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Universidad Andrés Bello

Facultad de Ciencias Biológicas


Departamento de Ciencias Biológicas

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

MICROBIOLOGIA

BIO253
CARRERA:
BIOTECOLOGÍA

PROFESORES:
MARIO CASTILLO RUIZ mario.castillo.r@uandresbelo.edu
(PROFESOR ECARGADO)
ALEJADRO GOZÁLEZ CADÍA a.gonzalez.c@uandresbello.edu
ÍNDICE

CONTENIDO FECHA (SECCIÓN) PÁGINAS

INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE
03 – 09
MICROBIOLOGÍA

Nº1 TÉCNICAS BÁSICAS DE


25-27 DE AGOSTO (1)
MICROBIOLOGÍA Y MORFOLOGÍA 10 – 32
1-3 DE SEPTIEMBRE (2)
BACTERIANA
Nº2 FLORA NORMAL Y
8-10 DE SEPTIEMBRE (1)
FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS GRAM 33 – 51
22-24 DE SEPTIEMBRE (2)
POSITIVO. ANTIMICROBIANOS

29 SEPTIEMBRE-1 DE
Nº3 FISIOTAXONOMÍA DE BACTERIAS
OCTUBRE (1) 52 – 67
GRAM NEGATIVO. ANTIMICROBIANOS
13-15 DE OCTUBRE (2)

Nº4 BACTERIAS ANAEROBIAS Y 20-27 DE OCTUBRE (1)


68 – 74
FASTIDIOSAS. FLORA NORMAL 22-29 DE OCTUBRE (2)

Nº5 HONGOS UNICELULARES Y 3 DE NOVIEMBRE (1)


75 – 84
FILAMENTOSOS 5 DE NOVIEMBRE (2)

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INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

1.1 BIOSEGURIDAD
Un laboratorio de microbiología debe contar con la infraestructura necesaria para
manipular un microorganismo de acuerdo a su riesgo biológico cumpliendo con los
procedimientos del nivel de bioseguridad correspondiente (niveles del 1 al 4).

Nuestro trabajo en el laboratorio involucra microorganismos no patógenos, siendo nuestro


nivel de Bioseguridad de tipo 2. Es decir, se requiere de un espacio diseñado especialmente
para la manipulación del microorganismo y otros espacios para la preparación del material
estéril y la eliminación o esterilización del material contaminado. Además se deben seguir
normas que permitan una manipulación libre de contaminación para el microorganismo, el
experimentador y para el medio ambiente.

1.2 MATERIALES PRESETES E U LABORATORIO DE


MICROBIOLOGÍA
Es esencial que posea: estereomicroscopios (lupas), microscopios, refrigeradores, cámaras
de cultivo, balanzas, centrífugas y destiladores de agua. En muchas ocasiones las cámaras
de cultivo y refrigeradores se ubican en una sala especial, o bien algunos de estos equipos
son de uso común para varios laboratorios.
MICROSCOPIO OPTICO COMPUESTO:

• Sistema óptico
o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del
objetivo.
o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de
ésta.
o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la
preparación.
o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

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o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
• Sistema mecánico
o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el
brazo.
o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular o
binocular.
o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar,
cambiar los objetivos.
o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y
micrométrico que consigue el enfoque correcto.

1.2 OTROS MATERIALES UTILIZADOS SO:


a) De vidrio: placas de Petri, matraces Erlenmeyer, tubos de ensayo, pipetas Pasteur,
embudos, matraces aforados, pipetas graduadas, buretas, probetas, cristalizadores,
portaobjetos, cubreobjetos, desecadores, frascos (diferentes capacidades, transparentes o
color ámbar), vasos de precipitado, frascos cuenta gotas, etc.
b) Otros: algodón, papel filtro, papel indicador de pH, papel de envolver, pinzas, bisturíes,
asas con hilos de platino, colorantes, reactivos diversos, etc.

Para realizar siembras y/o repiques, se utilizan asas con hilos de platino o de tungsteno. La
utilización de estos metales se debe a que son resistentes a la oxidación y porque una vez
esterilizados a la llama, se enfrían rápidamente sin riesgo de provocar la muerte de los

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microorganismos con que se está trabajando. Además, estos hilos son muy maleables
pudiendo ser transformados en un asa o en espátula, permitiendo repicar o resembrar desde
un medio líquido o sólido.

Asa níquel-cromo

Placa de Petri Placa petri con medio sólido

Matraz Erlenmeyer. Pipeta Pasteur INCUBADORA

(Rango temperatura 5-100ºC,


microprocesador regula la Tº
+/- 0.5ºC.)

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AUTOCLAVE

En términos de Física experimental se define el punto de ebullición de un líquido como la


temperatura a la cual se iguala el valor de la presión de vapor del fluido con el que
corresponde a la presión atmosférica. El autoclave está formado por una vasija cilíndrica de
hierro forjado, de paredes gruesas y con una tapadera resistente que se cierra
herméticamente mediante la acción o giro de un potente tornillo conectado a una
abrazadera. En un comienzo antes de que se alcance la temperatura de 100ºC, se elimina la
presión del vapor de agua (Flowing steam), de modo que suba la temperatura junto con la
presión, sin alcanzar el punto de ebullición del agua. Este procedimiento aplicado sobre
material resistente a la temperatura elimina las bacterias, virus y esporas, es decir, queda
totalmente estéril.

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1.4 Precauciones en el laboratorio y durante el trabajo práctico

- Para evitar posibles contaminaciones, es esencial la limpieza y el orden dentro del


laboratorio.
- Antes de comenzar a trabajar se debe limpiar el mesón con un algodón embebido en
alcohol etílico 70-96°, o con una solución de hipoclorito de sodio (1-5%).
- Se recomienda trabajar en forma cómoda en un mesón material sintético duro y no
inflamable. Este mesón debe estar ubicado en un sitio con menor corriente de aire (las
ventanas deben estar cerradas), alejado de las zonas de circulación de otras personas y debe
contar con un mechero.
- Los tubos de ensayo o matraces que contengan medios de cultivos o cultivos de mo,
nunca deben abrirse en posición vertical, sino lo más horizontalmente posible (inclinados) y
para quitar el tapón de algodón se mantendrán inclinados con una mano y se abrirán con la
otra, la que sostendrá a su vez el asa (con el dedo meñique, se retira el tapón de algodón
que obtura el tubo). Una vez abierto de la forma señalada, se flamea por algunos segundos
el orificio, repitiendo dicha operación una vez realizada la siembra (el tapón nunca debe
dejarse sobre el mesón).

- Antes de utilizar las asas con hilos de platino, que sirven para las siembras y/o repiques,
éstas deben flamearse al rojo en posición vertical bajo la acción de la llama. Antes de
efectuar la siembra y/o repique debe esperarse algunos segundos a que se enfríen, pudiendo
enfriarse también en el borde de la placa de Petri que contiene el medio de cultivo.
Inmediatamente después de haberlas utilizado, deben flamearse nuevamente, evitando
diseminar el microorganismo en el medio ambiente.

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Partes de la llama
1.- Cono frío: no llega oxígeno
2.- Cono de reducción: poco oxígeno
3.- Cono de oxidación: abundancia de oxígeno
4.- Zona de fusión: alcanza los 1500 ºC (Zona
que esteriliza por calor)

El asa se flamea en la zona 4, hasta lograr la


Incandescencia.

- Las placas de Petri deben abrirse manteniéndolas en lo posible en posición vertical.


- El material de vidrio destinado a esterilización debe prepararse previamente (placas de
Petri envueltas en papel, etc.), estar bien lavado y seco. El lavado se realiza con detergentes
y/o soluciones especiales, luego debe enjuagarse con H2O corriente y posteriormente con
H2O destilada.
- Las observaciones microscópicas, tinciones y las diferentes pruebas bioquímicas deben
realizarse en el momento oportuno.

1.5 ORMAS DE SEGURIDAD E EL LABORATORIO

a) Dejar la ropa innecesaria en las perchas del laboratorio y usar un delantal (blanco).
b) Nunca deben llevarse a la boca lápices, etiquetas o cualquier otro material.
c) Los mesones del laboratorio deben limpiarse antes y al final de cada laboratorio con un
desinfectante apropiado.
d) Las asas con los hilos de platino deben esterilizarse a la llama del mechero en toda su
extensión antes y después de su uso. El salpicado se evita sosteniendo el hilo alrededor de
la llama antes de flamearlo.
e) No se distraiga conversando mientras trabaja, así evitará quemarse con el mechero o
sufrir otros accidentes.

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f) Si se derrama un cultivo en el mesón o piso, cubrir el área con un desinfectante y
notificar al Instructor.
g) Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.
h) Los medios inoculados deben colocarse en las cámaras de cultivo con su identificación
respectiva, ej.: nombre, naturaleza del espécimen, sustrato del cual se aísla, fecha,
identificación del manipulador.
i) Cuando no se utilizan los mecheros, éstos deben guardarse y se debe estar seguro que se
les ha apagado al final de cada laboratorio.
j) Oculares, objetivos, como también otras partes del microscopio, deberán limpiarse antes
después de su uso. Los lentes deben limpiarse con papel especial para lentes o un paño de
batista.
k) Todos los reactivos y equipos deben dejarse en su lugar de origen al término de cada
laboratorio.
l) Todos los tubos, placas de Petri, pipetas, portaobjetos, etc., deben dejarse en los
recipientes adecuados una vez terminado el laboratorio.
m) Todos los materiales de desecho como trozos de papel, algodón, etc., deben colocarse en
los basureros adecuados y no en los mesones o suelo.
n) Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras, deben
comunicarse inmediatamente al Instructor.
ñ) Todos los estudiantes deberían lavarse las manos con jabón o con un desinfectante si es
necesario, antes de dejar el laboratorio.

EVITE ACCIDENTES TRABAJANDO ORDENADAMENTE Y CON PRECAUCION.


Si en forma accidental entra en contacto con este material, avise inmediatamente a su
Instructor indicándole el origen de la contaminación

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TRABAJO PRÁCTICO Nº1
TÉCNICAS BÁSICAS DE MICROBIOLOGÍA

OBJETIVOS
1. Identificar material básico empleado durante la práctica bacteriológica.
2. Adquirir la destreza para manipular materiales y cultivos bacterianos.
3. Adquirir la destreza y el cuidado para trabajar en esterilidad.
4. Conocer los diferentes medios de cultivo.
5. Conocer la utilidad de los medios de cultivo más usados.
6. Conocer el concepto de siembra y aislamiento de bacterias.
7. Practicar diferentes tipos de siembra.
8. Practicar diferentes tipos de aislamiento bacteriano.
9. Conocer distintos tipos de tinciones y la utilidad de éstas.

El Trabajo Práctico Nº1 tiene como objetivo principal que el alumno adquiera los
conocimientos básicos en lo que respecta a la manipulación de cultivos bacterianos
poniendo énfasis en los conceptos de esterilidad, siembra en medios líquidos y sólidos
(diferenciales, selectivos y enriquecidos) y manejo de microorganismos aeróbicos.

El Laboratorio de Microbiología muchas veces está encargado de identificar el


agente etiológico de una determinada patología. Para lograr esto es fundamental la obtención
de un CULTIVO PURO, ya que por lo general la muestra que contiene al patógeno ha
evaluar viene contaminada con bacterias de la flora normal. Por otra parte, luego de la
identificación del microorganismo, el Laboratorio de Microbiología puede orientar respecto
al tratamiento antibiótico a seguir, si este corresponde, ya que se puede evaluar la
susceptibilidad del patógeno a diferentes agentes antimicrobianos.

Como primera actividad práctica el alumno debe concentrarse en realizar los


procedimientos microbiológicos básicos de manera adecuada, manteniendo siempre las
condiciones de esterilidad necesarias para un buen análisis. Por lo tanto, como primeras

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actividades el alumno deberá familiarizarse con el material ESTÉRIL con el que trabajará
(Tabla Nº1) y los procedimiento de siembra y aislamiento de microorganismos desde
diferentes muestras.

La siembra implica colocar los microorganismos en un ambiente que contenga todos


los nutrientes necesarios para su desarrollo y multiplicación. En el laboratorio este medio
ambiente lo constituyen los medios de cultivo, cuyas características van a variar de acuerdo
a los requerimientos de los microorganismos o a los procedimientos experimentales que sea
necesario realizar a lo largo de su proceso de identificación.

Debido a que el cuerpo humano (que incluye a la cavidad oral) es un lugar donde
cohabitan un sin número de microorganismos distintos, generalmente las muestras
contienen una flora mixta, la que se manifiesta por el desarrollo de distintas especies
bacterianas. Por este motivo es de suma importancia obtener una cepa bacteriana aislada
para poder estudiar sus características morfológicas y bioquímicas y así lograr una
identificación correcta (Figura Nº1). Por lo tanto, en una primera instancia, para obtener un
cultivo puro se debe lograr primero el AISLAMIETO de UA COLOIA en medio
sólido, puesto que por definición una colonia proviene de una sola bacteria y por ende
correspondería a un cultivo puro. En el caso de los medios líquidos, una vez obtenido el
crecimiento bacteriano (enturbiamiento), se debe realizar el aislamiento de UA gota a un
medio sólido para obtener colonias aisladas y puras.

Colonia A

Colonias A y B se
encuentran mezcladas Colonia B

.
Figura Nº 1: Aislamiento por estrías o en cuadrantes en placa de agar MacConkey.
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Tabla Nº 1 : Material de uso común en el Laboratorio de Microbiología

Esterilización
Material Tipo esterilización Tipo de material
Antes de ser utilizada Después de ser utilizada

Asa de platino Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizable

Pipetas aforadas de vidrio* Directo a la llama del mechero Sí Sí Re-utilizable

Pipetas aforadas de plástico Química No No Desechable

Pipetas Pasteur de vidrio* Autoclave No Si Desechable


Autoclave
Tubos estériles** Si Si Re-utilizable
Llama Mechero
Placas Petri de vidrio Autoclave Si Si Re-utilizable

Puntas de Papel Absorbente Autoclave No No Desechable

Placas Petri de plástico Química No Si Desechable


* Este material se pueden encontrar en cilindros metálicos o envueltas en papel, ya estériles. En el primer caso, se debe poner el cilindro en
forma horizontal, destaparlo y sacar una pipeta sin tocar con los dedos las otras, en el segundo caso se debe desenvolver la pipeta, de manera
de no tocar su extremo inferior.
** Cada vez que se destape un tubo estéril, se debe flamear su boca y repetir la operación inmediatamente antes de volver a cerrarlo. Este
procedimiento pretende evitar la entrada de microorganismos del aire al interior del tubo.

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Una vez que se obtienen colonias aisladas se puede realizar la identificación de esta
especie bacteriana. Debemos recordar que cada colonia corresponde en su origen a UNA sola
bacteria que se ha desarrollado en un medio de cultivo sólido, hasta formar una población que
se observa como una colonia visible. Por lo tanto, la morfología de esta colonia estará
determinada por millones de bacterias idénticas y será propia de cada tipo de bacteria. Es
importante tener en cuenta que la morfología de colonia también dependerá del medio de
cultivo en el cual se propague la bacteria, ya que su metabolismo depende de la disponibilidad
de nutrientes y tanto la calidad como cantidad de éstos varía en los diferentes medios de
cultivo. La morfología macroscópica de las colonias (análisis macroscópico) permite evaluar
características como forma, elevación, margen, superficie, brillo, color y hemólisis (en agar
sangre) (Figura 2).

Es importante destacar que el crecimiento de las bacterias en medios líquidos no da


origen a la formación de colonias, sino que se evidencia mediante la turbidez del caldo,
sedimento y otras características.

Debido a que muchas especies bacterianas presentan colonias que son muy parecidas se
hace imposible diferenciarlas sólo con la observación MACROCÓPICA de éstas. Por esta
razón además se hace necesario realizar una observación MICROSCÓPICA de las células que
conforman cada colonias.
La suma de los datos obtenidos de la descripción macroscópica y microscópica
proporcionan una orientación sobre las pruebas bioquímicas a realizar para la identificación
definitiva de las bacterias que conforman la colonia.

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Figura Nº 2: Criterios macroscópicos para la descripción de una colonia bacteriana.

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Por otra parte, la observación al microscopio de las bacterias permite conocer una serie
de características complementarias a la morfología de la colonia entre las que encontramos:
forma, disposición o agrupación, presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas,
flagelos), movilidad, etc.

Existen numerosas técnicas para la observación microscópica de los microorganismos


(Tabla Nº 2), dentro de las cuales encontramos:

1. Observación de bacterias vivas: Para observar las bacterias vivas, sin teñir, se utiliza el
microscopio de fase contrastada. Este tipo de microscopio se desarrolló para hacer posible
observar células pequeñas sin teñir. Se basa en utilizar y aumentar la pequeña diferencia de
índice de refracción que existe entre las células y el medio que las circunda. Esta diferencia
puede ser usada para crear una imagen con mucho mayor contraste que la que se obtiene en
el microscopio de campo claro. Este microscopio usa un lente objetivo especial y en el
condensador se inserta un diafragma especial; además para aumentar el contraste se
insertan filtros verdes o azules.
a. Al fresco: Este método de examen permite observar el microorganismo vivo y evita las
deformaciones artificiales de su morfología que producen las técnicas de coloración. Su
aplicación más importante se refiere al estudio de la movilidad de los microorganismos.
b. Con fondo oscuro: Se basa en el fenómeno de Tyndall, de reflexión luminosa. Para la
observación se sustituye el condensador de Abbé por el condensador de fondo oscuro, o
de ultra. Se ilumina la preparación en forma oblicua, incidiendo los rayos luminosos
directamente sobre los microorganismos sin penetrar en el objetivo del microscopio. Se
le emplea para la observación de bacterias muy pequeñas o de aquellas que difícilmente
se observan al microscopio de campo claro por su falta de contraste con el medio.
c. Gota colgante: Consiste en suspender el microorganismo a observar en un líquido y
depositar una gota de la suspensión sobre un cubreobjeto, luego se procede a la
observación microscópica.

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2. Observación de bacterias muertas:
a. Tinciones simples: Se utiliza un sólo colorante para revelar la presencia de
microorganismos y su forma en general. Son de poco uso en bacteriología.
b. Tinción negativa: Se tiñe el fondo mientras que las células permanecen sin teñir
(transparentes), observándose como entidades claras sobre un fondo oscuro. Ejemplo de
este tipo de tinción es la tinción de cápsula en la que se usa tinta china.
c. Tinciones especiales: Se utilizan para observar alguna estructura en particular como
nucleoide, flagelo, esporas, etc.
d. Tinciones diferenciales: Las bacterias son diferentes entre sí, tanto en su estructura
física como en su composición química, de modo que reaccionan en forma diferente
frente a los colorantes. Estas tinciones se utilizan para diferenciar los distintos grupos de
bacterias. La Tinción de Gram es la tinción diferencial más importante usada en
bacteriología. Otra muy utilizada es la Tinción ácido resistente o tinción de Ziehl
Neelsen.

Otras estructuras bacterianas que también pueden ser diferenciadas por métodos de
tinción son las esporas y la cápsula:

a. Observación de esporas: Esta tinción es un ejemplo de una tinción especial. Algunos


géneros bacterianos como Bacillus y Clostridium, producen endosporas como una forma
de resistencia a condiciones ambientales adversas, por ejemplo sequedad o falta de
nutrientes. Las endosporas o esporas se caracterizan por ser altamente resistentes al
calor, a las radiaciones y a la desecación. La resistencia de la espora se debe a la
estructura proteica (rica en aminoácidos azufrados) de sus capas externas, lo que
también las hace resistentes a tinción. Por este motivo las esporas se tiñen en caliente.
b. Observación cápsula: se trata de una tinción negativa, usando tinta china, que permite
determinar la presencia de cápsulas polisacarídicas.

Por lo tanto el estudio macro y microscópico de una muestra bacteriana permite


obtener una orientación preliminar de su identidad y dirige el desarrollo de pruebas
bioquímicas especificas que permitan una buena identificación.

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TICIÓ DE GRAM
La técnica de mayor importancia en el área de la microbiología, es la tinción de Gram
(Figura Nº 3), pues divide a la mayoría de las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivo
y Gram negativo. Además permite diferenciar forma (cocos, bacilos) y la disposición
bacteriana (diplos, cadenas, racimos).

La tinción Gram consiste en teñir un frotis de bacterias con Cristal Violeta, y luego
tratarlas con una solución mordiente (fijadora) de Iodo/Ioduro (Lugol). Todas las bacterias se
tiñen en estas condiciones, sin embargo, sólo algunas son capaces de retener el colorante al
tratarlas con un agente decolorante como etanol o una solución decolorante de Etanol –
Acetona. Las bacterias que retienen el colorante son Gram positivo y las que se decoloran
son las Gram negativo que para observarse deberán teñirse con un colorante de contraste
(Safranina). Por lo tanto, las Gram positivo se verán de color azul/violeta y las Gram
negativo de color rojo o rosado.

La diferencia en la reacción frente a la tinción de Gram se debe a la composición


química de las estructuras externas de las bacterias. Las bacterias Gram positivo tienen una
capa gruesa de peptidoglicán o mureína, mientras que las Gram negativo tienen menor
cantidad de peptidoglicán y tienen una membrana externa (además de la membrana
citoplasmática). La explicación más aceptada es que, luego de la acción de la solución
decolorante, las bacterias Gram positivo son capaces de retener el colorante gracias al
peptidoglicán que se deshidrata. En cambio las Gram negativo, pierden parte de los lípidos de
su membrana externa por acción del decolorante (un solvente orgánico como por ejemplo
alcohol), lo que sumado a la menor cantidad de peptidoglicán, hace que se decoloren. Es
importante destacar que la etapa crítica en la tinción es la decoloración, por lo que se debe
tener especial cuidado en realizarla en forma adecuada.

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Figura Nº 3: Técnica Tinción Gram.

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TABLA Nº 2: Cuadro Resumen Tipo de Tinciones

TICIÓ REACTIVOS PRICIPIO UTILIDAD

Cristal Violeta, Lugol, Gram positivo retienen cristal violeta (azul) Clasificación bacteriana clásica:
Gram
Alcohol – Acetona, Safranina Gram negativo se tiñen con contraste (rojo) Gram Positivo y Negativo

Tinción de esporas Verde de malaquita, Safranina Tiñe la espora (verde) Esporas de bacilos Gram Positivo

Fucsina, Acido Sulfúrico, Azul de Unión ácido resistente de fucsina a escasos ocardia
Kinyoun
Metileno ácidos micólicos de la pared (fucsia) (BAA lábiles)

Naranja de Acridina Tiñe el DNA bacteriano (fluorescencia


Anaranjado de acridina Bacterias Gram lábiles
(fluorescencia) naranja)

Bartonella spp, corpúsculo


Giménez Fucsina, Verde de Malaquita Tiñe la pared de Bartonella (fucsia)
elemental de Chlamydia

Fucsina, Alcohol – Acido, Azul de Unión ácido-alcohol resistente de fucsina a


Ziehl-eelsen Micobacterias (BAAR*)
Metileno ácidos micólicos de pared (fucsia)

Unión de auramina-rodamina al ácido Micobacterias


Auramina – Rodamina
Auramina / rodamina micólico de la pared (fluorescencia (mayor sensibilidad que Ziehl
Permanganato de Potasio
amarilla) Neelsen)

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También es importante señalar que las bacterias Gram positivo pueden
observarse como Gram negativo en algunas condiciones: en cultivos viejos (de más de
24 ó 48 horas), a pH ácido y en condiciones de decoloración muy prolongada.

Un género bacteriano que representa una excepción a la tinción de Gram (no


posee una pared gruesa de peptidoglicán ni una membrana externa) es Mycobacterium
(bacilos ácido – alcohol resistentes), cuyas especies como M. tuberculosis (Bacilo de
Koch) y M. leprae (Bacilo de Hansen) deben ser teñidos con la tinción de Ziehl
Neelsen. Son bacterias que se tiñen con dificultad, pero que una vez teñidas, el
colorante no se libera, aún por acción de decolorantes enérgicos como una solución de
alcohol y ácido clorhídrico. Esta resistencia se debe a la gran cantidad de lípidos que
tienen en su cubierta, incluyendo ácidos grasos de alto peso molecular que constituyen
entre el 20 y el 40% del peso seco de la bacteria. Este contenido inusualmente alto en
lípidos le confieren a este grupo propiedades como: hidrofobicidad (las bacterias
tienden a formar grumos en medio líquido), resistencia a la acción de anticuerpos y el
complemento y, crecimiento lento debido a la dificultad de absorción de nutrientes a
través de esta pared celular lipídica.

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ACTIVIDADES PRÁCTICAS
SIEMBRAS
1. De medios Sólidos a medios Sólidos.
1.1. Desde placa Petri a placa de Petri:
a. Flamear el asa para su esterilización.
b. En la placa Petri con la muestra, enfriar el asa en las zonas del agar donde no
existan colonias.
c. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en
estudio (Con sólo tocar la colonia estará tomando la cantidad de
bacterias suficiente para poder sembrar).
d. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello:
i. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño
sector de la placa. Flamear el asa, para eliminar las bacterias.
ii. Con el asa estéril, deslizarla desde el sector ya sembrado hacia el
sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag.
uevamente flamear el asa, para eliminar las bacterias.
iii. Con el asa estéril, a partir de las últimas líneas realizadas deslizarla
hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. uevamente
flamear el asa.
e. Con el asa estéril, repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta completar
la placa. Tener cuidado de que la última estría no tome contacto con el
lugar donde se realizó el primer sembrado. Tapar la placa y flamear el asa
para su esterilización.
f. Incubar la placa recién sembrada a la temperatura adecuada.

A B

Figura Nº 4: Siembra desde agar en placa petri a agar en placa de petri.


C D
21
2. De medios Sólidos a medios Líquidos.
2.1. Desde placa Petri a tubo con medio de cultivo líquido:
a. Rotular el tubo de caldo con los datos correspondientes (Nombre
Microorganismo, Grupo, Fecha).
b. Flamear el asa para su esterilización.
c. Enfriar el asa en las zonas del agar donde no existan colonias.
d. Tomar una muestra con el asa desde el medio sólido con la bacteria en
estudio (Con sólo tocar la colonia estará tomando la cantidad de bacteria
suficiente para poder sembrar).
e. Flamear la boca del tubo con medio líquido estéril.
f. Introducir el asa dentro del tubo con caldo y agitar vigorosamente.
g. Flamear la boca del tubo y el asa para su esterilización.
h. Tapar el tubo e incubar a la temperatura adecuada.

A B

C D

18 – 24 Hrs.

Figura Nº 5: Siembra desde agar en placa Petri a Tubo con caldo de cultivo.
22
3. De medios Líquidos a medios Sólidos
3.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a placas de Petri:
a. Rotular la placa en el reverso (donde se encuentra el agar) con los datos
correspondientes.
b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitación.
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo
y enfriar el asa en las paredes de este. Introducir el asa hasta el fondo y agitar
suavemente para luego retirarla.
e. Flamear y tapar la boca del tubo.
f. Seleccionar el medio adecuado y poner la placa boca abajo cerca del
mechero. (Recuerde que no debe alejarse del mechero con la placa
abierta para no perder la esterilidad del medio)
g. Tomar la placa por su base y realizar la siembra mediante estrías, para ello:
iv. Deslizar el asa con la muestra en forma de zig – zag en un pequeño
sector de la placa. Flamear el asa, para eliminar las bacterias.
v. Con el asa estéril, deslizarla desde el sector ya sembrado hacia el
sector contrario de la placa nuevamente en forma de zig – zag.
uevamente flamear el asa, para eliminar las bacterias.
vi. Con el asa estéril, a partir de las últimas líneas realizadas deslizarla
hacia el sector contrario de la placa en forma de zig-zag. uevamente
flamear el asa.
vii. Con el asa estéril, repetir el procedimiento descrito en iii.) hasta
completar la placa. Tener cuidado de que la última estría no tome
contacto con el lugar donde se realizó el primer sembrado.
h. Tapar la placa y flamear el asa para su esterilización.
i. Incubar la placa a la temperatura adecuada.

A B C

D
18 – 24 hrs.

Figura Nº 6: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a agar en placa Petri.


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3.2. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con agar (Por
picadura).
a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.
b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitación.
c. Flamear el asa en punta para su esterilización.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo
y enfriar el asa en las paredes de éste. Introducir el asa hasta el fondo y
agitar suavemente para luego retirarla.
e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
f. Efectuar la siembra del tubo con el cultivo bacteriano al tubo con el medio
estéril; para ello:
i.- Destapar el tubo estéril e introducir el asa cargada sin tocar las paredes,
picando el medio de cultivo al centro sin llegar al fondo del mismo.
ii.- Retirar el asa con precaución para producir el menor desgarro posible.
g. Flamear la boca del tubo y taparlo.
h. Flamear el asa para su esterilización.
i. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

A B

C D

Figura Nº 7: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a Tubo con agar


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3.3. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con agar (Zig –
Zag superficie).
a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.
b. Homogenizar el tubo con la muestra por agitación.
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo y
enfriar el asa en las paredes de éste. Introducir el asa hasta el fondo y agitar
suavemente para luego retirarla.
e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
f. Destapar el tubo con agar tendido y flamear la boca del tubo.
g. Introduzca el asa hasta el fondo. Posteriormente, en un sólo movimiento,
deslizar el asa con movimientos en zig – zag ascendentes por la superficie del
medio de cultivo.
h. Flamear y tapar la boca del tubo.
i. Flamear el asa para su esterilización.
j. Incubar el tubo recién sembrado a la temperatura adecuada.

A B

C D

Figura Nº 8: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con agar tendido.

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4. Desde medios Líquidos a medios Líquidos.
4.1. Desde tubo con cultivo bacteriano líquido a tubo con medio de
cultivo líquido.
a. Rotular el tubo con los datos correspondientes.
b. Homogenizar el tubo problema por agitación.
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo
y enfriar el asa en las paredes de éste. Introducir el asa hasta el fondo y
agitar suavemente para luego retirarla.
e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
f. Destapar el tubo con medio de cultivo estéril e introducir el asa cargada sin
tocar las paredes, agitar en el medio de cultivo y retirar con cuidado.
g. Flamear la boca del tubo y taparlo.
h. Flamear el asa para su esterilización.
i. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

A B

18 - 24 hrs.

Figura Nº 9: Siembra desde cultivo bacteriano líquido a tubo con medio de cultivo.

26
Tabla Nº3: Cuadro Resumen Actividad Técnicas de Siembra.

Desde Medio Tipo A Medio Tipo Toma de muestra desde Siembra en Tipo Siembra

Sólido Placa Petri Placa Petri Aislamiento en cuadrantes


Sólido
Líquido Placa Petri Tubo con Medio de cultivo Agitación con asa

Placa Petri Aislamiento en cuadrantes

Sólido Tubo con cultivo líquido Tubo con Agar Pinchadura


Líquido
Tubo con Agar Tendido Zig-Zag superficie

Líquido Tubo con cultivo líquido Tubo con Medio de cultivo Agitación con asa

27
5. Técnicas de Esterilización
5.2. Flameado
a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos
correspondientes.
b. Homogenizar el tubo con el cultivo bacteriano por agitación.
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Destapar el tubo que contiene el cultivo bacteriano, flamear la boca del tubo
y enfriar el asa en las paredes de éste. Introducir el asa hasta el fondo y agitar
suavemente para luego retirarla.
e. Flamear y tapar la boca del tubo con el cultivo bacteriano.
f. Deslizar el asa suavemente por una mitad del agar. Cerrar la placa.
g. Luego, flamear el asa para su esterilización, enfríela en la tapa y deslícela
suavemente por la otra mitad del agar.
h. Cerrar la placa.
i. Incubar la placa a 37ºC.

6. Desinfección y Asepsia
6.2. Cloro
a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos
correspondientes.
b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico
c. Luego con esta misma deslizarla por alguna superficie fuera del laboratorio
de amplia exposición (baranda de la escalera, manillas de las puertas, etc.).
d. Una vez tomada la muestra, pasar la tórula suavemente sobre una mitad de la
placa de agar nutritivo.
e. A continuación, para comprobar la capacidad de desinfección del cloro,
limpiar varias veces la superficie analizada anteriormente con un algodón
con cloro y deslizar una tórula estéril.
f. Pasar la tórula por la otra mitad del agar.
g. Incubar la placa a 37ºC.

6.2. Yodo
a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos
correspondientes.
b. Por una mitad del agar, deslizar suavemente uno de sus dedos.
c. Tome un trozo de algodón con yodo y limpie la yema del dedo que utilizó,
espere unos segundos.
d. Pasar el dedo suavemente por la otra mitad de la placa.
e. Incubar la placa a 37ºC.

6.2. Alcohol
a. Dividir una placa de agar nutritivo por la mitad y rotularla con los datos
correspondientes.

28
b. Tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiológico
c. Luego con esta misma deslizarla por otra superficie fuera del laboratorio de
amplia exposición (baranda de la escalera, manillas de las puertas, etc.).
d. Una vez tomada la muestra, pasar la tórula suavemente sobre una mitad de la
placa de agar nutritivo.
e. A continuación, para comprobar la capacidad de desinfección del alcohol,
limpiar varias veces la superficie analizada anteriormente con un algodón con
alcohol y deslizar una tórula estéril.
f. Pasar la tórula por la otra mitad del agar.
g. Incubar la placa a 37ºC.

CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS Y MICROSCÓPICAS


1. Análisis Macroscópico.
Realice la observación de sus aislamientos en las placas de petri sembradas
previamente, según los parámetros presentes en la tabla, recuerde que debe analizar una
sola colonia aislada del cultivo (la más representativa del cultivo).

2. Análisis Microscópicos.
Realice tinción Gram a las colonias que tiene disponibles y observe al microscopio,
caracterizando afinidad tintorial, forma y agrupación bacteriana.

Tinción Gram:
Preparación frotis bacteriano a partir de colonia.
a. Colocar una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de
diámetro).
b. Flamear el asa para su esterilización.
c. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.
d. Obtener una pequeña muestra desde la placa.
e. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del
portaobjeto.
f. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque (sin
hervir).

Preparación frotis bacteriano a partir de caldo de cultivo.


a. Flamear el asa para su esterilización.
b. Enfríe el asa en las paredes internas del tubo.
c. Tome un inóculo del tubo problema procurando que quede una película en
el asa.
d. Esparcir la gota por la superficie del portaobjeto.
e. Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque (sin
hervir).

29
Tinción frotis
a. Verificar, con el dorso de la mano, que el vidrio no esté demasiado caliente.
b. Cubrir el frotis completamente con cristal violeta e incubar por 3 min.
c. Dejar escurrir el cristal violeta y agregar sobre la muestra una solución de
Lugol. Dejar con Lugol por 2 min.
d. Lavar el lugol alternando alcohol-acetona y agua dejando escurrir, hasta que
se decolore completamente.
Nota : Debe primero lavar con el decolorante alcohol – acetona y luego con
agua. De otra manera retirara el colorante de la muestra y no podrá observar
las bacterias.
e. Cubrir con colorante de contraste, Safranina al 1%, por 1 min.
f. Lavar con agua, dejar escurrir y secar suavemente con papel absorbente.
g. Observar en el microscopio óptico con inmersión (objetivo 100X).

Utilizar el microscopio, anotar y fotografiar lo que observe.

3. Tinción de Esporas.
Procedimiento :
a. Limpiar una lámina portaobjeto con alcohol.
b. Con el asa colocar una gota de agua en el centro de la lámina (aprox. 0,5 cm de
diámetro).
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.
e. Obtener una pequeña muestra desde la placa de Bacillus spp.
f. Mezclar la muestra con la gota de agua y esparcirla por la superficie del
portaobjeto.
g. Fijar en el mechero hasta que se seque completamente (sin hervir).
h. No olvidar esterilizar el asa después de usarla.
i. Cortar papel absorbente en forma rectangular, de manera que cubra el frotis con
bacteria, pero que no sobresalga a los bordes de la lamina del portaobjeto.
j. Poner 4 capas de papel sobre el frotis y a continuación agregar solución
colorante Verde de Malaquita. Debe fijarse que el colorante tiene que atravesar
las 4 capas de papel y ponerse en contacto con el frotis bacteriano.
k. Como esta tinción se realiza en caliente: para ello con una pinza de madera debe
colocar la muestra encima de la llama del mechero hasta observar emisión de
vapor durante 5 min. No sobrecaliente para evitar que se queme su muestra o se
rompa el portaobjeto.
l. Una vez que se observa emisión de vapor desde la muestra, se debe reponer el
colorante nuevamente. Debe repetir 3 veces este proceso.
m. Lavar con agua de tal manera que escurra suavemente todo el colorante Verde
de Malaquita.

30
n. Posteriormente cubra el frotis con el colorante de contraste Safranina, durante 2
min.
o. Lavar con agua y secar cuidadosamente con papel absorbente y observar con
lente de inmersión.
NOTA:
− Las bacterias se observan rosadas mientras que las esporas (de menor tamaño
que las bacterias) son pequeñas esferas verdes.
− Es posible observar esporas libres y esporas intracelulares. En estas últimas es
posible determinar si se encuentran al centro o hacia un extremo de la célula y, si la
espora deforma o no al bacilo.
− Una vez observada la muestra desechar la lámina en los frascos con
DESINFECTANTE ubicados en cada mesón.

A B

C D
Papel
Absorbente

E F G
Verde Malaquita Safranina

Figura Nº 10: Procedimiento Tinción de Esporas.

Localización y morfología de las esporas en Bacillus

31
4. Tinción de Cápsula.
Procedimiento:
a. Limpiar una lámina portaobjeto con alcohol.
b. En una esquina de la lámina portaobjeto colocar una gota de Tinta China del
tamaño de una arveja.
c. Flamear el asa para su esterilización.
d. Enfriar el asa en un sector del agar donde no existan colonias.
e. Obtener una pequeña muestra desde la placa de Klebsiella spp.
f. Mezclar la muestra con la gota de tinta, esterilizar el asa y repetir 3 o 4 veces
(sólo agregar la bacteria). La Tinta China impide ver si la solución tiene o no
suficiente bacteria, por lo mismo es necesario mezclar con suficiente cultivo.
g. Tenga cuidado de no ensuciar su cultivo bacteriano con tinta china, asegurarse
de esterilizar el asa previamente y de enfriar ésta.
h. Realizar un frotis de la suspensión de manera que quede una capa delgada. Esto
se realiza tomando un cubreobjeto y esparciendo la mezcla a lo largo del
portaobjeto que contiene la mezcla Tinta China–Bacteria (Figura 12).
i. Fijar suavemente en el mechero.
j. Durante 2 min cubra completamente con colorante de contraste, Fucsina.
k. Lave con agua, seque con papel absorbente y observe con lente inmersión.

A B

C D

F
E

Fucsina

Bacterias
Cápsula

Figura Nº 12: Procedimiento Tinción de Cápsula.


32
TRABAJO PRÁCTICO º 2:
FLORA ORMAL Y FISIOTAXOOMÍA DE BACTERIAS
GRAM POSITIVO

OBJETIVOS
1. Realizar pruebas bioquímicas para la identificación de cocáceas Gram positivo.
2. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de
productos intermediarios, debido a la acción bacteriana.
3. Identificar cepas bacterianas Gram positivo, provenientes de muestras de mucosa
bucal y nasofaríngea.

Como en la mayoría de los animales, en el organismo humano existen lugares


que deben mantenerse estériles y otros donde de forma natural cohabitan una gran
diversidad de microorganismos, aún en las personas más sanas.

La sangre, el líquido cefalorraquídeo, la médula ósea y las vías aéreas inferiores


(bronquios y alvéolos), entre muchos otros, carecen de microorganismos debido a los
mecanismos de defensa que presentan. Pero en la boca, faringe, intestinos, vagina,
oídos, piel, nariz o conjuntivas residen diversos microorganismos que conforman la
FLORA ORMAL del ser humano. Algunos de los microorganismos aislados con
mayor frecuencia desde las diferentes regiones del cuerpo y que se consideran
integrantes de la flora normal son: Staphylococcus epidermidis, S. aureus (portadores),
Streptococcus mitis, S. salivarius, S. mutans, bacterias coliformes como Escherichia
coli, lactobacilos, entre otros.
Innumerables bacterias son filtradas a medida que el aire que los transporta pasa
a través de la nasofaringe, la tráquea y los bronquios; la mayoría de estos
microorganismos son atrapados en la secreciones mucosas y deglutidos. Así, los senos
nasales, la tráquea, los bronquios y los pulmones son habitualmente estériles. La
nasofaringe es el hábitat natural de bacterias y virus patógenos comunes que causan
infecciones en la nariz, garganta, bronquios y pulmones. Algunas personas se
convierten en portadores nasales de estreptococos y estafilococos y descargan estos
microorganismos en grandes cantidades desde la nariz hacia el aire.

33
Las bacterias con las que convivimos diariamente pueden representar un riesgo
para nuestra salud cuando el ecosistema cuerpo humano-bacteria se ve afectado, ya sea
por alteración del ecosistema bacteriano o por factores del hospedero, como una
disminución en las defensas, que permitan que las bacterias normales invadan o ataquen
al ser humano. Es en estos casos que el diagnóstico de los organismos responsables es
de suma importancia para poder elaborar tratamientos adecuados. Por este motivo, el
Laboratorio de Microbiología cumple un rol fundamental en la identificación de
bacterias en una muestra determinada.

En el laboratorio de Microbiología el análisis de una muestra sigue por lo


general, la siguiente secuencia:
a. Siembra y obtención del microorganismo aislado (cultivo puro)
b. Observación de morfología macroscópica
c. Tinciones y observación de morfología y agrupación microscópica.
d. Identificación fisiotaxonómica (reacciones metabólicas específicas)
e. Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos.

La fisiología bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas a través


de las alteraciones que producen en el medio de cultivo. Estas alteraciones están
determinadas por el metabolismo de cada bacteria, por lo tanto ha sido posible
establecer diferencias entre ellas, las que han sido utilizadas en su clasificación en
diferentes géneros y especies.

Las técnicas de identificación bioquímica de las bacterias diferencian géneros y


especies bacterianas en base a la detección de:
a. Utilización de fuentes de carbono: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Manitol,
Sorbitol, Citrato.
b. Formación de productos finales o intermediarios del metabolismo microbiano:
Indol, CO2 Acido sulfhídrico (H2S), Acetilmetilcarbinol, etc.
c. Presencia de enzimas: Catalasa, Ureasa, Oxidasa, Coagulasa, etc.
d. Sensibilidad a algunas compuestos químicos o antibióticos: Bacitracina,
Optoquina, Novobiocina, etc.

34
En general, para cocáceas Gram positivo se utilizan fundamentalmente los dos
últimos métodos, en cambio para bacilos Gram negativo se emplean los tres primeros.
Estos test se pueden realizar mediante baterías en tubos convencionales o mediante
sistemas comerciales más fáciles de manipular (API).
En este trabajo se analizaran dos de las Familias de Bacterias Gram positivo más
importantes, como son la Micrococcaceae y Streptococcaceae.

Familia Micrococcaceae

La Familia Micrococcaceae comprende los géneros Micrococcus, Staphylococcus y


Planococcus. Son bacterias Gram positivo, esféricas (cocos) agrupadas en racimo. Son
catalasa positivo, reacción característica de la Familia Micrococcaceae y que permite
diferenciara la de otros cocos Gram positivos como por ejemplo Streptococcus.

Figura Nº 13: Agrupación de algunas cocáceas Gram Positivo


Las especies del género Micrococcus son saprófitas, se encuentran
habitualmente en la piel de mamíferos, en el suelo y el agua. Tienen metabolismo
estrictamente aerobio, a diferencia de las especies del género Staphylococcus que son
anaerobios facultativos.

Otra característica que diferencia ambos géneros, es la propiedad de


Staphylococcus de fermentar glucosa en anaerobiosis, no así Micrococcus.
35
Las principales especies del género Staphylococcus son:
 Staphylococcus aureus.
 Staphylococcus epidermidis.
Staphylococcus aureus es patógeno para el hombre. Produce una variedad de
factores responsables de su patogenicidad, algunos de estos se describen en las Tablas
Nº 1 y 2.

Tabla Nº 1: Algunas enzimas producidos por Staphylococcus aureus.


Enzimas Acción en la célula blanco
Rompe el cemento celular facilitando la invasión de los
Hialuronidasa
tejidos por las bacterias.
Fibrinolisina Disgrega coágulos de fibrina.
Coagulan el plasma y, se pueden encontrar secretadas al
Coagulasa
medio extracelular y otras que están unidas a membranas.
Nucleasas Hidrolizan DNA.

Tabla Nº 2: Algunas toxinas producidos por Staphylococcus aureus.


Toxinas Acción en la célula blanco

Alfa toxina Es una hemolisina que produce lisis total de los glóbulos rojos. Es una
proteína antigénica de peso molecular 30.000 D.
Leucocidina* Causa degranulación de los leucocitos y macrófagos.

Exfoliatina Algunas cepas producen esta toxina, la que causa el síndrome de piel
quemada.
Enterotoxinas Algunas cepas producen estas toxinas que causan intoxicaciones
alimentarías.
* También es conocida como toxina de Panton - Valentine.
Las toxinas producidas por Staphylococcus aureus son causantes de los síntomas de las
enfermedades estafilocócicas.

36
AISLAMIETO Y CARACTERIZACIÓ

El medio de cultivo utilizado para el aislamiento de S. aureus dependerá del


origen de la muestra. Para el aislamiento de S. aureus de muestras CLÍICAS como
pus, heridas, secreciones, etc. se utiliza:

A. AGAR SAGRE: Éste es un medio enriquecido que contiene sangre desfibrinada


de cordero o de conejo. Permite el desarrollo abundante de las especies de
Staphylococcus y además permite visualizar la producción de hemólisis por lisis de
los glóbulos rojos alrededor de las colonias.
S. aureus : produce halos de hemólisis completa alrededor de las colonias,
producida por la alfa toxina.
S. epidermidis : no produce hemólisis o lo hace débilmente.
Micrococcus : no produce hemólisis.

Figura Nº 14: Tipos de hemólisis

B. AGAR MAITOL SALADO O MEDIO DE CHAPMA: Es un medio


selectivo que contiene Manitol, NaCl al 7,5% y el indicador de pH Rojo de
Fenol. Micrococcus y Staphylococcus son halotolerantes, es decir, son capaces
de crecer en esta concentración de NaCl. En este medio además se evidencia la
fermentación de Manitol, la que se observa por el viraje del indicador a amarillo.
S. aureus: Genera colonias amarillas cremosas rodeadas de una zona amarilla
(producto de la fermentación)
S. epidermidis : generalmente no fermenta el manitol
Micrococcus: No fermenta el manitol.

37
TABLA DE IDETIFICACIÓ DE BACTERIAS GRAM POSITIVO

Cocaceas Bacilos

Catalasa Catalasa positivo

Positivo Negativo Aspecto Tinción Gram

Test de Bacitracina Streptococcus


R S
Observar Hemólisis
Test de Coagulasa Micrococcus Bacilos Grandes
(+) (-) Esporulados
Hemólisis Hemólisis Hemólisis Bordes netos
Alfa Beta Gamma
Staphylococcus aureus Staphylococcus
Coagulasa negativo Bacillus sp
Test de Latex Bilis Esculina
Optoquina Optoquina NaCl 6,5 %
Test de Novobiocina Bacilos finos
resistente sensible
S R Streptococcus Enterococcus
Grupo A, B, C, Listeria
S. Coagulasa negativo Staphylococcus D, F, G
No saprophyticus saprophyticus
Streptococcus Streptococcus Bacilo en empalizada
grupo viridans pneumoniae

Corynebacterium sp
Bilis positivo
NaCl positivo

Enterococcus

38
En los dos medios (Agar Sangre y Agar Manitol Salado) se debe confirmar
mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo en racimo, ya que otras
especies pueden dar colonias semejantes. Una vez confirmada la presencia de cocos
Gram positivo en racimo se realizan pruebas bioquímicas para confirmar el diagnóstico.
Una vez aisladas las colonias y habiendo observado su aspecto y características
en medios selectivos se realizan las pruebas bioquímicas.
Prueba de la Catalasa: Busca la presencia de la enzima catalasa, que
descompone el H2O2.
Enzima Catalasa
H2O2 H2 O + O2

La enzima se encuentra en la mayoría de las bacterias que contienen citocromo.


La excepción es Streptococcus que no puede descomponer el H2O2. El test permite
diferenciar Staphylococcus, Micrococcus y Listeria (catalasa positivo) de Streptococcus
(catalasa negativo).
Para realizar esta prueba se debe colocar una gota de peróxido de hidrógeno en
un portaobjetos, sobre la cual se agrega la colonia en estudio. La aparición rápida y
sostenida de burbujas (antes de 5 segundos) indica test positivo.
Precauciones: no tocar el agar sangre al tomar la colonia ni usar asas de platino
ya que estas sustancias dan falsos positivos.

Si se sospecha que la colonia corresponde a Staphylococcus aureus, se realiza la


prueba de la COAGULASA.
Coagulasa: Es una prueba de PATOGEICIDAD que busca la presencia de la
enzima coagulasa producida por Staphylococcus aureus.

39
La enzima es un activador del fibrinógeno a fibrina, además, la pared de
Staphylococcus aureus posee receptor de fibrinógeno lo que permite la formación de
puentes entre bacteria y bacteria, formándose un coágulo.

Diferencia Staphylococcus aureus de otros Staphylococcus coagulasa negativo.


Esta prueba se puede realizar de dos formas:
a) Técnica en tubo: consiste en incubar plasma de conejo con gotas de cultivo
líquido de Staphylococcus. La reacción positiva se observa como la aparición de
un coágulo a las 4 horas. Esta técnica detecta la coagulasa libre.
b) Técnica en portaobjeto: a partir de un cultivo de Staphylococcus en medio
sólido, se hace una suspensión abundante sobre una gota de agua. Esta
suspensión debe ser lo más homogénea posible. Sobre ésta se coloca una o dos
gotas de plasma de conejo y se homogeniza. La reacción positiva se observa
como aglutinación de las bacterias a los 20 segundos. Esta técnica detecta la
coagulasa unida a membrana.
c) Otra prueba que sirve para diferenciar Staphylococcus aureus de otros
Staphylococcus es un test comercial de aglutinación a través de partículas de
latex. La metodología consiste en poner una gota del reactivo latex sobre un
círculo de la tarjeta, a continuación se emulsiona sobre la gota la colonia
sospechosa, se agita durante unos segundos y si hay formación de grumos
visibles se considera positiva. Siempre se debe realizar un control negativo que
está incluido en el kit. El fundamento de la técnica de aglutinación con
partículas de latex se muestra en la siguiente figura.

Partículas de
latex con Bacterias Aglutinación de las partículas
anticuerpos
Anticuerpo (Antígeno específico) = reconocen el antígeno bacteriano.

40
Familia Streptococcaceae

El Género Streptococcus corresponde a cocos Gram positivos, anaerobios


facultativos que se disponen en pares o en cadenas y son catalasa negativo. Bajo
ciertas condiciones de cultivo las células son ovoides o alargadas. Se encuentran en
diferentes superficies y mucosas del hombre y de algunos animales como cavidad oral,
faringe, piel, tracto intestinal. Algunas especies son utilizadas en la industria lechera
para la elaboración de quesos, leches fermentadas y yoghurt (Streptococcus lactis).
Los miembros del género Streptococcus se clasifican de acuerdo a:
1.- ACTIVIDAD HEMOLÍTICA: según el tipo de hemólisis que presenten al ser
cultivadas en placas de agar sangre de conejo o de cordero.
a) Beta hemolíticos: producen halos limpios de hemólisis alrededor de las
colonias.
b) Alfa hemolíticos: producen halos de hemólisis incompleta de color verdoso
(viridans) alrededor de las colonias.
c) Gama hemolíticos: no producen hemólisis
2.- SEGÚ COSTITUCIÓ ATIGÉICA DE LA PARED CELULAR O
CLASIFICACIÓ DE LACEFIELD: Se basa en la composición química y
antigénica de un hidrato de carbono presente en la pared celular y permite clasificar
a los estreptococos en grupos serológicos que van desde la A hasta la U.

Ambas clasificaciones se asocian entre sí, así tenemos por ejemplo estreptococos
beta hemolíticos del grupo A como Streptococcus pyogenes, que corresponde al más
patógeno del género.
Streptococcus pyogenes produce varias toxinas y enzimas responsables de su poder
patógeno. Es el agente causal de infecciones locales purulentas como amigdalitis,
faringitis, otitis, etc. Además provoca enfermedades sistémicas como fiebre puerperal y
escarlatina.
Streptococcus pneumoniae o pneumococo es otra especie importante de este
género, agente causante de neumonía lobar en el hombre. Es un diplococo no
perfectamente esférico, tiene forma de cabeza de lanza (lanceolado). Su forma virulenta
se encuentra rodeada por una cápsula. Es habitante normal de la faringe del hombre.
Para su aislamiento las placas deben incubarse en un ambiente con 10% de CO2. En

41
agar sangre S. pneumoniae presenta alfa hemólisis y las colonias son planas con formas
de fichas de damas.
Estreptococos fecales o enterococos (por ejemplo Enterococcus faecalis). Existen
otras especies de Streptococcus que habitan el intestino del hombre y animales y se les
conoce con el nombre de estreptococos fecales o enterococos. Se caracterizan porque
generalmente son no hemolíticos y pueden crecer en condiciones de alta salinidad (NaCl
6,5%), pH básico (pH 9,6) y en presencia sales biliares en que otros estreptococos no
pueden hacerlo. Su presencia en alimentos o agua indica contaminación fecal.

AISLAMIETO Y CARACTERIZACIÓ
El aislamiento de Streptococcus pyogenes se efectúa sembrando la muestra sobre
una placa de agar sangre. Streptococcus pyogenes presenta las siguientes características:
1. Hemólisis en placa de agar sangre. Se observa hemólisis limpia alrededor de las
colonias, las cuales son muy pequeñas.
Se debe confirmar mediante tinción de Gram la presencia de cocos Gram positivo
en cadena, ya que otras especies pueden dar colonias semejantes, por ejemplo
Staphylococcus. Una vez confirmada su presencia se realizan pruebas adicionales para
confirmar el diagnóstico.
a) Prueba de sensibilidad a Bacitracina. Los estreptococos beta hemolíticos del
grupo A (Streptococcus pyogenes) son sensibles a Bacitracina (se realiza en forma
similar a un antibiograma). Otros estreptococos también son sensibles, sin embargo
no son beta hemolítico.
b) Pruebas serológicas. El diagnóstico de Streptococcus pyogenes se debe confirmar
mediante reacciones serológicas con antisueros específicos para el antígeno
superficial.
c) Bilis/Esculina, aCl 6,5%. Los Enterococos crecen en presencia de NaCl 6,5%,
toleran las sales biliares y pueden hidrolizar la esculina. Estas propiedades se
pueden usar para distinguir los Enterococos de otros cocos Gram Positivo catalasa-
negativos. En la prueba positiva, el tubo donde está el medio se torna de color
chocolate oscuro, característico al desdoblar la bilis esculina.

42
OTA: Lea el procedimiento por completo antes de comenzar a trabajar.
RECUERDE EN TODO MOMENTO TRABAJAR CON TÉCNICA ASÉPTICA
PARA EVITAR LA CONTAMINACIÓN QUE CONDUCIRÁ A RESULTADOS
ERRÓNEOS.
RECUERDE QUE ESTÁ TRABAJANDO CON MUESTRAS BIOLÓGICAS Y
MICROORGANISMOS POTENCIALMENTE PATÓGENOS, POR LO QUE
DEBE APLICAR LAS MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD APRENDIDAS CON

43
ACTIVIDADES PRÁCTICAS
1. Observe las placas sembradas y describa las colonias bacterianas. Describa si
se trata de cultivos puros.

2. Realizar una tinción de Gram a su muestra problema. Observe al


microscopio.

3. Realizar un aislamiento de colonia en los siguientes tipos de agar.


a. Agar Corriente.
b. Agar Sangre.

4. Realizar las pruebas bioquímicas correspondientes según la tabla


Para el estudio de bacterias Gram positivo, se utilizan básicamente la detección
de enzimas y la sensibilidad a compuestos químicos o antibióticos.
Ante esto, se estudiara la presencia de enzimas como catalasa y coagulasa. La
sensibilidad a antibióticos se verá más adelante.

Procedimiento Prueba de Catalasa:


a. Tome una colonia desde el agar con un mondadientes o varilla de plástico
estéril (sin sacar agar).
b. Poner la bacteria sobre un portaobjeto.
c. Poner sobre el portaobjeto con la bacteria una gota de H2O2 y observe. Anote
lo observado y compare con su resultado del Gram.

Procedimiento Prueba de Coagulasa:


a. Tomar una tira reactiva y agregue una gota de cada reactivo en las zonas
marcadas.
b. Con una varilla de plástico o un mondadientes tome varias colonias desde el
agar.
c. Mezclar con la solución de anticuerpos del Test de aglutinación (plasma de
conejo).
d. Esperar unos minutos agitando constantemente.
e. Si existe la presencia de coágulos (como “leche cortada”), la reacción es
positiva. Si se ve siempre homogéneo, la reacción es negativa. Anote lo
observado y compare con su resultado del Gram.

Procedimiento Prueba Bilis / Esculina:


44
a. Rotular el tubo con agar Bilis / Esculina con los datos correspondientes.
b. Flamear el asa para su esterilización.
c. Tomar un inóculo del tubo con cultivo bacteriano.
d. Efectuar la siembra de la siguiente manera:
i. Destapar el tubo con agar Bilis / Esculina e introducir el asa cargada sin
tocar las paredes, picando el medio de cultivo al centro sin llegar al
fondo del mismo.
ii. Retirar el asa con precaución para producir el menor desgarro posible.
e. Flamear la boca del tubo y taparlo.
f. Flamear el asa para su esterilización
g. Incubar el tubo sembrado a la temperatura adecuada.

Test de CAMP para Streptococcus

La sigla CAMP proviene de Christie, Atkins, Munch y Petersen, los descubridores del
fenómeno. Este procedimiento se utiliza para confirmar la presencia de Streptococcus
tipo B por la producción de una zona de hemólisis característica cuando crece en la
proximidad de Staphylococcus aureus, lo que se denomina “punta de lanza” (Ver figura
adjunta)

Procedimiento:
a.- Sobre una placa de agar Sangre realice con el asa una única estría en el centro
a partir de un cultivo de Staphylococcus aureus.
b.- Perpendicular a la estría original, realice con el asa una o más estrías con el
cultivo de Streptococcus.
c.- Incubar a la temperatura adecuada.

45
5. Procedimiento toma de muestra desde mucosas.
a. Tomar una placa de Agar Sangre, una placa de Agar Corriente y dividirla en
5 partes iguales. No olvidar rotular la placa en el reverso (por donde se
encuentra el agar) con los datos correspondientes.
b. A continuación tomar una tórula estéril y humedecerla en suero fisiólogico.
c. Deslizar la tórula por una de las siguientes mucosas:
i. Mucosa yugal derecha o mejilla derecha.
ii. Mucosa yugal izquierda o mejilla izquierda.
iii. Mucosa vestibular
iv. Paladar Duro
v. Paladar Blando
d. Tomar la placa por su base y realizar la siembra en una de las zonas
demarcadas.
e. Repetir el procedimiento hasta haber sembrado una muestra de cada una de
las mucosas.

6. Siembre una muestra de la zona buconasofaringea y una nasal de su


compañero, de la misma forma que en la actividad anterior, en:
a. Agar Corriente
b. Agar Sangre

46
TEST DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS AGETES
ATIMICROBIAOS
MÉTODO DE DIFUSIÓ E AGAR O KIRBY-BAUER

Una metodología común para el estudio de la sensibilidad a antimicrobianos es


la difusión en agar. Este método cualitativo se basa en la inoculación del
microorganismo sobre una placa de agar donde se colocan discos de papel filtro
estériles impregnados con una concentración conocida de antibiótico. El antibiótico en
los discos difunde radialmente durante el tiempo de incubación de tal manera que a
medida que se aleja del disco, la concentración disminuye. En un punto determinado, la
concentración del antibiótico no podrá inhibir el crecimiento del microorganismo,
produciéndose entonces una zona circular de inhibición (o halo de inhibición) alrededor
del disco. El diámetro del área de inhibición puede ser convertido a las categorías de
“susceptible”, “intermedio” o “resistente” de acuerdo a las tablas publicadas por el
“National Committee for Clinical Laboratories Standars (NCCLS)”.

Antibiograma mediante la técnica de difusión con discos

Interpretación de los halos de Inhibición para Staphylococcus spp (Agar Mueller –


Hinton)

CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE


DROGA
DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm)
Oxacilina 1 µg ≥ 13 11 – 12 ≤ 10
Eritromicina 15 µg ≥ 23 14 – 22 ≤ 13
Clindamicina 2 µg ≥ 21 15 – 20 ≤ 14
Vancomicina 30 µg ≥ 15 - -
Novobiocina 5 µg ≥ 16 - ≤ 16
Amoxicilina /
20 / 10 µg ≥ 20 - ≤ 19
A. Clavulánico

47
Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus β-hemolíticos
(Mueller-Hinton con sangre de cordero)

CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE


DROGA
DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm)
Penicilina 10 unidades ≥ 24 - -
Eritromicina 15 µg ≥ 21 16 – 20 ≤ 15
Clindamicina 2 µg ≥ 19 16 – 18 ≤ 15
Vancomicina 30 µg ≥ 17 - -

Interpretación de los halos de Inhibición para Streptococcus pneumoniae (Mueller-


Hinton con sangre de cordero)

CONTENIDO SENSIBLE INTERMEDIA RESISTENTE


DROGA
DEL DISCO (Halo en mm) (Halo en mm) (Halo en mm)
Penicilina 1 µg de oxacilina ≥ 20
Eritromicina 15 µg ≥ 21 16 – 20 ≤ 15
Trimet/sulfame 1.25 / 25.75 µg ≥ 21 16 – 20 ≤ 15
Vancomicina 30 µg ≥ 17 - -

Bacitracina: Detecta si el desarrollo bacteriano es inhibido por este antibiótico. Se


debe diseminar en una placa de agar sangre una colonia con la precaución de una
siembra homogénea y total de la placa. Luego se coloca un disco de bacitracina, se
incuba 16-24 horas y después se mide el tamaño del halo.
Se considera sensible cuando existe un halo de inhibición ≥ a 10 mm de diámetro.
Se considera resistente cuando el halo de resistencia es de < 10 mm de diámetro.
Micrococcus son sensibles a bacitracina.
Staphylococcus, son resistentes a bacitracina.

Optoquina: es un compuesto químico que pone a prueba la fragilidad de la


membrana celular de la bacteria y que a bajas concentraciones (5µg/ml) permite
diferenciar Streptococcus pneumoniae que es sensible de otros Streptococcus α
hemolíticos. Se utiliza un disco de optoquina que se deposita en una placa de agar
sangre cordero luego de haber diseminado la colonia sospechosa. Se incuba la placa a
37°C por 24 horas y después se mide el halo de inhibición. Si el halo es ≥ de 14 mm,
corresponde a Streptococcus pneumoniae.

ovobiocina: es un antibiótico activo por vía oral. Se utiliza para el tratamiento de


infecciones por S. aureus y para el tratamiento de infecciones urinarias resistentes a

48
otros fármacos. La novobiocina es bacteriostática e interfiere con la síntesis de la pared
bacteriana. Este fármaco se utiliza muy poco debido a que su uso está asociado a una
alta incidencia de reacciones adversas y a que frecuentemente emergen cepas resistentes

Amoxicilina / Ácido Clavulánico: La asociación amoxicilina/ácido clavulánico está


indicado para el tratamiento a corto plazo de las infecciones bacterianas y cuando se
sospecha que estén causadas por cepas resistentes a amoxicilina productoras de beta-
lactamasas. En otras situaciones, debería considerarse la amoxicilina sola. Este
tratamiento se recomienda parea las siguientes infecciones
• Infecciones del tracto respiratorio superior, en particular sinusitis, otitis media,
amigdalitis recurrente: Estas infecciones son a menudo producidas por
Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis y
Streptococcus pyogenes.
• Infecciones del tracto respiratorio inferior, en particular exacerbaciones agudas
de bronquitis crónicas (especialmente si se consideran graves), bronconeumonía.
Estas infecciones son a menudo producidas por Streptococcus pneumoniae,
Haemophilus influenzae y Moraxella catarrhalis.
• Infecciones del tracto genitourinarío e infecciones abdominales, en particular
cistitis (especialmente cuando sea recurrente o complicada excluyendo
prostatitis), aborto séptico, sepsis pélvica o puerperal y sepsis intraabdominal,
las cuales son a menudo producidas por Enterobacterias (principalmente
Escherichia coli, Staphylococcus saprophyticus spp. y Enterococcus spp.)
• Infecciones de la piel y tejidos blandos, en particular celulitis, mordeduras de
animales y abscesos dentales con celulitis diseminada que son a menudo
producidas por Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes y Bacteroides
spp. Algunas cepas bacterianas producen beta-lactamasas, lo cual hace que no
sean sensibles a amoxicilina sola.

49
ACTIVIDADES PRÁCTICAS

7. Realice el Test de difusión por disco (Sensidisco)


a) Ud. cuenta con una placa de agar Müller-Hinton donde se encuentra la bacteria
en estudio.
b) Con el asa, tomar una colonia desde la placa y sembrarla en el tubo de agua
estéril hasta que quede turbio (McFarland 0,5).
c) Tomar una tórula estéril y (SIN FLAMEARLA!!!!) sumérjala en el caldo recién
inoculado. Flamear la boca del tubo y cerrar.
d) Tomar la tórula mojada y deslizarla sobre toda la superficie del agar Müller-
Hinton. Una vez terminado, eliminar la tórula.
e) Tomar una pinza estéril y flamear brevemente. Tomar con cuidado cada uno de
los sensidiscos y distribuirlos homogéneamente en la placa, cuidando de que no
queden demasiado cerca del borde de la placa ni demasiado cerca entre si.

Nota: Asegúrese de flamear las pinzas cada vez que tome un sensidisco y enfríe en
la tapa de la placa antes de sacar uno.
Trate de no tocar el agar al poner los discos, sólo déjelos caer desde cerca y
presiónelos suavemente contra el agar con la pinza (sin hundirlos!!!)

50
Interpretación del Test de Sensidiscos (2º sesión).
• Observe los halos de inhibición y mida el diámetro de estos para determinar si la
bacteria es “susceptible”, “intermedio” o “resistente” con respecto a los
antibióticos dispuestos en el agar. Compare con la Tabla adjunta.
• Tipos de zonas que pueden desarrollarse alrededor de los discos:
a. Resistentes: No hay zona de inhibición o si existe es muy estrecha.
b. Intermedio: Hay una estrecha zona libre de crecimiento bacteriano alrededor
del disco.
c. Sensible: Hay una amplia zona libre de crecimiento bacteriano alrededor del
disco.

51
TRABAJO PRÁCTICO º3:
FISIOTAXOOMÍA DE BACTERIAS GRAM EGATIVO

OBJETIVOS
1. Realizar pruebas bioquímicas convencionales para la identificación de bacterias
Gram negativo.
2. Realizar Test de Detección Comerciales para la identificación de bacterias Gram
negativo (API 10E – API 20E – API 32A - API 10S).
3. Reconocer alteraciones producidas en los medios de cultivo, por la presencia de
productos intermediarios, debido a la acción bacteriana.
4. Realizar prueba de susceptibilidad antimicrobiana por difusión en agar.

En el laboratorio de Microbiología el análisis de una muestra sigue por lo


general, la siguiente secuencia:
a) Siembra y obtención del microorganismo aislado (cultivo puro)
b) Observación de morfología macroscópica
c) Tinciones y observación de morfología y agrupación microscópica.
d) Identificación fisiotaxonómica (reacciones metabólicas específicas)
e) Estudios de sensibilidad a agentes antimicrobianos.
Los trabajos prácticos anteriores se han centrando en los primeros tres puntos (a, b
y c), por lo que el presente se tratará la fisiotaxonomía bacteriana y sensibilidad a
antibióticos de bacterias Gram negativo.

Como se vio en el trabajo práctico sobre bacterias Gram positivo, la


fisiotaxonomía bacteriana estudia el comportamiento de las bacterias vivas frente a
distintos medios de cultivo a través de las alteraciones que producen en estos medios.
Estas alteraciones, son producidas por enzimas específicas de las diferentes bacterias, ya
que no todos los microorganismos poseen los mismos requerimientos nutricionales o
poseen las mismas rutas metabólicas. De este modo esta técnica taxonómica se basa
principalmente en la detección de:
a) Utilización de distintas fuentes de carbono.
b) Presencia de enzimas.
c) Sensibilidad a productos químicos o antibióticos.

52
La identificación de un bacteriana aislada puede realizarse utilizando diferentes
ensayos bioquímicos que generalmente determinan la actividad de una vía metabólica
(conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio
de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado
para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como la
presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o
determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en
presencia de inhibidores, etc. Estas pruebas no significan de ninguna manera un estudio
profundo del metabolismo bacteriano.

A la determinación de la especie se puede llegar según diversos sistemas


(manuales de identificación, comerciales, etc.). Los sistemas comerciales utilizan
modificaciones de las pruebas bioquímicas convencionales, ya sea sustratos
deshidratados, tiras de papel filtro impregnadas con reactivos o pequeños
compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos se emplean códigos
numéricos para la interpretación de resultados.

La batería con la cual trabajaremos en el laboratorio consta de 6 tubos con medio


estéril:
1. Agar tendido corriente: Es un medio sólido nutritivo, que permite observar posible
pigmentación en las colonias.

2. Agar Urea: Es un medio sólido en él que se puede observar la producción de la


enzima Ureasa ya que contiene además de nutrientes básicos:
 Triptona.
 Urea.
 Indicador de pH fenolftaleina.
Esta prueba se basa en la capacidad de algunas bacterias que poseen la enzima
ureasa y pueden degradar urea a amoníaco y CO2. Esta reacción es fácilmente
evidenciable por que el pH varía hacia alcalino debido al efecto del amoníaco. El
cambio de pH se observa por viraje de un indicador de pH como la fenolftaleína.

53
3. Agar Citrato: Este medio de cultivo contiene además de sales minerales:
 Fosfato de amonio.
 Citrato de sodio, como única fuente de carbono.
 Indicador de pH azul de bromo timol (verde a pH neutro, azul a pH alcalino).
Este medio contiene como única fuente de carbono el citrato y solamente pueden
desarrollarse aquellas bacterias que posean la enzima Citrato Permeasa la que les
permite transportar el citrato a través de la membrana citoplasmática. Una vez en el
interior de la célula el ión citrato es metabolizado a través del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos.

54
4. Agar TSI: Las bacterias pueden utilizar azúcares (hidratos de carbono) a través de
varias rutas metabólicas. Los productos finales de estas reacciones dependerán de la
bacteria de que se trate, del azúcar utilizado y de la ruta metabólica. En general estos
productos serán ácidos (fórmico, pirúvico, láctico, etc.) y gases (CO2, H2). Existen
muchos medios de cultivo que se han diseñado con el objeto de detectar la
producción de ácidos y de gas a partir de distintos azúcares.
El Agar TSI (Triple Sugar Iron) es un medio rico que contiene los nutrientes
necesarios para el crecimiento de las bacterias y que permite visualizar la utilización
de azúcares. Contiene además de nutrientes como extracto de carne, extracto de
levadura, peptona, etc:
 Glucosa al 0,1%
 Lactosa al 1,0%
 Sacarosa al 1,0%
 Citrato de amonio.
 Hierro.
 Indicador de pH rojo de fenol (Amarillo pH ácido; Rojo pH alcalino).
La bacteria primero usará glucosa, como la concentración es baja, se agota
rápidamente. Si la bacteria fermenta solamente la glucosa, en el fondo del tubo se
producirán ácidos y el indicador de pH virará a amarillo. En cambio, en la superficie
inclinada por efecto del metabolismo oxidativo de los aminoácidos presentes en el
medio de cultivo, se producirán aminas, por lo que el indicador en la superficie
virará a rojo.
Si la bacteria fermenta además de la glucosa, la lactosa (que está en mayor
concentración) todo el tubo virará a amarillo por la producción de ácidos, pues no se
alcanza a consumir toda la lactosa presente.
Si se produce gas se observará como quiebres en el agar o separación de la
columna de agar del fondo del tubo.
Si la bacteria produce H2S, este reacciona con la sal de hierro dando sulfato
ferroso, un compuesto insoluble de color negro.
Este medio permite diferenciar a los microorganismos que fermentan glucosa y/o
lactosa de los que no. Siempre hay que asegurarse que exista desarrollo bacteriano.

55
C: Control negativo
1: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa negativa,
fermentación de lactosa y sacarosa negativa, producción de H2S negativo.
2: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa positiva,
fermentación de lactosa y sacarosa negativa, producción de H2S negativo.
3: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa positiva,
fermentación de lactosa y sacarosa negativa, producción de H2S positivo.
4: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa positiva,
fermentación de lactosa y sacarosa positiva, producción de H2S negativa.
5: Desaminación de aminoácidos positiva, fermentación de glucosa positiva,
fermentación de lactosa y sacarosa positiva, producción de H2S positiva.

5. Agar LIA : Las distintas bacterias poseen enzimas inducibles que pueden actuar
sobre algunos aminoácidos, desaminándolos o decarboxilándolos. Ejemplo de estas
reacciones enzimáticas son: la decarboxilación de la lisina (Figura 1) y la
desaminación de la lisina.

Figura Nº 1: Esquema de descarboxilación de la Lisina


56
Otro efecto de las bacterias sobre aminoácidos azufrados es la remoción del
grupo -SH2, produciendo H2S (reacción que se observa también en el medio TSI).
Este medio contiene además de nutrientes como peptona y extracto de levadura:
 Aminoácido lisina
 Aminoácidos azufrados
 Glucosa
 Citrato de hierro y amonio
 Indicador de pH púrpura de bromocresol (Amarillo a pH ácido, Morado a pH
alcalino).

La bacteria primero utiliza la glucosa produciendo ácido por lo que el pH baja y


el indicador vira a amarillo. Si la bacteria NO PRODUCE lisina decarboxilasa se
mantendrá esta coloración amarilla (Reacción K/A, negativa). Si la bacteria
PRODUCE la enzima lisina decarboxilasa, la cual remueve el grupo COOH de la
lisina dando como producto CO2 y una diamina (alcalina), entonces el indicador vira
nuevamente hacia el lado alcalino y se revierte el viraje de amarillo a morado
(Reacción K/K, positiva)
Si la bacteria produce H2S éste reacciona con la sal de hierro formando sulfuro
ferroso (negro). Si la bacteria es capaz de desaminar a la lisina, la superficie se verá
roja y el fondo amarillo (Reacción R/A)

57
6. Medio MIO: Permite observar motilidad, donde la reacción será positiva cuando el
crecimiento bacteriano se observe como el enturbamiento completo del medio. Si
sólo se limita al pinchazo, es negativa. También es posible observar la presencia de
la enzima ornitina descarboxilasa, que participa en el metabolismo de varios
aminoácidos en algunas bacterias. La reacción positiva se observa por el color
morado del tubo en cambio la reacción negativa el medio se torna amarillo (puede
ponerse morado el fondo). Además, se puede observar la presencia de indol, para lo
cual hay que agregar una gota de reactivo de Kovacs. En este caso, la reacción
positiva será la aparición de un aro rojo sobre la superficie del medio.

En la figura, los pares están organizados sin y con reactivos de Kovacs,


respectivamente.
1: Motilidad negativa, ornitina descarboxilasa negativa, indol positivo (con reactivo de
Kovacs se observa anillo fucsia)
2: Motilidad positiva, ornitina descarboxilasa positiva, indol negativo (con reactivo de
Kovacs se observa anillo amarillo)
3: Motilidad positiva, ornitina descarboxilasa positiva, indol positivo.

Otra prueba que complementa la determinación de una especie bacteriana


desconocida es la susceptibilidad a antibióticos. Los antibióticos son agentes
terapéuticos producidos por organismos vivos, que inhiben o destruyen a los agentes
infecciosos. Los ensayos de susceptibilidad están indicados para apoyar la
quimioterapia antimicrobiana de tratamiento en procesos infecciosos por bacterias en las
que la identidad del microorganismo no es suficiente para predecir en forma confiable

58
su susceptibilidad. Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el
organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes
antimicrobianos más comúnmente usados.
Los métodos de susceptibilidad antimicrobiana o antibiogramas son métodos
que determinan in vitro la sensibilidad de los microorganismos a una variedad de
agentes antimicrobianos bajo condiciones específicas y estandarizadas.

OTA PARA LA PRUEBA DE LABORATORIO: O es necesario que Ud. se


aprenda de memoria cada una de las reacciones bioquímicas que se describieron.
Sólo debe ser capaz de manejar los conceptos generales, como por ejemplo: "el
medio MIO sirve para ver si la bacteria es móvil o no".

ACTIVIDADES PRÁCTICAS
1. Observe las placas sembradas y describa las colonias bacterianas. Describa si se
trata de cultivos puros.

2. Realizar una tinción de Gram a su muestra problema. Observe al microscopio.

3. Siembra de Batería Bioquímica Convencional.


Cada grupo contara con una batería convencional compuesta por 6 pruebas
bioquímicas dispuestas en 6 tubos. Para sembrar la batería se deben seguir las siguientes
indicaciones:
a. Flamear el asa para su esterilización.
b. Tomar una colonia aislada de la placa de agar Mac Conkey con la muestra a
estudiar.
c. Flamear la boca del tubo con caldo estéril o suero fisiológico, sumergir el asa
con cuidado y agitar.
d. Flamear el asa para su esterilización. El caldo recién sembrado será utilizado
como inóculo para sembrar toda la batería.
e. Esterilizar el asa, enfriar en las paredes internas del tubo recién sembrado y
sumergirla en el caldo.
f. Usar este inóculo para sembrar todos los tubos de la batería.
g. Antes de empezar, anotar los colores de los distintos medios. Esto le servirá
para hacer una comparación con el resultado final.
h. Para cada tubo de la batería el asa debe ser esterilizada previamente y enfriada
en las paredes del tubo antes de sumergirla en el caldo inoculado.

59
Posteriormente siembre en los medio teniendo en cuenta que:
1. Los medios semitendidos (Agar TSI, Urea y LIA) se deben sembrar en
profundidad y en superficie, es decir, atravesándolos hasta el fondo con el asa
en punta, y luego en zig-zag por la superficie.
2. Los medios tendidos (Agar Citrato y Corriente) se siembran sólo en la
superficie, es decir, se realiza un zig-zag con un asa convencional (en argolla).
3. Los caldos se siembran agitando el asa con el inóculo dentro del tubo con el
medio.
4. Los medios semisólidos (agar MIO) se siembran sólo en profundidad con un asa
en punta, pinchando el agar hasta la mitad del tubo aproximadamente.
Lectura e interpretación de la Batería.
Una vez que la batería es sembrada, se incuba a 37ºC para que los
microorganismos crezcan y produzcan los cambios en los distintos medios.
Posteriormente los resultados se “leen” y se comparan con la Tabla de
Resultados adjunta.

4. Siembra de Tira Reactiva Comercial para la identificación de bacterias Gram


negativo (API 10S).
Procedimiento:

a. Preparar una cámara de incubación y rellenar con agua corriente lo pocillos para
mantener un ambiente húmedo. Que NO quedé un exceso.
b. Anotar en el exceso de la tapa, en la parte lateral, el nombre de la bacteria y el de
un integrante del grupo.
c. Coloque la galería de reacciones sobre la cámara de incubación.
d. Tome con el asa una colonia desde el agar y siembre en el tubo de suero estéril
hasta una medida de densidad igual 0.5 Mc Farland (Estándar)
e. Con una pipeta Pasteur estéril, inocule cada una de las celdas de la galería hasta
el menisco, tal y como se muestra en la figura adjunta (línea azul).

60
f. Llenar las pruebas CIT hasta la cúpula (ver figura)
g. En las pruebas LDC, ODC, URE y H2S coloque, después de inocular, una gota de
aceite mineral, para crea un ambiente microaerofílico.
h. Incubar a 37ºC
g. Lea la tira de acuerdo a la Tabla anexa y luego agregue los reactivos abajo
mencionados:
h. Para la producción de Indol: Coloque una gota del reactivo de James en la prueba
IND (esperar un par de minutos). Coloración rosa indica positivo.
Para la producción de Nitritos: Coloque una gota del reactivo de NIT1 y NIT2 en la
prueba GLU. Esperar unos minutos. Coloración roja indica positivo.
Para la detección de triptofano desaminasa: Coloque una gota de FeCl3 (TDA) en
la prueba TDA (Marrón es positivo)
i. Lea y compare sus resultados con la Tabla adjunta.
j. Rellene la cartilla de resultados según como detalle la profesora.
k. Compare su código numérico con los catálogos que tiene la profesora. Anote el
resultado en la cartilla y guárdelo para pegarlo en su informe.

Test Reacciones Positivo Negativo


ONPG Beta galactosidasa Amarillo Incoloro
GLU Fermentación Amarillo, Azul,
/oxidación glucosa Amarillo/Gris Azul/Verdoso
ARA Fermentación Amarillo Azul,
/oxidación glucosa Azul/Verdoso
LDC Enzima lisina Naranja Amarillo
descarboxilasa
ODC Enzima ornitina Rojo/Naranja Amarillo
descarboxilasa
CIT Utilización del citrato Azul/Verde, Azul Verde pálido/
Amarillo
H2S Producción de H2S Depósito/línea negra Incoloro/Gris
URE Enzima ureasa Rojo/Naranja Amarillo

61
5. Test de difusión por disco (sensidiscos)
a. Tomar una tórula estéril y (sin flamearla!!) sumergirla en el caldo con el inoculo.
Flamear la boca del tubo y cierre.
b. Deslizar la tórula mojada sobre toda la superficie del agar Müller – Hinton. Una
vez que termine, eliminar la tórula.
c. Dejar secar la placa con la tapa ligeramente entreabierta.
d. Tomar la pinza y flamear brevemente. Tomar con cuidado cada uno de los
sensidiscos y distribuirlos homogéneamente en la placa, cuidando de que no
queden demasiado cerca del borde de la placa ni demasiado cerca entre si.
e. Incubar a 37ºC durante 16 hrs.
f. Observar y medir el diámetro del halo formado alrededor de los sensidiscos.

Determine sensibilidad o resistencia al antibiótico según NCCLS.

NOTA: Los diversos tamaños de los halos de inhibición producidos por antibióticos
diferentes para una misma especie bacteriana NO PUEDEN SER COMPARADOS
ENTRE SI. Por ejemplo: un halo de inhibición de 30 mm. para Penicilina no indica
mayor sensibilidad que un halo de 20 mm. para Tetraciclina.

62
LECTURA BATERÍA BIOQUÍMICA

Agar Urea
Reacción positiva : El agar se torna fucsia.
Reacción negativa : El agar no cambia de color.

Agar Citrato
Reacción positiva : Viraje del indicador de pH a color azul (alcalino).
Reacción negativa : El agar permanece de color verde (neutro).

Agar TSI
Utilización de glucosa : Superficie roja (pH alcalino). Se anota K
Fondo amarillo (pH ácido). Se anota A
Utilización de lactosa : Fondo y superficie amarilla (pH ácido). Se anota A/A
Producción de gas : Ruptura de la columna de agar
Producción de H2S : Ennegrecimiento del agar.
Reacción negativa : El tubo no varía de color. Se anota K/K.

Agar LIA
Decarboxilación de lisina positivo : todo el tubo morado (alcalino). Se anota K/K
Decarboxilación de lisina negativo : superficie morada (alcalina). Se anota como K
fondo amarillo (ácido). Se anota como A
Desaminación de lisina positivo : superficie roja. Se anota R
fondo amarillo. Se anota A
Desaminación de lisina negativo : no hay cambio. Se anota A/A
Producción de H2S : ennegrecimiento del agar

Medio MIO
Reacción positiva : El medio se observa de color morado.
Reacción negativa : El medio se torna amarillo (puede ponerse morado el fondo).

Presencia de indol
Reacción positiva será la aparición de un aro rojo sobre la superficie del medio al
agregar una gota de reactivo de Kovacs.

63
RESULTADOS MAS FRECUETES DE ALGUAS PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA FAMILIA ETEROBACTERIACEAE

Glucosa Lactosa Sacarosa Manitol Sorbitol Gelatina Citrato H2S Motilidad Indol V-P R-M Pigmento Urea
Escherichia coli AG + V + + - - - +/- + - + - -
Shigella flexneri A - V V - - - - - + - + - -
Shigella dispar - V - - - - - - - + - + - -
Salmonella Typha A - - + + - V + + - - + - -
Salmonella paratyphi A AG - - + + - - - + - - + - -
Salmonella paratyphi B AG - - + + - + + + - - + - -
Salmonella gallinarum A - - + + - + +/- - - - + - -
Citrobacter freundii AG + +/- + + - + +/- + - - + - -
Klebsiella pneumoniae AG + + + + - + - - - + - - -
Enterobacter aerogenes AG + + + + -/+ + - + - + - - -
Enterobacter hafniae AG V V + - - V - + - +/- -/+ - -
Serratia marcescens V - + + + + + - + - + -/+ + V
Serratia rubidae AV + + + - + + - +/- - + -/+ + V
Proteus vulgaris AV - + - - + V + + + - + - +
Proteus mirabilis AG - V - - + (+) + + - -/+ + - +
Pseudomonas aeruginosa* - - - - - + + - + - - - + -
Alcaligenes faecalis* - - - - - - V - + - - - - -
* No pertenecen a la familia Enterobacteriaceae

AG = Acido – Gas (utilización del substrato y producción de gas)


V = Variable
(+) = Positivo después de 3 ó 4 días
+/- = Generalmente positivo
-/+ = Generalmente negativo

64
TABLA I

Fermentación de Glucosa Positivo


Fermentación de Lactosa Positivo
Lisina Desaminasa Negativo

Producción de H2S

Positivo Negativo

Indol Negativo Lisina Descarboxilasa Positivob

Lisina Descarboxilasa Indol

Positivo Negativo Positivo Negativo

Salmonella Arizonaa Citrobacter freundii Escherichia coli Enterobacter spp.


Klebsiella spp.

Nota : Todos producen gas de glucosa.


Todos son Citrato positivo. Excepto E. coli
Todos son Ureasa negativo. Excepto Klebsiella, que puede dar positivo al 2do o 3er día

a : ciertas especies de S. Arizona Fermentan la Lactosa lentamente 65


b : ciertas especies de E. coli son Lisina Descarboxilasa negativo.
TABLA II

Fermentación de Glucosa Positivo


Fermentación de Lactosa Negativo
Lisina Desaminasa Negativo

Producción de H2S

Positiva Negativo

Lisina Descarboxilasa Negativo Lisina Descarboxilasa Negativo

Indol Indol Positivo

Citrato
Positivo Negativo
Negativo Positivo
Proteus vulgaris Proteus mirabilis
Proteus morganii Proteus rettgeri
Providencia spp.

Nota : P. vulgaris y P. mirabilis pueden o no utilizar Citrato


Todos producen un poco de gas de Glucosa
66
Todos son Ureasa positivo. Excepto Providencia
TABLA III
Fermentación de Glucosa Positivo
Fermentación de Lactosa Negativo
Lisina Desaminasa Negativo

Producción de H2S

Positiva Negativa

Lisina Descarboxilasa Lisina Descarboxilasa

Positivo Negativo
Positivo Negativo

Indol Citrato Positivo Indol Negativo Citrato Negativo


Citrato Positivo
Positivo Negativo Citrobactera Indol
Serratia
Citrato Citrato Negativo Positivo
Negativo
Negativo Positivo Salmonella Paratyphi A Shigella spp.
Shigella spp. Yersinia enterocolitica
Edwarsiella
Salmonella Typhi Salmonella Paratyphi B
Salmonella Arizona

Nota : Todos son Ureasa Negativo. Excepto algunas cepas de Yersinia enterocolitica.
No producen gas de Glucosa Shigella, Serratia, Salmonella Typhi y Yersinia enterocolitica. El resto produce gas de
Glucosa.
a: Ciertas especies de Citrobacter son Lactosa Negativo y pueden ser Indol Positivo o Negativo

67
TRABAJO PRÁCTICO º4:
BACTERIAS AAEROBIAS Y FASTIDIOSAS. FLORA ORMAL

OBJETIVOS

1. Conocer la importancia de una buena muestra para un cultivo anaerobio


2. Conocer y practicar el procesamiento microbiológico de bacterias anaerobias y con
requerimientos especiales de cultivo aisladas a partir de muestras de flora normal de la
boca.
3. Conocer algunos cuadros clínicos relevantes causados por microorganismos de este
tipo.

ITRODUCCIÓ

Las bacterias anaerobias estrictas son microorganismos incapaces de


multiplicarse en presencia de oxígeno (el metabolismo del oxigeno genera radicales
tóxicos) ya que no tienen los sistemas de citocromos para el metabolismo del oxígeno,
ni las enzimas superoxido dismutasa (SOD) y catalasa para eliminar estos radicales.
Para su desarrollo in Vitro éstas requieren medios de cultivo enriquecidos y un
ambiente anaeróbico.
En el hombre las bacterias anaeróbicas predominan normalmente en la cavidad
oral alrededor de los dientes, en el tracto gastrointestinal, en los orificios del tracto
genitourinario y en la piel. La mayoría de estos hábitats tienen una baja tensión de
oxígeno y bajo potencial de oxidorreducción.
Si enfocamos nuestra atención en la cavidad oral, es posible observar que
existen diversos ecosistemas donde se encuentran diferencias significativas dependiendo
si el área de estudio es la flora de dientes, la lengua, la mucosa yugal o el crévice
gingival. La flora oral es de tipo mixto, con asociación de microorganismos facultativos
y anaerobios que se adhieren a la superficie dental, en primera instancia gracias a la
película adquirida y luego entre si a través de diferentes polisacáridos de origen
bacteriano (biopelícula). Los dientes corresponden a la única superficie de nuestro
cuerpo que NO sufre recambio lo que facilita enormemente la formación de esta
biopelícula.

68
En esta cavidad predominan diferentes especies de Streptococcus α hemolíticos
(Grupo viridans). Streptococcus mutans y Streptococcus sanguis que se encuentran a
en la placa dental; Streptococcus mitis que se adhiere tanto a los dientes como a las
mucosas y S. salivarius que predomina en la mucosa lingual. Entre los
microorganismos anaerobios Gram positivo puede encontrase Actinomyces spp. a nivel
de la placa y en menor cantidad algunas especies de Lactobacillus. También es posible
encontrar espiroquetas del género Treponema distintas de T. pallidum. Los cocos Gram
positivo anaerobios pertenecen a los géneros Peptococcus, Peptostreptococcus,
Ruminococcus entre otros. Pueden además aislarse especies de Mycoplasma y
levaduras del género Candida. Por otro lado, la mayoría de los Gram negativos
presentes en la boca son anaerobios estrictos como Bacteroidales y especies del género
Fusobacterium.
La flora de la cavidad oral está involucrada en enfermedades como la caries y
periodontitis. Por una parte, en el desarrollo de la caries dental intervienen no sólo las
bacterias sino también factores externos como el pH ácido resultante de la
descomposición de hidratos de carbono de la dieta, etc. Por otra parte, la periodontitis
resulta de la agresión de la flora normal a los tejidos de soporte del diente (infección
endógena) en individuos susceptibles.

Los microorganismos de la boca también causan otras infecciones bucales como


abscesos periapicales y estomatitis y más importante aún, pueden causar una serie de
infecciones extraorales. Por ejemplo, pacientes con válvulas cardíacas patológicas
pueden desarrollar endocarditis bacteriana en la que están implicados Streptococcus α
hemolíticos. Las actinomicosis cérvico-facial, pulmonar, gástrica son un grupo de
infecciones que tienen como agente etiológico especies de Actinomyces, las que
provienen exclusivamente de la boca

Las infecciones de importancia médica por bacterias anaerobias son comunes.


Estas son frecuentemente polimicrobianas, es decir, las bacterias anaerobias en general
producen infecciones mezcladas con otros anaerobios, con anaerobios facultativos y
con aerobios, las infecciones se producen cuando los anaerobios y otras bacterias de la
flora normal contaminan sitios del cuerpo normalmente estériles

69
Las infecciones producidas por anaerobios pueden dividirse según su origen en:

a) Endógenas: abcesos, endocarditis, infecciones pleurales y pulmonares,


bacteremia, infecciones peridontales, peritonitis, sinusitis crónica, gingivitis
necrotizante, colitis pseudomembranosa.

b) Exógenos: intoxicaciones alimentarias, botulismo, tétanos, colitis


pseudomembranosa.

AISLAMIETO DE BACTERIAS AAERÓBICAS

A fin de obtener resultados óptimos se debe actuar según los siguientes principios
generales:

- Correcta recolección y transporte de la muestra clínica


- Procesamiento de muestras con mínima exposición al oxígeno atmosférico
- Uso de medios frescos y prerreducidos
- Empleo correcto del sistema anaeróbico, con inclusión de un catalizador activo
para permitir la eliminación del oxígeno presente

Existen diferentes sistemas que son satisfactorios para el cultivo de bacterias


anaeróbicas. Uno de los más utilizados es el “Sistema GASPAK”, este consta de un
soporte para placas incluido en una cubeta transparente con tapa hermética (Figura 1).
Para crear la atmósfera anaeróbica se utiliza un sobre comercial con catalizador que
contiene una tableta de borohidrato sódico y otra de bicarbonato sódico y ácido cítrico.
Las placas y los tubos sembrados en el interior de la jarra, obtendrán un ambiente de
anaerobiosis, al reaccionar el catalizador con 10 mL de agua destilada estéril que se
adiciona al sistema, de esta manera se produce la reducción del oxígeno según la
siguiente reacción.

2H2+ O2 2H2O

70
Por otra parte la reacción del catalizador con el agua libera CO2. Este CO2 es
utilizado para confirmar el ambiente anaerobio, para ello se utiliza un papel indicador
(azul de metileno) que vira de color (de azul a blanco) en presencia de CO2.

Figura 1: Sistema GASPAK para crecimiento de bacterias anaeróbicas

BACTERIAS FASTIDIOSAS

Las bacterias fastidiosas, corresponden a aquellas que no crecen en medios de


cultivo convencionales (agar nutriente, agar sangre) y requieren medios suplementados
con vitaminas, aminoácidos, factores de crecimiento, etc. Además pueden requerir
condiciones especiales de cultivo como por ejemplo mayor tiempo de incubación,
condiciones anaeróbicas o de CO2 (bacterias capnofílicas).
Un medio utilizado para el crecimiento de bacterias anaeróbicas fastidiosa es el
agar sangre suplementado con hemina-menadiona, la menadiona es una tipo de
vitamina K y la hemina es un producto de la descomposición de la hemoglobina, la
gran cantidad de nutrientes de este medio permite el crecimiento de bacterias
metabólicamente exigentes.

71
Las bacterias capnofílicas son aquellas que requieren de una concentración de
CO2 para su proliferación. En la cavidad oral se pueden encontrar un sin número de
estas bacterias, particularmente las involucradas con el desarrollo de las caries. Un
medio propicio para el aislamiento de estas bacterias es el agar “Mitis salivarius”, este
es un medio selectivo para el aislamiento de Streptococcus oralis, Streptococcus
salivarius y Enterococcus (ver recuadro) y se utiliza para estudios microbiológicos de
la placa dental y caries producidas por bacterias presentes en la saliva.
Este medio esta compuesto por cristal violeta, telurito de potasio y azul de
tripan, que son agentes que inhiben la mayoría de los bacilos Gram Negativos y
bacterias Gram positivo a excepción de Streptococcus.

Streptococcus salivarius en agar Mitis-salivarius


Streptococcus oralis en agar Mitis salivarus

Enterococcus en agar Mitis-salivarius

72
ACTIVIDADES PRÁCTICAS

I.- Flora anaerobia facultativa


1.- Tinción directa de muestras del diente:
Para esto el alumno con un mondadientes estéril tomará muestras de al menos
una superficie dental que le parezca más interesante. Las muestras tomadas se fijarán y
teñirán con tinción de Gram para observar los microorganismos adheridos a la
superficie celular.
Tinción Gram:

1) Preparar un frotis con la bacteria de la siguiente manera:


a.- Colocar una gota de agua en el centro del portaobjeto
b.- Obtener una pequeña muestra desde la mucosa oral a estudiar.
c.- Mezclar la muestra con la gota de agua.
d.- Fijar el frotis exponiéndolo a la llama del mechero hasta que se seque.
2) Teñir el frotis de manera habitual, observar al microscopio, anotar y dibujar lo
que observe

2.- Siembra de saliva en agar sangre y en agar Mitis-Salivarius (Streptococcus mutans)

1) El alumno deberá obtener una muestra de saliva en un tubo de ensayo estéril

(aprox. 3 mL)

2) Se realizarán dos diluciones seriadas 1/10 de la muestra de saliva obtenida en el


punto anterior y se sembrará 0,1 mL de cada dilución en placas Mitis-salivarius.
Con la misma saliva realizar un aislamiento en placas de agar sangre.
3) Incubar las placas en un ambiente con 5% de CO2, que se logra en un tarro con
una vela
4) Realizar análisis macroscópico de colonias en agar sangre y contar colonias
azules y negras en agar Mitis-Salivarius. Las colonias azules corresponden a
Streptococcus mutans que juegan un rol en cariogénesis y son uno de los
principales agentes causales de bacteremias continuas y endocarditis. Las
colonias negras corresponden a Enterococcus, que pueden ser causantes de
infecciones urinarias, bacteremias, abscesos y endocarditis.
5) Realizar análisis microscópico mediante tinción de Gram.

73
II.- Análisis de la microflora anaerobia de la lengua. Siembra en placa de muestras
tomadas de la lengua e incubadas en presencia y ausencia de oxígeno.

1) Con un limpiador lingual (asa de plástico) el alumno tomará muestras


del dorso de la lengua. Desde la secreción remanente en el limpiador realizará 2
aislamientos en placa con asa en loop e incubará una de las placas (agar sangre
suplementado con hemina y menadiona) en anaerobiosis y otra (agar sangre) en
aerobiosis. Además, observará directamente las bacterias, para lo cual se fijarán y
teñirán con tinción de Gram para analizar la microflora adherida a la superficie de la
lengua.
Para el cultivo en anaerobiosis la placa debe ser debidamente rotulada e
incubada en una jarra de anaerobiosis (GASPAK).

2) Realizar análisis macroscópico de colonias observando principalmente la


variedad de colonias distintas. Aquellas colonias pigmentadas de negro en la
placa de agar sangre H-M se relacionan con el nivel de halitosis. Algunas de
estos géneros bacterianos también son causantes de endocarditis.

3) Realizar análisis microscópico mediante tinción de Gram.

74
TRABAJO PRÁCTICO º5:
HOGOS UICELULARES Y FILAMETOSOS

ITRODUCCIÓ

Los hongos son organismos eucariontes que tienen la capacidad de infectar al ser
humano. La mayoría tolera esta exposición sin secuelas, pero algunos desarrollan una
hipersensibilidad alérgica. Esto porque un individuo sano tiene una resistencia innata a
la colonización de hongos y porque la virulencia inherente en estos microorganismo es
muy baja. Sin embargo, en individuos inmunosuprimidos, la infección puede
desencadenar enfermedades que, si no son debidamente controladas, pueden conllevar a
un resultado fatal para el hospedero. A los hongos que se aprovechan de la debilidad
del hospedero se les denominan hongos oportunistas. Hongos como Candida
(Candida albicans), Aspergillus (Aspergillus fumigatus) y varios Zigomicetos (Rhizopus
arrhizus) son ejemplos de ellos.
TALO

(Cuerpo macroscópico)

Unicelular Pluricelular

Levaduras Micelio

Colonias semejantes a las Sifonado Septado


bacterianas

Colonias algodonosas,
lanosas, aterciopeladas

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Hongos unicelulares (Levaduras)
Las levaduras son organismos fúngicos unicelulares que generalmente se reproducen
asexualmente por gemación. Los criterios usados para el diagnóstico son
fundamentalmente morfológicos (macroscópicos y microscópicos).
Las levaduras normalmente prosperan en hábitat con abundante azúcar, tales
como frutas, flores e incluso la corteza de los árboles. Algunas de ellas viven en
simbiosis con animales, especialmente insectos. Las levaduras más importantes desde
el punto de vista comercial son las cepas cerveceras y panaderas de la especie
Sacharomiyces cerevisiae.

Candida spp.: En ciertas condiciones C. albicans, C. tropicalis, C. kefyr, y otras,


son parte de la flora normal de los humanos. Pueden aislarse de las superficies mucosas
sanas de la cavidad oral, vagina, tracto gastrointestinal y área rectal. Sin embargo,
cuando se rompe la barrera mucosa, los microorganismos pueden llegar a la sangre e
invadir pulmones, bazo, riñones, hígado, corazón y cerebro. Este género se caracteriza
por un aspecto macroscópico de su colonia opaco, de color cremoso y consistencia
pastosa (Figura 1)

Figura 1: Observación microscópica de una muestra de esputo en que se ponen en


manifiesto las levaduras en gemación y las pseudohifas de las especies de Candida.

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Hongos Filamentosos:
Estos pueden ser sifonados (aseptados) o septados. Los hongos sifonados son
generalmente multinucleares (ej. Mucoral) y los hongos septados presentan hifas con
tabiques que son prolongaciones de la membrana citoplasmática (ej. Aspergillus,
Dermatophytos).
1) Hongos septados
Estos hongos pueden presentarse como contaminantes ambientales (ej. Penicillium),
como patógenos oportunistas (ej. Aspergillus) y como patógenos (ej.
Dermatophytos).

Aspergillus spp.: Los microorganismos que pertenecen a éste género son


extremadamente frecuentes en el medio ambiente y de crecimiento rápido (48 h). En
contraste con la mayoría de las infecciones producidas por Candida, la aspergilosis se
adquiere de fuentes exógenas. Estos microorganismo se identifican por sus
características morfológicas presentando colonias aterciopeladas, algodonosas o
pulvurentas, coloreadas (crema, verde, café y negras). Microscópicamente
presentan hifas septadas de la que nace una prolongación no septada (conidóforo),
el cual se dilata en su extremo distal (vesículas) rodeándose allí de células
conidiogénicas (fiálides). Las fiálides producen conidios los que se disponen en
forma de cadenas. El conjunto vesícula, fiálide y conidios se conoce como “cabeza
aspergilar”. Ver Figura 2.
De las aproximadamente 900 especies de Aspergillus descritas, A. Fumigatus y
A. Flavus son las que con mayor frecuencia se asocian a enfermedad invasiva. Son
ubiquitarios en el ambiente y no forman parte de la flora normal del ser humano, aunque
pueden producirse colonizaciones transitorias. La aspergilosis está asociada con
problemas respiratorios como la dilatación crónica de la vía aérea hasta un colapso de
un segmento pulmonar.

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Figura 2: Estructura microscópica de especies de Aspergillus.

Penicillium: Estos microorganismo son ubicuitarios en el medio ambiente y


suelen aislarse en muestras de aire y como contaminantes en los cultivos de laboratorio,
desarrollándose en 3-4 días. En 1929, Sir Alexander Fleming observó que una especie
de Penicillium había contaminado su cultivo de Staphylococcus aureus, destruyendo las
bacterias que se encontraban inmediatamente en contacto con el hongo. Esta
observación casual llevó al descubrimiento de la penicilina.
Los hongos que petenecen a este género se caracterizan por la producción
de conodióforos en el extremo de hifas septadas ramificantes. Cuando se alojan en
superficies, como una placa de agar, germinan y crecen rápidamente produciendo
colonias con aspecto polvoriento, de color verde azulado.
P. marnefeii es la única especie patógena de Penicillium y es causa de
infecciones espontáneas del sistema retículoendotelial, afectando vasos linfáticos,
pulmón, hígado, bazo y hueso. Ver figura 3.

78
Figura 3: Aspecto microscópico de Penicillium.

2) Hongos sifonados.

Zigomicetos: Especies de Rhyzopus, Mucor y Absidia han sido implicados en


cuadros de zigomicosis. Macroscópicamente presentan un micelio algodonoso.
Microscópicamente, forman hifas aceptadas y se reproducen asexualmente
produciendo esporangios en los que se desarrollan esporas (Ver figura 4). Las
enfermedades asociadas a estos microorganismos son usualmente la mucormicosis
rinocerebral. Esta infección se origina en los senos paranasales y puede afectar órbita y
el paladar, extendiéndose hacia el cerebro. En pacientes inmunodeprimidos puede
afectar el pulmón, el tracto gastrointestinal y los tejidos subcutáneos.

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Figura 4: Aspecto microscópico de hongos sifonados.

Tanto las levaduras como los hongos filamentosos se siembran en agar Sabouraud, cuyo
contenido en glucosa es mayor que el de otros medios de cultivo y el pH es ácido (pH
5,6) para impedir la contaminación bacteriana. Generalmente se incuban a 25-30°C por
un tiempo que depende de la especie fúngica (levaduras y hongos ambientales, 48 h
aprox, hongos dermatofitos, 15-30 días).

ota:
-Recuerde el principal criterio para la identificación de estos microorganimos es el
morfológico, por lo tanto, es importante que trabaje con cuidado.
-Recuerde que está trabajando con patógenos oportunistas: Trabaje siempre cerca del
mechero y no se acerque demasiado a los medios que contienen los hongos. Así mismo,
ante cualquier posibilidad de contaminación, lávese de inmediato.

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ACTIVIDADES PRÁCTICAS

1.- Observación y descripción de cultivos de levadura.


1.1.- Procedimientos.
a) Examen macroscópico: Describa, tal como lo hacía para colonias bacterianas,
forma, color, aspecto de la superficie, borde, elevación y brillo de las colonias.
Anote lo que observe.
b) Examen microscópico: Realice una tinción Gram tradicional. Es decir, realice
un frotis con la colonia de levaduras en una gota de agua y continúe con el
protocolo por usted conocido. Observe con inmersión y dibuje lo que observa.

ota: La tinción Gram es sólo una técnica de tinción. Las levaduras no son
Gram + ni Gram -. Recuerde que la característica de ser Gram+ o Gram- está
relacionada con propiedades que pertenecen a las membranas bacterianas.

c) Tinción de cápsula en levadura Cryptococcus:


1. Coloque en un portaobjeto limpio una gota de agua y una gota de tinta china.
2. Emulsione una colonia de Cryptococcus y extienda la preparación con otro
portaobjeto.
3. Seque suavemente en la llama del mechero
4. Cubra con fucsina y deje reposar 2-3 minutos.
5. Lave con agua, seque y observe al microscopio con aceite de inmersión en
100X.

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2.- Observación, y descripción de hongos filamentosos.
2.1.- Procedimientos.
a) Examen macroscópico: Color y aspecto (aterciopelada, algodonosa,
polvorienta, lanosa) en anverso y reverso. Anote lo que observe.
b) Examen microscópico: Para esto se realizará un examen al fresco.

Examen al Fresco:

1.- Coloque una gota de azul de lactofenol sobre un portaobjeto.


2.- Flamee un asa, enfríe cerca del mechero y obtenga un pequeño trozo del hongo
(sin sacar agar). DEBE USAR MASCARILLA.
3.- Mezcle el fragmento del hongo con el azul de lactofenol y cubra con un
cubreobjeto.
4.- Observe con aumento de 40X (sin inmersión, ni aplastando la muestra).
5.- Reconozca las estructuras microscópicas reproductivas de cada especie y dibuje.

• Recuerde: el principal criterio para la identificación de estos microorganismos


es el morfológico, por lo tanto, es importante que trabaje con cuidado.

• Recuerde que está trabajando con patógenos oportunistas: Trabaje siempre


cerca del mechero y no se acerque demasiado a los medios que contienen los
hongos. Asimismo, ante cualquier posibilidad de contaminación, lávese de
inmediato.

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“El camino al éxito, comienza con el
recorrido de nuestros esfuerzos”

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