PRACTICA 1 CUANTIFICACIÓN DE BIOMASA Y CONSUMO DE SUSTRATO

Objetivo • Evaluar el crecimiento celular de un microorganismo y determinar el consumo de

sustrato. Procedimiento de la curva de crecimiento microbiana

1. Consultar dos técnicas de recuento de microorganismos, explicar en qué consisten, enunciar las
principales ventajes y desventajas de cada una, y construir el diagrama de flujo.

La cuantificación de microorganismos es un elemento crítico en los estudios de ecología microbiana

y microbiología clínica. No solo es importante conocer al responsable de un efecto benéfico o
identificar al microorganismo potencial de causar alguna infección severa, sino también es
importante saber el número de microorganismos implicados, para establecer si éstos serán capaces
de desarrollar una función benéfica o perjudicial.

TÉCNICA DE RECUENTO DE MICRORGANISMOS GSPM : GOTEO POR SELLADO EN PLACA MASIVO

DEFINICION:

Mediante el método GSPM se cuantificaron bacterias presentes en diversos tipos

de muestra en forma de suspensión. Mediante el método GSPM se cuantificaron
bacterias presentes en diversos tipos de muestra en forma de suspensión.
Mediante el método GSPM se cuantificaron bacterias presentes en diversos
tipos de muestra en forma de suspensión.

La metodología de recuento en placa por plaqueo es una metodología

ampliamente utilizada (Hoben y Somasegaran, 1982), que consiste en realizar
diluciones seriadas 1:10 y extender 100µl de cada dilución en una placa; las
placas se incuban hasta que las colonias son apreciables para su recuento. Esta
metodología tiene la ventaja de tener un buen límite de detección, sin embargo
consume mucho tiempo durante los plaqueos; en el caso de realizar el recuento
de bacterias a partir de muestras cuya población se desconoce se requiere
realizar el extendido de 7 diluciones y la muestra original (para cada conteo) lo
que significa consumir 8 placas de cultivo y alrededor de 25 minutos para los
plaqueos, sin tomar en consideración repeticiones.
GSPM es una metodología para cuantificar bacterias cultivables de forma
masiva, tanto para muestras ambientales como de fluidos humanos, no requiere
equipo costoso y es una metodología rápida, reproducible y económica. El
método GSPM es 1.4 veces más rápido para el procesamiento de muestras que
el método de cuantificación de goteo en placa 6X6, 6 veces más rápido que el
método de goteo en placa y más de 10 veces superior en comparación con el
método de plaqueo. Además, GSPM presenta un ahorro de placas con medio de
cultivo de 24 veces en comparación al plaqueo y 6 veces en comparación al
goteo en placa. El ahorro de material hace que GSPM contribuya con una menor
contaminación para el planeta en referencia a las otras metodologías.

VENTAJAS

- la ventaja de tener un buen límite de detección, sin embargo, consume

mucho tiempo durante los plaqueos; en el caso de realizar el recuento de
bacterias a partir de muestras cuya población se desconoce se requiere
realizar el extendido de 7 diluciones y la muestra original (para cada conteo)
lo que significa consumir 8 placas de cultivo y alrededor de 25 minutos para
los plaqueos, sin tomar en consideración repeticiones. 
- GSPM presenta un ahorro de placas con medio de cultivo de 24 veces en comparación al
plaqueo y 6 veces en comparación al goteo en placa.
- . El ahorro de material hace que GSPM contribuya con una menor contaminación para el
planeta en referencia a las otras metodologías. La rapidez de la metodología GSPM
puede incrementarse dependiendo del tipo y número de replicadores usados, así como
del tipo de pipeta multicanal utilizada
El método permite el ahorro de recursos como puntas que son requeridas por la pipeta

multicanal en el método de goteo en placa 6X6 y otros métodos.

DESVENTAJAS
- hay que tener un buen manejo de la pipeta multicanal a la hora de dispensar en el medio

de cultivo pues de otra forma el goteo podría mezclarse con diluciones vecinas. La
 dispensación de cada una de las diluciones implica la toma de puntas con la pipeta
multicanal, la absorción de muestra y su colocación en el medio de cultivo.
DIAGRAMA DE FLUJO. Método Petrifilm 3MTM para el Recuento Rápido de Mohos y Levaduras
DILUYENTE (SOLUCIÓN
BUFFER) 225 mL de buffer
fosfato
Disolver 4.25g de
(KH2PO4) en 100 mL de
Agua destilada
Agregar 1mL de esta
solución en 1L de agua
destilada y homogenizar.
Servir en matraces de
vidrio 225mL.
Autoclavar a 121°C por 15
minutos a pH hasta 7.2 +
0.1 a 25°C.
Levantar la lámina semitransparente
PREPARACION DE LA superior.
MUESTRA
Añadir 1 mL con el Pipetor de la
muestra en el centro de la película
cuadriculada inferior.
INOCULACION Bajar la lámina semitransparente
superior.
PLACA PETRIFILM
Colocar el aplicador refer. 6425 3M™
Petrifilm™ plano en el centro de la
placa y presionar en el centro.
Levantar el aplicador y dejar en
reposo durante 1 minuto para que
solidifique el gel.
Incubar las placas a 25 a 28°C
INCUBACION durante 48 ± 2 horas* en posición
horizontal con la cara arriba, apiladas
pero no más de 40 placas
Si aparecen colonias débiles, dejar
un período adicional de 12 horas de
tiempo de incubación.
INTERPRETACION
Leer los resultados a las 48 horas.
Para mejorar la interpretación de
estos mohos dejar un periodo
adicional de 12 horas de tiempo de
incubación
Almacenar los paquetes cerrados a
una temperatura menor a 8 0 .las
placas deben usarse antes de su
fecha de caducidad
Para cerrar un paquete abierto,
ALMACENAMIENTO doble el sobre y séllelo con cinta
adhesiva para evitar el ingreso de
humedad y, por lo tanto, la
alteración de las placas.
 Utilizar las Placas Petrifilm máximo
un mes después de abierto el
paquete.

Referencias bibliográficas

Andrés Corral-Lugo1  , Yolanda Elizabeth Morales-García1  , Laura Abisaí Pazos-Rojas1

Cuantificación de bacterias cultivables mediante el método de "Goteo en Placa
por Sellado (o estampado) Masivo " Revista Colombiana de
Biotecnología Print version ISSN 0123-3475 Rev. colomb.
biotecnol vol.14 no.2 Bogotá jul./Dec. 2012

TÉCNICA DE RECUENTO DE MICRORGANISMOS RECUENTO EN PLACA PETRIM

DEFINICION:
,

VENTAJAS

DESVENTAJAS
•Poca cantidad de bacterias en la muestra
. •Diluciones mal hechas.
•Medio muy caliente.
•Mala homogenización.
•Error al contar.
•Error en los cálculos.

DIAGRAMA DE FLUJO.
5. Evaluar el efecto de las condiciones de cultivo: El estudiante debe modificar las condiciones
iniciales del cultivo según la tabla y dejar las condiciones de Init. Level y Phys. State en 3,2 log10
ufc /ml y 0.04, respectivamente.

Hacer un análisis crítico, basado en referentes bibliográficos, y responder las siguientes preguntas:
• Con base a los resultados indique que efecto tiene la variación de pH sobre la velocidad máxima
de crecimiento y por qué

• Con base a los resultados indique que efecto tiene la variación de la actividad acuosa sobre el
tiempo de duplicación y por qué

• Con base a los resultados indique que efecto tiene la variación de la temperatura sobre el
tiempo de latencia y por qué
 • Indique los beneficios de conocer la curva de crecimiento de un microorganismo, antes de
comenzar a diseñar un bioproceso con este.

• ¿Qué indica que la velocidad máxima de crecimiento sea mayor?

• ¿Bajo qué circunstancias se espera que se alcance la fase estacionaria más rápido?
Procedimiento para curva c