NUMERACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y

E. Coli.

I. INTRODUCCIÓN

La definición generalmente aceptada para el término “coliformes” describe a estos

microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o
anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas.
La presencia de Coliformes fecales y Escherichia coli se utiliza para indicar una
contaminación potencialmente peligrosa por el hecho de que el hábitat natural de
estos microorganismos son las heces humanas y de animales de sangre caliente.
E. coli es aceptada como el indicador más positivo de contaminación fecal
reciente. Esta contaminación se produce, de modo general, por deficiencias en la
limpieza y desinfección en las industrias y por falta de higiene de los
manipuladores.

II. OBJETIVOS

- Familiarizarse con los métodos de recuento, especialmente con el de NMP.

- Detectar bacterias coliformes totales, fecales y E.coli de un alimento.

III. MATERIAL
- Muestra (Agua)
- Placas de Petri
- Tubos de ensayo 16 x 150
- Tubos de ensayo 13 x 100
- Pipetas de 10 y 1 ml.
- Campanas Durham de 10 x 75
- Gradilla
- Mechero Bunsen
 - Caldo lactosa bilis verde brillante (BRILLA)
- Caldo triptonado o peptonado.
- Estufa regulada a 35 – 37 °C.
- Baño maría regulado a 44 °C.
- Reactivo KOVAC’S.

IV. PROCEDIMIENTO
El procedimiento a seguir, depende del tipo de microorganismo que se quiere
enumerar en la muestra de alimento. Así para la presente práctica, se determinará
en una muestra de agua el número de coliformes totales, coliformes fecales
(termotolerantes) y E. coli fecal.

A. DETERMINACIÓN DE COLIFORMES TOTALES

1. Desinfectar la mesa de trabajo con alcohol yodado.

2. Agitar el frasco que contiene la muestra.
3. Pipetear 10 ml de la muestra original a cada uno de los tres primeros
tubos conteniendo 10 ml de caldo BRILLA doble concentrado, 1 ml a
los tres siguientes tubos conteniendo BRILLA a concentración
normal, y 0,1 ml a los tres tubos restantes con BRILLA concentración
normal.
4. Homogeneizar la siembra adecuadamente e incubar los tubos a 35 –
37 °C durante 24 a 48 horas.
5. Anotar como positivos los tubos que muestren producción de gas en
las campanas Durham.
6. Obtener el Número Más Probable (NMP) ver tabla.
B. DETERMINACION DE COLIFORMES FECALES Y E. coli
1. De cada tubo positivo (presencia de gas) del paso anterior, sembrar
una alícuota en caldo BRILLA (concentración simple) y otra alícuota
en caldo triptonado.
2. Incubar en baño maría a 44 °C durante 24 a 48 horas.
3. Luego del tiempo de incubación, efectuar la prueba del Indol en los
tubos con caldo triptonado, para lo cual se adiciona 2 a 3 gotas de
reactivo de Kovacs.
4. Agitar el tubo y observar la formación de un anillo color grosella en la
interfase del medio de cultivo (reacción positiva); un color naranja,
indica la presencia probable de escatol y puede ser reportado también
como una prueba positiva.
5. Los cultivos (tubos) que muestren producción de gas en caldo
BRILLA y formación de Indol en caldo triptonado son positivos a E.
coli fecal.
6. Los cultivos que sólo muestren producción de gas más no producción
de Indol se consideran coliformes fecales.
7. Determinar el NMP de coliformes fecales y E. coli en la tabla de
NMP.

POSITIVO
Presencia de E.coli en caldo
triptonado
 TABLA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE
Índice del NMP y límites de confianza 95% para varias combinaciones de
resultados positivos y negativos cuando se utilizan tres alícuotas de 10, 1 y 0,1
ml.

Límite de
10 ml 1 ml 0,1ml NMP/100ml confianza
0 0 1 3 0,5 9
0 1 0 3 0,5 13
1 0 0 4 0,5 20
1 0 1 7 1 21
1 1 0 7 1 23
1 1 1 11 3 36
1 2 0 11 3 36
2 0 0 9 1 36
2 0 1 14 3 37
2 1 0 15 3 44
2 1 1 20 7 89
2 2 0 21 4 47
2 2 1 28 10 150
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 380
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
 TABLA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE

Número Más Probable (NMP) de bacterias; tres tubos de cada dilución

Número de tubos positivos en cada nivel Límites de confianza

NMP por g.
de dilución
Dilución 10-1 Dilución 10-2 Dilución 10-3 99% 95%
0 1 0 3 <1 23 <1 17
1 0 0 4 <1 28 1 21
1 0 1 7 1 35 2 27
1 1 0 7 1 36 2 28
1 2 0 11 2 44 4 35
2 0 0 9 1 50 2 38
2 0 1 14 3 62 5 48
2 1 0 15 3 65 5 50
2 1 1 20 5 77 8 61
2 2 0 21 5 80 8 63
3 0 0 23 4 177 7 129
3 0 1 40 10 230 10 180
3 1 0 40 10 290 20 210
3 1 1 70 20 370 20 280
3 2 0 90 20 520 30 390
3 2 1 150 30 660 50 510
3 2 2 210 50 820 80 640
3 3 0 200 100 1900 100 1400
3 3 1 500 100 3200 200 2400
3 3 2 1100 200 6400 300 4800