FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y AMBIENTAL

INGENIERÍA AMBIENTAL
MICROBIOLOGÍA GENERAL

DOCENTE: ZAIDA ROCIO CONTRERAS VELASQUEZ

GUÍA: TECNICAS DE TINCIÓN

1. INTRODUCCIÓN

Las bacterias por su misma estructura son difíciles de visualizar en su estado natural, por lo cual se
han estandarizado métodos de coloración para su estudio. La principal dificultad es la falta de
contraste entre la célula y el medio que la rodea, y la manera más simple de visualizarlas es la
utilización de colorantes. Estos pueden ser utilizados para distinguir entre diferentes tipos de
bacterias o para evidenciar un componente celular específico tales como flagelos, esporas,
cápsulas, paredes celulares, etc.

2. OBJETIVO

 Realizar las técnicas de tinción adecuadas para la identificación bacteriana.

 Diferenciar la morfología bacteriana con cada una de las técnicas de tinción realizadas en
el laboratorio.

3. FUNDAMENTO

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica por
los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadas
positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados
negativamente, tales como los ácidos nucléicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes
catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.

Otros colorantes son moléculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los
constituyentes celulares eosina, la fuscina ácida y el rojo congo.

Otros colorantes son liposolubles y se combinan con los materiales lipidicos de la célula, usándose
a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de
colorantes liposolubles es el negro Sudán.

Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otra
sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente, el
cual se combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora si podrá atacar el
colorante.

Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía son

suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorante simple
que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tan intenso
que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia de bacterias
en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.

3.1 Tinción de Gram:

Es un tipo de Tinción diferencial. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias
pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas.
Las células fijadas al calor sobre un portaobjetos se tiñen primero con una solución de cristal
violeta y son lavadas despúes para quitar el exceso de colorante. En este estado todas las células,
tanto las gramnegativas como las grampositivas, están teñidas de azul. El portaobjetos se cubre
con una solución de yodo – yoduro de potasio (I2-KI). El yodo entra en las células y forma un
complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las células gran + como las gran –
se encuentran en la misma situación. Se decolora con alcohol o acetona, algunos se decoloran
(Gram -), mientras otros no (gran +). Después de la decoloración las células gram+, son todavía
azules o violeta, pero las gran – son incoloras. Para poner en manifiesto las células gran – se
utiliza una coloración de contraste, usualmente safranina o fuscina básica y colorean las células de
color rojo.

Tomado de: http://www.thinkstockphotos.es/image/foto-de-stock-bacteria-blue-cells-and-red-

cells/488881586

3.2 Tinción de endosporas:

Tomado de: https://jugandoconpipetas.files.wordpress.com/2016/12/captura2.jpg?w=604

Se utiliza para teñir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas. Sobre el
portaobjetos con la preparación se agrega verde malaquita que tiñe las células de verde. Luego se
lava con agua destilada con lo que las células se quedan incoloras y las endosporas permanecen
verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las
endosporas continúan su color verde.

3.3 Tinción ácido-alcohol resistencia

Esta tinción sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que no pueden ser
clasificados por la tinción de gran.
Inicialmente se agrega sobre el portaobjetos una mezcla de fuscina fenol, en la que la fuschina
hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Todas las células se tiñen de color rosa, después
se usa un decolorante acido alcohol resistente que hace que las bacterias acidoalcohol
resistentes quedan de color rosa y se decoloran las demás. Como en la tinción de gran se utiliza
un colorante de contraste, que en éste caso es el azul de metileno, lo cual hace que las demás
bacterias se tiñan de azul.

Tomado de;
http://www.biopack.com.ar/backend/upload/Biopack/MailerImagen/00000575_Ziehl%20Neelsen%2
02.jpg

4. PROCEDIMIENTO

4.1. Preparación de un montaje en fresco

1. Coloque sobre un portaobjetos una gota de agua estéril y con ayuda de un asa de
siembra (recuerde siempre esterilizar) tome una colonia y colóquela en la gota de agua.
2. Tape la muestra con un cubreobjetos
3. Visualice al microscopio
4. Anote los resultados

4.2. Preparación de un frotis

1. Coloque sobre 4 láminas portaobjetos una gota de agua estéril y con ayuda de un asa
de siembra arrastre una colonia y colóquela en cada gota de agua. Marque los frotis 1, 2, 3
y 4.
Lámina 1: Cualquier colonia
Lamina 2: Colonia de Escherichia coli o cualquier enterobacteria
Lámina 3: Colonia de stafilococo, estreptococos, etc
Lamina 4: Colonia de Bacillus thurigensis

2. Deje secar al aire.

3. Fije la preparación cortando la lámina tres veces la llama del mechero.
4. Visualizar al microscopio. Realizar dibujos, hacer anotaciones.

4.3 Tinción simple

1. El frotis No 1: cúbralo con azul de metileno, durante 60 segundos.

2. Lave con agua corriente.
3. Secar al aire
4. Visualizar al microscopio. Realizar dibujos, hacer anotaciones.
4.4 Tinción de gram

1. El frotis No 2 y 3: Cubra el frotis con cristal violeta, espere 60 seg y lave con agua
corriente.
2. Cubra el frotis con lugol, espere 60 segundos y lave con agua corriente.
3. Cubra el frotis con alcohol cetona, espere 30 segundos y lave con agua corriente.
4. Cubra el frotis con colorante safranina, espere 60 segundos y lave con agua corriente.
5. Secar al aire
6. Visualizar al microscopio. Realizar dibujos, hacer anotaciones.

4.5. Tinción de esporas:

El frotis No 4:
1. colocarle un papel de filtro encima del frotis y agregar el verde de malaquita.
2. Colocar la muestra encima de un vaso precipitado con agua que está previamente
calentada con el calor del mechero. Se debe evitar que hierva, en caso de que éste se
evapora, se le agrega más colorante; es importante que la muestra no se seque.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante
4. Teñir con safranina por 1 minuto.
5. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
6. visualizar al microscopio. Realizar dibujos. Hacer anotaciones.

5. CUESTIONARIO

 Que componentes celulares contribuyen para que las bacterias se tiñan de un colorante y
no de otro. Explíquelo en las bacterias Gram + y gram -, en las endosporas y bacterias
acidoalcohol resistentes.

 Escribe el nombre de 3 microorganismos, esporulados, capsulados, Gram +, gram -,

acidoalcoholresistentes. Señala la importancia de cada una de ellos.

6. BIBLIOGRAFÍA

ACUA NATURA. Técnicas de Tinción [En Línea]

<http://www.acuanatura.com/cursosonline/tecnicasdetincion/tecnicasdetincion.pdf>

SANCHEZ, Maria de Jesús. Microbiología de Suelos: Técnicas, métodos y medios de cultivo.

Universidad Nacional Autónoma de México. 2004
<http://enlinea.zaragoza.unam.mx/didacta/biologia/micorrizas/Microbiol.pdf >

RODRIGUEZ VALERA, Francisco. Prácticas de Microbiología. Universidad Miguel Hernandez.

España [En Línea] http://egg.umh.es/frvalera/manualDePracticas.pdf

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA. Prácticas de Microbiología y Genética.

Universidad de Salamanca. [En Linea] http://imb.usal.es/Practicas2/P2/Practicas2.pdf