UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS Y PECUARIAS

ESCUELA DE CIENCIAS VETERINARIAS

IMPLEMENTACIÓN DEL MÉTODO DIAGNÓSTICO PARA VIRUS

HERPES FELINO MEDIANTE LA DETECCIÓN DEL GEN UL37 A
TRAVÉS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

ANAIS SARAHI POLANCO VERGARA

Proyecto de memoria de Título para

optar al titulo de Medico Veterinario
Departamento de medicina
preventiva animal.

PROFESOR GUÍA:
CARLOS OSVALDO NAVARRO VENEGAS
Universidad de chile

SANTIAGO, CHILE
AÑO 2021
INTRODUCCIÓN

El virus Herpes Felino (VHF-1) es responsable de causar una enfermedad respiratoria

superior aguda y ocular la cual es Rinotraqueitis viral felina, pudiendo dejar secuelas
importantes que afectan la calidad de vida del animal, en este caso, el gato. Este fue aislado
por primera vez por Crandell y Maurer en el año 1957, se conoce solo un serotipo y aunque
sea antigenéticamente similar a otros tipos de virus herpes, este no es zoonotico ni causa
enfermedades en otros tipos de familia animal.

El virus susodicho (VHF-1) conforma parte de la orden herpesvirales, de la familia

Herpesviridae, subfamilia Alphaherpesvirinae y del genero Varicellovirus, estos tienen una
amplia gama de hospedadores y son especie-especificos, se replican de forma muy rápida
en muchos tipos de células y a pesar de que sean líticos, estos pueden establecer latencia en
neuronas y células gliales.

Así como VHF-1 infecta a gatos domésticos también puede hacerlo con otros miembros de
la familia felina (felidae). Este virus tiene relación estrecha genética y antigeneticamente
con el virus Herpes Canino (VHC-1) y el virus Herpes Fócido.

Los viriones de esta familia poseen un tamaño que varia entre los 120-200nm y son en
forma morfológica indistinguible entre ellos. El genoma esta encapsulado en una caspide
icosahedrica que esta compuesta por 162 capsomeros, cubierta por una envoltura lipídica
extraida de la celula que esta infectada, en esta envoltura se encuentran las glicoproteínas.
Tienen un tegumento que es una estructura amorfa de la naturaleza proteica asimétrica que
se encuentra localizada entre la caspide y la envoltura lipídica.

El genoma de el virus Herpes que se ha mencionado anteriormente es un ADN de doble

hebra lineal y la variación que hay entre los tamaños del genoma de la familia
Herpesviridae es debido a un arreglo que es característico de sus secuencias de ADN.

El genoma de los virus Herpes tienen secuencias internas que se repiten, estas serian: una
región única larga (UL) y una región única corta (US); al tener estas repeticiones se
permiten los cambios genómicos entre distintos virus herpes. El genoma de estos virus es
grande y al menos se codifica para 100 proteinas distintas, de la cual muchas son
estructurales y forman el tegumento.
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 El tegumento ayuda mucho al momento de realizarse el ensamblaje viral de los virus
herpes, ya que puede asegurar la unión entre la envoltura y la capside. Las proteínas UL36,
UL37 y UL48 son esenciales para este ensamblaje. La proteína UL37 es conservada en
todos los integrantes de la familia Herpesviridae.

Durante el ensamblaje, localizar y la adicion de la proteína UL37 a la nucleocapside

depende de la unión con otra proteína contenida en el tegumento, esta es la UL36.

Este virus (VHF-1) se replica en el epitelio superior respiratorio, ocular y también en

neuronas. Despues de la infección comienza la excreción viral por secreciones nasales,
orales y oculares. A pesar de que el virus puede estar durante días, ya que su periodo de
incubación es de más de 14 días y la enfermedad dura entre 1 a 2 semanas, es destruido de
forma casi completa por los desinfectantes. Luego de tener la infección, continua una
proliferación lítica en el epitelio respiratorio y ocular, el virus logra avanzar por los nervios
sensoriales, asi hasta llegar a las neuronas y en el ganglio trigemino se concentra.

El diagnostico de la infección con VHF-1, en su mayoría, se realiza en base a los signos

clínicos. Esta puede presentarse al observar úlceras dendríticas, estas son lesiones
patognomónicas del animal afectado, para poder confirmar esta sospecha se requiere
detección del virus en el laboratorio, existe mas de una técnica para confirmar; aislamiento
viral, técnica de anticuerpos fluorescentes, técnicas serológicas y PCR.

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA (3 – 4 páginas)

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Complejo respiratorio felino. Esta enfermedad producida por el herpes virus felino es una
patología que comúnmente afecta a los gatos domésticos y los agentes patógenos
principales asociados a la enfermedad son dos virus que son altamente contagiosos: el virus
herpes felino (VHF-1) y el calcivirus. El gato es un principal hospedador del VHF-1, se han
detectado anticuerpos en los pumas y fue aislado de los guepardos y leones, hasta ahora no
hay evidencia de infección en humanos. Esta enfermedad patológica se presenta
principalmente en gatos menores a seis meses, ya que en este momento el sistema inmune
del animal se presenta poco desarrollado. Se presenta su transmisión en animales que viven
en criaderos, centros de rescate, etc.; estos ambientes al tener una mezcla de gatos
precedentes con el virus y animales mas jóvenes mas susceptibles al virus. Los gatos son
mantenidos en alta proximidad permitiendo asi la diseminación viral entre los animales y
evitando muchos de los factores de estrés que son conocidos como causantes de la
reactivación del virus.

La forma de transmisión del virus es por contacto directo, siendo las dos vías más comunes
a través de gatos con la infección aguda que liberan el virus al ambiente y a través de gatos
con infección latente que experimentan la reactivación del virus y con eso la diseminación
al exterior, las hembras que tengan la infección latente pueden transmitir el virus a sus
camadas, ya que el proceso de lactancia y parto inducen a periodos de estrés lo que puede
llevar a la reactivación del virus. Por esta misma razón los gatos a temprana edad pueden
adquirir el virus. El VHF-1 tiene afinidad con neuronas sensitivas y tejidos epiteliales, la
infección latente se localiza en el ganglio trigémino, desde aquí pueden ocurrir infecciones
oculares por la reactivación del virus, el cual viaja a través de los axones de la rama
oftálmica del nervio trigémino hacia el ojo. Hay evidencia de que el virus en muchas
especies, incluyendo el gato, puede estar presente de forma latente o de forma inactiva en la
córnea (Ramsey, D. 2001). Muchos gatos que están clínicamente normales han presentado
ADN de VHF-1 en la córnea y conjuntiva.

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Signos clínicos. Estos pueden ser nasales, oculares y fiebre. Los síntomas agudos ocurren
principalmente en gatos pequeños que son expuestos por primera vez al virus y desarrollan
fiebre, letargia, estornudos, tos, descarga nasal y conjuntivitis. La severidad de los signos
varía según la cepa viral, el tipo de exposición, la edad del gato o animal, el estado inmune
y la susceptibilidad (Stiles, 2003). Los signos oculares traen consigo la conjuntivitis,
úlceras corneales, queratitis estromal, secuestro corneal y queratoconjuntivitis sicca (kang
et al,.2008). El VHF-1 tiende a tener su localización en la vía respiratoria alta sin
sobrepasar el área laringe-traquea. Una vez ocurrida la infección primaria, el virus replica
en las membranas mucosas de la nariz, laringe, tráquea y tracto genital pero también en las
conjuntivas (Vogtlin et al,. 2002). Al transcurrir de 24 a 48 horas comienzan los signos
clínicos mencionados anteriormente. La infección del herpes felino (VHF-1) en gatos
mayores a seis meses de edad es más probable que sea una infección leve o subclínica. Las
hembras preñadas teniendo el virus pueden abortar, aunque no existe evidencia de que el
virus traspase la placenta. (Mclachlan et al,. 2011).

Diagnóstico. La confirmación de la infección con VHF-1 requiere detección del virus en el

laboratorio y la microscopia electrónica es el método más idóneo para la detección o
identificación del virus. Sin embargo el método más usado para la detección de este virus es
la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

La detección de ácidos nucleicos por medio de la PCR convencional son rutina en los
laboratorios para la detección de este virus herpes, de esta forma son utilizadas las muestras
del animal, en este caso, el gato. (Thiry et al., 2009)

Ya que las cantidades de los ácidos nucleicos detectados con la PCR son mínimos, los
resultados positivos pueden estar no asociados con la enfermedad, por esto tienen que ser
interpretados de forma correcta y con precaución. La técnica PCR además detecta los virus
en animales con latencia viral a pesar de no presentar los signos clínicos dichos
anteriormente.

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La idea del PCR es sintetizar de forma repetida un fragmento de ADN utilizando una
polimerasa termoestable: Taq polimerasa. Al realizar una PCR se simula lo que sucede en
una celula al sintetizar su ADN y en el tubo de ensayo es donde se mezclan todos los
reactivos: la enzima, el ADN (aquí se encuentra el fragmento que se quiere sintetizar), los
desoxinucleotidos y los partidores necesarios para iniciar la reacción. El tubo con la mezcla
se lleva a un termociclador, que lo calienta y enfría a tres temperaturas distintas en ciclos
programados, la primera es a 95°C (denaturacion del ADN), luego a un intervalo entre 40°
y 60° C (alineamiento de partidores) y finalmente a 72°C (extensión o síntesis de la cadena
de ADN). Este proceso se repite entre 20 a 40 veces y genera millones de copias del
fragmento deseado.(Mullis et al., 1987).

Una limitación de la PCR o de cualquier técnica de amplificación de acidos nucleicos

puede ser la muestra objetivo donde se encuentren los virus. El material de la muestra
ouede inhibir las enzimas del ensayo. Deben incluirse muestras, controles en estos tipos de
casos para descubrir si hay problemas en el proceso de amplificación. Para esto deben
usarse partidores específicos que se acoplen a la secuencia del virus de la muestra, así de
esta forma se podrá generar la amplificación del ADN y por lo tanto, podrá visualizarse.
(Mclachlan et al,. 2011)

Antecedentes diagnósticos. Fuentes (2010) implemento un protocolo para la detección

molecular del gen de la proteína UL37 de VHC-1 mediante la PCR convencional (Fuentes,
2010). En este estudio se procedió a establecer un método diagnóstico para ambos de los
virus herpes mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando los mismos partidores
y protocolos usados por Fuentes, basado en porcentaje de identidad nucleotídica.

OBJETIVO GENERAL

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Implementar la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para obtener un
diagnóstico molecular del virus herpes felino (VHF-1).

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

1. Identificar el producto del PCR mediante porcentaje de identidad nucleotídica

respecto a los datos oficiales del Genbank®

2. Implementar un ensayo de PCR para el diagnóstico molecular del VHF-1.

3. MATERIALES Y MÉTODOS (3 – 4 páginas)

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El proceso práctico es realizado en los laboratorios de Virología y Microbiología Animal
pertenecientes al Departamento de Medicina Preventiva Animal de la Facultad de Ciencias
Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile.

BIBLIOGRAFÍA (1-2 páginas)

RAMSEY, D. 2001. Ocular manifestations of feline herpesvirus. Journal of Feline

Medicine and Surgery. 3:9-16

PLANIFICACIÓN (1 páginas)

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Inserte la planificación temporal de su proyecto, a la forma de un cronograma, o una carta
Gantt, aquí.