemos saber que un microorganismo est muerto? El nico criterio vlido es la prdida irreversible de la capacidad de divisin celular, es decir, de la prdida de viabilidad, y se suele comprobar empleando tcnicas con placas de Petri (es decir, confirmando que no crecen en medios slidos adecuados). Existen diversas molculas que pueden afectar el crecimiento o la viabilidad de los microorganismos, entre las que se encuentran: Agentes esterilizantes son aquellos que producen la inactivacin total de todas las formas de vida microbiana (o sea, su muerte o prdida irreversible de su viabilidad). Agentes desinfectantes (o germicidas) son agentes (sobre todo qumicos) antimicrobianos capaces de matar los microorganismos patgenos (infecciosos) de un material. Pueden (y en muchos casos suelen) presentar efectos txicos sobre tejidos vivos, por lo que se suelen emplear slo sobre materiales inertes. Agentes antispticos son sustancias qumicas antimicrobianas que se oponen a la sepsis o putrefaccin de materiales vivos. Se trata de desinfectantes con baja actividad txica hacia los tejidos vivos donde se aplican. Quimioterpicos son compuestos qumicos con actividad microbicida o microbiosttica, con una toxicidad suficientemente baja como para permitir su administracin a un organismo superior, en cuyos fluidos corporales y tejidos permanece estable un cierto tiempo a concentraciones tales que los hace eficaces como antimicrobianos dentro del organismo. Todos los das usamos agentes qumicos para controlar el crecimiento microbiano: detergentes y jabones para el cuerpo y la ropa, cloracin de las aguas potables, antispticos para la piel y el tratamiento de heridas, desinfectantes para tratar superficies en la industria y en los laboratorios, quimioterpicos y antibiticos para tratar enfermedades bacterianas, etc.
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FACTORES QUE AFECTAN LA POTENCIA DE UN DESINFECTANTE 1. Concentracin del agente y tiempo de actuacin 2. El pH afecta tanto a la carga superficial neta de la bacteria como al grado de ionizacin del agente. En general, las formas ionizadas de los agentes disociables pasan mejor a travs de las membranas biolgicas, y por lo tanto son ms efectivos. Los agentes aninicos suelen ser ms efectivos a pH cidos. Los agentes catinicos muestran ms eficacia a pH alcalinos. 3. Temperatura. Normalmente, al aumentar la temperatura aumenta la potencia de los desinfectantes. Para muchos agentes la subida de 10 grados supone duplicar la tasa de muerte. 4. Naturaleza del microorganismo y otros factores asociados a la poblacin microbiana segn la especie empleada: p. ej., el bacilo tuberculoso resiste los hipocloritos mejor que otras bacterias; segn la fase de cultivo; dependiendo de la presencia de cpsulas o de esporas (suelen conferir ms resistencia); dependiendo del nmero de microorganismos iniciales. 5. Presencia de materiales extraos: La existencia de materia orgnica en el material a tratar (p. ej., sangre, suero, pus) afecta negativamente a la potencia de los desinfectantes de tipo oxidante (como los hipocloritos) y de tipo desnaturalizante de protenas, hasta el punto que pueden llegar a hacerlos inactivos en cuanto a su poder desinfectante o esterilizante. Por lo tanto, para el empleo eficaz de muchos desinfectantes hay que contar con este factor, determinando previamente el gasto de materia orgnica inerte, o calculando la potencia neta del desinfectante en presencia de la materia orgnica.
OBJETIVO
Al terminar la prctica el alumno conocer la existencia de agentes que no permiten el desarrollo del microorganismo ya sea para inhibir el crecimiento o por efectos letales.
FUNDAMENTOS
FENOL Y ALCOHOL Los compuestos fenlicos actan como bactericidas o bacteriostticos, dependiendo de la concentracin a la que se usen. Las esporas bacterianas y los virus son ms resistentes que las clulas vegetativas. Algunos compuestos fenlicos son altamente fungicidas. Bsicamente actan desnaturalizando las protenas y rompiendo la membrana celular a bajas concentraciones. Es muy txico, su actividad aumenta con detergentes, pero no se modifica con sustancias orgnicas, se ocupa para la desinfeccin de superficies grandes y muy sucias (pisos, paredes, etc). El alcohol se considera tambin como agente qumico antimicrobiano. El alcohol etlico a concentraciones entre 50 y 70%, es efectivo contra clulas vegetativas y no productoras de esporas. El
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alcohol etlico no produce condiciones absolutas de esterilidad ya que es ineficaz contra las esporas bacterianas. El alcohol metilico es menos bactericida que el etlico y, es sumamente txico al hombre. Los alcoholes superiores (proplico, butlico, amlico y otros) son mas germicidas que el etlico, de hecho hay un aumento en el poder germicida a medida que es mayor el peso molecular de los alcoholes. JABON El jabn es un ejemplo de detergente muy pobre en aguas duras, el cual acta como depresor de la tensin superficial o como agente humectante empleado principalmente para la limpieza de superficies, aunque el calos real de los jabones ordinarios tiene relacin directa con la accin mecnica de eliminar microorganismos. El agua jabonosa tiene la propiedad de emulsionar y dispersar aceites y polvo. Los microorganismos son atrapados por el jabn y arrastrados por el agua corriente. Actualmente a los jabones se les agregan diversas sustancias qumicas para aumentar su actividad germicidad. ANTISPTICO COMERCIAL Los antispticos comerciales son agentes que impiden, detienen o inhiben el crecimiento microbiano sin necesidad de matarlos. La naturaleza de su composicin es muy variable y cubren una amplia gama de sustancias que incluyen: sales de metales pesados, halgenos, aldehdos y cidos, compuestos orgnicos, agentes oxidantes, lcalis, jabones, etc. Ningn antisptico posee todas las caractersticas ideales para su eficacia; cada uno de ellos tiene sus propias ventajas y desventajas dependiendo del lugar y las condiciones donde acten. COMPUESTOS DE METALES PESADOS Los metales pesados y sus sales tiene capacidad bactericida solamente en soluciones concentradas y bacteriostticos en soluciones diluidas, la plata tiene la propiedad de que en cantidades sumamente pequeas ejerce efectos letales sobre las bacterias. Muchos compuestos de metales pesados se utilizan como germicidas o agentes antispticos, principalmente son los de mercurio, plata y cobre, en forma de cloruro mercrico, nitrato de plata y sulfato de cobre, respectivamente. Estos actan bsicamente contra los microorganismos al combinarse con las protenas celulares y desnaturalizarlas o precipitarlas. COLORANTES Muchos de los colorantes que se emplean comnmente para teir los microorganismos tiene poder antisptico, estos colorantes son los derivados de la acridina y del trifenilmetano. Dentro de los colorantes del trifenilmetano estn el verde de malaquita, el verde brillante y el cristal violeta. Los derivados de la acridina son la acriflavina y la proflavina los cuales muestran inhibicin selectiva contra las bacterias, siendo ms eficaces contra las especies Gram (+) y muy poca accin antifungica. En ambos tipos de colorantes, la capacidad de actuar como bactericida o bacteriosttico estn en relacin de la concentracin.
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MATERIAL Y EQUIPO
MATERIAL BIOLOGICO

REACTIVOS
Fenol 5% Alcohol 70% Alcohol 95% Lejia 1% Lejia 20% Antisptico bucal Sulfato de plata Sulfato de cobre Nitrato de plomo Oxido de mercurio Soluciones acuosas estriles de cristal violeta y verde de malaquita a las siguientes concentraciones: 1:10, 1:100, 1:1000
4 Cajas Petri con agar Escherichia Coli nutritivo Staphylococcus aureus Hisopos estriles Etiquetas Pinzas de diseccin estriles Discos de papel filtro de 1cm de dimetro
PROCEDIMIENTO
PREPARACIN DE SENSIDISCOS 1. Con una perforadora preparar discos de papel filtro, tomar un disco de papel con las pinzas estriles y sumergir ligeramente uno de sus bordes en la solucin de casa agente qumico (observar como la sustancia asciende por accin capilar) 2. Cuando la sustancia ha ascendido dos tercios el disco, extraerlo, la sustancias se esparcir por todo el disco, dejarlo secar (mantenerlos siempre con la pinza de diseccin) EFECTO DEL FENOL, ALCOHOL, JABN Y ANTISPTICO COMERCIAL. 1. Utilizar cajas Petri con 6 divisiones, o en su caso, dividir las cajas Petri en 6 y rotular cada seccin de la siguiente manera: 1. Fenol 5%, 2. Alcohol 70%, 3. Alcohol 95%, 4. Lejia 1%, 5. Lejia 20% y 6. Antisptico bucal. 2. Inocular con un hisopo y suficiente cantidad del microorganismo seleccionado, toda la superficie del medio de cultivo de una caja Petri. 3. Colocar los sensidiscos impregnados de cada sustancia, con una pinza estril sobre el medio de cultivo inoculado 4. Incubar por 24 a 48 horas a 37C 5. Realizar la observacin.
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PRECAUCIONES No manejar el fenol con los dedos, es custico. El inculo no debe ser tan denso ni tan ralo, pueden dar resultados falsamente negativos o positivos. EFECTO DE LOS METALES PESADOS (ACCIN OLIGODINMICA) 1. Utilizar cajas Petri con 4 divisiones, o en su caso, dividir las cajas Petri en 4 y rotular cada seccin de la siguiente manera: 1. Sulfato de plata, 2. Sulfato de cobre, 3. Nitrato de plomo y 4. Oxido de mercurio 2. Inocular con un hisopo y suficiente cantidad del microorganismo seleccionado, toda la superficie del medio de cultivo de una caja Petri. 3. Colocar los sensidiscos impregnados de las sales de metales, con una pinza estril sobre el medio de cultivo inoculado 4. Incubar por 24 a 48 horas a 37C 5. Realizar la observacin. EFECTO DE LOS COLORANTES (ACCIN BACTERIOSTATICA) 1. Utilizar 2 cajas Petri con 3 divisiones, o en su caso, dividir las cajas Petri en 3, en una caja se probar el colorante cristal violeta y en la otra el verde de malaquita, rotular con el nombre del colorante a utilizar y un el nmero 1 para la concentracin 1:10, 2. para 1:100 y 3. 1:1000. 2. Inocular con un hisopo y suficiente cantidad del microorganismo seleccionado, toda la superficie del medio de cultivo de una caja Petri. 3. Colocar los sensidiscos impregnados de los colorantes, con una pinza estril sobre el medio de cultivo inoculado 4. Incubar por 24 a 48 horas a 37C 5. Realizar la observacin.
OBSERVACIONES
Haga sus esquemas, mida el rea de influencia del sensidisco y explique la efectividad de los diferentes agentes qumicos. SUSTANCIAS QUMICAS CULTIVO:_______________________
81
METALES PESADOS 1
CULTIVO:____________________________
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COLORANTES
CULTIVO:____________________________
CULTIVO:____________________________
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CUESTIONARIO
1. En qu casos es recomendable el uso de sustancias qumicas y no de calor en la destruccin de microorganismos?
2. Qu es una sustancia yodfora?
84
3. En el tratamiento de agua potable Qu sustancias generalmente son empleadas?
4. Cul es el mecanismo de accin de los jabones sobre los microorganismos?
5. Cmo actan las sustancias qumicas sobre las bacterias?
6. Cul es la accin de los metales sobre las bacterias?
85
7. Investigue la aplicacin de un compuesto donde se emplee un metal pesado
8. Qu cualidades debe tener un desinfectante ideal?
9. Qu metales inhiben el crecimiento bacteriano? Mencione tres
10. Qu es la accin oligodinmica de los metales?
11. Se emplea en la vida prctica los colorantes como antispticos? Mencione ejemplos.
CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
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___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFIA
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
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88
Prctica 12 ANTIBIOSIS EXPERIMENTAL Y USO DE ANTIBIOTICOS COMERCIALES INTRODUCCIN

Son sustancias capaces de destruir y eliminar los microorganismos causantes de una infeccin producida por bacterias (faringitis, bronquitis, otitis, neumona, amigdalitis, etc). No son eficaces cuando la infeccin es producida por virus (gripe). Cada tipo de antibitico ser efectivo para destruir una clase de microorganismos en funcin de su modo de actuacin..Se les llama antibiticos de amplio espectro a los que son efectivos frente a un gran nmero de agentes microbianos: los microorganismos causantes de la infeccin son capaces de desarrollar resistencias al antibitico de manera que este no ser eficaz para eliminarlos. Cada ao se investiga creando nuevos antibiticos eficaces para las formas microbianas resistentes a sus anteriores tratamientos. Se deben usar siempre bajo prescripcin mdica. Existen pruebas (antibiogramas) que determinan el antibitico ms eficaz para cada infeccin, pero normalmente se sigue un protocolo de actuacin de los antibiticos de eleccin para cada tipo de infeccin. Es el mdico el profesional que juzga la infeccin existente y el antibitico eficaz para su tratamiento. Los antibiticos siempre se deben tomar bajo prescripcin mdica y cumplir el tratamiento completo. El incumplimiento del tratamiento puede dar lugar a recadas que precisarn el tratamiento con otro tipo de antibitico por haber desarrollado resistencia al primero
OBJETIVO
El alumno conocer la antibiosis que se presenta entre especies microbianas y determinar la sensibilidad de un microorganismo ante diversos antibiticos.
FUNDAMENTO
Un fenmeno bastante comn en la naturaleza es la es la antibiosis, la cul se refiere al tipo de asociacin en el cual una o mas especies resultan daadas como consecuencia de su relacin con otra especie, la cual produce secreciones qumicas (antibiticos) que inhiben el crecimiento de los organismos afectados. La funcin de este mecanismo es eliminar la competencia por los alimentos a otras especies. La palabra antibitico en un sentido ms particular se refiere a un producto metablico de un organismo que es perjudicial o inhibitorio, en muy pequeas cantidades para otros microorganismos. La popularidad de los antibiticos se debe a la capacidad de destruir muchas clases de microorganismos patgenos y a su no toxicidad relativa cuando se administra por va general. Su manera de accin puede ser por: 1.- Inhibicin de la sntesis de la pared celular. 2.- Alteracin sobre la membrana citoplsmica. 3.- Inhibicin de la sntesis proteica.4.- Bloqueo de la sntesis de los cidos nucleicos.
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Para estudiar la sensibilidad de un microorganismo por tcnicas de difusin se dispone de dos sistemas, el de discos de papel impregnados con el antibitico y las tabletas, consistentes en una suspensin del antibitico liofilizada y comprimida en material inerte. Los fabricantes recomiendan conservar los discos a 20 C para largos periodos o entre 2 y 8 C si se utilizan en el plazo de una semana. Por el contrario, las tabletas se han considerado ms estables, pudindose almacenar a temperatura ambiente y manteniendo su actividad ms tiempo que los discos .Por lo que respecta a la temperatura de conservacin, al comparar para cada antibitico los dimetros de los halos de inhibicin de los discos conservados entre 4 y 6 C con los conservados a temperatura ambiente no se encontraron diferencias significativas a lo largo de todo el estudio; tampoco se encontraron diferencias al comparar los halos de las pastillas conservadas entre 4 y 6 C con las conservadas a temperatura ambiente, de modo que tanto los antibiticos que permanecieron estables durante el tiempo del estudio como los que disminuyeron su actividad lo hicieron de modo paralelo a ambas temperaturas
MATERIAL Y EQUIPO

MATERIAL BIOLOGICO

REACTIVOS
Metronidazol Gentamicina Terramicina Penicilina
2 Caja Petri con agar nutritivo Escherichia Coli 2 Caja Petri estril Staphylococcus aureus Pipeta estril de 1.0 ml Bacillus subtilis 1 Tubo de ensaye con agar nutritivo estril Asa bacteriolgica Mechero Sensidiscos Hisopos estriles Pinzas estriles
PROCEDIMIENTO
ANTIBIOSIS 1. Derrita a bao Maria el agar contenido en los tubos de ensaye. Mantngalos siempre estriles. 2. Enfre a 50C el agar sin dejar que solidifique. 3. Inocule un tubo con agar licuado y estril con 1.0 ml de cultivo de E. coli. Homogenice por rotacin. 4. Repita el procedimiento para Staphylococcus aureus 5. Vierta siguiendo la tcnica asptica, cada tubo en su respectiva caja Petri identificando cada caja. 6. Espere a que solidifique el medio inoculado 7. Siembre la superficie de cada caja, trazando una sola lnea de siembra, de manera que se bisecte la superficie de la caja con el cultivo de Bacills subtilis. 8. Incubar por varios das a 37C y observe si detecta evidencia de antibiosis.
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ANTIBIOTICOS 1. Utilizar 2 cajas Petri con 4 divisiones, o en su caso, dividir las cajas Petri en 4, en una caja se sembrar E. coli y en la otra S. aureus, rotular con el nombre del antibitico a evaluar. 2. Inocular con un hisopo y suficiente cantidad del microorganismo seleccionado, toda la superficie del medio de cultivo de una caja Petri. 3. Colocar los sensidiscos impregnados de los antibiticos, con una pinza estril sobre el medio de cultivo inoculado 4. Incubar por 24 a 48 horas a 37C 5. Realizar la observacin.
OBSERVACIONES
Haga sus esquemas, sobre el comportamiento de antibiosis y mida el rea de influencia del sensidisco y explique la efectividad de los diferentes agentes qumicos. ANTIBIOSIS CULTIVO:_______________________
CULTIVO:_______________________
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ANTIBITICOS 1
CULTIVO:____________________________
92
CULTIVO:____________________________
CUESTIONARIO
1. Qu funcin tiene lo antibiticos?
93
2. Qu son los antibiogramas y cual es su funcin?
3. Menciona dos causas del por qu los microorganismos pueden llegar a hacerse resistentes a los antibiticos
4. Escribe dos fuentes naturales de donde se puedan obtener los antibiticos.
5. Segn los resultados de tu prctica .Qu medicamentos puedes utilizar para destruir y eliminar a los microorganismos como: Staphylococcus y Escherichia Coli?
6. Investiga que tipo de enfermedades pueden ocasionar los microorganismos estudiados en la prctica
7. Qu es un antibitico de amplio espectro?
8. Cules son las vas por las que los antibiticos inhiben o matan los microorganismos?
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CONCLUSIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
RECOMENDACIONES
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
BIBLIOGRAFIA
___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________
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FORMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES PRCTICAS DE ESTE CURSO

SOLUCIN DE AGUA PEPTONADA PREPARACIN Por cada litro de agua agregar 10 g de peptona de casena y 5 g de NaCl SOLUCIN DE AGUA OXIGENADA AL 10% PREPARACIN Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de agua oxigenada en 9 ml de agua destilada 2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5% PREPARACIN Azul de metileno Agua destilada 3.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE GRAM A) COLORANTE CRISTAL VIOLETA FRMULA: Cristal violeta Etanol al 95% Oxalato de amonio Agua destilada PREPARACIN: 1.- Disolver el cristal violeta en el etanol 2.- Disolver el oxalato en el agua 3.- Mezclar las dos soluciones B) SOLUCION DE LUGOL FORMULA Yoduro de potasio Agua destilada Yodo metlico Etanol, aforar a PREPARACIN: 1.- Disolver el yoduro de potasio en el agua 2.- Agregar el yodo metlico y disolver 3. Aforar a 100 ml con etanol C) SOLUCIN DE ALCOHOL ACETONA FORMULA Acetona Etanol al 95%
5.0 gr 100 ml
2.0 gr 20 ml 0.8 gr 80 ml
10.0 gr 20.0 ml 5.0 gr 100.0ml
1 volumen 2 volmenes
96
D) COLORANTE SAFRANINA FORMULA Safranina 0.5 gr Agua destilada 100.0 ml PREPARACIN Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, despus aforara a 100 ml con ms agua. 4.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE ZIEHL- NEELSEN A) COLORANTE FUCSINA FENICADA FORMULA: Fucsina bsica 5.0 gr Fenol 25.0 grs Etanol al 95% 50 ml Agua destilada aforar a 500 ml PREPARACIN 1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en bao a ebullicin 2.- Aadir la fucsina bsica y disolver 3.- Aadir el etanol y mezclar 4.- Aforar la solucin a 500 ml con agua destilada B) SOLUCIN DE ALCOHOL CIDO FORMULA cido clorhdrico concentrado Etanol al 95% PREPARACIN Adicionar el cido clorhdrico al etanol, lentamente y agitando C) COLORANTE AZUL DE METILENO FORMULA Azul de metileno Agua destilada 5.- MEZCLA CRMICA Dicromato de potasio cido sulfrico concentrado Agua destilada 20.0 gr 20.0 ml. 250.0 ml.
3.0 ml 100.0 ml
5.0 gr 100.0 ml
97
BIBLIOGRAFIA
Q.F.B. MONICA ALCARAZ MUNGUA, MANUAL DE PRCTICAS DE LA UNIVERSIDAD DE COLIMA I.Q. JUSTINA OCAMPO LINARES, MANUAL DE PRCTICAS DEL INSTITUTO TECNOLOGICO DE ORIZABA.
98
INSTITUTO TECNOLGICO SUPERIOR DE CIUDAD SERDAN INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
QFB. RODOLFO FRANCISCO SNCHEZ ROMN
99

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Prctica 1 EMPACADO DE MATERIAL Y ESTERILIZACIN POR CALOR INTRODUCCION

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2. Qu finalidad tiene el empacado antes de la esterilizacin?

4. Qu desventaja tiene el utilizar la esterilizacin por calor seco en este laboratorio?

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13. Cmo acta la esterilizacin por calor seco en los microorganismos?

14. Cmo acta la esterilizacin por calor hmedo en los microorganismos?

15. Qu tipo de esterilizacin es ms recomendable y por qu?

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Prctica 2 PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIN

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3. Qu finalidad tiene utilizar medios de cultivo slidos?

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Prctica 3 SEMBRADO EN PLACA DE MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE INTRODUCCIN

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SUPERFICIE: suave, brillante, rugosa, plegada, seca y polvorienta

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AGAR PAPA-DEXTROSA Muestra:___________________________ Lugar:__________________________

CALDO NUTRITIVO Muestra:______________________

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4. Qu tipo de microorganismos podemos encontrar en el ambiente?

5. Cul es la importancia de trabajar en condiciones aspticas?

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3. Qu mtodo de preservacin de microorganismos son comnmente empleados?

4. De qu manera puede aislarse un solo microorganismo?

6. En cul caja crecieron ms y ms grandes las colonias?

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Prctica 5 MEDIOS DE CULTIVO SELECTIVOS Y DIFERENCIALES INTRODUCCIN

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Medio de cultivo Escherichia coli Otras coliformes

Agar EMB Colonias oscuras brillo metlico

Agar S-S con Colonias rojas

Verde brillante Colonias verdes

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Salmonella Shigella Proteus Pseudomonas

AGAR PAPA-DEXTROSA Muestra:_ Lugar:

MEDIO DE CULTIVO: MEDIO DE CULTIVO: 1 1