Interpretación de resultados de laboratorio de patologías monitoreadas, análisis de las

muestras tomadas desde los RM (rastro municipal) para la toma de decisiones.

UNAN-LEON
LABORATORIO N° 1: Identificación y recuento de coliformes totales y fecales por NMP

1. Objetivo
Desarrolla el método para la identificación y el recuento de Coliformes totales y fecales en muestras
de carne y leche por el método del número más probable (NMP).
2. Introducción.
Bacterias Coliformes: Microorganismos aeróbicos y anaeróbicos, Gram negativos, no formadores
de esporas, que fermentan la lactosa con producción de ácido y de gas a 35ºC +/- 2°C, cuando se
realiza el ensayo del mismo.
La determinación de microorganismos Coliformes totales por el método del Número más Probable
(NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con
producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C ° ± 2˚C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo
que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa.

En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual
permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y
que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se
emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite
el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde
brillante.

La determinación del número más probable de microorganismos Coliformes fecales se realiza a partir
de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para
fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 45.5 ˚± 0.5°C por un
periodo de 24 a 48 h.

3. Descripción del método de ensayo

Equipos y materiales
MATERIALES
 Utensilios estériles para la manipulación de las muestras tijeras, cucharas.
 Botellas de vidrio de 1000 mL de capacidad
 Tubos de fermentación Durham de 75 x 10 mm.
 Gradillas para tubos de ensayos de ensayos de 16 x 150 mm con tapa roscada.
 Tubos de 16 x 150 mm con tapa rosca, estériles
 Bolsas para stomacher.
 Asa bacteriológica.
EQUIPOS
 Incubadora regulada a 35 º C ± 2 ºC
 Baño María.
 Cabina de bioseguridad clase II.
 Agitador Vortex
  Balanza analítica
 pH- metro digital.

Soluciones, medios, reactivos, biológicos

 Caldo lauril sulfato triptosa (LST)

 Caldo lactosado bilis verde brillante (BGLB)
 Caldo EC
 Agua tamponada con fosfato, según Butterfield:
 Fosfato monopotásico
 Hidróxido de sodio
 Agua destilada para uso de laboratorio

4. Preparación de la muestra analítica

En general, las muestras deben mantenerse en las condiciones adecuadas al producto, hasta el
momento del examen.

5. Realización del ensayo

Ensayo Presuntivo para Coliformes, Coliformes de Origen Fecal.

1. Pesar 50 g de muestra dentro de una bolsa para Stomacher

2. Agregar 450 mL de agua tamponada con fosfato, según Butterfield homogenizar. Si el
peso de la muestra varía, se debe pesar una porción que sea equivalente para que al
agregar el volumen necesario de diluyente estéril se logre preparar una dilución 1:10.
3. Preparar diluciones decimales con el diluyente de agua tamponada con fosfato, según
Butterfield, estéril
4. Agitar todas las suspensiones un agitador tipo Vortex por 7 segundos.
5. Transferir porciones de 1 mL a 3 tubos de ensayos con 9 mL de caldo lauril sulfato
triptosa (LST) o caldo lactosado (CLS) conteniendo tubos de fermentación Durham
invertidos
Nota: Mientras se transfieren las porciones de las diluciones a los tubos con caldo, mantener
inclinada la pipeta en ángulo, de modo que su borde inferior se apoya contra la pared interna del
tubo. Permitir que la pipeta drene de 2 a 3 segundos. No deben transcurrir más de 15 minutos desde
el momento en que la muestra se homogeniza, hasta que todas las diluciones sean inoculadas en el
medio apropiado.
6. Incubar los tubos con LST a 35.0 ± 0.5 °C por 24 ± 2 horas.
 7. Llegadas las 24 horas, examinar los tubos y registrar aquellos con producción de gas, por
ejemplo, el desplazamiento del medio dentro del tubo Durham, o la formación de
efervescencia cuando los tubos se agitan suavemente.
8. Volver a incubar los tubos negativos para la producción de gas, por otras 24 horas
adicionales, examinar de nuevo y registrar los tubos con producción de gas a las 48 ± 2
horas.
9. A todos los tubos con LST que presentan reacciones positivas de producción de gas en
este ensayo presuntivo, se les realizarán los ensayos confirmativos.
10. También se establecen los procesos de control de calidad (blanco, positivos, negativos)
que son llevados a la par de la muestra durante el ensayo.

Ensayo Confirmativo para Coliformes Totales por el Método NMP

1- De cada tubo con LST con reacción positiva de producción de gas registrado en el ensayo
presuntivo, transferir un asa de siembra de la suspensión a otro tubo conteniendo 10 mL de
caldo lactosado bilis verde brillante BGLB, evitando las películas si se presentan.
2- Incubar los tubos con inoculados a 35 °C ± 0.5 °C, examinar y registrar los tubos con
producción de gas a las 48 ± 2 horas.
3- Calcular el número más probable (NMP) de Coliformes totales sobre la base de la
proporción de tubos con BGLB confirmados con reacción de producción de gas para las 3
diluciones consecutivas. Utilizar Tablas del Anexo A.

Ensayo Confirmativo para Coliformes Fecales por el método del número más
probable (NMP).
1- De cada tubo con LST con reacción positiva de producción de gas registrado en el ensayo
presuntivo, transferir un asa de siembra de la suspensión a otro tubo conteniendo 10 mL de
caldo EC.
2- Incubar los tubos con caldo EC por 24 ± 2 horas a 45.5 °C ± 0.5 °C, examinar y registrar
los tubos con producción de gas. Si resultan negativos, volver a incubar y examinar de
nuevo a la 48 ± 2 horas.
3- Usar los resultados de este ensayo para calcular el número más probable (NMP) de los
Coliformes fecales.

Tratamiento de datos y cálculo de los resultados

Para calcular el NMP de organismos Coliformes por gramo de muestra utilizar la tabla en Anexo A
6. Aseguramiento de la calidad
1. Las muestras nunca deben ser tocadas directamente con las manos.
 2. Se deben utilizar solamente instrumentos estériles para manipular todas las muestras.

ANEXO A

Combinación
Indice NMP
de Positivos Límite de Confianza 95%
por
( 0.1 g 0.01 g 0.001 g ) Inferior Superior
g ó mL
0 0 0 0.0 0.0 9.5
0 0 1 3.0 0.2 96.0
0 1 0 3.1 0.2 10.7
0 1 1 6.1 1.2 18.1
0 2 0 6.2 1.2 18.1

1 0 0 3.6 0.2 18.1

1 0 1 7.2 1.3 18.2
1 1 0 7.4 1.3 20.3
1 1 1 11.2 3.6 38.0
1 2 0 11.4 3.6 42.0
1 2 1 15.4 4.5 42.0

2 0 0 9.2 1.4 37.5

2 0 1 14.3 3.6 42.0
2 1 0 14.7 3.7 42.0
2 1 1 20.5 4.5 42.0
2 2 0 21.1 4.5 42.5
2 2 1 27.6 8.7 94.5
2 2 2 34.8 8.7 94.5
2 3 0 28.6 8.7 94.5
2 3 1 36.0 8.7 94.5

3 0 0 23.1 4.6 94.5

3 0 1 38.5 8.7 105.0
3 0 2 63.6 16.8 183.0
3 1 0 42.7 9.0 183.0
3 1 1 74.9 16.9 200.0
3 1 2 115.0 37.0 425.0
3 2 0 93.3 18.1 425.0
3 2 1 149.0 37.0 425.0
3 2 2 215.0 40.0 427.0
3 3 0 240.0 42.0 1000.0
3 3 1 462.0 90.0 2000.0
3 3 2 1100.0 180.0 4100.0
3 3 3 >1100.0 425.00 
Flujograma para identificación y recuento de
Coliformes totales

Pesar 50 gr de muestra en
condiciones de asepsia.

Homogenizar la muestra con

450 ml de agua tamponada con
fosfato

Realizar 2 diluciones decimales más en tubos

9ml de agua tamponada con fosfato.

Sembrar por triplicado cada dilución en tubos con 9 ml

de Caldo Lauryl Sulfato de Sodio (1 X) conteniendo tubos tubo con CLSS con reacción
de fermentación Durham invertidos, incubar a 35 °C ± 2.0 negativa sin producción de gas ˂ 3NMP/ G FIN
°C por 24- 48 ± 2 horas

tubos con CLSS con reacción

positiva de producción de gas

Transferir un asa de siembra de la

suspensión a otro Tubos con 10 ml de
Caldo Lactosa Verde Brillante Bilis 2%
encubar a 35 °C ± 1.0 °C 48 ± 2 horas.

Lectura de tubos positivos en

tablas. NMP de coliformes
totales/g de muestra.

FIN
 Flujograma para identificación y recuento
Coliformes fecales
Pesar 50 gr de muestra en
condiciones de asepsia.

Homogenizar la muestra con

450 ml de agua tamponada con
fosfato

Realizar 2 diluciones decimales más en tubos

9ml de agua tamponada con fosfato.

Sembrar por triplicado cada dilución en tubos con 9 ml

de Caldo Lauryl Sulfato de Sodio (1 X) conteniendo tubos tubo con CLSS con reacción
de fermentación Durham invertidos, incubar a 35 °C ± 2.0 negativa sin producción de gas ˂ 3NMP/ G FIN
°C por 24- 48 ± 2 horas

tubos con CLSS con reacción

positiva de producción de gas

Transferir un asa de siembra de la

suspensión a otro Tubos con 10 ml de
caldo EC incubar a 45.5 °C ± 0.2 °C por 48
± 2 horas.

Lectura de tubos positivos en

tablas. NMP de coliformes FIN
fecales /g de muestra.

ANEXO:

Evaluación de las Pruebas presuntivas y confirmativas en la determinación del NMP de Coliformes

totales y fecales