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MICROBIOLOGIA
BIO253
CARRERA:
BIOTECOLOGÍA
PROFESORES:
MARIO CASTILLO RUIZ mario.castillo.r@uandresbelo.edu
(PROFESOR ECARGADO)
ALEJADRO GOZÁLEZ CADÍA a.gonzalez.c@uandresbello.edu
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE
03 – 09
MICROBIOLOGÍA
29 SEPTIEMBRE-1 DE
Nº3 FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS
OCTUBRE (1) 52 – 67
GRAM NEGATIVO. ANTIMICROBIANOS
13-15 DE OCTUBRE (2)
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INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA
1.1 BIOSEGURIDAD
Un laboratorio de microbiología debe contar con la infraestructura necesaria para
manipular un microorganismo de acuerdo a su riesgo biológico cumpliendo con los
procedimientos del nivel de bioseguridad correspondiente (niveles del 1 al 4).
• Sistema óptico
o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del
objetivo.
o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de
ésta.
o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la
preparación.
o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
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o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
• Sistema mecánico
o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el
brazo.
o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o
binocular.
o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar,
cambiar los objetivos.
o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y
micrométrico que consigue el enfoque correcto.
Para realizar siembras y/o repiques, se utilizan asas con hilos de platino o de tungsteno. La
utilización de estos metales se debe a que son resistentes a la oxidación y porque una vez
esterilizados a la llama, se enfrían rápidamente sin riesgo de provocar la muerte de los
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microorganismos con que se está trabajando. Además, estos hilos son muy maleables
pudiendo ser transformados en un asa o en espátula, permitiendo repicar o resembrar desde
un medio líquido o sólido.
Asa níquel-cromo
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AUTOCLAVE
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1.4 Precauciones en el laboratorio y durante el trabajo práctico
- Antes de utilizar las asas con hilos de platino, que sirven para las siembras y/o repiques,
éstas deben flamearse al rojo en posición vertical bajo la acción de la llama. Antes de
efectuar la siembra y/o repique debe esperarse algunos segundos a que se enfríen, pudiendo
enfriarse también en el borde de la placa de Petri que contiene el medio de cultivo.
Inmediatamente después de haberlas utilizado, deben flamearse nuevamente, evitando
diseminar el microorganismo en el medio ambiente.
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Partes de la llama
1.- Cono frío: no llega oxígeno
2.- Cono de reducción: poco oxígeno
3.- Cono de oxidación: abundancia de oxígeno
4.- Zona de fusión: alcanza los 1500 ºC (Zona
que esteriliza por calor)
a) Dejar la ropa innecesaria en las perchas del laboratorio y usar un delantal (blanco).
b) Nunca deben llevarse a la boca lápices, etiquetas o cualquier otro material.
c) Los mesones del laboratorio deben limpiarse antes y al final de cada laboratorio con un
desinfectante apropiado.
d) Las asas con los hilos de platino deben esterilizarse a la llama del mechero en toda su
extensión antes y después de su uso. El salpicado se evita sosteniendo el hilo alrededor de
la llama antes de flamearlo.
e) No se distraiga conversando mientras trabaja, así evitará quemarse con el mechero o
sufrir otros accidentes.
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f) Si se derrama un cultivo en el mesón o piso, cubrir el área con un desinfectante y
notificar al Instructor.
g) Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.
h) Los medios inoculados deben colocarse en las cámaras de cultivo con su identificación
respectiva, ej.: nombre, naturaleza del espécimen, sustrato del cual se aísla, fecha,
identificación del manipulador.
i) Cuando no se utilizan los mecheros, éstos deben guardarse y se debe estar seguro que se
les ha apagado al final de cada laboratorio.
j) Oculares, objetivos, como también otras partes del microscopio, deberán limpiarse antes
después de su uso. Los lentes deben limpiarse con papel especial para lentes o un paño de
batista.
k) Todos los reactivos y equipos deben dejarse en su lugar de origen al término de cada
laboratorio.
l) Todos los tubos, placas de Petri, pipetas, portaobjetos, etc., deben dejarse en los
recipientes adecuados una vez terminado el laboratorio.
m) Todos los materiales de desecho como trozos de papel, algodón, etc., deben colocarse en
los basureros adecuados y no en los mesones o suelo.
n) Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, deben
comunicarse inmediatamente al Instructor.
ñ) Todos los estudiantes deberían lavarse las manos con jabón o con un desinfectante si es
necesario, antes de dejar el laboratorio.
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TRABAJO PRÁCTICO Nº1
TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA
OBJETIVOS
1. Identificar material básico empleado durante la práctica bacteriológica.
2. Adquirir la destreza para manipular materiales y cultivos bacterianos.
3. Adquirir la destreza y el cuidado para trabajar en esterilidad.
4. Conocer los diferentes medios de cultivo.
5. Conocer la utilidad de los medios de cultivo más usados.
6. Conocer el concepto de siembra y aislamiento de bacterias.
7. Practicar diferentes tipos de siembra.
8. Practicar diferentes tipos de aislamiento bacteriano.
9. Conocer distintos tipos de tinciones y la utilidad de éstas.
El Trabajo Práctico Nº1 tiene como objetivo principal que el alumno adquiera los
conocimientos básicos en lo que respecta a la manipulación de cultivos bacterianos
poniendo énfasis en los conceptos de esterilidad, siembra en medios líquidos y sólidos
(diferenciales, selectivos y enriquecidos) y manejo de microorganismos aeróbicos.
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actividades el alumno deberá familiarizarse con el material ESTÉRIL con el que trabajará
(Tabla Nº1) y los procedimiento de siembra y aislamiento de microorganismos desde
diferentes muestras.
Debido a que el cuerpo humano (que incluye a la cavidad oral) es un lugar donde
cohabitan un sin número de microorganismos distintos, generalmente las muestras
contienen una flora mixta, la que se manifiesta por el desarrollo de distintas especies
bacterianas. Por este motivo es de suma importancia obtener una cepa bacteriana aislada
para poder estudiar sus características morfológicas y bioquímicas y así lograr una
identificación correcta (Figura Nº1). Por lo tanto, en una primera instancia, para obtener un
cultivo puro se debe lograr primero el AISLAMIETO de UA COLOIA en medio
sólido, puesto que por definición una colonia proviene de una sola bacteria y por ende
correspondería a un cultivo puro. En el caso de los medios líquidos, una vez obtenido el
crecimiento bacteriano (enturbiamiento), se debe realizar el aislamiento de UA gota a un
medio sólido para obtener colonias aisladas y puras.
Colonia A
Colonias A y B se
encuentran mezcladas Colonia B
.
Figura Nº 1: Aislamiento por estrías o en cuadrantes en placa de agar MacConkey.
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Tabla Nº 1 : Material de uso común en el Laboratorio de Microbiología
Esterilización
Material Tipo esterilización Tipo de material
Antes de ser utilizada Después de ser utilizada
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Una vez que se obtienen colonias aisladas se puede realizar la identificación de esta
especie bacteriana. Debemos recordar que cada colonia corresponde en su origen a UNA sola
bacteria que se ha desarrollado en un medio de cultivo sólido, hasta formar una población que
se observa como una colonia visible. Por lo tanto, la morfología de esta colonia estará
determinada por millones de bacterias idénticas y será propia de cada tipo de bacteria. Es
importante tener en cuenta que la morfología de colonia también dependerá del medio de
cultivo en el cual se propague la bacteria, ya que su metabolismo depende de la disponibilidad
de nutrientes y tanto la calidad como cantidad de éstos varía en los diferentes medios de
cultivo. La morfología macroscópica de las colonias (análisis macroscópico) permite evaluar
características como forma, elevación, margen, superficie, brillo, color y hemólisis (en agar
sangre) (Figura 2).
Debido a que muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas se
hace imposible diferenciarlas sólo con la observación MACROCÓPICA de éstas. Por esta
razón además se hace necesario realizar una observación MICROSCÓPICA de las células que
conforman cada colonias.
La suma de los datos obtenidos de la descripción macroscópica y microscópica
proporcionan una orientación sobre las pruebas bioquímicas a realizar para la identificación
definitiva de las bacterias que conforman la colonia.
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Figura Nº 2: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia bacteriana.
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Por otra parte, la observación al microscopio de las bacterias permite conocer una serie
de características complementarias a la morfología de la colonia entre las que encontramos:
forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas,
flagelos), movilidad, etc.
1. Observación de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teñir, se utiliza el
microscopio de fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarrolló para hacer posible
observar células pequeñas sin teñir. Se basa en utilizar y aumentar la pequeña diferencia de
índice de refracción que existe entre las células y el medio que las circunda. Esta diferencia
puede ser usada para crear una imagen con mucho mayor contraste que la que se obtiene en
el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente objetivo especial y en el
condensador se inserta un diafragma especial; además para aumentar el contraste se
insertan filtros verdes o azules.
a. Al fresco: Este método de examen permite observar el microorganismo vivo y evita las
deformaciones artificiales de su morfología que producen las técnicas de coloración. Su
aplicación más importante se refiere al estudio de la movilidad de los microorganismos.
b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenómeno de Tyndall, de reflexión luminosa. Para la
observación se sustituye el condensador de Abbé por el condensador de fondo oscuro, o
de ultra. Se ilumina la preparación en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos
directamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del microscopio. Se
le emplea para la observación de bacterias muy pequeñas o de aquellas que difícilmente
se observan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el medio.
c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un líquido y
depositar una gota de la suspensión sobre un cubreobjeto, luego se procede a la
observación microscópica.
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2. Observación de bacterias muertas:
a. Tinciones simples: Se utiliza un sólo colorante para revelar la presencia de
microorganismos y su forma en general. Son de poco uso en bacteriología.
b. Tinción negativa: Se tiñe el fondo mientras que las células permanecen sin teñir
(transparentes), observándose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo de
este tipo de tinción es la tinción de cápsula en la que se usa tinta china.
c. Tinciones especiales: Se utilizan para observar alguna estructura en particular como
nucleoide, flagelo, esporas, etc.
d. Tinciones diferenciales: Las bacterias son diferentes entre sí, tanto en su estructura
física como en su composición química, de modo que reaccionan en forma diferente
frente a los colorantes. Estas tinciones se utilizan para diferenciar los distintos grupos de
bacterias. La Tinción de Gram es la tinción diferencial más importante usada en
bacteriología. Otra muy utilizada es la Tinción ácido resistente o tinción de Ziehl
Neelsen.
Otras estructuras bacterianas que también pueden ser diferenciadas por métodos de
tinción son las esporas y la cápsula:
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TICIÓ DE GRAM
La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología, es la tinción de Gram
(Figura Nº 3), pues divide a la mayoría de las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo
y Gram negativo. Además permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y la disposición
bacteriana (diplos, cadenas, racimos).
La tinción Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con Cristal Violeta, y luego
tratarlas con una solución mordiente (fijadora) de Iodo/Ioduro (Lugol). Todas las bacterias se
tiñen en estas condiciones, sin embargo, sólo algunas son capaces de retener el colorante al
tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solución decolorante de Etanol –
Acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram positivo y las que se decoloran
son las Gram negativo que para observarse deberán teñirse con un colorante de contraste
(Safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se verán de color azul/violeta y las Gram
negativo de color rojo o rosado.
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Figura Nº 3: Técnica Tinción Gram.
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TABLA Nº 2: Cuadro Resumen Tipo de Tinciones
Cristal Violeta, Lugol, Gram positivo retienen cristal violeta (azul) Clasificación bacteriana clásica:
Gram
Alcohol – Acetona, Safranina Gram negativo se tiñen con contraste (rojo) Gram Positivo y Negativo
Tinción de esporas Verde de malaquita, Safranina Tiñe la espora (verde) Esporas de bacilos Gram Positivo
Fucsina, Acido Sulfúrico, Azul de Unión ácido resistente de fucsina a escasos ocardia
Kinyoun
Metileno ácidos micólicos de la pared (fucsia) (BAA lábiles)
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También es importante señalar que las bacterias Gram positivo pueden
observarse como Gram negativo en algunas condiciones: en cultivos viejos (de más de
24 ó 48 horas), a pH ácido y en condiciones de decoloración muy prolongada.
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ACTIVIDADES PRÁCTICAS
SIEMBRAS
1. De medios Sólidos a medios Sólidos.
1.1. Desde placa Petri a placa de Petri:
a. Flamear el asa para su esterilización.
b. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no
existan colonias.
c. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en
estudio (Con sólo tocar la colonia estará tomando la cantidad de
bacterias suficiente para poder sembrar).
d. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello:
i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño
sector de la placa. Flamear el asa, para eliminar las bacterias.
ii. Con el asa estéril, deslizarla desde el sector ya sembrado hacia el
sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag.
uevamente flamear el asa, para eliminar las bacterias.
iii. Con el asa estéril, a partir de las últimas líneas realizadas deslizarla
hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. uevamente
flamear el asa.
e. Con el asa estéril, repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar
la placa. Tener cuidado de que la última estría no tome contacto con el
lugar donde se realizó el primer sembrado. Tapar la placa y flamear el asa
para su esterilización.
f. Incubar la placa recién sembrada a la temperatura adecuada.
A B
A B
C D
18 – 24 Hrs.
Figura Nº 5: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo.
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3. De medios Líquidos a medios Sólidos
3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a placas de Petri:
a. Rotular la placa en el reverso (donde se encuentra el agar) con los datos
correspondientes.
b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitación.
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo
y enfriar el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar
suavemente para luego retirarla.
e. Flamear y tapar la boca del tubo.
f. Seleccionar el medio adecuado y poner la placa boca abajo cerca del
mechero. (Recuerde que no debe alejarse del mechero con la placa
abierta para no perder la esterilidad del medio)
g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello:
iv. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño
sector de la placa. Flamear el asa, para eliminar las bacterias.
v. Con el asa estéril, deslizarla desde el sector ya sembrado hacia el
sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag.
uevamente flamear el asa, para eliminar las bacterias.
vi. Con el asa estéril, a partir de las últimas líneas realizadas deslizarla
hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. uevamente
flamear el asa.
vii. Con el asa estéril, repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta
completar la placa. Tener cuidado de que la última estría no tome
contacto con el lugar donde se realizó el primer sembrado.
h. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización.
i. Incubar la placa a la temperatura adecuada.
A B C
D
18 – 24 hrs.
A B
C D
A B
C D
Figura Nº 8: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con agar tendido.
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4. Desde medios Líquidos a medios Líquidos.
4.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con medio de
cultivo líquido.
a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.
b. Homogenizar el tubo problema por agitación.
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo
y enfriar el asa en las paredes de éste. Introducir el asa hasta el fondo y
agitar suavemente para luego retirarla.
e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
f. Destapar el tubo con medio de cultivo estéril e introducir el asa cargada sin
tocar las paredes, agitar en el medio de cultivo y retirar con cuidado.
g. Flamear la boca del tubo y taparlo.
h. Flamear el asa para su esterilización.
i. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.
A B
18 - 24 hrs.
Figura Nº 9: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con medio de cultivo.
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Tabla Nº3: Cuadro Resumen Actividad Técnicas de Siembra.
Desde Medio Tipo A Medio Tipo Toma de muestra desde Siembra en Tipo Siembra
Líquido Tubo con cultivo líquido Tubo con Medio de cultivo Agitación con asa
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5. Técnicas de Esterilización
5.2. Flameado
a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos
correspondientes.
b. Homogenizar el tubo con el cultivo bacteriano por agitación.
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo
y enfriar el asa en las paredes de éste. Introducir el asa hasta el fondo y agitar
suavemente para luego retirarla.
e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
f. Deslizar el asa suavemente por una mitad del agar. Cerrar la placa.
g. Luego, flamear el asa para su esterilización, enfríela en la tapa y deslícela
suavemente por la otra mitad del agar.
h. Cerrar la placa.
i. Incubar la placa a 37ºC.
6. Desinfección y Asepsia
6.2. Cloro
a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos
correspondientes.
b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico
c. Luego con esta misma deslizarla por alguna superficie fuera del laboratorio
de amplia exposición (baranda de la escalera, manillas de las puertas, etc.).
d. Una vez tomada la muestra, pasar la tórula suavemente sobre una mitad de la
placa de agar nutritivo.
e. A continuación, para comprobar la capacidad de desinfección del cloro,
limpiar varias veces la superficie analizada anteriormente con un algodón
con cloro y deslizar una tórula estéril.
f. Pasar la tórula por la otra mitad del agar.
g. Incubar la placa a 37ºC.
6.2. Yodo
a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos
correspondientes.
b. Por una mitad del agar, deslizar suavemente uno de sus dedos.
c. Tome un trozo de algodón con yodo y limpie la yema del dedo que utilizó,
espere unos segundos.
d. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa.
e. Incubar la placa a 37ºC.
6.2. Alcohol
a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos
correspondientes.
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b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico
c. Luego con esta misma deslizarla por otra superficie fuera del laboratorio de
amplia exposición (baranda de la escalera, manillas de las puertas, etc.).
d. Una vez tomada la muestra, pasar la tórula suavemente sobre una mitad de la
placa de agar nutritivo.
e. A continuación, para comprobar la capacidad de desinfección del alcohol,
limpiar varias veces la superficie analizada anteriormente con un algodón con
alcohol y deslizar una tórula estéril.
f. Pasar la tórula por la otra mitad del agar.
g. Incubar la placa a 37ºC.
2. Análisis Microscópicos.
Realice tinción Gram a las colonias que tiene disponibles y observe al microscopio,
caracterizando afinidad tintorial, forma y agrupación bacteriana.
Tinción Gram:
Preparación frotis bacteriano a partir de colonia.
a. Colocar una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de
diámetro).
b. Flamear el asa para su esterilización.
c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.
d. Obtener una pequeña muestra desde la placa.
e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del
portaobjeto.
f. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque (sin
hervir).
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Tinción frotis
a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no esté demasiado caliente.
b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta e incubar por 3 min.
c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de
Lugol. Dejar con Lugol por 2 min.
d. Lavar el lugol alternando alcohol-acetona y agua dejando escurrir, hasta que
se decolore completamente.
Nota : Debe primero lavar con el decolorante alcohol – acetona y luego con
agua. De otra manera retirara el colorante de la muestra y no podrá observar
las bacterias.
e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min.
f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.
g. Observar en el microscopio óptico con inmersión (objetivo 100X).
3. Tinción de Esporas.
Procedimiento :
a. Limpiar una lámina portaobjeto con alcohol.
b. Con el asa colocar una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de
diámetro).
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.
e. Obtener una pequeña muestra desde la placa de Bacillus spp.
f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del
portaobjeto.
g. Fijar en el mechero hasta que se seque completamente (sin hervir).
h. No olvidar esterilizar el asa después de usarla.
i. Cortar papel absorbente en forma rectangular, de manera que cubra el frotis con
bacteria, pero que no sobresalga a los bordes de la lamina del portaobjeto.
j. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y a continuación agregar solución
colorante Verde de Malaquita. Debe fijarse que el colorante tiene que atravesar
las 4 capas de papel y ponerse en contacto con el frotis bacteriano.
k. Como esta tinción se realiza en caliente: para ello con una pinza de madera debe
colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta observar emisión de
vapor durante 5 min. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra o se
rompa el portaobjeto.
l. Una vez que se observa emisión de vapor desde la muestra, se debe reponer el
colorante nuevamente. Debe repetir 3 veces este proceso.
m. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde
de Malaquita.
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n. Posteriormente cubra el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 2
min.
o. Lavar con agua y secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con
lente de inmersión.
NOTA:
− Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamaño
que las bacterias) son pequeñas esferas verdes.
− Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas últimas es
posible determinar si se encuentran al centro o hacia un extremo de la célula y, si la
espora deforma o no al bacilo.
− Una vez observada la muestra desechar la lámina en los frascos con
DESINFECTANTE ubicados en cada mesón.
A B
C D
Papel
Absorbente
E F G
Verde Malaquita Safranina
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4. Tinción de Cápsula.
Procedimiento:
a. Limpiar una lámina portaobjeto con alcohol.
b. En una esquina de la lámina portaobjeto colocar una gota de Tinta China del
tamaño de una arveja.
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.
e. Obtener una pequeña muestra desde la placa de Klebsiella spp.
f. Mezclar la muestra con la gota de tinta, esterilizar el asa y repetir 3 o 4 veces
(sólo agregar la bacteria). La Tinta China impide ver si la solución tiene o no
suficiente bacteria, por lo mismo es necesario mezclar con suficiente cultivo.
g. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con tinta china, asegurarse
de esterilizar el asa previamente y de enfriar ésta.
h. Realizar un frotis de la suspensión de manera que quede una capa delgada. Esto
se realiza tomando un cubreobjeto y esparciendo la mezcla a lo largo del
portaobjeto que contiene la mezcla Tinta China–Bacteria (Figura 12).
i. Fijar suavemente en el mechero.
j. Durante 2 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina.
k. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersión.
A B
C D
F
E
Fucsina
Bacterias
Cápsula
OBJETIVOS
1. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de cocáceas Gram positivo.
2. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de
productos intermediarios, debido a la acción bacteriana.
3. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras de mucosa
bucal y nasofaríngea.
33
Las bacterias con las que convivimos diariamente pueden representar un riesgo
para nuestra salud cuando el ecosistema cuerpo humano-bacteria se ve afectado, ya sea
por alteración del ecosistema bacteriano o por factores del hospedero, como una
disminución en las defensas, que permitan que las bacterias normales invadan o ataquen
al ser humano. Es en estos casos que el diagnóstico de los organismos responsables es
de suma importancia para poder elaborar tratamientos adecuados. Por este motivo, el
Laboratorio de Microbiología cumple un rol fundamental en la identificación de
bacterias en una muestra determinada.
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En general, para cocáceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos
últimos métodos, en cambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros.
Estos test se pueden realizar mediante baterías en tubos convencionales o mediante
sistemas comerciales más fáciles de manipular (API).
En este trabajo se analizaran dos de las Familias de Bacterias Gram positivo más
importantes, como son la Micrococcaceae y Streptococcaceae.
Familia Micrococcaceae
Alfa toxina Es una hemolisina que produce lisis total de los glóbulos rojos. Es una
proteína antigénica de peso molecular 30.000 D.
Leucocidina* Causa degranulación de los leucocitos y macrófagos.
Exfoliatina Algunas cepas producen esta toxina, la que causa el síndrome de piel
quemada.
Enterotoxinas Algunas cepas producen estas toxinas que causan intoxicaciones
alimentarías.
* También es conocida como toxina de Panton - Valentine.
Las toxinas producidas por Staphylococcus aureus son causantes de los síntomas de las
enfermedades estafilocócicas.
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AISLAMIETO Y CARACTERIZACIÓ
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TABLA DE IDETIFICACIÓ DE BACTERIAS GRAM POSITIVO
Cocaceas Bacilos
Corynebacterium sp
Bilis positivo
NaCl positivo
Enterococcus
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En los dos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar
mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras
especies pueden dar colonias semejantes. Una vez confirmada la presencia de cocos
Gram positivo en racimo se realizan pruebas bioquímicas para confirmar el diagnóstico.
Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y características
en medios selectivos se realizan las pruebas bioquímicas.
Prueba de la Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que
descompone el H2O2.
Enzima Catalasa
H2O2 H2 O + O2
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La enzima es un activador del fibrinógeno a fibrina, además, la pared de
Staphylococcus aureus posee receptor de fibrinógeno lo que permite la formación de
puentes entre bacteria y bacteria, formándose un coágulo.
Partículas de
latex con Bacterias Aglutinación de las partículas
anticuerpos
Anticuerpo (Antígeno específico) = reconocen el antígeno bacteriano.
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Familia Streptococcaceae
Ambas clasificaciones se asocian entre sí, así tenemos por ejemplo estreptococos
beta hemolíticos del grupo A como Streptococcus pyogenes, que corresponde al más
patógeno del género.
Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder
patógeno. Es el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis,
faringitis, otitis, etc. Además provoca enfermedades sistémicas como fiebre puerperal y
escarlatina.
Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este
género, agente causante de neumonía lobar en el hombre. Es un diplococo no
perfectamente esférico, tiene forma de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulenta
se encuentra rodeada por una cápsula. Es habitante normal de la faringe del hombre.
Para su aislamiento las placas deben incubarse en un ambiente con 10% de CO2. En
41
agar sangre S. pneumoniae presenta alfa hemólisis y las colonias son planas con formas
de fichas de damas.
Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis). Existen
otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y animales y se les
conoce con el nombre de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan porque
generalmente son no hemolíticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad (NaCl
6,5%), pH básico (pH 9,6) y en presencia sales biliares en que otros estreptococos no
pueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminación fecal.
AISLAMIETO Y CARACTERIZACIÓ
El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efectúa sembrando la muestra sobre
una placa de agar sangre. Streptococcus pyogenes presenta las siguientes características:
1. Hemólisis en placa de agar sangre. Se observa hemólisis limpia alrededor de las
colonias, las cuales son muy pequeñas.
Se debe confirmar mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo
en cadena, ya que otras especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo
Staphylococcus. Una vez confirmada su presencia se realizan pruebas adicionales para
confirmar el diagnóstico.
a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolíticos del
grupo A (Streptococcus pyogenes) son sensibles a Bacitracina (se realiza en forma
similar a un antibiograma). Otros estreptococos también son sensibles, sin embargo
no son beta hemolítico.
b) Pruebas serológicas. El diagnóstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar
mediante reacciones serológicas con antisueros específicos para el antígeno
superficial.
c) Bilis/Esculina, aCl 6,5%. Los Enterococos crecen en presencia de NaCl 6,5%,
toleran las sales biliares y pueden hidrolizar la esculina. Estas propiedades se
pueden usar para distinguir los Enterococos de otros cocos Gram Positivo catalasa-
negativos. En la prueba positiva, el tubo donde está el medio se torna de color
chocolate oscuro, característico al desdoblar la bilis esculina.
42
OTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar.
RECUERDE EN TODO MOMENTO TRABAJAR CON TÉCNICA ASÉPTICA
PARA EVITAR LA CONTAMINACIÓN QUE CONDUCIRÁ A RESULTADOS
ERRÓNEOS.
RECUERDE QUE ESTÁ TRABAJANDO CON MUESTRAS BIOLÓGICAS Y
MICROORGANISMOS POTENCIALMENTE PATÓGENOS, POR LO QUE
DEBE APLICAR LAS MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD APRENDIDAS CON
43
ACTIVIDADES PRÁCTICAS
1. Observe las placas sembradas y describa las colonias bacterianas. Describa si
se trata de cultivos puros.
La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, los descubridores del
fenómeno. Este procedimiento se utiliza para confirmar la presencia de Streptococcus
tipo B por la producción de una zona de hemólisis característica cuando crece en la
proximidad de Staphylococcus aureus, lo que se denomina “punta de lanza” (Ver figura
adjunta)
Procedimiento:
a.- Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una única estría en el centro
a partir de un cultivo de Staphylococcus aureus.
b.- Perpendicular a la estría original, realice con el asa una o más estrías con el
cultivo de Streptococcus.
c.- Incubar a la temperatura adecuada.
45
5. Procedimiento toma de muestra desde mucosas.
a. Tomar una placa de Agar Sangre, una placa de Agar Corriente y dividirla en
5 partes iguales. No olvidar rotular la placa en el reverso (por donde se
encuentra el agar) con los datos correspondientes.
b. A continuación tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiólogico.
c. Deslizar la tórula por una de las siguientes mucosas:
i. Mucosa yugal derecha o mejilla derecha.
ii. Mucosa yugal izquierda o mejilla izquierda.
iii. Mucosa vestibular
iv. Paladar Duro
v. Paladar Blando
d. Tomar la placa por su base y realizar la siembra en una de las zonas
demarcadas.
e. Repetir el procedimiento hasta haber sembrado una muestra de cada una de
las mucosas.
46
TEST DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS AGETES
ATIMICROBIAOS
MÉTODO DE DIFUSIÓ E AGAR O KIRBY-BAUER
47
Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus β-hemolíticos
(Mueller-Hinton con sangre de cordero)
48
otros fármacos. La novobiocina es bacteriostática e interfiere con la síntesis de la pared
bacteriana. Este fármaco se utiliza muy poco debido a que su uso está asociado a una
alta incidencia de reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepas resistentes
49
ACTIVIDADES PRÁCTICAS
Nota: Asegúrese de flamear las pinzas cada vez que tome un sensidisco y enfríe en
la tapa de la placa antes de sacar uno.
Trate de no tocar el agar al poner los discos, sólo déjelos caer desde cerca y
presiónelos suavemente contra el agar con la pinza (sin hundirlos!!!)
50
Interpretación del Test de Sensidiscos (2º sesión).
• Observe los halos de inhibición y mida el diámetro de estos para determinar si la
bacteria es “susceptible”, “intermedio” o “resistente” con respecto a los
antibióticos dispuestos en el agar. Compare con la Tabla adjunta.
• Tipos de zonas que pueden desarrollarse alrededor de los discos:
a. Resistentes: No hay zona de inhibición o si existe es muy estrecha.
b. Intermedio: Hay una estrecha zona libre de crecimiento bacteriano alrededor
del disco.
c. Sensible: Hay una amplia zona libre de crecimiento bacteriano alrededor del
disco.
51
TRABAJO PRÁCTICO º3:
FISIOTAXOOMÍA DE BACTERIAS GRAM EGATIVO
OBJETIVOS
1. Realizar pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de bacterias
Gram negativo.
2. Realizar Test de Detección Comerciales para la identificación de bacterias Gram
negativo (API 10E – API 20E – API 32A - API 10S).
3. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de
productos intermediarios, debido a la acción bacteriana.
4. Realizar prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusión en agar.
52
La identificación de un bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes
ensayos bioquímicos que generalmente determinan la actividad de una vía metabólica
(conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio
de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.
Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado
para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como la
presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o
determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en
presencia de inhibidores, etc. Estas pruebas no significan de ninguna manera un estudio
profundo del metabolismo bacteriano.
53
3. Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene además de sales minerales:
Fosfato de amonio.
Citrato de sodio, como única fuente de carbono.
Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino).
Este medio contiene como única fuente de carbono el citrato y solamente pueden
desarrollarse aquellas bacterias que posean la enzima Citrato Permeasa la que les
permite transportar el citrato a través de la membrana citoplasmática. Una vez en el
interior de la célula el ión citrato es metabolizado a través del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos.
54
4. Agar TSI: Las bacterias pueden utilizar azúcares (hidratos de carbono) a través de
varias rutas metabólicas. Los productos finales de estas reacciones dependerán de la
bacteria de que se trate, del azúcar utilizado y de la ruta metabólica. En general estos
productos serán ácidos (fórmico, pirúvico, láctico, etc.) y gases (CO2, H2). Existen
muchos medios de cultivo que se han diseñado con el objeto de detectar la
producción de ácidos y de gas a partir de distintos azúcares.
El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes
necesarios para el crecimiento de las bacterias y que permite visualizar la utilización
de azúcares. Contiene además de nutrientes como extracto de carne, extracto de
levadura, peptona, etc:
Glucosa al 0,1%
Lactosa al 1,0%
Sacarosa al 1,0%
Citrato de amonio.
Hierro.
Indicador de pH rojo de fenol (Amarillo pH ácido; Rojo pH alcalino).
La bacteria primero usará glucosa, como la concentración es baja, se agota
rápidamente. Si la bacteria fermenta solamente la glucosa, en el fondo del tubo se
producirán ácidos y el indicador de pH virará a amarillo. En cambio, en la superficie
inclinada por efecto del metabolismo oxidativo de los aminoácidos presentes en el
medio de cultivo, se producirán aminas, por lo que el indicador en la superficie
virará a rojo.
Si la bacteria fermenta además de la glucosa, la lactosa (que está en mayor
concentración) todo el tubo virará a amarillo por la producción de ácidos, pues no se
alcanza a consumir toda la lactosa presente.
Si se produce gas se observará como quiebres en el agar o separación de la
columna de agar del fondo del tubo.
Si la bacteria produce H2S, este reacciona con la sal de hierro dando sulfato
ferroso, un compuesto insoluble de color negro.
Este medio permite diferenciar a los microorganismos que fermentan glucosa y/o
lactosa de los que no. Siempre hay que asegurarse que exista desarrollo bacteriano.
55
C: Control negativo
1: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa negativa,
fermentación de lactosa y sacarosa negativa, producción de H2S negativo.
2: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa positiva,
fermentación de lactosa y sacarosa negativa, producción de H2S negativo.
3: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa positiva,
fermentación de lactosa y sacarosa negativa, producción de H2S positivo.
4: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa positiva,
fermentación de lactosa y sacarosa positiva, producción de H2S negativa.
5: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa positiva,
fermentación de lactosa y sacarosa positiva, producción de H2S positiva.
5. Agar LIA : Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar
sobre algunos aminoácidos, desaminándolos o decarboxilándolos. Ejemplo de estas
reacciones enzimáticas son: la decarboxilación de la lisina (Figura 1) y la
desaminación de la lisina.
57
6. Medio MIO: Permite observar motilidad, donde la reacción será positiva cuando el
crecimiento bacteriano se observe como el enturbamiento completo del medio. Si
sólo se limita al pinchazo, es negativa. También es posible observar la presencia de
la enzima ornitina descarboxilasa, que participa en el metabolismo de varios
aminoácidos en algunas bacterias. La reacción positiva se observa por el color
morado del tubo en cambio la reacción negativa el medio se torna amarillo (puede
ponerse morado el fondo). Además, se puede observar la presencia de indol, para lo
cual hay que agregar una gota de reactivo de Kovacs. En este caso, la reacción
positiva será la aparición de un aro rojo sobre la superficie del medio.
58
su susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el
organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes
antimicrobianos más comúnmente usados.
Los métodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son métodos
que determinan in vitro la sensibilidad de los microorganismos a una variedad de
agentes antimicrobianos bajo condiciones específicas y estandarizadas.
ACTIVIDADES PRÁCTICAS
1. Observe las placas sembradas y describa las colonias bacterianas. Describa si se
trata de cultivos puros.
59
Posteriormente siembre en los medio teniendo en cuenta que:
1. Los medios semitendidos (Agar TSI, Urea y LIA) se deben sembrar en
profundidad y en superficie, es decir, atravesándolos hasta el fondo con el asa
en punta, y luego en zig-zag por la superficie.
2. Los medios tendidos (Agar Citrato y Corriente) se siembran sólo en la
superficie, es decir, se realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla).
3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inóculo dentro del tubo con el
medio.
4. Los medios semisólidos (agar MIO) se siembran sólo en profundidad con un asa
en punta, pinchando el agar hasta la mitad del tubo aproximadamente.
Lectura e interpretación de la Batería.
Una vez que la batería es sembrada, se incuba a 37ºC para que los
microorganismos crezcan y produzcan los cambios en los distintos medios.
Posteriormente los resultados se “leen” y se comparan con la Tabla de
Resultados adjunta.
a. Preparar una cámara de incubación y rellenar con agua corriente lo pocillos para
mantener un ambiente húmedo. Que NO quedé un exceso.
b. Anotar en el exceso de la tapa, en la parte lateral, el nombre de la bacteria y el de
un integrante del grupo.
c. Coloque la galería de reacciones sobre la cámara de incubación.
d. Tome con el asa una colonia desde el agar y siembre en el tubo de suero estéril
hasta una medida de densidad igual 0.5 Mc Farland (Estándar)
e. Con una pipeta Pasteur estéril, inocule cada una de las celdas de la galería hasta
el menisco, tal y como se muestra en la figura adjunta (línea azul).
60
f. Llenar las pruebas CIT hasta la cúpula (ver figura)
g. En las pruebas LDC, ODC, URE y H2S coloque, después de inocular, una gota de
aceite mineral, para crea un ambiente microaerofílico.
h. Incubar a 37ºC
g. Lea la tira de acuerdo a la Tabla anexa y luego agregue los reactivos abajo
mencionados:
h. Para la producción de Indol: Coloque una gota del reactivo de James en la prueba
IND (esperar un par de minutos). Coloración rosa indica positivo.
Para la producción de Nitritos: Coloque una gota del reactivo de NIT1 y NIT2 en la
prueba GLU. Esperar unos minutos. Coloración roja indica positivo.
Para la detección de triptofano desaminasa: Coloque una gota de FeCl3 (TDA) en
la prueba TDA (Marrón es positivo)
i. Lea y compare sus resultados con la Tabla adjunta.
j. Rellene la cartilla de resultados según como detalle la profesora.
k. Compare su código numérico con los catálogos que tiene la profesora. Anote el
resultado en la cartilla y guárdelo para pegarlo en su informe.
61
5. Test de difusión por disco (sensidiscos)
a. Tomar una tórula estéril y (sin flamearla!!) sumergirla en el caldo con el inoculo.
Flamear la boca del tubo y cierre.
b. Deslizar la tórula mojada sobre toda la superficie del agar Müller – Hinton. Una
vez que termine, eliminar la tórula.
c. Dejar secar la placa con la tapa ligeramente entreabierta.
d. Tomar la pinza y flamear brevemente. Tomar con cuidado cada uno de los
sensidiscos y distribuirlos homogéneamente en la placa, cuidando de que no
queden demasiado cerca del borde de la placa ni demasiado cerca entre si.
e. Incubar a 37ºC durante 16 hrs.
f. Observar y medir el diámetro del halo formado alrededor de los sensidiscos.
NOTA: Los diversos tamaños de los halos de inhibición producidos por antibióticos
diferentes para una misma especie bacteriana NO PUEDEN SER COMPARADOS
ENTRE SI. Por ejemplo: un halo de inhibición de 30 mm. para Penicilina no indica
mayor sensibilidad que un halo de 20 mm. para Tetraciclina.
62
LECTURA BATERÍA BIOQUÍMICA
Agar Urea
Reacción positiva : El agar se torna fucsia.
Reacción negativa : El agar no cambia de color.
Agar Citrato
Reacción positiva : Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino).
Reacción negativa : El agar permanece de color verde (neutro).
Agar TSI
Utilización de glucosa : Superficie roja (pH alcalino). Se anota K
Fondo amarillo (pH ácido). Se anota A
Utilización de lactosa : Fondo y superficie amarilla (pH ácido). Se anota A/A
Producción de gas : Ruptura de la columna de agar
Producción de H2S : Ennegrecimiento del agar.
Reacción negativa : El tubo no varía de color. Se anota K/K.
Agar LIA
Decarboxilación de lisina positivo : todo el tubo morado (alcalino). Se anota K/K
Decarboxilación de lisina negativo : superficie morada (alcalina). Se anota como K
fondo amarillo (ácido). Se anota como A
Desaminación de lisina positivo : superficie roja. Se anota R
fondo amarillo. Se anota A
Desaminación de lisina negativo : no hay cambio. Se anota A/A
Producción de H2S : ennegrecimiento del agar
Medio MIO
Reacción positiva : El medio se observa de color morado.
Reacción negativa : El medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo).
Presencia de indol
Reacción positiva será la aparición de un aro rojo sobre la superficie del medio al
agregar una gota de reactivo de Kovacs.
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RESULTADOS MAS FRECUETES DE ALGUAS PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA FAMILIA ETEROBACTERIACEAE
Glucosa Lactosa Sacarosa Manitol Sorbitol Gelatina Citrato H2S Motilidad Indol V-P R-M Pigmento Urea
Escherichia coli AG + V + + - - - +/- + - + - -
Shigella flexneri A - V V - - - - - + - + - -
Shigella dispar - V - - - - - - - + - + - -
Salmonella Typha A - - + + - V + + - - + - -
Salmonella paratyphi A AG - - + + - - - + - - + - -
Salmonella paratyphi B AG - - + + - + + + - - + - -
Salmonella gallinarum A - - + + - + +/- - - - + - -
Citrobacter freundii AG + +/- + + - + +/- + - - + - -
Klebsiella pneumoniae AG + + + + - + - - - + - - -
Enterobacter aerogenes AG + + + + -/+ + - + - + - - -
Enterobacter hafniae AG V V + - - V - + - +/- -/+ - -
Serratia marcescens V - + + + + + - + - + -/+ + V
Serratia rubidae AV + + + - + + - +/- - + -/+ + V
Proteus vulgaris AV - + - - + V + + + - + - +
Proteus mirabilis AG - V - - + (+) + + - -/+ + - +
Pseudomonas aeruginosa* - - - - - + + - + - - - + -
Alcaligenes faecalis* - - - - - - V - + - - - - -
* No pertenecen a la familia Enterobacteriaceae
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TABLA I
Producción de H2S
Positivo Negativo
Producción de H2S
Positiva Negativo
Citrato
Positivo Negativo
Negativo Positivo
Proteus vulgaris Proteus mirabilis
Proteus morganii Proteus rettgeri
Providencia spp.
Producción de H2S
Positiva Negativa
Positivo Negativo
Positivo Negativo
Nota : Todos son Ureasa Negativo. Excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica.
No producen gas de Glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica. El resto produce gas de
Glucosa.
a: Ciertas especies de Citrobacter son Lactosa Negativo y pueden ser Indol Positivo o Negativo
67
TRABAJO PRÁCTICO º4:
BACTERIAS AAEROBIAS Y FASTIDIOSAS. FLORA ORMAL
OBJETIVOS
ITRODUCCIÓ
68
En esta cavidad predominan diferentes especies de Streptococcus α hemolíticos
(Grupo viridans). Streptococcus mutans y Streptococcus sanguis que se encuentran a
en la placa dental; Streptococcus mitis que se adhiere tanto a los dientes como a las
mucosas y S. salivarius que predomina en la mucosa lingual. Entre los
microorganismos anaerobios Gram positivo puede encontrase Actinomyces spp. a nivel
de la placa y en menor cantidad algunas especies de Lactobacillus. También es posible
encontrar espiroquetas del género Treponema distintas de T. pallidum. Los cocos Gram
positivo anaerobios pertenecen a los géneros Peptococcus, Peptostreptococcus,
Ruminococcus entre otros. Pueden además aislarse especies de Mycoplasma y
levaduras del género Candida. Por otro lado, la mayoría de los Gram negativos
presentes en la boca son anaerobios estrictos como Bacteroidales y especies del género
Fusobacterium.
La flora de la cavidad oral está involucrada en enfermedades como la caries y
periodontitis. Por una parte, en el desarrollo de la caries dental intervienen no sólo las
bacterias sino también factores externos como el pH ácido resultante de la
descomposición de hidratos de carbono de la dieta, etc. Por otra parte, la periodontitis
resulta de la agresión de la flora normal a los tejidos de soporte del diente (infección
endógena) en individuos susceptibles.
69
Las infecciones producidas por anaerobios pueden dividirse según su origen en:
A fin de obtener resultados óptimos se debe actuar según los siguientes principios
generales:
2H2+ O2 2H2O
70
Por otra parte la reacción del catalizador con el agua libera CO2. Este CO2 es
utilizado para confirmar el ambiente anaerobio, para ello se utiliza un papel indicador
(azul de metileno) que vira de color (de azul a blanco) en presencia de CO2.
BACTERIAS FASTIDIOSAS
71
Las bacterias capnofílicas son aquellas que requieren de una concentración de
CO2 para su proliferación. En la cavidad oral se pueden encontrar un sin número de
estas bacterias, particularmente las involucradas con el desarrollo de las caries. Un
medio propicio para el aislamiento de estas bacterias es el agar “Mitis salivarius”, este
es un medio selectivo para el aislamiento de Streptococcus oralis, Streptococcus
salivarius y Enterococcus (ver recuadro) y se utiliza para estudios microbiológicos de
la placa dental y caries producidas por bacterias presentes en la saliva.
Este medio esta compuesto por cristal violeta, telurito de potasio y azul de
tripan, que son agentes que inhiben la mayoría de los bacilos Gram Negativos y
bacterias Gram positivo a excepción de Streptococcus.
72
ACTIVIDADES PRÁCTICAS
(aprox. 3 mL)
73
II.- Análisis de la microflora anaerobia de la lengua. Siembra en placa de muestras
tomadas de la lengua e incubadas en presencia y ausencia de oxígeno.
74
TRABAJO PRÁCTICO º5:
HOGOS UICELULARES Y FILAMETOSOS
ITRODUCCIÓ
Los hongos son organismos eucariontes que tienen la capacidad de infectar al ser
humano. La mayoría tolera esta exposición sin secuelas, pero algunos desarrollan una
hipersensibilidad alérgica. Esto porque un individuo sano tiene una resistencia innata a
la colonización de hongos y porque la virulencia inherente en estos microorganismo es
muy baja. Sin embargo, en individuos inmunosuprimidos, la infección puede
desencadenar enfermedades que, si no son debidamente controladas, pueden conllevar a
un resultado fatal para el hospedero. A los hongos que se aprovechan de la debilidad
del hospedero se les denominan hongos oportunistas. Hongos como Candida
(Candida albicans), Aspergillus (Aspergillus fumigatus) y varios Zigomicetos (Rhizopus
arrhizus) son ejemplos de ellos.
TALO
(Cuerpo macroscópico)
Unicelular Pluricelular
Levaduras Micelio
Colonias algodonosas,
lanosas, aterciopeladas
75
Hongos unicelulares (Levaduras)
Las levaduras son organismos fúngicos unicelulares que generalmente se reproducen
asexualmente por gemación. Los criterios usados para el diagnóstico son
fundamentalmente morfológicos (macroscópicos y microscópicos).
Las levaduras normalmente prosperan en hábitat con abundante azúcar, tales
como frutas, flores e incluso la corteza de los árboles. Algunas de ellas viven en
simbiosis con animales, especialmente insectos. Las levaduras más importantes desde
el punto de vista comercial son las cepas cerveceras y panaderas de la especie
Sacharomiyces cerevisiae.
76
Hongos Filamentosos:
Estos pueden ser sifonados (aseptados) o septados. Los hongos sifonados son
generalmente multinucleares (ej. Mucoral) y los hongos septados presentan hifas con
tabiques que son prolongaciones de la membrana citoplasmática (ej. Aspergillus,
Dermatophytos).
1) Hongos septados
Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej. Penicillium),
como patógenos oportunistas (ej. Aspergillus) y como patógenos (ej.
Dermatophytos).
77
Figura 2: Estructura microscópica de especies de Aspergillus.
78
Figura 3: Aspecto microscópico de Penicillium.
2) Hongos sifonados.
79
Figura 4: Aspecto microscópico de hongos sifonados.
Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en agar Sabouraud, cuyo
contenido en glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y el pH es ácido (pH
5,6) para impedir la contaminación bacteriana. Generalmente se incuban a 25-30°C por
un tiempo que depende de la especie fúngica (levaduras y hongos ambientales, 48 h
aprox, hongos dermatofitos, 15-30 días).
ota:
-Recuerde el principal criterio para la identificación de estos microorganimos es el
morfológico, por lo tanto, es importante que trabaje con cuidado.
-Recuerde que está trabajando con patógenos oportunistas: Trabaje siempre cerca del
mechero y no se acerque demasiado a los medios que contienen los hongos. Así mismo,
ante cualquier posibilidad de contaminación, lávese de inmediato.
80
ACTIVIDADES PRÁCTICAS
ota: La tinción Gram es sólo una técnica de tinción. Las levaduras no son
Gram + ni Gram -. Recuerde que la característica de ser Gram+ o Gram- está
relacionada con propiedades que pertenecen a las membranas bacterianas.
81
2.- Observación, y descripción de hongos filamentosos.
2.1.- Procedimientos.
a) Examen macroscópico: Color y aspecto (aterciopelada, algodonosa,
polvorienta, lanosa) en anverso y reverso. Anote lo que observe.
b) Examen microscópico: Para esto se realizará un examen al fresco.
Examen al Fresco:
82
83
84
“El camino al éxito, comienza con el
recorrido de nuestros esfuerzos”
85