Medida de Analitos Por Métodos de Detección de La Radiación Electromagnética

[AFO007847] MF0371_3 Análisis Bioquímicos en Muestras Biológicas Humanas
[MOD007722] MF0371_3 Análisis Bioquímicos en Muestras Biológicas Humanas

[UDI040844] Medida de analitos por métodos de detección de la radiación electromagnética
INTRODUCCIÓN
Uno de los métodos de medida de analitos se puede realizar a través de la medición de la radiación
electromagnética emitida y absorbida por la materia. Siendo la radiación electromagnética una
forma de energía que se transmite en el espacio sin necesidad de medio ni apoyo para transmitirse,
y no va acompañada de materia.
El analito es un componente (elemento, compuesto o ion) de interés analítico de una muestra. Tiene
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una gran importancia ya que es una especie química cuya presencia o contenido es necesario
co
conocer, identificar y cuantificar, mediante un proceso de radiación electromagnética.
n.
io
A continuación, en la siguiente Unidad Didáctica se van a describir cuales son los diferentes
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conocimientos químicos y leyes que se tiene que tener en cuenta para después realizar una
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descripción de las diferentes técnicas para poder realizar las diferentes mediciones del analito.
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campusvirtual.esnecaformacion.com
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OBJETIVOS
Citar las técnicas basadas en los métodos de detección de la radiación electromagnética:
métodos ópticos de análisis molecular: espectrofotometría de absorción molecular,
espectrofluorometría, turbidimetría, nefelometría y fotometría de reflectancia.
Citar las técnicas basadas en los métodos de detección de la radiación electromagnética:
métodos ópticos de análisis atómico: fotometría de llama, y espectroscopia de absorción
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atómica.
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MAPA CONCEPTUAL
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1. Interacción de la radiación con la materia
Unas de las características esenciales de las radiaciones ionizantes (fotones, neutrones, partículas
cargadas, etc.) es su capacidad de penetrar en la materia e interaccionar con ella. En estas
interacciones, la radiación pierde parte o toda su energía cediéndola al medio que atraviesa
mediante distintos mecanismos de interacción que dependen esencialmente del tipo de Radiación,
de su energía y de las propiedades del medio material con el que interaccionan.
m
Estos procesos de interacción de la radiación con la materia son la causa de los efectos producidos
co
por las radiaciones y determinan las condiciones de propagación de radiación en un medio material.
n.
io
La interacción de la radiación con un material determinado depende fundamentalmente de su carga
ac
eléctrica y su masa. Distinguimos:
m
or
Partículas sin carga y sin masa (fotones).
af
Partículas “ligeras” (electrones).
ec
Partículas “pesadas” (radiación alfa).

sn
Partículas con masa y sin carga (neutrones).

.e
al
Como ya sabemos, la luz es una onda electromagnética, por lo que la interacción de la luz con la
u
matera se debe tratar como una interacción de radiación electromagnética con la materia. Dos de
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los fenómenos más importantes de interacción son la absorción y la dispersión de la luz.

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Absorción
m
La absorción de radiación electromagnética implica el paso de una especie de su estado fundamental

ca
de mínima energía (E0) a un estado excitado de mayor energía (E*). Solo cuando la energía de los
fotones que incidan sobre la especie coincidan exactamente con la diferencia de energía existente
entre su estado fundamental y alguno de los posibles estados excitados se producirá la absorción de
dicha energía.
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La representación gráfica de la atenuación de la radiación incidente (absorbancia) o la radiación
transmitida (transmitancia) frente a la longitud de onda, frecuencia o número de ondas da lugar al
espectro de absorción de dicha especie.
Cuando la frecuencia de la onda electromagnética que incide en un material, coincide o es próxima a
la frecuencia de resonancia de los átomos o moléculas del material, la onda es fuertemente
absorbida ya que la transferencia de energía de la onda al electrón ligado es muy efectiva.
m
Al hacer pasar un haz de luz blanca a través de una material, y la luz transmitida se hace pasar por
co
un prisma, en el espectro transmitido se observan la desaparición de ciertas frecuencias (líneas
n.
negras). Estas frecuencias han sido absorbidas por el material.
io
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Para entender esto debemos considerar que además de la fuerza elástica entre el electrón ligado y el
sn
núcleo, existen fuerzas entre los iones atómicos. Estas fuerzas se pueden representar por
osciladores elásticos pero con una constante recuperadora mucho menos que la fuerza que liga el
.e
al
electrón al núcleo. Esto quiere decir que estos “muelles iónicos” tendrán frecuencias de resonancia
u
más bajas que las resonancias electrónicas. Es por ello, que al incidir una onda electromagnética con
rt
frecuencia cercana a la resonancia electrónica la energía de la onda incidente se transferirá a la red

vi
del medio material en forma de vibraciones de baja frecuencia, con lo que la energía
s
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electromagnética se convierte en energía cinética, con lo que se entiende que esa radiación ha sido
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absorbida.
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Dispersión
af
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La dispersión de la luz es el fenómeno mediante el cual la radiación electromagnética, al chocar

sn
con pequeñas partículas de tipo coloidal o molecular, es desviada en su dirección de propagación, de

.e
forma aparentemente caótica, en cada uno de los núcleos de dispersión, por tener un índice de
al
refracción diferente al del medio.

u
rt
Cualquier medio sólido, líquido o gaseoso es capaz de dispersar luz en mayor o menor grado. Este
vi
fenómeno se conoce como efecto Tyndall. Sin embargo fue Rayleigh quien propuso el primer modelo
s
pu
físico que interpreta de forma notable los fenómenos de dispersión en sistemas Diluidos, y que
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constituye la base fundamental de los métodos turbidimétricos y nefelométricos.

ca
La ecuación obtenida por Rayleigh para partículas esféricas cuyo radio es pequeño comparado con
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la longitud de onda de la luz (λ) es:
Donde I0 es la intensidad de la luz incidente no polarizada, I la intensidad de luz dispersada en una
dirección que forma un ángulo θ con el haz incidente, mediante una distancia d. La mayor parte de
m
la luz dispersada está polarizada. La concentración c se expresa como el número de partículas por
co
unidad de volumen. Los índices de refracción nf y n0 se refieren a la dispersión y al solvente
n.
respectivamente.
io
ac
El color azul del cielo se debe a la dispersión de Rayleigh. Cuando la luz del sol atraviesa la
m
atmósfera para llegar hasta nosotros, la mayor parte de luz roja, anaranjada y amarilla (alta
or
longitudes de onda) pasa sin ser casi afectadas. Sin embargo, buena parte de la luz de longitudes de
af
onda más cortas es dispersada por moléculas gaseosas de aire. Esa luz dispersada es azul, en
ec
cambio la luz que nos llega directamente del Sol perdió parte de su color azul, por la dispersión por
sn
lo que es sol se ve amarillo. En la órbita fuera de la atmósfera terrestre o desde la Luna, el Sol se ve
.e
blanco y el cielo negro ya que al no haber moléculas que dispersen la luz, todas las longitudes de
al
onda de la luz solar llegan por igual.

u
rt
De acuerdo con las leyes de la electrodinámica clásica, los dipolos oscilantes se convierten en
vi
fuentes emisoras de radiación. La radiación emitida sin embargo, puede tener la misma o distinta
s
pu
frecuencia que el incidente. En este sentido existen tres tipos de dispersión de luz que son:
dispersión estática, dinámica y de Raman.

m
ca
En la dispersión estática la frecuencia no cambia sensiblemente.
En la dispersión dinámica la frecuencia se modifica ligeramente.
En la dispersión de Raman la frecuencia se modifica de forma importante, involucrando
normalmente otros tipos de energía.
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n.
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2. Ley de Lambert-Beer
Las leyes de Lambert-Bouguer-Beer son esenciales para entender la metodología de la absorción
espectrofotométrica. La combinación de estas leyes se conoce como Ley de Beer. Sin embargo, se
debe tener en cuenta que es la combinación de varias leyes y que todas las personas antes
mencionadas contribuyeron a ella.
Esta Ley se trata de un método matemático, que es utilizados para expresar de qué modo la materia
m
absorbe la luz, afirmando que la totalidad de la luz que emana de una muestra puede disminuir
co
debido a los siguientes fenómenos:
n.
io
El número de partículas que se encuentre en su trayectoria (concentración).
ac
Las distancias que la luz debe atravesar a través de la muestra. Denominándose distancia del
m
trayecto óptico. or
Las probabilidades que hay que de que el fotón de esta amplitud de onda particular pueda
af
absorberse por el material. Recibe el nombre de coeficiente de extinción.

ec
sn
El enunciado por tanto de la esta Ley dice: “La intensidad de un haz de luz monocromática, que
.e
incide perpendicular sobre una muestra, decrece exponencialmente con la concentración de dicha
al
muestra”.
u
rt
La ley de Beer relaciona la absorbancia y la concentración de una muestra, por lo que se puede decir
vi
que la relación funcional entre la cantidad medida en un método absorciométrico y la cantidad

s
pu
deseada, se conoce como ley de Beer, y que se puede expresar:

m
ca
Siendo:
a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad.
b es la longitud del camino que recorre la radiación a través del medio absorbente.
c es la concentración de analito c.
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A es la absorbancia.
Cuando la concentración está expresada en moles/L y b en centímetros, la constante de
proporcionalidad se denomina absortividad molar y se presenta con el símbolo especial ε.
La ecuación de Lambert Beer es el fundamento de la espectrofotometría tal como se aplica en
química analítica.
m
La ley de Beer afirma que la absorbancia es proporcional a la concentración de la especie
co
absorbente. Esta ley se aplica a la radiación monocromática y funciona con disoluciones diluidas
n.
(≤0.01 M) de la mayoría de sustancias.
io
Deducción de la Ley de Beer
ac
m
La ley de Beer se puede justificar considerando lo que la pasa a un haz de radiación monocromática
or
paralela de potencia P0 después de penetrar una capa de material absorbente. Después de atravesar
af
un tramo de material, que contienen n partículas absorbentes, la potencia de la radiación disminuye

ec
a P, como resultado de la absorción. Considerando una sección transversal de área S y de espesor

sn
infinitesimal dx, que contiene dn partículas absorbente, podemos imaginar que a cada partícula le
.e
corresponde un área de captura, es decir, si un fotón alcanza fortuitamente una de estas áreas, se
al
absorbe inmediatamente. Sea dS la proyección de todas las áreas de captura que hay dentro de la
u
rt
sección de espero dx, el cociente de dicha área de captura y el área total, es dSIS. En términos
vi
estadísticos, este cociente es igual a la probabilidad de captura del fotón por la sección.
s
pu
La potencia del haz Px que penetra en la sección es proporcional al número de fotones por
m
centímetro cuadrado por segundo y dPx es la cantidad perdida por segundo dentro de la sección. La
ca
fracción absorbida es pues:
Como dS es la suma de las áreas de captura de las partículas absorbentes dentro la sección y que
debe proporcional al número de partículas:
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Donde dn es el número de partículas y a es una constante de proporcionalidad que se llama sección
transversal de captura. Combinando ambas ecuaciones e integrando entre cero y n, se obtiene:
m
co
n.
io
Calculando las integrales resulta:
ac
m
or
af
ec
Pasando a logaritmos decimales e invirtiendo la fracción para cambiar de signo, se obtiene:

sn
.e
u al
rt
vi
Donde n es el número total de partículas dentro del bloque. El área de sección S se puede expresar
s
pu
en términos del volumen V y de la longitud b bloque (S=V/b). Y sustituyendo en la ecuación anterior

m
se obtiene:
ca
Nótese que n/V tiene unidades de concentración (es decir número de partículas por centímetro
cúbico), que se convierten fácilmente en moles por litro de la forma:
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Combinando esta ecuación con la anterior y sustituyendo nos queda, finalmente:
m
co
n.
io
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3. Concepto de linealidad
Atendiendo a lo anteriormente explicado, hay que tener en cuenta la linealidad, que es el intervalo
de concentraciones del cromógeno entre las cuales existe una relación lineal entre absorbancia y
concentración.
Cuando la concentración del cromógeno sobrepasa los límites de linealidad se deja de cumplir la Ley
de Beer, convirtiéndose la recta en una curva. La lectura de la absorbancia fuera de los límites de
m
linealidad se traduce en una concentración falsamente baja de cromógeno. En esta situación, hay
co
que diluir la muestra para que su concentración entre en los límites de la linealidad.
n.
io
ac
Linealidad:
m
Es la capacidad de producir resultados proporcionales a la concentración de analito en las muestras
or
dentro de un rango determinado de concentración ya sea directamente o por medio de una
transformación matemática bien conocida.
af
ec
sn
.e
Una curva de calibración es la representación gráfica de una señal que se mide en función de la
al
concentración de un analito. La calibración incluye la selección de un modelo para estimar los

u
parámetros que permitan determinar la linealidad de esa curva, y, en consecuencia, la capacidad de

rt
un método analítico para obtener resultados que sean proporcionales a la concentración de un

s vi
compuesto en una muestra, dentro de un determinado intervalo de trabajo. En el procedimiento se

pu
compara una propiedad del analito con la de estándares de concentración conocida del mismo
m
analito.
ca
Dentro de las metodologías analíticas, las determinaciones cuantitativas tienen una especial
relevancia en diversas actividades como el diagnóstico clínico. La obtención de una curva de
calibración, nos permite cuantificar la concentración de muestras problema con cierto grado de
incertidumbre, siendo ahí donde la estadística y la química interaccionan dando al operador las
herramientas necesarias para asegurar la calidad de los resultados generados en el proceso.
La curva estándar inicial debe incluir un blanco reactivo, y por lo menos, ocho estándares que
cubran toda la escala de concentraciones que se usarán en los análisis del laboratorio.
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Las curvas de calibración pueden ser lineales y no lineales. En la mayoría de los casos, cuando la
curva es lineal se aplica la Ley de Beer. Para definir la curva que mejor representa la relación entre
Absorbancia y la concentración se puede usar cálculos de regresión lineal.
m
Donde A es la absorbancia, c la concentración que se relacionan mediante una ecuación de una recta
co
lineal.
n.
io
Se puede demostrar que:
ac
m
or
af
ec
m es la pendiente de la curva de calibración (también denominada factor de calibración).

sn
B es la intersección de la curva de calibrado con el eje de las abscisas, y se corresponde con el

.e
valor de absorbancia de la disolución a concentración de analito cero.

al
n es el número de observaciones, o el número de ensayos que se hacen a la muestra.

u
rt
vi
La linealidad de la curva de calibración es un requerimiento fundamental en la práctica de análisis

s
cuando se realizan curvas de calibración. En general la linealidad no se cuantifica pero se observa

pu
por simple inspección o mediante pruebas significativas de no linealidad. La no linealidad se elimina

m
mediante la selección de un intervalo de operación más restringido. No olvidemos que el intervalo

ca
lineal puede ser distinto para matrices diferentes de acuerdo al efecto de las interferencias
procedentes de la matriz.
A modo de ejemplo, los siguientes datos obtenidos de concentración en relación con al absorbancia:
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Si calculamos la recta, que relaciona eso datos, mediante un ajuste por mínimos cuadrados,
obtenemos la siguiente ecuación:
Será está ecuación, la que se usará en el análisis de muestras. Las muestras deben analizarse
m
co
exactamente de la misma manera que se hayan analizado los patrones utilizados para hacer la curva
de calibrado.
n.
io
ac
m
or
af
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sn
.e
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vi
Finalmente para obtener la concentración de analito en la muestra, basta con interpolar la

s
pu
absorbancia, obtenida de la medida de la muestra problema, en la curva de calibrado. Por ejemplo,

m
si la absorbancia de la muestra problema fuera de 0.5 la concentración se calcularía o gráficamente

ca
(como observamos en la figura anterior) o utilizando la ecuación obtenida, que en nuestro caso sería:
De esta ecuación se observa que hay tres parámetros que son causa de incertidumbre en la
determinación de la concentración que son:
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La medida efectuada.
La ordenada en el origen de la recta de regresión.
La pendiente de la recta.
De esta manera el cálculo de la concentración en la ecuación anterior se verá afectado por la
incertidumbre en estos tres parámetros.
En el laboratorio se usan curvas de calibración “permanentes” de las que se requiere verificar su
m
co
exactitud con cada lote de análisis, mediante el análisis de un patrón o estándar de verificación,
antes de analizar las muestras.
n.
io
En ocasiones la matriz de la muestra es compleja y/o desconocida. Por ejemplo una muestra de
ac
sangre que contiene muchos constituyentes que no pueden ser incorporados a los estándares en la
m
disoluciones de los utilizados para la curva de calibración, por lo que en este caso se recomienda
or
añadir a la muestra pequeños volúmenes de una disolución de un estándar concentrado, con lo que
af
la matriz que contiene el estándar no difiere mucho de la propia muestra. Este método se conoce
ec
como calibración de adición estándar.

sn
.e
Consideremos que una muestra con un analito X es concentración inicial C da una señal M
al
proporcional a dicha concentración; cuando a esta muestra se le añade un pequeño volumen

u
estándar del mismo analito se obtendrá una señal más grande proporcional a la cantidad de muestra
rt
añadida.
s vi
pu
Cuando se preparan estándares que contienen la muestra y se representa la concentración de los
estándares frente a la señal obtenido al medirlos, se obtiene una curva de calibración en la cual el
m
ca
intercepto de x corresponde con la concentración desconocida, de la forma matemática:
La gráfica siguiente representa la curva de calibración para una muestra de una analito X al que se
han añadido estándares del mismo analito de concentraciones conocida y se ha determinado el valor
de la absorbancia (A) producida por cada uno de ellos. Se observa la concentración del analito en la
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muestra, debe ser calculada para un valor de absorbancia cero.
m
co
n.
io
Un estándar es una preparación que contiene una concentración conocida de un elemento o una
ac
sustancia específica. Un patrón primario o estándar primario es una sustancia utilizada como
m
referencia en el momento del estudio, y que usualmente son sólidos y presentan las siguientes
or
características:
af
ec
Composición conocida: es decir se ha de conocer la estructura y elementos que lo componen.

sn
Elevada pureza.
.e
Estable a temperatura ambiente.

al
Posible su secado en estufa.

u
rt
No debe absorber gases.

vi
Debe tener un peso equivalente grande.

s
pu
m
ca
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4. Tipos de medida: punto final, dos puntos y cinética
En el laboratorio de análisis clínicos al unirse una muestra bioquímica con los reactivos comerciales,
se desencadenan una serie de reacciones que dan lugar a un cambio apreciable y mesurable por el
equipo instrumental gracias al cual, se puede obtener información sobre la presencia, ausencia,
concentración, cantidad y/o actividad del analito.
m
co
Siendo A la muestra y, B y C reactivos comerciales.
n.
io
Los tipos de análisis o de medida según el desarrollo de la reacción se dividen en:
ac
m
Punto final y dos puntos
or
El punto final también es llamado de incubación fija o análisis en dos puntos.
af
ec
La reacción entre la muestra y los reactivos se produce hasta el final, se agota A, B y/o C y se forma
sn
D y/o E. En las determinaciones con reactivos comerciales suele haber exceso de reactivos para
.e
asegurar que el parámetro reacciona en su totalidad en las condiciones de Tª, pH, tº, etc., indicadas
al
en sus protocolos.
u
rt
La concentración del parámetro es directamente proporcional a la concentración de alguno de los

vi
productos formados en la reacción bien:

s
pu
De forma directa: por variación en la estructura del parámetro al unirse a algún reactivo
m
De forma indirecta: al aparecer o desaparecer algún compuesto mesurable, por la existencia

ca
del parámetro en la muestra biológica.
Generalmente en las condiciones establecidas por el protocolo de la casa comercial, se cumple la
Ley de Lambert-Beer; en caso de no cumplirse habrá que realizar la dilución de la muestra y el
factor de corrección para que se encuentre dentro del rango lineal.
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Para la determinación de la concentración problema (la del parámetro) se suele emplear una
disolución acuosa patrón del mismo parámetro, de concentración conocida e indicada por la casa
comercial; aplicando la Ley de Lambert-Beer para la solución patrón y para la muestra problema:
Cinética
m
co
Se mide la velocidad de la reacción antes de que esta concluya; es muy importante mantener las
n.
condiciones de la reacción descritas en los protocolos comerciales sobre temperatura, tiempo de
io
medida, etc. para garantizar la Fiabilidad de los resultados.
ac
En estas determinaciones analíticas, la absorbancia no es directamente proporcional a la
m
or
concentración del parámetro biológico en la muestra problema. Es la variación de la absorbancia
af
durante una unidad de tiempo establecida, lo que es proporcional a la concentración y/o actividad
ec
del parámetro.
sn
Esto es debido a que la presencia del parámetro en la muestra va a dar lugar a la aparición o
.e
desaparición de sustancias capaces de absorber la radiación a la λ de medida. La presencia de estas

al
sustancias está ocasionada por la existencia del parámetro (incluso a veces es el mismo parámetro
u
rt
biológico el que varía por acción de los reactivos).

vi
La Ley de Lambert-Beer que se aplica en estos casos queda modificada o adaptada como:
s
pu
m
ca
Siendo Δ, la que representa la variación de la magnitud que viene a continuación, en este caso la
absorbancia, extinción o densidad óptica, por lo que también se expresa como:
Generalmente se toma el minuto como unidad de tiempo de medida de la variación de la densidad
óptica por lo que se expresa:
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Al ser ε y b, dos valores constantes, se expresa su producto como un factor numérico que a menudo
lo proporcionan las casas comerciales de tal manera que la concentración del parámetro viene
expresada como:
m
co
n.
La reacción que da lugar a una variación de la absorbancia se desencadena al añadir los otros
io
reactivos a la muestra biológica convenientemente preparada y con las condiciones de reacción
ac
controladas.
m
or
A mayor concentración del parámetro biológico, mayor será la variación de absorbancia en la unidad
af
de tiempo. En el caso de que el parámetro sea una enzima, y que lo que se esté determinando sea su
ec
actividad enzimática la variación de absorbancia en la unidad de tiempo será directamente

sn
proporcional a su actividad.
.e
u al
rt
s vi
pu
m
ca
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5. Fotometría y espectrofotometría: tipos y utilidades
La fotometría implica un gran número de las determinaciones que se realizan habitualmente en los
laboratorios clínicos utilizando medidas de la energía radiante. El fundamento de la fotometría se
basa en las interacciones de las radiaciones electromagnéticas sobre la materia.
La fotometría se puede definir como la medida de las magnitudes relativas a las radiaciones,
evaluadas según la impresión visual producida por éstas y basándose en ciertas convenciones.
m
co
Por tanto, la fotometría proporciona una medida directa del flujo de energía recibido de los objetos
celestes de un intervalo de longitud de onda. Se considera que es mucho menos exigente que la
n.
io
espectrofotometría ya que se integra del flujo en una banda.
ac
Por otro lado, la espectrofotometría, en química analítica es una técnica de medición que asocia el
m
análisis espectral de la espectroscopia de medición de magnitudes fotométricas relativas, en la
or
mayoría de los casos relacionados con las propiedades de la materia.
af
ec
La espectrofotometría permite aislar, en la radiación compleja emitida por una fuente, una radiación
sn
casi monocromática que caracteriza cualitativa y cuantitativamente la material que ha atravesado.

.e
Debido a que la diferencia principal de estos dos tipos de técnicas, la tecnología empleada, se van a
u al
describir los dos tipos principales de aparatos usados en las medidas de absorbancia de la radiación
rt
visible o Ultravioleta, que son los fotómetros y los espectrofotómetros.

s vi
Técnicamente la palabra fotómetro se aplica a cualquier dispositivo que pueda medir la intensidad
pu
de una radiación, pero normalmente se usa para designar a los instrumentos relativamente sencillos
m
provisto de filtros para seleccionar una zona estrecha de longitudes de onda y de una fotocélula o
ca
fototubo para medir la intensidad de radiación.
Por el contrario, un espectrofotómetro es un instrumento muy sofisticado que posee un
monocromador en lugar de filtros. El monocromador permite una variación continua al elegir la
longitud de onda y hacer un barrido en una zona amplia de longitudes de onda. Además, el sistema
de detección que posee el espectrofotómetro, normalmente fototubos o fotomultiplicadores, es el
más sensible que existe.
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m
co
Componentes básicos
n.
io
Fuente de energía.
ac
Filtro o monocromador: aislar bandas de energía.
m
Detector: medida de la energía radiantes transmitida a través de la muestra.
or
af
ec
sn
.e
u al
rt
vi
Fuentes de radiación
s
pu
Una fuente de radiación ideal debe ser continua en una zona amplia del espectro y tener una
m
intensidad elevada y que no varíe apreciablemente con la longitud de onda, aunque la mayoría de las
ca
fuentes de radiación disponibles en el mercado emiten con una intensidad que varía con la longitud
de onda.
Existen diversos tipos de fuentes de radiación que emiten en la región del ultravioleta-visible, las
cuales se pueden clasificar en continuas y discontinuas o de líneas.
Fuentes de descarga eléctrica: usadas en la región ultravioleta, dentro de las cuales se
encuentras las lámparas de hidrógeno o deuterio, la lámpara de descarga de Xenón y el arco de
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mercurio. Se hace pasar una corriente de electrones a través de un gas y son las colisiones
entre dichos electrones y las moléculas de gas las que provocan excitación electrónica,
vibracional y rotacional.
Fuentes térmicas: las radiaciones emitidas son debidas a altas temperaturas. La lámpara de
filamento Wolframio emite en la zona del visible. El wolframio es el mejor material para las
lámparas térmicas de filamento, pero cuando se necesita radiación más intensa se recurre a las
lámparas de arco de carbón.
m
co
Selectores de longitud de onda (λ). Filtros y monocromadores
n.
Para conseguir que las medidas de absorbancia sean selectivas, exactas y sensibles, es muy
io
importante poder seleccionar una banda estrecha de longitudes de onda del amplio espectro que nos
ac
proporciona la fuente de radiación.
m
or
Los monocromadores son dispositivos que produce un haz de radiación de gran pureza, es decir,
af
proporciona una banda estrecha de longitudes de onda, además de permitir que dichas longitudes
ec
de onda varíen. Posee ciertas partes características que son:

sn
.e
Rendija de entrada: funciona como fuente de radiación, su imagen se enfoca en última

al
instancia en el plano focal que contiene la rendija de salida. Proporciona una imagen óptica
u
rectangular.
rt
Colimadores: son elementos que se encargan de dar dirección al haz, con ellos se busca que
s vi
todos los haces que inciden sobre los elementos, la muestra, etc. sean paralelos entre sí.
pu
Elementos dispersores: pueden ser prismas o redes de difracción que dispersan la radiación
m
de longitudes de onda que la componen.

ca
Rendija de salida: al estar esta rendija de salida se disminuye la intensidad del haz de
radiación y se reduce su anchura de banda. Es posible, gracias a ella, aumentar la resolución si
disminuimos la anchura de esta rendija.
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Los filtros son discos de material coloreado, usualmente vidrio óptico, con los que se logra eliminar
m
parte de la luz recibida desde la fuente de radiación, dejando solo la que nos interesa. Los
co
fotómetros sencillos de haz simple, usados para medidas cuantitativas en la región del visible, están
n.
provistos de filtros, cada uno de los cuales transmite una porción del espectro, siendo adecuado, por
io
lo general, un filtro de color complementario al color de la disolución de analito, porque la disolución
ac
absorbe precisamente el color complementario.
m
or
af
ec
sn
.e
u al
rt
s vi
pu
Los filtros de banda se caracterizan por su anchura de banda, su longitud de onda nominal en el
centro de la banda y su transmitancia de pico, mientras que los filtros de interferencia,

m
ca
proporcionan, anchuras de bandas más estrechas, y transmitancias de picos mayores.
Detectores
Los sistemas de detección pueden estar diseñados con fotoceldas, fototubos, fotodiodos o
fotomultiplicadores. Este depende de los rangos de longitud de onda, de la sensibilidad y de la
velocidad de respuesta requeridas. El sistema de detección recibe la energía lumínica que proviene
de la muestra y la convierte en una señal eléctrica proporcional a la energía recibida. La señal
eléctrica puede ser procesada y amplificada, para que pueda interpretarse a través del sistema de
24 / 55
lectura.
m
co
La siguiente tabla recoge un resumen de las ventajas y desventajas de los detectores más utilizados:
n.
io
ac
m
or
af
ec
sn
.e
u al
rt
s vi
pu
m
ca
25 / 55
m
co
n.
io
ac
m
or
af
ec
sn
.e
u al
rt
s vi
pu
m
ca
Una vez vistos los componentes básicos de los fotómetros y espectrofotómetros, podemos describir
los principios fundamentales del diseño de los instrumentos.
Todos los fotómetros y espectrofotómetros tienen uno de los siguientes diseños básicos:
Haz simple, lectura directa.
Haz simple, de compensación.
26 / 55
Doble haz, lectura directa.
Doble haz, de compensación.
En los instrumentos de haz simple, la radiación sólo pasa a través de un disolución, mientras que en
los de haz doble, un haz pasa a través de la disolución que contiene la muestra al mismo tiempo que
otro haz pasa a través de un blanco que nos da una señal de referencia. Con los instrumentos de haz
doble la operación de media de absorbancia y transmitancia es más sencilla, aunque es necesario
m
calibrar el instrumento antes de usarlo.
co
Un instrumento de lectura directa usa un medidor para leer absorbancias o transmitancias. Un
n.
instrumento de compensación a cambio usa, en la etapa de medida, un dispositivo de
io
compensación que permite comparar la señal a medir con una señal de referencia, por lo que este
ac
último es más exacto que el de lectura directa.
m
or
af
ec
sn
.e
u al
rt
s vi
pu
m
ca
27 / 55
6. Espectrofluorometría
La espectrometría de fluorescencia o espectrofluorimetría es el método espectroscópico óptico más
extensivamente usado en mediciones analíticas y en investigación científica.
El gran número de aplicaciones va desde la determinación analítica de trazas de metales en el
ambiente a mediciones de pH en células completas bajo condiciones fisiológicas.
En la investigación en laboratorio, la espectrofluorimetría se está aplicando para estudiar procesos
m
co
físicos fundamentales de moléculas;
n.
Relaciones estructura-función e interacciones de biomoléculas como proteínas y ácidos
io
ac
nucleicos.
m
Secuenciación de DNA.
or
Caracterización genómica.
af
ec
En aplicaciones analíticas, el uso de la fluorescencia es dominante en laboratorios clínicos donde

sn
inmunoensayos de fluorescencia han reemplazado ampliamente a los radioinmunoensayos.

.e
Hay dos razones principales para el extensivo uso de la espectrofluorimetría:

u al
rt
El alto nivel de sensibilidad y el amplio rango dinámico que pueden realizarse. Un gran número
vi
de laboratorios han reportado detección de una sola molécula.

s
La instrumentación requerida es conveniente y para la mayoría de propósitos puede adquirirse

pu
por un costo no muy elevado.

m
ca
Fluorescencia:
Es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la absorción de radiación
electromagnética y al relajarse al estado basal liberan el exceso de energía en forma de fotones.
La emisión de Fluorescencia tiene lugar en nanosegundos y durante este periodo de tiempo, suceden
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numerosos procesos moleculares (interacciones proteína-ligado, desplazamiento de biomoléculas,
fenómenos de hidratación, etc.) que pueden inducir modificaciones en algunas de las propiedades de
los compuestos fluorescentes (espectros, vidas medias, rendimiento cuántico, anisotropía de
fluorescencia, etc.).
Las dos principales ventajas de los métodos de fluorescencia sobre los de absorción son:
Una sensibilidad entre 1 y 3 órdenes de magnitud mayor.
m
Mayor intervalo de respuesta lineal.
co
n.
No obstante, los métodos de fluorescencia se aplican menos que los de absorción ya que no todos los
io
sistemas químicos son capaces de fluorescer y además el equipamiento necesario es mucho más
ac
costoso que el de la espectroscopia de absorción.
m
or
Los fundamentos teóricos de la espectrofluorescencia son:
af
ec
Los inicios de la fluorescencia.

sn
Diagramas de Jablonski: procesos radiantes y no radiantes.

.e
Moléculas fluorescentes. Fluoróforos intrínsecos y extrínsecos.

al
Propiedades de la fluorescencia (espectro, rendimiento cuántico y vida media).

u
Desactivación (“quenching”) de fluorescencia.

rt
Transferencia de energía.
s vi
Anisotropía de fluorescencia.
pu
Instrumentación.
m
ca
Teoría de la fluorescencia
En la siguiente figura se muestra un diagrama de energía parcial para una especio molecular
hipotética. Se presentan un nivel electrónico basal (E0) y dos excitados (E1 y E2).
Cada uno de estos estados electrónicos muestra cuatro niveles vibracionales. Cuando la molécula se
irradia con ondas electromagnéticas cuya energía coincide con las diferencias de energía entre los
diferentes niveles se producen las transiciones electrónicas que se muestran en la figura A.
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La relajación molecular, señalada por las flechas cortas entre niveles de energía vibracionales tiene
lugar durante las colisiones entre moléculas excitadas y las moléculas del disolvente (figura B).
También puede ocurrir el relajamiento no radiante entre el nivel vibracional inferior de un estado
excitado y el nivel vibracional superior de otro estado electrónico.
La fluorescencia es otro proceso de relajación que se muestra en la figura C. La radiación
fluorescente se emite cuando las moléculas electrónicamente excitadas se relajan a cualquiera de los
estados vibracionales del estado electrónico basal.
m
co
n.
io
ac
m
or
af
ec
sn
.e
u al
rt
La fluorescencia es uno de los mecanismos mediante las cuales una molécula regresa a su estado
vi
basal después de haber sido excitada por absorción de radiación. Por lo tanto, a priori cualquier
s
molécula capaz de absorber radiación electromagnética sería capaz de fluorescer. No obstante, la

pu
mayoría de las moléculas no fluorescen porque disponen de vías no radiantes.

m
ca
30 / 55
7. Fotometría de llama
La fotometría de llama es una técnica de emisión que utiliza una llama como fuente de excitación y
un fotodetector electrónico como dispositivo de medida. Se trata principalmente de un método de
análisis cuantitativo y es uno de los métodos más sencillos y precisos. También es posible realizar un
análisis cualitativo examinando todas las longitudes de onda del espectro de emisión. Su aplicación
es limitada si se compara con la espectroscopía de emisión ordinaria, ya que la energía de la llama
permite excitar únicamente de 30 a 50 elementos, siendo este número función del tipo de la llama
m
utilizada. La muestra debe estar disuelta.
co
n.
El principio de la fotometría de llama es la transformación reversible entre un estado electrónico
io
fundamental y un estado electrónico excitado, originando una señal óptica que es la que se mide.
ac
Este fenómeno se puede representar como:
m
or
af
ec
sn
Se fundamenta en la excitación sufrida por los electrones de un átomo al serles aplicada una fuente
.e
de energía térmica procedente de la combustión de una llama. Estos electrones, al retomar al estado
al
fundamental, emiten una cierta cantidad de energía en forma cuantificada, susceptible de ser
u
rt
medida. De los múltiples espectros posibles se utiliza la región espectral debida a transiciones
vi
electrónicas, situada en la zona del visible-ultravioleta.

s
pu
La energía procedente de la llama hace que los iones o moléculas de la sustancia a mediar se
m
transformen en átomos libres, excluyéndose con ello que las emisiones sean debidas a la energía
ca
vibracional y rotacional molecular.
La energía emitida (en forma de radiación) presenta una longitud de onda específica para cada
transición, la cual está directamente relacionada con la cantidad de sustancia del átomo.
La manera habitual de representar estos cambios energéticos de un átomo es lo que se conoce como
espectro de absorción, o de emisión, que son específicos de cada compuesto.
31 / 55
m
co
La línea más prominente (1) en su espectro es la producida por el paso de un electrón desde el nivel
excitado menor hasta su estado fundamental. Las otras líneas corresponden a pasos al estado
n.
io
fundamental desde niveles más altos de energía (2). Por último, pueden recogerse líneas
ac
correspondientes a la transición entre un nivel de energía superior a uno inferior, ambos en un
m
átomo excitado, es decir, sin llegar al estado fundamental. or
Es una técnica analítica muy antigua, que consiste en pulverizar la solución de la muestra en una
af
llama y medir la intensidad de la luz emitida a ciertas longitudes de onda.

ec
sn
La fotometría de llama de emisión se utiliza fundamentalmente en la determinación de electrolitos,

.e
en los distintos fluidos biológicos, siendo los más comunes el sodio (Na+) y el potasio (K+); y en la
al
medición de niveles terapéuticos del Li2+ en pacientes en los que se les administra como terapia
u
para enfermedades maniaco-depresivas.

rt
s vi
pu
m
ca
32 / 55
8. Absorción atómica
La espectrofotometría de absorción atómica o espectroscopía de absorción atómica es un método
para la detección y la determinación de elementos químicos, particularmente de elementos
metálicos. Los compuestos, para su examen, se tienen que romper en los átomos que los constituyen.
Ello se realiza por pulverización en una llama a alta temperatura. Un rayo luminoso de una cierta
longitud de onda, producido por un tipo especial de lámpara, se dirige a lo largo del eje longitudinal
de una llama plana y hacia un espectrofotómetro. La solución es aspirada una vez se ha dispersado
m
formando una niebla de gotas muy finas, hasta el interior de la llama, evaporándose dando vapor, el
co
cual se disocia en átomos del elemento.
n.
io
La absorción atómica es capaz de detectar y determinar cuantitativamente la mayoría de los
ac
elementos y consiste en la medición de especies atómicas por su absorción a una determinada
m
longitud de onda. La especie atómica se logra por atomización de la muestra, siendo los distintos
or
procedimientos utilizados para llegar al estado fundamental del átomo lo que diferencia las técnicas
af
y los accesorios utilizados.

ec
sn
Todas las especies pueden absorber energía radiante. La absorción de la radiación ultravioleta,
.e
visible e infrarroja depende la estructura de las moléculas y es característica de cada sustancia

al
química. Cuando la luz atraviesa una sustancia para de la energía es absorbida, siendo el
u
fundamento más elemental de esto la Teoría Cuántica que postula que los átomos, iones y moléculas
rt
sólo pueden existir en ciertos estados discretos, caracterizados por cantidades definidas de energía
s vi
de modo que cuando una especie cambia su estado, absorbe o emite una cantidad de energía
pu
exactamente igual a la diferencia de energía entre los dos estados. Así pues, cuando la radiación
m
atraviesa una sustancia ciertas frecuencias pueden eliminarse selectivamente por absorción,
ca
mediante la transferencia de energía electromagnética a los átomos, iones o moléculas que
componen la muestra. En el caso de absorción atómica serán los átomos los que absorban esa
energía en forma de radiación.
Ésta radiación absorbida se emplea en cambiar el estado de los electrones del átomo de su estado
fundamental a uno excitado, siendo necesaria una cantidad determinada y característica de energía
(característica de cada elemento) para que dicho cambio se produzca. Es esta cantidad
característica de energía (radiación) la que permite caracterizar los componentes de la muestra.
33 / 55
m
co
n.
io
ac
m
La espectrometría de absorción atómica permite cuantificar indirectamente la fracción de átomos no
or
excitada. Para ello, los átomos presentes en una muestra son sometidos a una fuente de radiación
af
electromagnética de la longitud de onda deseada, y que es característica del elemento que se desea
ec
medir. Los átomos de la muestra absorben una cantidad de esta energía. Posteriormente se recoge
sn
la potencia radiante de la radiación electromagnética que emerge de la muestra, es decir, que no ha

.e
sido absorbida por ella, y se resta de la que fue suministrada inicialmente por la fuente. La
al
diferencia entre las potencias radiantes de la radiación electromagnética que entre y sale de la
u
rt
muestra, es directamente proporcional al número de átomos presentes en esta.

s vi
Si comparamos la técnica de emisión atómica o fotometría de llama y esta técnica, esta última se
pu
basa en la cuantificación de la radiación absorbida por la muestra dependiente de una mayor

m
proporción de átomos, mientras que la primera (emisión) se basa en la cuantificación de la radiación

ca
emitida por la muestra y que depende de la cantidad de átomos excitados.
Para un cambio de nivel energético (diagrama) la cantidad de energía absorbida o emitida (al
efectuar dicho cambio de nivel) es la misma, y se corresponderá con una radiación electromagnética
de igual longitud de onda.
Los dos requisitos que debe satisfacer un elemento para que pueda ser cuantificado mediante
espectrometría de absorción son la posibilidad de que el elemento sea vaporizable en átomos y que
la longitud de onda en que se produce la absorción esté comprendida (como veremos más adelante)
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en el intervalo de 200 a 800 nm. No es, por tanto, aplicable a la medición de como halógenos,
fosforo, azufre, hidrógeno, oxigeno, nitrógeno o carbono. La espectrofotometría de absorción
atómica ha sido utilizada en bioquímica clínica como método para la cuantificación de diferentes
sistemas biológicos, aunque su aplicación más generalizada es la medición de la concentración de
Calcio, magnesio, cobre, cinco o hierro, en suero y orina. Además se utiliza para el diagnóstico de
enfermedades derivadas de intoxicaciones por mercurio, plomo, cadmio, cromo, etc.
Componentes de un espectrofotómetro de absorción atómica
m
co
La espectrofotometría de absorción atómica requiere de los siguientes elementos para llevarse a
n.
cabo:
io
ac
Fuente de radiación o lámpara.
m
Excitador. or
Filtros ópticos y monocromadores.
af
Detector.
ec
Medidor o registro.
sn
.e
Fuentes de radiación
al
La parte más crítica del instrumento de absorción atómica es la fuente, ya que es muy difícil medir
u
rt
con buena exactitud líneas de absorción tan estrechas como las que presentan los átomos. Este
vi
problema se ha resuelto aplicando el principio de que “cada especie química es capaz, en

s
pu
condiciones adecuadas, de absorber sus propias radiaciones”. Bajo esta premisa se han desarrollado
las lámparas de cátodo hueco y las lámparas de descarga sin electrodos.

m
ca
Las lámparas de cátodo hueco son las fuentes más empleadas. Consiste en dos electrodos, un
cátodo y un ánodo, en el interior de un cilindro de cristal. El cátodo está recubierto con un metal
puro o un compuesto que contenga analito. Como ánodo se utiliza un alambre grueso de wolframio o
níquel. El cilindro de vidrio contiene un gas noble (argón o neón) a baja presión, y al aplicar un
potencial entre los dos electros se produce una descarga que ioniza a las moléculas de gas noble.
Los iones producidos son atraídos eléctricamente hacia el cátodo, y las colisiones resultantes
inducen la vaporización de los átomos de analito. En este proceso los electrones de los átomos de
analito son excitados, y al volver al estado fundamental emiten su radiación característica.
35 / 55
Finalmente, los átomos de analito son excitados, y al volver al estado fundamental emiten su
radiación característica. Finalmente, los átomos de analito se depositan sobre la superficie del
cátodo. No obstante, una fracción se deposita sobre las paredes de la lámpara y ya no son útiles para
un nuevo ciclo.
m
co
n.
io
ac
m
La emisión de la lámpara de cátodo hueco se produce exactamente a la misma longitud de onda que
or
la línea de absorción que se utiliza para excitar los átomos producidos en el horno ya que en ambos
af
casos se produce la misma transición. Sin embargo, puesto que estas lámparas trabajan a menos
ec
presión y temperatura que las celdas de atomización, el perfil de emisión es más estrecho que el
sn
perfil de absorción y otras especies no pueden absorber luz de la lámpara de cátodo hueco.
.e
al
Sus principales características son:

u
rt
vi
La disponibilidad para una gran variedad de elementos.

s
Fácil manejo, en el que se incluye ajuste de la corriente de la lámpara al valor recomendado.

pu
Gran estabilidad.
m
Buena intensidad.
ca
Tiempo de vida relativamente largo.
Para cada elemento se utiliza una lámpara, aunque se han comercializado lámparas de cátodo hueco
multielementales. Estas lámparas se construyen con aleaciones de diferentes metales, procurando
que tenga similares puntos de fusión y volatilidad.
Las lámparas de descarga sin electrodos consisten en un tubo de cuarzo herméticamente
cerrado conteniendo unos pocos miligramos de elemento de interés y un gas inerte a baja presión.
36 / 55
La activación se lleva a cabo mediante un campo intenso de radiofrecuencias o radiación
microondas. Cuando opera el gas noble se ioniza y los iones producidos son acelerados por el campo
de radiofrecuencia hasta que adquieren la energía suficiente para excitar a los átomos del metal.
Estas lámparas, tienen el inconveniente de que sólo se fabrican elementos fácilmente vaporizables.
Las lámparas de arco de Xenón se utilizan para el análisis de elementos en los que no se pueden
utilizar las lámparas anteriores, debido a que se requiere un análisis multielemental y por tanto son
necesarias fuentes que emitan de forma continua en todo el espectro. Estas lámparas emiten
m
radiación continua de forma intensiva entre 200 y 450 nm. Están compuestas de dos electrodos de
co
wolframio dentro de una cavidad de sílice o zafiro rellana de Xenón.
n.
io
Excitador
ac
En la espectrometría de absorción atómica, una vez que se dispone de una radiación adecuada, es
m
preciso introducir la muestra excitada en el trayecto de dicha radiación. La excitación de la muestra
or
puede tener lugar de diferentes maneras:
af
ec
Introducción de la muestra diluida, en el seno de una llama, haciendo llegar a ésta la radiación
sn
procedente de una lámpara de cátodo hueco.

.e
Colocación de un pequeño volumen de muestra diluida sobre una superficie calentada. Se

al
utiliza cuando la fuente de radiación empleada es una lámpara de cátodo hueco.

u
rt
Interposición de la muestra atomizada en el haz de radiación, procedente de otras fuentes, por

vi
ejemplo de una fuente de rayos X.

s
pu
Los excitadores de llama más utilizados son:

m
ca
Llama de aire-hidrocarburos.
Llama de aire-acetileno.
Llama de óxido nitroso-acetileno.
La única diferencia con las llamas utilizadas en la emisión de radiación estriba en que en la
espectrometría de emisión la llama es utilizada a la vez como cámara de excitación y fuente de
radiación, mientras que aquí se utiliza únicamente como método de excitación de la muestra.
37 / 55
Los excitadores electrotérmicos, se utilizan de manera específica en la espectrometría de absorción
atómica, siendo los más importantes los descritos a continuación.
El horno de grafito es un sistema que tiene la ventaja de no necesitar dilución previa de la muestra,
además que permite los volúmenes de muestra pequeños puedan ser sometidos a temperaturas
elevadas y prácticamente constantes. Sirve como celda de atomización donde el analito de la
muestra se convierte en átomos gaseosos. Con un tubo de grafito u otro material conductor sujeto
por dos electrodos de grafito refrigerados por agua, que se calienta al aplicarle una elevada
m
intensidad de corriente.
co
n.
Monocromadores
io
Los monocromadores son dispositivos que permiten la selección de una determinada longitud de
ac
onda a partir de una radiación incidente que incluya a esta longitud entre otras. La longitud de onda
m
seleccionada puede variarse en un mismo instrumento. Es decir, un solo monocromador puede
or
programarse para discriminar longitudes de onda diferentes cada vez que se utiliza.
af
ec
Su función es separar la radiación utilizada para excitar los átomos de analito del resto de líneas
sn
emitidas por la fuente de luz y/o la atomizadora.

.e
al
Un monocromador se halla definido por las siguientes características:

u
rt
Intervalo espectral útil. Es frecuente que vaya de 200 a 1000 nm. Es función de la proximidad
vi
de las ranuras del enrejado de difracción y de la amplitud del ángulo de giro del instrumento.
s
pu
Paso de luz. Depende los tamaños de los espejo, de la rejilla y de la rendija de la salida de luz.
m
Resolución y ancho de banda. Es interesante un ancho de banda pequeño y una alta resolución.
ca
El monocromador estándar, la luz que proviene del horno o del atomizador es dirigida mediante
un espejo cóncavo a una red de difracción, donde es dispersada en diferentes longitudes de onda. La
luz, finalmente, es dirigida mediante el espejo cóncavo anterior, al detector.
38 / 55
m
co
n.
Su capacidad para separar líneas espectrales viene determinada por su paso de banda espectral, el
io
cual se define como la mitad del ancho de banda que emerge por la rendija de salida.
ac
Los monocromadores Echelle se emplean para análisis multielemental. Se emplea de forma
m
simultánea una red de difracción tipo echelle junto con un prisma, lo que permite generar un
or
espectro en dos dimensiones en el plano focal y cubrir toda la región UV-visible desde los 200 hasta
af
ec
los 800 nm. La resolución es aproximadamente lineal para cualquier orden.

sn
.e
u al
rt
s vi
pu
m
ca
Detectores
El tipo y fundamento teórico de los detectores utilizados en absorción atómica son esencialmente los
mismos que en espectrometría de emisión (Fotometría de llama).
El detector universalmente utilizado en absorción atómica es el tubo fotomultiplicador, ya que
ningún otro ofrece la misma sensibilidad en el margen de longitudes de onda utilizado en esta
técnica.
39 / 55
9. Turbidimetría y nefelometría
Turbidimetría
Cuando una luz monocromática, de longitud de onda no absorbible choca contra las partículas de
una sustancia que está en suspensión y cambia la dirección de propagación del haz de luz. Este
efecto es usado para determinar la presencia de un analito en suspensión ya que ese cambio de
dirección del haz y de su intensidad depende de muchos factores que una vez relacionados y
m
cuantificados permiten obtener los valores buscados.
co
Cuando un haz de radiación monocromática de una longitud de onda determinada es enfocada sobre
n.
io
un medio que contiene partículas de dimensiones muy pequeñas, se observa dispersión de radiación
ac
en todas direcciones del espacio, sin embargo si la partícula presenta mayores tamaños la radiación
m
puede ser reflejada o refractada. Existen dos tipos de dispersión:
or
af
ec
Elástica
sn
La radiación es absorbida por el analito y reemitida sin cambios en la energía de la radiación.

.e
Es el caso de la dispersión de Rayleigh.

al
Inelástica
u
rt
La radiación es absorbida y reemitida con cambios en su energía.

s vi
pu
La turbidimetría puede realizar en espectrofotómetros. Cuando la concentración de partículas se
mide por turbidimetría, la suspensión se pone en una cubeta similar a un tubo de ensayo, que
m
permite realizar las medidas de las energías incidentes y transmitidas. La fuente de radiación más
ca
frecuentemente usada es la lámpara de wolframio, pero pueden utilizarse otras fuentes de radiación.
La ecuación matemática que relaciona la concentración de analito con las energías incidente y
transmitida es:
40 / 55
Donde P es la energía de la radiación transmitida, P`es la energía de la radiación incidente, b es el
espesor de la cube, C la concentración de partículas disertantes por unidad de volumen y f una
constante que depende del tamaño de partícula y longitud de onda.
Casi todas las medidas turbidimétricas se realizan con colorímetros o espectrofotómetros ordinarios.
Los turbidimétros, propiamente dichos, son instrumentos nefelométricos que miden la turbidez
causada por partículas suspendidas en un líquido.
m
Nefelometría
co
La nefelometría se define como la detección de la energía lumínica dispersa o reflejada hacia un
n.
detector que no se encuentra en el camino directo del haz luminoso. Las mediciones se realizan a
io
menudo en un determinado ángulo en relación con dicho haz. Las mediciones nefelométricas son
ac
más adecuadas para medir muestras cuya concentración de partículas es baja, lo que da lugar a una
débil dispersión de la luz.

m
or
af
El nefelómetro es un tipo de instrumento fotométrico, que puede o no ser automatizados para la

ec
determinación de proteínas específicas en diferentes fluidos biológicos, y que presenta un esquema

sn
genera, en cuanto a sus componentes:

.e
u al
rt
s vi
pu
m
ca
Donde I0 es la intensidad de luz incidente, It la intensidad de luz transmitida y S la intensidad de luz
dispersada.
Para determinar la concentración de analito en este método aplicamos la siguiente ecuación:
41 / 55
Donde K0 es una constante empírica del sistema y que depende de una curva de calibración
preparada, usando una serie de patrones de concentración conocida.
El procedimiento analítico para llevar a cabo la nefelometría se basa en la dispersión de la radiación
m
que atraviesa las partículas. Cuando la luz atraviese un medio transparente en el que existe una
co
suspensión de partículas sólidas, se dispersa en todas direcciones y como consecuencia se observa
n.
turbia. La dispersión no supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de
io
la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier ángulo. La intensidad
ac
depende del número de partículas suspendidas, su tamaño, su forma, los índices de refracción de la
m
partícula y del medio dispersante, y la longitud de onda de la radiación dispersada.
or
af
ec
sn
.e
u al
rt
s vi
pu
m
El procedimiento de nefelometría generalmente es empírico y sólo se consideran 3 factores:

ca
Concentración: a mayor número de partículas, mayor dispersión.
Tamaño de partícula: factores como pH, la velocidad y orden de la mezcla, concentración de
los reactivos y la fuerza iónica.
Longitud de onda: generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si están
coloreadas se debe escoger una porción del espectro electromagnético en la que la absorción
del medio se reduzca al mínimo.
42 / 55
Diferencia entre nefelometría y turbidimetría
La nefelometría se basa en la medición de la radiación dispersa, en cambio la turbidimetría en la
medición de la intensidad de un haz disminuido.
Los factores que influyen para la elección de uno u otro método son:
m
Intensidad de la radiación
co
Transmitida o dispersada con la intensidad de la radiación procedente de la fuente. La
n.
mejor elección cuando la muestra contiene pocas partículas es la nefelometría. Por el
io
contrario, la turbidimetría es buena cuando las muestras contienen grande
concentraciones de partículas dispersantes.
ac
Tamaño de las partículas dispersantes
m
or
En la nefelometría la intensidad de la radiación dispersada a 90º es mayor si las partículas
son bastantes pequeñas para que se produzca un dispersión Rayleigh. Si las partículas son
af
mayores la intensidad de la dispersión disminuirá. En turbidimetría la señal consiste en la

ec
disminución relativa de la radiación trasmitida, por lo que el tamaño de las partículas

dispersantes es menos importante.
sn
.e
u al
rt
s vi
pu
m
ca
43 / 55
10. Refractometría de líquidos
La refractometría es una técnica analítica que consiste en la medida del índice de refracción de un
líquido con un objeto de investigar su composición o su pureza. También se considera un método
óptico usado para determinar la velocidad de propagación de la luz en un medio que está
relacionado con la densidad.
El fenómeno de la refracción consiste en la desviación de trayectoria que sufre un haz de radiación
m
monocromática al pasar desde el vacío a otro medio material de distinta densidad. A nivel molecular
co
este fenómeno se debe a la interacción entre el campo eléctrico de la radiación y los electrones de
n.
las moléculas, originándose temporalmente momentos dipolares inducidos.
io
ac
Por tanto, la refracción de una onda es la flexión que sufre cuando entra en un medio con velocidad
m
de propagación diferente. La refacción de la radiación, cuando pasa de un medio de propagación
or
rápido a otro más lento, dobla el rayo de luz en dirección a la normal de la superficie de contacto
af
entre ambos medios.

ec
sn
.e
u al
rt
s vi
pu
m
ca
La cantidad de difracción depende de los índices de refracción de los dos medios y se describe
cuantitativamente por la ley de Snell.
La ley de Snell define el llamado índice de refacción “n” de un medio, que es una medida de su
interacción con la radicación y se define como:
44 / 55
m
Donde “i” y “r” son los ángulos de incidencia y refracción que forma el haz con la normal a la
co
superficie de separación.
n.
A su vez, la interacción entre la radiación y el medio ocasiona una reducción en la velocidad de la luz
io
mientras ésta camina a través del medio. Este fenómeno está relacionado con el índice de refracción
ac
por:
m
or
af
ec
sn
Donde “c” y “v” son las velocidades de propagación de la radiación en el vacío y en el medio.
.e
al
Por tanto, el índice de refracción quedaría definido por:

u
rt
s vi
pu
Este índice de refracción medido frente al vacío se denomina índice de refracción absoluto de la
m
ca
sustancia en cuestión y como c > v estos índices de refracción siempre son mayores que 1.
El índice de refracción depende de:
La temperatura.
La presión.
La longitud de onda.
Concentración de especies.
45 / 55
Las aplicaciones de la refractometría son:
Análisis cualitativo: basado en el hecho de que el índice de refracción es una constante física
característica de cada sustancia para una radiación de longitud de onda dada. Por ejemplo en
algunas farmacopeas se cita como estándar de pureza de un líquido el intervalo dentro del cual
debe situarse el índice de refracción.
Análisis cuantitativo: la obtención de curvas de calibrado proporciona un procedimiento
adecuado para analizar mezclas y disoluciones.
m
co
Más concretamente, se puede definir tres aplicaciones centradas en bioquímica clínica:
n.
io
ac
Confirmar la identidad de un compuesto.
Medir la pureza de un compuesto, conjuntamente con otras propiedades físicas.
m
or
Utilizarse como base para medir la concentración de una mezcla binaria.
af
ec
sn
.e
u al
rt
s vi
pu
m
ca
46 / 55
11. Fotometría de reflectancia: química seca
Cuando un haz de luz incide sobre una superficie, la luz es reflejada por esta superficie,
produciéndose a la vez dos tipos de reflexión:
Reflexión especular: en donde la luz es reflejada como lo haría en un espejo.
Reflexión difusa (reflectancia): que consiste en la reflexión producida al penetrar la luz en
las capas internas de la superficie iluminada.
m
co
Dentro de la fase sólida, la luz sufre una serie de fenómenos de absorción y dispersión. Este tipo de
n.
reflexión es de interés para las mediciones que se realizan con las técnicas de química seca.
io
ac
La fotometría de reflectancia implica la medida de la intensidad de la luz que es reflejada por una
m
fase sólida, tras iluminar ésta con un haz de luz de una longitud de onda que es absorbida por los
or
productos de interés.
af
ec
sn
.e
u al
rt
s vi
pu
m
Los espectrofotómetros de reflexión miden la reflectancia y la relacionan con la concentración del

ca
analito de interés. Sus componentes son:
Fuente de luz: se emplean dos tipos de lámparas, que pueden ser de haluro de tungsteno o de
xenón.
Sistemas ópticos: consisten en combinaciones de lentes, espejos y filtros.
Reactivos de fase sólida: aquí radica una de las diferencias fundamentales con la fotometría
de absorción. La muestra se sitúa en los reactivos de fase solida (tiras reactivas, reactivos
multicapa). Todos los componentes necesarios para que se produzca la reacción se encuentran
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impregnados en estas unidades, en las que tiene lugar la reacción y la lectura.
Detector y procesador de datos.
Química seca
La tecnología de química seca tiene sus indicios en los años 70. Se basa en la estabilización de los
componentes de la reacción necesarios para el análisis (indicadores, enzimas y reactivos auxiliares),
por pretratamiento y deshidratación de las respectivas soluciones, en papel de filtro, fijado a su vez
m
sobre un soporte de material sintético.
co
n.
La muestra que contiene el analito a determinar (suero, plasma, sangre total, orina, etc.) se aplica
io
sobre la superficie del reactivo en fase sólida, y a partir de ésta difunde la matriz, disolviendo los
ac
componentes de reacción que contiene. Cuando los reactivos se disuelven se produce la reacción
m
colorida, que se cuantificará. or
Todos los sistemas constan de tres partes:
af
ec
sn
Soporte
.e
al
Está constituido por una lámina de plástico, sobre la cual se construye el reactivo de fase
u
sólida.
rt
Parte reflectante
s vi
Su función es reflejar la luz. Está fabricado de materiales reflectantes como metales, o

pu
materiales fibrosos como el papel.

m
Parte reactiva
ca
Contiene, en forma deshidratada todos los reactivos y sustancias auxiliares necesarias para
que se produzca una reacción. Los reactivos son reconstituidos mediante rehidratación por el
agua de la muestra.
En ocasiones se añaden otras capas con funciones complementarias como:
Capa difusora: con lo cual la muestra difunde rápidamente hacia los laterales y se distribuye
uniformemente.
48 / 55
Capa separadora de plasma: la utilizan los sistemas preparados para trabajar con sangre
total. Su función es retener las células y permitir el paso del plasma hacia la matriz del
reactivo.
m
co
n.
io
ac
m
Los reactivos de fase sólida empleados en la química seca se engloban en dos tipos:
or
af
Tiras reactivas: consisten, básicamente en un soporte de plástico que sirve de soporte a una
ec
matriz de celulosa que contiene los reactivos secos necesarios para que se produzca una
sn
reacción con el componente a estudiar. Las ventajas de las dichas tiras son mantener los
.e
reactivos deshidratados, aportando una prolongada estabilidad al sistema, que puede ser de
al
meses e incluso de uno o dos años. Este tipo de tiras se emplean para: análisis de orina,
u
rt
autocontrol de la glucemia y en sistemas de diagnóstico rápido.

vi
Películas multicapa o slides: están constituidas por diferentes capas muy finas, a través de
s
pu
las cuales se van produciendo todas las etapas necesarias para la determinación cuantitativa
del analito. Las diferentes capas son:

m
ca
Capa difusora: sobre ella se deposita la muestra. Homogeneiza la muestra antes de
que llegue a la capa reactiva, distribuyéndola por toda la superficie. Retiene células,
cristales y pequeñas y grandes moléculas, así la muestra se convierte en un filtrado
libre de proteínas, eliminándose las interferencias.
Capa reactiva: pueden ser una o varias, son las que contienen los reactivos.
Capa soporte: está hecha de plástico transparente y sobre ella se depositan todas las
demás capas una tras otra. Tiene doble función: servir de soporte y dejar pasar la
luz, ya que la lectura se hace por la parte inferior.
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m
co
n.
io
ac
m
or
af
ec
sn
.e
u al
rt
s vi
pu
m
ca
50 / 55
Glosario
Radiación: 1. Transmisión de un suceso por radio 2. Emisión de energía o de partículas, por
parte de una sustancia radiactiva, que se propaga por el espacio y a través de los cuerpos con
un determinado poder de penetración 3. Emisión de luz, calor u otra energía 4. Elemento de
una onda electromagnética o luminosa.
m
Diluidos: To dilute;___ con agua → ;.
co
n.
Fiabilidad: 1. Cualidad de la persona o cosa fiables 2. Probabilidad de que una máquina, un
io
ac
aparato o un dispositivo funcionen correctamente bajo ciertas condiciones y en un periodo de
tiempo determinado.
m
or
af
Ultravioleta: 1. Se aplica al espacio del espectro electromagnético que no es visible para el ojo
ec
humano y comprende el intervalo que va desde la luz visible violeta hasta la región de los rayos
sn
X 2. Se aplica a la radiación o rayo que pertenece a este espacio del espectro electromagnético.
.e
al
Fluorescencia: Propiedad de algunas sustancias por la cual, al ser expuestas a la acción de

u
rt
ciertos rayos, transforman estas radiaciones, emitiendo ondas luminosas de longitud de onda
vi
mayor que la de los rayos incidentes.

s
pu
m
Calcio: Elemento químico metálico blanco.

ca
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Recuerda
La absorción de radiación electromagnética implica el paso de una especie de su estado
fundamental de mínima energía (E0) a un estado excitado de mayor energía (E*).
La dispersión de la luz es el fenómeno mediante el cual la radiación electromagnética, al
chocar con pequeñas partículas de tipo coloidal o molecular, es desviada en su dirección de
propagación, de forma aparentemente caótica, en cada uno de los núcleos de dispersión, por
m
tener un índice de refracción diferente al del medio.
co
La ley de Beer dice que “la intensidad de un haz de luz monocromática, que incide
n.
perpendicular sobre una muestra, decrece exponencialmente con la concentración de dicha
io
muestra”.
ac
La linealidad es la capacidad de producir resultados proporcionales a la concentración de
m
analito en las muestras dentro de un rango determinado de concentración ya sea directamente
or
o por medio de una transformación matemática bien conocida.
af
La fotometría se puede definir como la medida de las magnitudes relativas a las radiaciones,
ec
evaluadas según la impresión visual producida por éstas y basándose en ciertas convenciones.
sn
La espectrofotometría, en química analítica es una técnica de medición que asocia el análisis

.e
espectral de la espectroscopia de medición de magnitudes fotométricas relativas, en la mayoría

al
de los casos relacionados con las propiedades de la materia.

u
rt
La fluorescencia es un proceso de emisión en el cual las moléculas son excitadas por la

vi
absorción de radiación electromagnética y al relajarse al estado basal liberan el exceso de

s
energía en forma de fotones.

pu
La fotometría de llama es una técnica de emisión que utiliza una llama como fuente de
m
excitación y un fotodetector electrónico como dispositivo de medida. Se trata principalmente

ca
de un método de análisis cuantitativo y es uno de los métodos más sencillos y precisos.
La espectrofotometría de absorción atómica o espectroscopía de absorción atómica es un
método para la detección y la determinación de elementos químicos, particularmente de
elementos metálicos. Los compuestos, para su examen, se tienen que romper en los átomos que
los constituyen. Ello se realiza por pulverización en una llama a alta temperatura.
La nefelometría se define como la detección de la energía lumínica dispersa o reflejada hacia
un detector que no se encuentra en el camino directo del haz luminoso.
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La refractometría es una técnica analítica que consiste en la medida del índice de refracción
de un líquido con un objeto de investigar su composición o su pureza.
La fotometría de reflectancia implica la medida de la intensidad de la luz que es reflejada
por una fase sólida, tras iluminar ésta con un haz de luz de una longitud de onda que es
absorbida por los productos de interés.
La tecnología de química seca tiene sus indicios en los años 70. Se basa en la estabilización
de los componentes de la reacción necesarios para el análisis (indicadores, enzimas y reactivos
m
auxiliares), por pretratamiento y deshidratación de las respectivas soluciones, en papel de
co
filtro, fijado a su vez sobre un soporte de material sintético.
n.
io
ac
m
or
af
ec
sn
.e
u al
rt
s vi
pu
m
ca
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Autoevaluación
1. Indica si es verdadero o falso el siguiente enunciado: “La absorción de radiación

electromagnética implica el paso de una especie de su estado fundamental de máxima
energía a un estado excitado de menor energía”.
Verdadero.
m
co
Falso.
n.
io
2. Completa el espacio en blanco del siguiente enunciado: “La ______________ es la
ac
capacidad de producir resultados proporcionales a la concentración de analito
m
en las muestras dentro de un rango determinado de concentración.
or
af
Dispersión.
ec
sn
Refracción.
.e
u al
Linealidad.
rt
s vi
3. Los componentes del espectrofotómetro son:

pu
m
ca
Fuente de energía y el detector.
Fuente de energía, monocromador y detector.
Fuente de energía, selector de longitud de onda, monocromador y detector.
4. ¿Qué proceso es sirve para la determinación de elementos químicas,
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particularmente de elementos metálicos?
Absorción atómica.
Fotometría en llama.
Espectrofluorometría.
m
co
n.
5. En la nefelometría si las partículas son mayores, la intensidad de la
dispersión:
io
ac
m
Aumenta. or
af
Disminuye.
ec
sn
Se queda en equilibrio.
.e
u al
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s vi
pu
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ca
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Medida de Analitos Por Métodos de Detección de La Radiación Electromagnética

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Medida de Analitos Por Métodos de Detección de La Radiación Electromagnética

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[AFO007847] MF0371_3 Análisis Bioquímicos en Muestras Biológicas Humanas

[MOD007722] MF0371_3 Análisis Bioquímicos en Muestras Biológicas Humanas

electromagnética emitida y absorbida por la materia. Siendo la radiación electromagnética una

Citar las técnicas basadas en los métodos de detección de la radiación electromagnética:

métodos ópticos de análisis molecular: espectrofotometría de absorción molecular,

espectrofluorometría, turbidimetría, nefelometría y fotometría de reflectancia.

Citar las técnicas basadas en los métodos de detección de la radiación electromagnética:

métodos ópticos de análisis atómico: fotometría de llama, y espectroscopia de absorción

1. Interacción de la radiación con la materia

cargadas, etc.) es su capacidad de penetrar en la materia e interaccionar con ella. En estas

de su energía y de las propiedades del medio material con el que interaccionan.

Partículas “pesadas” (radiación alfa).

Partículas con masa y sin carga (neutrones).

los fenómenos más importantes de interacción son la absorción y la dispersión de la luz.

La absorción de radiación electromagnética implica el paso de una especie de su estado fundamental

La representación gráfica de la atenuación de la radiación incidente (absorbancia) o la radiación

transmitida (transmitancia) frente a la longitud de onda, frecuencia o número de ondas da lugar al

espectro de absorción de dicha especie.

Cuando la frecuencia de la onda electromagnética que incide en un material, coincide o es próxima a

la frecuencia de resonancia de los átomos o moléculas del material, la onda es fuertemente

absorbida ya que la transferencia de energía de la onda al electrón ligado es muy efectiva.

frecuencia cercana a la resonancia electrónica la energía de la onda incidente se transferirá a la red

La dispersión de la luz es el fenómeno mediante el cual la radiación electromagnética, al chocar

con pequeñas partículas de tipo coloidal o molecular, es desviada en su dirección de propagación, de

refracción diferente al del medio.

constituye la base fundamental de los métodos turbidimétricos y nefelométricos.

la longitud de onda de la luz (λ) es:

Donde I0 es la intensidad de la luz incidente no polarizada, I la intensidad de luz dispersada en una

onda de la luz solar llegan por igual.

dispersión estática, dinámica y de Raman.

En la dispersión estática la frecuencia no cambia sensiblemente.

En la dispersión dinámica la frecuencia se modifica ligeramente.

En la dispersión de Raman la frecuencia se modifica de forma importante, involucrando

normalmente otros tipos de energía.

Las leyes de Lambert-Bouguer-Beer son esenciales para entender la metodología de la absorción

mencionadas contribuyeron a ella.

absorberse por el material. Recibe el nombre de coeficiente de extinción.

que la relación funcional entre la cantidad medida en un método absorciométrico y la cantidad

deseada, se conoce como ley de Beer, y que se puede expresar:

a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad.

Cuando la concentración está expresada en moles/L y b en centímetros, la constante de

proporcionalidad se denomina absortividad molar y se presenta con el símbolo especial ε.

La ecuación de Lambert Beer es el fundamento de la espectrofotometría tal como se aplica en

un tramo de material, que contienen n partículas absorbentes, la potencia de la radiación disminuye

a P, como resultado de la absorción. Considerando una sección transversal de área S y de espesor

fracción absorbida es pues:

debe proporcional al número de partículas:

Donde dn es el número de partículas y a es una constante de proporcionalidad que se llama sección

transversal de captura. Combinando ambas ecuaciones e integrando entre cero y n, se obtiene:

Pasando a logaritmos decimales e invirtiendo la fracción para cambiar de signo, se obtiene:

en términos del volumen V y de la longitud b bloque (S=V/b). Y sustituyendo en la ecuación anterior

cúbico), que se convierten fácilmente en moles por litro de la forma:

Combinando esta ecuación con la anterior y sustituyendo nos queda, finalmente:

concentración de un analito. La calibración incluye la selección de un modelo para estimar los

parámetros que permitan determinar la linealidad de esa curva, y, en consecuencia, la capacidad de

un método analítico para obtener resultados que sean proporcionales a la concentración de un

compuesto en una muestra, dentro de un determinado intervalo de trabajo. En el procedimiento se

relevancia en diversas actividades como el diagnóstico clínico. La obtención de una curva de

herramientas necesarias para asegurar la calidad de los resultados generados en el proceso.

Absorbancia y la concentración se puede usar cálculos de regresión lineal.

m es la pendiente de la curva de calibración (también denominada factor de calibración).

B es la intersección de la curva de calibrado con el eje de las abscisas, y se corresponde con el

valor de absorbancia de la disolución a concentración de analito cero.