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EspectrofotometrÍa de AbsorciÓn Ultravioleta-Visible

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BIOQUIMICA I
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ESPECTROFOTOMETRÍA DE ABSORCIÓN ULTRAVIOLETA-VISIBLE

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Se basa en la absorción de radiación ultravioleta y visible por el analito, originándose un estado activado que posteriormente elimina su exceso de energía en forma de calor. X + hυ→X* → X + calor Colorimetría. Este término se refiere a la medida de la radiación absorbida en la región visible del espectro electromagnético y se emplean aparatos que utilizan filtros. Espectrofotometría. Se refiere a la medida de la radiación absorbida en las regiones visible, ultravioleta e infrarroja, y además, se utilizan monocromadores en lugar de filtros, así como sistemas de detección más sensibles, como tubos fotomultiplicadores.

Leyes de la absorción de radiación - Cuando un haz de radiación monocromática de una determinada longitud de onda atraviesa una capa de disolución conteniendo una especie absorbente, la potencia (energía por unidad de tiempo y unidad de área) del haz, incidente P0 se atenúa, disminuyendo hasta P. Se define la transmitancia, como la fracción de radiación incidente que consigue atravesar la muestra.
P T = --- ; Po P T = --- x 100 Po

- Un parámetro de mayor utilidad práctica es la absorbancia, A, definida como
Po A = - log T = log ----P

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- Normalmente, la concentración c de un analito absorbente está relacionada linealmente con la absorbancia, de acuerdo con la ley de Beer: A=εbc

ε es una constante que recibe el nombre de absortividad molar, es
una propiedad característica de la sustancia absorbente y depende de la longitud de onda. • b es camino óptico en centímetros. • c es la concentración en moles/litro.

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Desviaciones de la ley de Beer - La proporcionalidad entre la absorbancia y la concentración únicamente se cumple para disoluciones muy diluidas, observándose desviaciones más o menos acusadas al aumentar la concentración

Figura 1. Desviaciones de la ley de Beer

Clasificación:

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DESVIACIONES REALES - Influencia del índice de refracción DESVIACIONES INSTRUMENTALES - Las fluctuaciones producidas en la corriente eléctrica, la inestabilidad de algunas fuentes de radiación o la respuesta no lineal del detector pueden originar el funcionamiento incorrecto de un determinado aparato. Además: a) Uso de radiación no monocromática. La deducción de la ley de Beer se hace sobre la base de utilizar radiación monocromática, lo cual, en sentido estricto, nunca se cumple, pues en la práctica, todos los dispositivos seleccionan una banda más o menos ancha en torno a una determinada longitud de onda.

Figura 2. Influencia de la radiación policromática sobre la ley de Beer

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b) Presencia de radiación parásita o espúrea. - El haz de radiación que sale de un monocromador suele estar contaminado con pequeñas cantidades de radiación parásita o dispersada, originada por reflexión de los distintos componentes ópticos, dispersión por partículas de polvo atmosférico o dispersión por la propia muestra, dando lugar a desviaciones negativas en la ley de Beer. c) Errores de lectura. - Son los errores indeterminados en la lectura de la transmitancia o absorbancia que potencialmente siempre están presentes y es necesario tenerlos en cuenta. En ocasiones, pequeños errores en la lectura de la transmitancia o de la absorbancia pueden ocasionar errores grandes en la concentración cuando se opera en los extremos de la escala.

Figura 3. Errores de lectura

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DESVIACIONES QUÍMICAS

- Se incluyen las desviaciones aparentes de la ley de Beer producidas como consecuencia de procesos químicos en los que participan las especies absorbentes. a) Influencia del equilibrio. Cuando la sustancia problema interviene o forma parte de un sistema en equilibrio con otras especies, el desplazamiento del equilibrio implica una modificación en la concentración, y, en consecuencia, en la absorbancia. * Dimerizaciones de las especies absorbentes * Influencia de las propiedades ácido-base de las especies absorbentes * Formación de complejos de las especies

b) Influencia del disolvente. Las interacciones soluto-disolvente originan con frecuencia desplazamientos espectrales, ensanchamientos de bandas y otros fenómenos que pueden provocar desviaciones en la ley de Beer. En este sentido, no es posible hacer predicciones de forma general. c) Influencia de la temperatura. La temperatura puede influir modificando el equilibrio químico de algunos sistemas, así como, en ocasiones, dar lugar a desplazamientos batocrómicos.

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d) Presencia de impurezas en los reactivos. Los errores por impurezas en los reactivos pueden ser considerables en las determinaciones de especies a niveles traza. Se pueden conocer y corregir estos errores, haciendo las medidas espectrofotométricas frente a blancos “sin analíto” pero con los reactivos. e) Interacciones entre especies absorbentes. Cuando en una disolución existen varias especies absorbentes, la ley de Beer se cumple para cada una de ellas, si todas actúan independientemente. Las interacciones entre ellas pueden producir desviaciones de dicha ley.

ERRORES PERSONALES - Los mayores errores suelen cometerse por el uso inadecuado de las cubetas de absorción. Resultan de utilidad las recomendaciones siguientes:
Las cubetas han de estar perfectamente limpias, no rayadas y exentas de huellas o adherencias en las paredes por las que ha de pasar la radiación. Las cubetas de vidrio y cuarzo pueden limpiarse con ácido nítrico o con agua regia en frío, pero no con mezcla crómica. . Una vez limpias, las cubetas deben enjuagarse con agua destilada y con varias porciones de la disolución a medir Una vez llena con la disolución problema, no deben formarse burbujas de aire. Se debe trabajar con cubetas idénticas (cubetas pareadas) para la muestra y la referencia (blanco), y además es bueno utilizar siempre la misma cubeta para cada uno de esos dos tipos de disolución.

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Absorción de radiación - Cuando una molécula absorbe un fotón UV-vis se incrementa su energía, pasando a un estado excitado. - La absorción de radiación ultravioleta y visible origina transiciones entre distintos niveles de energía electrónicos, así como simultáneamente transiciones vibracionales y rotacionales. ∆E = ∆Eelectrónica + ∆Evibracional +∆Erotacional + ∆Etraslacional - En base al tipo de transiciones electrónicas que pueden tener lugar, se pueden clasificar las especies absorbentes y permite correlacionar el comportamiento espectral de una determinada especie con sus características químicas.

TIPOS DE TRANSICIONES ELECTRÓNICAS Pueden tener lugar cuatro tipos de transiciones: σ→σ*, π→π*, n→σ*, n→π*. También pueden producirse transiciones →σ →π denominadas de transferencia de carga y de campo ligando.

Figura 4 . Transiciones electrónicas entre niveles de energía moleculares

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Transiciones σ→σ*. - Estas transiciones implican energías relativamente grandes, de forma que las bandas de absorción se observan en el ultravioleta lejano, a longitudes de onda inferiores a 200 nm. - Esta región del espectro se denomina frecuentemente ultravioleta de vacío - En los hidrocarburos saturados, en los que solamente hay enlaces sencillos C—H, se producen estas transiciones.

Transiciones n→σ*. →σ - Estas transiciones requieren bastante energía, si bien en menor grado que las σ→σ*, por lo que las bandas correspondientes se presentan fundamentalmente en el ultravioleta lejano. - Las especies químicas saturadas que contengan átomos con pares electrónicos en orbitales no enlazantes pueden dar lugar a que se produzcan transiciones n→σ*.

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Transiciones n→π* y π→π*. - Las transiciones π→π* requieren la absorción de una cantidad de energía relativamente grande, por lo que suelen aparecer en el ultravioleta lejano y próximo, mientras que las n→π* necesitan menor cantidad de energía, como consecuencia de lo cual se originan bandas en las zonas ultravioleta próximo y visible. - Sobre la intensidad de la absorción, las absortividades molares de los picos asociados a las transiciones n→π* son generalmente bajos, mientras que los correspondientes a los π→π* son considerablemente mayores

Figura 5. Bandas de absorción originadas por diferentes transiciones electrónicas

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Tabla 1 Grupos cromóforos y transiciones electrónicas

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Grupos cromóforos (absorben la luz, generalmente anillos aromáticos) y grupos auxocromos (hacen que se modifique alguna de las características de la absorción del cromóforo, exaltan el color o la intensidad del mismo)

a) Si los cromóforos están separados por dos o más enlaces sencillos se dice que están aislados, y, en estos casos, la absorción es la suma de todos los grupos cromóforos presentes.

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b) Cuando los cromóforos están conjugados, esto es, separados por un enlace sencillo, se produce un desplazamiento batocrómico acompañado de un efecto hipercrómico.

c) Cuando los cromóforos están unidos directamente, el espectro resultante normalmente es distinto del que presentan ambos cromóforos cuando están aislados, ya que en realidad se forma un nuevo cromóforo.

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Bandas de transferencia de carga. - Se originan cuando se produce transferencia de electrones de una parte a otra de un sistema. Para ello es necesario que uno de sus componentes tenga características de dador de electrones y otro de aceptor. Ejemplos: Fe(III)-SCN- + hv → Fe(II)-SCN

- Las bandas de absorción originadas por estos procesos de transferencia de carga, tanto en el ultravioleta como en el visible, son particularmente importantes en análisis químico, dando lugar en muchos czsos a absortividades molares superiores a 10.000

Bandas de campo ligando. - El color que presentan muchos iones y compuestos de metales de transición normalmente se deben a absorciones denominadas de campo ligando. - Estas absorciones suelen ser de baja intensidad y aparecen en la región visible, llegando en ocasiones hasta el ultravioleta próximo y el infrarrojo próximo. - Origen de las bandas de campo ligando. - Orden de los ligandos más comunes en orden creciente de ∆ (serie espectroquímica): I-<Br- < Cl- <F- <OH- < C2O4=~ H20 < SCN- <NH3 < etilendiamina < <NO2- < CN-

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COLOR Las radiaciones comprendidas entre unos 400 y 700 nm son capaces de afectar la retina del ojo humano y con ello dar origen a las impresiones subjetivas de la visión. En la percepción del influyen factores químicos, fisiológicos y físicos. - Cuando incide radiación electromagnética visible (policromática) sobre la materia puede ser absorbida total o parcialmente; si la absorción es total, el objeto aparece de color negro. Sino se da nada de absorción se produce la relexión y el bjeto aparece de color blanco. - Teoría del color: -Al incidir sobre un objeto un haz de ondas de distinta longitud, absorbe unas y refleja otras, siendo estas últimas las que en conjunto determinan el color del objeto. -De manera equivalente si se trata de una disolución transparente las longitudes de ondas transmitidas son las que determinan el color del líquido.

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Tabla 3. Colores del espectro visible

_______________________________________________ Color observado λ absorbida (nm) Color absorbido (complementario) ________________________________________________ 380-420 Violeta Amarillo-verdoso 420-440 Azul-violeta Amarillo 440-470 Azul Anaranjado 470-500 Verde-azulado Rojo 500-520 Verde Púrpura 520-550 Amarillo-verdoso Violeta 550-580 Amarillo Azul-violeta 580-620 Anaranjado Azul 620-680 Rojo Verde-azulado 680-780 Púrpura Verde _________________________________________________

Instrumentación Colorímetro - Instrumento muy simple que compara, usando el ojo humano como detector, el color de la sustancia problema con el de una disolución patrón. Fotómetro - Cualquier dispositivo utilizado para medir la intensidad de radiación. Normalmente se utiliza para designar un instrumento sencillo provisto de filtros para seleccionar una banda de longitudes de onda y de una fotocélula o un fototubo para medir la intensidad de radiación. Espectrofotómetro - Instrumento más sofisticado que posee un monocromador en lugar de filtros. Además, el sistema de detección normalmente es un fotomultiplicador, más sensible que una fotocélula.

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Componentes básicos de un espectrofotómetro • Fuente de radiación • Monocromador • Cubeta • Detector de radiación • Sistema de tratamiento y lectura de la señal detectada

Figura 8. Espectrofotómetro de doble haz

FUENTES DE RADIACIÓN Las fuentes de radiación utilizadas en espectrofotometría ultravioleta y visible deben ser continuas en una amplia zona del espectro, de intensidad elevada y ser esencialmente constante con la longitud de onda. Fuentes térmicas * Lámpara de filamento de wolframio Fuentes de descargas eléctricas en el seno de gases * Lámpara de descarga de hidrógeno, o de deuterio * Lámpara de descarga de xenon * Lámpara de vapor de mercurio

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FILTROS Y MONOCROMADORES - La misión de los filtros y de los monocromadores es seleccionar un haz de radiación «monocromática». Con este fin se utilizan los siguientes dispositivos:

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Filtros de absorción - Se utilizan en la región visible y se basan en la absorción selectiva de ciertas longitudes de onda. Filtros de banda, se caracterizan por su anchura de banda (anchura mitad de la altura) que puede oscilar entre 30 y 250 nm. * Filtros de corte, tienen transmitancias de casi el 100 % en una zona del espectro visible, pero luego disminuye rápidamente hasta un valor de transmitancia cero.

Filtros de interferencia Consisten en un dieléctrico transparente (frecuentemente, fluoruro cálcico o magnésico) recubierto en ambos lados con dos finas capas de plata semirreflectante (Fig. 11). Se utilizan para todas las zonas de las regiones ultravioleta y visible, así como parte del infrarrojo.

Figura 11. Filtro de interferencia

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Figura 12. Anchuras de banda efectiva para dos tipos de filtros

Monocromador - Se caracteriza por producir un haz de radiación de gran pureza espectral y permitir variar, de forma continua y en un amplio intervalo, la longitud de onda de la radiación. * Prisma, se basa en el fenómeno de la refracción. En la región visible se usan prismas de vidrio, mientras que en el ultravioleta es necesario usarlos de cuarzo.

Figura 12. Dispersión de radiación por un prisma

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* Redes de reflexión, se basan en el fenómeno de la difracción en tanto que se produce una reflexión sobre una superficie dura, pulida y grabada con un gran número de surcos paralelos y muy próximos entre sí (entre 300 y 2.000 surcos por milímetro para las regiones ultravioleta y visible.

Figura 13. Difracción de radiación por una red de reflexión

Difracción de radiación por una red de reflexión. Principio de una red de reflexión

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Interferencia de ondas adyacentes que están desfasadas (a) 0o (en fase), (b) 90o y (c) 180 0o

- El fenómeno de la difracción de una radiación policromática por una red se representa esquemáticamente en la figura.

Figura 14. Difracción de una radiación policromática por una red

- En resumen, y comparando con los prismas, las redes de difracción presentan las ventajas de su elevada resolución, dispersión lineal y pocas pérdidas de radiación por absorción.

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RECIPIENTES PARA LAS MUESTRAS - Se utilizan celdas o cubetas para colocar las muestras líquidas en el haz del espectrómetro. Así, el vidrio puede emplearse entre 350 y 2.000 nm, mientras que en la región ultravioleta se necesita cuarzo o sílice fundida.

Figura 15. Celdas para espectrofotometría

Figura 17. Intervalos de transmitancia para distintos materiales ópticos

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DETECTORES Son transductores que convierten la energía radiante en una señal eléctrica. Un detector ideal deberá presentar las características siguientes:
Sensibilidad elevada en la región espectral de interés. Respuesta lineal para la energía radiante. Tiempo de respuesta pequeño. Utilizable en un amplio intervalo de longitudes de onda. Elevada relación señal/ruido. Mínima señal de salida en ausencia de radiación. Buena disponibilidad para la amplificación.

- Los más utilizados son: células fotovoltaicas, fototubos y tubos fotomultiplicadores.

Celdas fotovoltaicas. - Consisten en una placa de hierro, que actúa de electrodo positivo, sobre la que se deposita una fina capa de un material semiconductor, como selenio, y éste se recubre de una capa muy fina de oro o plata, que actúa como segundo electrodo o electrodo colector.

Figura 16. Célula fotovoltaica

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Ventajas: • Son sencillas de construir. • Relativamente baratas • No requieren una fuente de energía externa, por lo que pueden conectarse directamente a un galvanómetro o un amperímetro. Inconvenientes: • Su uso limitado a la región visible (su máxima sensibilidad se presenta hacia los 550 nm, mientras que la respuesta a 350 y a 750 nm disminuye hasta un 10 % de la máxima). • Presentan dificultades para la amplificación y fenómenos de fatiga.

Fototubo. - Consiste en un cátodo semicilíndrico recubierto interiormente de un material fotosensible, y un ánodo, en el interior de un recipiente en el que se ha hecho el vacío.

Figura 17. Fototubo

- En general, los fototubos son más sensibles que las células fotovoltaicas, por la posibilidad de poder amplificar la corriente inicialmente generada.

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Tubo fotomultiplicador. - Es el detector con un uso más extendido. Este tipo de detector consiste en un cátodo fotosensible (conversión en e-) y una serie de electrodos (dínodos), cada uno a un potencial menos negativo que el que le precede.

Figura 18. Tubo fotomultiplicador

- Este sistema de detección se caracteriza por su respuesta rápida y elevada sensibilidad. El límite de detección viene condicionado por el ruido de fondo que se origina como consecuencia de la emisión termoiónica, la cual puede reducirse enfriando.

Figura 18. Tubo fotomultiplicador

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Instrumentos de haz sencillo y de haz doble
- En los instrumentos de haz sencillo hay solamente un haz de radiación que, después de pasar a través de la muestra llega al detector. De esta forma, para comparar la absorción del blanco, debe sustituir éste a la muestra en cada lectura, lo cual implica varios segundos entre cada medida. - En un instrumento de doble haz, la radiación pasa alternativamente a través de la muestra y de la referencia, y pueden compararse varias veces por segundo (se compensa fluctuaciones y deriva en las medidas).

Figura 19. Espectrofotómetro de doble haz

Aplicaciones - En principio, cualquier especie química que absorba radiación electromagnética en las regiones ultravioleta o visible es susceptible de poder ser determinada por técnicas espectrofotométricas. ANÁLISIS CUALITATIVO - Está muy limitado, debido a que los espectros de absorción proporcionan bandas muy anchas, que son poco útiles para la identificación de moléculas. - La identificación de un compuesto requiere la comparación empírica del espectro (máximos, mínimos y puntos de inflexión) y, con frecuencia, de la intensidad de la absorción, expresada en términos de la absortividad molar, ε, la de la sustancia problema con los del compuesto puro.

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ANÁLISIS CUANTITATIVO - La espectrofotometría de absorción ultravioleta y visible es una de las técnicas más usadas en análisis cuantitativo. Sólo en el campo biosanitario, un 95 % de las determinaciones cuantitativas se llevan a cabo por espectrofotometría. - En relación con los métodos clásicos de análisis (gravimétricos y volumétricos), los métodos espectrofotométricos son menos exactos, pero presentan mayor sensibilidad (l0-4 — 10-6 M) y rapidez. La precisión puede considerarse aceptable (incertidumbres relativas entre el 1 y 2 %) aunque con determinadas precauciones pueden reducirse considerablemente.

Etapas para llevar a cabo una determinación a) Selección de la longitud de onda. b) Preparación de las muestras para el análisis. • Disolución y medida. Ejemplo, muchos compuestos orgánicos. • Reacciones rédox previas. Ejemplo, Mn2+ a Mn04. • Desarrollo de un color por medio de reactivos orgánicos o inorgánicos. Ejemplo, Ni2+ y dimetilglioxima; Fe3 y SCN, etc. - La formación de especies absorbentes mediante el uso de reactivos adecuados hace necesario considerar toda una serie de factores, entre los que cabe mencionar:
pH Concentración de los reactivos Tiempo adecuado para la medida Temperatura Orden de adición de los reactivos Eliminación de interferencias. Extracción con disolventes orgánicos

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c) Determinación de la relación absorbancia-concentración. • Preparación de un calibrado externo a partir de una serie de disoluciones patrón, preparadas en las mismas condiciones que la muestra. • Método de adición estándar, con objeto de contrarrestar los efectos de la matriz.

Figura 20. Método de adición estándar para análisis espectrofotométrico

ANÁLISIS DE MEZCLAS DE SUSTANCIAS ABSORBENTES - Se va a considerar el caso de que la muestra esté constituida por los componentes M y N. La forma de proceder depende de los espectros de absorción de ambas especies, y pueden presentarse los siguientes casos: a) Espectros no superpuestos.

Figura 21. Análisis de mezclas. Espectros no superpuestos

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b) Espectros superpuestos parcialmente.

Figura 22. Análisis de mezclas. Superposición parcial de espectros

c) Espectros completamente superpuestos.

Figura 23. Análisis de mezclas. Superposición completa de espectros

Espectrofotometría de derivadas - Un procedimiento alternativo para analizar muestras con gran solapamiento consiste en aplicarle las derivadas a los espectros . -Actualmente, la utilización de sistemas electrónicos de diferenciación mediante el empleo de un micro ordenador acoplado en serie con el espectrofotómetro permite la representación de derivadas de primero, segundo e incluso órdenes superiores de la absorbancia frente a la longitud de onda: dA — para la primera derivada dλ d2 A — dλ2 para la segunda derivada

siendo A la absorbancia y λ la longitud de onda.

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- La primera derivada de un espectro original también puede definirse como la representación gráfica de la pendiente de la curva de absorción a cada longitud de onda.

Figura 24. Pico de absorbancia simétrico y su primera derivada

- La utilización de la espectrofotometría de derivadas presenta las siguientes ventajas: • Medida exacta de λmax • Mejor resolución de los espectros. • Determinaciones en presencia de turbidez. • Determinaciones cuantitativas en presencia de dos o más componentes.

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DETERMINACIÓN DE CONSTANTES DE DISOCIACIÓN DE ÁCIDOS Y BASES - Se basa en que el espectro de absorción de moléculas orgánicas con grupos funcionales ácidos o básicos depende del pH del medio. -Para determinar el valor de pKa es necesario conocer el pH y las concentraciones (en sentido estricto, las actividades) de las formas ácida (HA) y básica (A-). - La relación [HA]/[A-] puede obtenerse espectrofotométricamente si se conocen las correspondientes absortividades molares, εHA y εA pKa = pH + log [HA]/[A-] - Según esta ecuación, cuando [HA] = [A], pKa = pH y este valor de pH corresponde a la mitad de la curva de valoración fotométrica, esto es, al 50 % de la valoración del ácido HA.

- El punto donde se cruzan los espectros se denomina punto isosbéstico. La presencia de un punto isosbéstico evidencia que el equilibrio en cuestión implica sólo dos especies absorbentes.

Figura 26. Espectros a varios pH y variación de la absorbancia con el pH a λ = 625 nm.

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VALORACIONES FOTOMÉTRICAS - En las valoraciones fotométricas se miden las cambios de absorbancia de una disolución durante la valoración. Estos cambios de absorbancia indican cambios en la concentración de alguna especie absorbente de radiación. - Las curvas de valoración consisten, si la reacción es completa, en dos líneas rectas que se cortan en el punto final. Para las que son apreciablemente incompletas se produce una curvatura en las proximidades del punto de equivalencia. - Las valoraciones fotométricas tienen fundamentalmente una ventajas sobre las convencionales, que la presencia de otras sustancias que absorban a la longitud de onda a la que se mide no origina necesariamente interferencia, ya que sólo importa el cambio que se observa en los valores de la absorbancia

.

Figura 27. curvas de valoración fotométricas

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