Enzimas y Cinetica Enzimatica Texto

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íNDICE
Prologo 7
Capitulo 1 Las enzimas 9

Consideraciones generales 9
Perspectiva histórica 9
Estructura de las enzimas. Mecanismo de la acción
enzimática 10
Cofactores y coenzimas 11
Clasificación y nomenclatura de las enzimas 12
Función biológica de las enzimas 13
Capitulo 2 Fuentes de enzimas. Aplicaciones industriales,

médicas y farmacéuticas de las enzimas 15
Fuentes de enzimas 15
Enzimas de origen animal 15
Enzimas de origen vegetal 15
Enzimas de origen microbiano 16
Nuevas fuentes de enzimas 17
Aplicaciones industriales de las enzimas 19
Aplicaciones médicas y farmacéuticas de las enzimas 23
Capitulo 3 Extracción y purificación de enzimas 27

Extracción de las enzimas 27
Purificación de las enzimas 29
Capitulo 4 Propiedades cinéticas de las enzimas 35

Velocidad de reacción 35
Determinación de las constantes cinéticas de las
reacciones enzimáticas 39
Significación de las constantes cinéticas 44
Capitulo S Factores que afectan a la velocidad de las reacciones

enzimáticas 46
Efecto de la temperatura 46
Efecto de pH 48
Inhibición enzimática 50
Determinación de las constantes de inhibición 58
Capitulo 6 Aspectos de diseño

de reactores enzimáticos 60
Procesos discontinuos 60
Procesos continuos 63
Elección de tipo de reactor 68
Capitulo 7 Inmovilización de las enzimas 73

Aspectos generales 73
Métodos de inmovilización de enzimas 75
Efectos de la inmovilización 81
Elección del método de inmovilización 86
Capitulo S Biosensores 88
Aspectos generales 88
Sensores enzimáticos 91
Aplicaciones de los biosensores 94
Apéndice 1 Problemas 99
Apéndice 2 Trabajos prácticos 104
Bibliografía 112
Las enzimas 9
Capitulo 1
Las enzimas
1. Consideraciones generales
Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteica. Las reacciones cata-

lizadas por enzimas se llaman reacciones enzimáticas. Las enzimas actúan
sobre algunas moléculas, denominadas sustratos, las cuales se convierten
en moléculas diferentes denominadas productos. Las enzimas funcionan
disminuyendo la energía de activación de la reacción. No alteran el balance
energético de las reacciones, no pueden modificar el equilibrio de la reac-
ción y no pueden actuar sobre las reacciones termodinámicamente imposi-
bles. Las enzimas difieren de los otros catalizadores por ser mas especificas.
Catalizan alrededor de 4,000 reacciones bioquímicas distintas.
La actividad de las enzimas puede ser afectada por otras moléculas. Los
inhibidores son moléculas que disminuyen o impiden la actividad enzi-
mática. Los activadores son moléculas que incrementan la actividad de
las enzimas. Igualmente, la actividad enzimática es afectada por factores
físlco-qufmicos: temperatura, pH, concentración del sustrato, concentra-
ción enzimática.
2. Perspectiva histórica
Antes del 1800: se utilizaron algunos procesos biológicos catalizados por

enzimas (la digestión de la carne por las secreciones del estomago; la con-
versión del almidón en azúcar por los extractos de plantas y de la saliva). Sin
embargo, no había sido identificado el mecanismo de la acción enzimática.
Entre 1800 y 1900: periodo de descubrimientos. Louis Pasteur llego a la con-

clusión, estudiando la fermentación del azúcar en el alcohol con levaduras,
10 Enzimas y cinetica enzimatica Las enzimas 11
que el proceso era catalizado por una fuerza vital contenida en las células activo cambia su conformación estructural por la interacción con el sustrato
de la levadura. Las sustancias que catalizan el proceso de fermentación se (Fig. 1).
llamaron fermentos. Por el contrario, otros científicos (Liebig) defendieron
el carácter puramente químico de la reacción de fermentación.En 1878
Wilhelm Kühne introdujo el término enzima que viene del griego y significa
"en levadura': En 1897 Eduard Buchner demostró que las enzimas pueden
funcionar fuera de una célula viva. Recibió el Premio Nobel de Química "por
La enzima cambia su forma
cuando se une el sustrato e:»
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sus investigaciones bioquímicas y el haber descubierto la fermentación
libre de células': El próximo paso era determinar la naturaleza bioquímica
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de las enzimas.
Después de 1900: periodo de aplicación industrial de las enzimas. El sustrato accede Complejo Complejo Los productos salen
al sitio activo del enzima enzima/sustrato enzima/productos del sitio activo
Después de1970: periodo de modificaciones biológicas específicas, conoci-
do como periodo de ingeniería genética. Fig.l. Mecanismo de la acción enzimática (modelo del encaje inducido)
Las enzimas pueden actuar de diversas formas, siempre dando lugar a

3. Estructura de las enzimas. una disminución de la energía de activación de la reacción. La energía de
Mecanismo de la acción enzimática activación se puede reducir de manera diferente:
mediante la creación de un ambiente en el cual el estado de tran-

Las enzimas son generalmente proteínas globulares. Pueden presentar
sición es estabilizado debido a lo que la enzima provoca el cambio
tamaños muy variables: desde 62 hasta 2,500 aminoácidos. Las actividades
de la conformación del sustrato unido;
de las enzimas vienen determinadas por su estructura tridimensional, la
cual viene por su vez determinada por la secuencia de aminoácidos. Sin mediante la creación de un ambiente con una distribución de carga
embargo, solo una pequeña parte de la enzima (3 a 4 aminoácidos) esta in- optima;
volucrada en la catálisis. La región que contiene estos residuos encargados
proporcionando una ruta alternativa;
de catalizar la reacción es denominada centro activo.
mediante la acción de orientar correctamente los sustratos, favore-
Las enzimas presentan una alta especificidad tanto del tipo de reacción que
ciendo así la reacción.
catalizan, como del sustrato involucrado en la reacción. La forma, la carga
y las características hidrofilicas/hidrofóbicas de las enzimas y los sustratos
son los responsables de esta especificidad. Emil Fisher en 1894 dedujo que 4. Cofactores y coenzimas
ambas moléculas, enzima y sustrato, poseen complementariedad geomé-
trica. El modelo de Fisher ha sido denominado modelo "llave-cerradura: Algunas enzimas requieren la unión de moléculas no proteicas, denomi-
considerando la enzima como una especie de cerradura y el sustrato como nadas cofactores para poder ejercer su actividad. Los cofactores pueden
una llave ajustada de forma perfecta a la cerradura. Este modelo explica la ser compuestos inorgánicos (iones metálicos, complejos ferrosulfurosos,
especificidad de las enzimas. etc.) o compuestos orgánicos (la flavina, el grupo hemo). Los cofactores
orgánicos pueden ser a su vez grupos prostéticos que se unen fuertemente
En 1958 Daniel Koshland sugiere una modificación al modelo de la lIave-
a la enzima, o coenzimas que son liberados del sitio activo de la enzima
cerradura. Según su modelo, llamado modelo del encaje inducido, el sitio
durante la reacción. .'
12 Enzimas y cinetica enzimatica
Las enzimas 13
Un ejemplo de una enzima que contiene un cofactor es la anhidrasa carbó-
nica, en el cual el zinc (cofactor) se mantiene unido al sitio activo. 6. Función biológica de las enzimas
Las enzimas que requieren un cofactor pero no lo tienen unido son deno-
minadas apoenzimas o apoproteínas. Una apoenzima junto con cofactor es
denominada holoenzima (enzima activa).
Las coenzimas incluyen compuestos como el nicotinamida adenina dinu-

cleótido, nicotinamida adenina dlnudeótido fosfato y el adenosin trifosfato.
Son moléculas orgánicas que transportan grupos químicos de una enzima
a otra. Algunos son vitaminas (riboflavina, tiamina, acido fólico).
5. Clasificación y nomenclatura de las enzimas
El nombre de la enzima es derivado del nombre del sustrato o de la reacción

catalizada, con la palabra terminada en "asa" Por ejemplo, lactasa proviene
de su sustrato lactosa; alcohol deshidrogenasa proviene de la reacción que
consiste en deshidrogenar el alcohol.
La Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular ha desarrollado

una nomenclatura para identificar a las enzimas basadas en los denomina-
dos números EC (Enzyme Comission numbers). De este modo, cada enzima
queda registrada por una secuencia de 4 números precedidos por las letras
EC (Tabla 1). El primer número clasifica a la enzima en base a su mecanismo
de acción. Posteriormente son subdivididas en función del tipo de substra-
to y el requerimiento por coenzima. Finalmente se les asigna un número
que hace referencia a la reacción específica que la enzima cata liza.
Tabla 1. Principales clases de enzimas
I:r1 ~:,J.....•..•....•
I ...•. ...J •• -+............. '-1:••.•.....•.•..,.. •..•••
I ..... ~ •...:Á_
I deshidrogenasas, peroxidasas
I:r, I "~~rf~.~r~r I "~~rfM~~_'~..I~ grupos activos I transaminasas, quinasas
I:r"l I hirl •.
nl":tor'''!Ior' I hi,.a •.",lirir I glucosidasas,lipasas, esterasas
~rA IlbC,'~C' I 01;••.•;•.•.,.,.;" •.•..lo H O CO y NH I descarboxilasas, liasas
2' 2 3
I:r<: I ;.~ ••.•~.~.~. I obtención de isómeros

~
EC6 Iligasas I degradación o síntesis de enlaces I sintetasas, carboxilasas
14 Enzimas y cinetica enzimatica Fuentes de enzimas. Aplicaciones industriales, médicas.: 15
Las enzimas determinan los pasos que siguen estas rutas metabólicas.
Sin las enzimas, el metabolismo no se produciría a través de los mismos
pasos, ni sería lo suficientemente rápido para atender las necesidades de
la célula. De hecho, una ruta metabólica como la glucolisis no podría existir Capitulo 2
sin enzimas. La glucosa, por ejemplo, puede reaccionar directamente con el
ATP de forma que quede fosforilada en uno o más carbonos. En ausencia de
enzimas, esta reacción se produciría tan lentamente que sería insignifican-
te. Sin embargo, si se añade la enzima hexoquinasa que fosforila el carbono Fuentes de enzimas. Aplicaciones industriales,
6 de la glucosa y se mide la concentración de la mezcla en un breve espacio médicas y farmacéuticas de las enzimas
de tiempo se podrá encontrar únicamente glucosa-6-fosfato a niveles
significativos. Por tanto, las redes de rutas metabólicas dentro de la célula
dependen del conjunto de enzimas funcionales que presenten.
1. Fuentes de enzimas
Las enzimas pueden ser de origen animal, vegetal, y microbiano (90% de las
enzimas para el procesado industrial).
2. Enzimas de origen animal

Enzimas de tipo animal son las lipasas, las amilasas y las proteasas pancreá-
ticas (CE 3.1.1.1 a-amilasa, CE 3.4.1.14 fosfolipasa, CE 3.4.21.1 quimotripsi-
na), las esterasas prégastricas (CE 3.1.1.2 aril éster hidrolasas), la pepsina
(CE 3.4.21.1) de mucosa intestinal, la quimosina (CE 3.4.23.4), así como la
catalasa (CE 1.11.1.6) de hígado de bovinos, la lactoperoxidasa (CE 1.11.1.1)
de la leche de vaca, la lisozima (CE 3.2.1.17) del albumen del huevo de
gallina y la urokinasa, entre otras.
El uso de enzimas de origen animal es reducido por las siguientes razones

principales: los fabricantes de enzimas deben aceptar precios de las mate-
rias primas fijadas por otros sectores; existen variaciones estaciona les; se
deben tomar en cuenta varios aspectos sanitarios (vehiculacion de virus;
restricciones a la entrada de productos de origen animal en determinados
países) y aspectos humanitarios (necesidad del sacrificio de animales).
3. Enzimas de origen vegetal
Entre las enzimas de tipo vegetal se encuentran las siguientes:
papaina (CE 3.4.22.2) de papaya (Carica papaya);

16 Enzimas y cinetica enzimatica Fuentes de enzimas. Aplicaciones industriales, médicas ... 17
ficina (CE 3.4.22.3) de higuera (Ficus glabrata, Ficus carica);
bromelaína (CE 3.4.22.4) de piña (Ananas corosus);
proteasas de cardo (Cynara cardunculus);
alipoxigenasa (EC 1.13.11.12) de soja;
peroxidasa (CE 1.11.1.7) de rábano;
enzimas de cítricos con aplicaciones específicas.
Se observa un descenso en la utilización de enzimas de origen vegetal,

debido al incremento del costo de producción, causado por la falta de in-
fraestructura, inestabilidad económica y política en las regiones de produc-
Fig. 3. La levadura Saccharomyces lactis
ción tropicales y subtropicales y debido a las variaciones estacionales que
inducen la necesidad de almacenamiento de materias primas y inactividad
de los equipos de extracción de las enzimas.
4. Enzimas de origen microbiano
Las enzimas del tipo microbiano provienen de bacterias, levaduras y hon-

gos. Lo más importantes fuentes de enzimas de origen microbiano incluyen:
las bacterias Thermoanaerobium spp., Bacillus subtilis, Bacillus Iiche-

niformis, Pseudomonas aeruginosa, Clostrtdtum spp, Micrococcus
Iysodeikticus, Lactobacillus fermentum (Fig. 2);
Aspergillus niger Aspergillus orizae
las levaduras Saccharomyces lactis, Saccharomices spp. (Fig. 3); Fig. 4. Los hongos Aspergillus niger y Aspergillus orizae
los hongos Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Penicillium spp. (Fig. 4).
La ventaja de la obtención de enzimas microbianas es que los microorga-
• nismos se reproducen a ritmo acelerado, son fáciles de manipular genéti-
camente, crecen en un amplio rango de condiciones ambientales y tienen
una gran variedad de vías metabólicas, haciendo que las enzimas obtenidas
sean más económicas.
5. Nuevas fuentes de enzimas

Bacillus subtilis Pseudomonas aeruginosa Lactobacillus fermentum
Las nuevas fuentes de enzimas envuelven los organismos psicrófilicos,
Rg. 2. Las bacterias Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa y Lactobacillus fermentum termófilos y extremófilos químicos.
18 Enzimas v cinetica enzimatica Fuentes de enzimas. Aplicaciones industriales, médicas ... 19
Los organismos psicrófilicos (Fig. 5) son capaces de vivir a temperatura Los organismos extremófilos químicos son:
por debajo de los sO( (Ártico y Antártida). Las enzimas de los organismo
psicrófilicos presentan alta actividad molecular a temperatura óptima rela acidófilos: se desarrollan en ambientes de alta acidez (Fig. 7);
tivamente baja. alcalófilos: se desarrollan en lagos alcalinos;
halofilos: se desarrollan en lagos salados y piscinas (Fig. 8).
Fig. 5. Los organismos psicrófilicos han especializado sus membranas celulares Fig. 7. RioTinto: acción de las bacterias acidófilas Thiobacillus ferrooxidans
que no se endurecen en temperaturas heladas
Las enzimas producidas por organismos termófilos que se encuentran e

fumarolas y géiseres (Fig. 6) son resistentes a alta temperatura.
Fig. 8. Halobacterium. Se encuentra en el Mar Muerto
6. Aplicaciones industriales de las enzimas

Fig. 6. Thermophilus aquaticus encontrado en un manantial del Parque Nacional
La cantidad de enzimas producidas en el mundo es de unos 75,000 a 80,000
de Yellowstone
toneladas por año. Los productores mas importantes son: Dinamarca (50%
20 Enzimas v cinetica enzimatica Fuentes de enzimas. Aplicaciones industriales, médicas.: 21
de la producción), Países Bajos (20% de la producción), Estados Unido económicas se utilizan un número limitado de enzimas de origen vegetal
(12% de la producción), Japón, Alemania, Francia, Suiza e Inglaterra (el rest y animal. Entre las enzimas de origen vegetal se utilizan más comúnmente
de la producción). las enzimas proteolíticas: papaína, bromelaína y ficina y las enzimas ami-
lolíticas obtenidas a partir de cereales. Las enzimas de origen animal más
Alrededor del 80% de las enzimas industriales son hidrolasas y se utiliza
utilizadas son: tripsina, quimotripsina, pepsina, renina y lipasa. Las enzimas
principalmente para la conversión de sustratos naturales. De estos, una
microbianas son numerosas. Se producen por no más de 11 especies de
60% son enzimas proteolíticas, utilizadas para la preparación de detergen
hongos, 8 especies de bacterias y 4 especies de levaduras. A continuación
te s, en la industria láctea y en peletería. Las glicosidasas se utilizan prin
se describen algunas de las aplicaciones de las enzimas.
cipalmente en la cocción, en la fabricación de cerveza y en las industria
del textil y del almidón. Constituyen aproximadamente el 30% del import
total de las enzimas industriales. Las otras enzimas como las lipasas y las en Procesado de alimentos
zimas para usos específicos se utilizan principalmente para fines analítico
y farmacéuticos. Las amilasas de hongos y plantas se utilizan en la producción de azucares
desde el almidón, como por ejemplo en la producción de jarabe de maíz,
La Fig. 9 muestra la tasa de producción industrial de enzimas.
en la cocción al horno, para catalizar la rotura del almidón de la harina en
azúcar y en la fermentación del azúcar llevada a cabo por levaduras para
producir CO2 que hace "subir" la masa.
G/icosidasas
t
Proteinasas pectinasa, Las proteasas se usan por los fabricantes de galletas para reducir la cantidad
3% de proteínas en la harina.
alcallnas, 6%
alcalinas para~ • a-amllasa, ~
d"'~:%"", ~ ,"e"t' as,12% 5%
celulasay ~
~
~
~-amilasa,
13% limentos para bebés
lactasa, 1% ~
acidas, 3% ~ qulmoslna, La tripsina se aplica a pre-digerir el alimento dirigido a bebés.
isomerasa,
trlpslna, 3% 10%
6%
Elaboración de cerveza
proteinasas,
59%
rs:
Iipasas,3%
9IiCOSidasas,
Las enzimas de la cebada liberadas durante la fase de molido degradan
I almidón y las proteínas para generar azucares sencillos, aminoácidos y
péptidos que son usados por las levaduras en el proceso de fermentación.
ctualmente se utilizan enzimas de cebada producidas a nivel industrial
para sustituir las enzimas naturales de cebada.
28%
La amilasa, la glucanasa y las proteasas digieren los polisacáridos y las
proteínas en la malta.
Fig. 9. Tasa de producción ' industrial de enzimas
Las -glucanasas y las arabinoxilanasas mejoran la filtración del mosto y la
La variedad de las enzimas utilizadas con fines industriales proviene pri_ferveza.
mordialmente de las aisladas a partir de fuentes microbianas. Por razones
Fuentes de enzimas. Aplicaciones industriales, médicas... 23
tintas. Las lipasas reducen la oscuridad. Las ligninasas eliminan la lignina
Las amiloglucosidasas Y las pululanasas se utilizan en la producción de
para ablandar el papel.
cerveza baja en calorias y para el ajuste de la capacidad de fermentación.
Las proteasas eliminan la turbidez producida durante el almacenamiento

Producción de detergentes
de la cerveza.
La acetolactatodecarboxilasa incrementa la eficiencia de la fermentación Las proteasas se utilizan en la eliminación de tintes proteicos.
mediante la reducción de la formación de diacetilo. Las amilasas se utilizan para eliminar residuos resistentes de almidón.
Las lipasas se utilizan para facilitar la eliminación de tintes grasos y oleosos.

Industria láctea
Las celulasas se utilizan en los suavizantes biológicos.
La renina se utiliza para hidrolizar las proteínas en la producción de queso.
Las lipasas se introducen durante el proceso de producción del queso Roc- 7. Aplicaciones médicas y farmacéuticas de las enzimas
quefort para favorecer la maduración.
Puesto que las aplicaciones médicas y farmacéuticas de las enzimas abar-
La lactasa causa la rotura de la lactosa en glucosa y galactosa.
can un amplio espectro de materias, es conveniente dividirlas en tres áreas
importantes de interés: terapia enzimática, uso analítico y productos de
Digestión de carne compuestos farmacéuticos. Cada una de estas áreas, auque cubre un gran
número de aplicaciones, presenta una serie de principios predominantes
A la papaina se debe el ablandamiento de la carne utilizada para cocinar. que son esenciales para que la utilización de las enzimas se realice con éxi-
to. A diferencia de otros usos industriales para las enzimas, las aplicaciones
médicas y farmacéuticas de las mismas requieren generalmente pequeñas
Industria del almidón
cantidades de enzimas muy purificadas. Esto contrasta con muchos pro-
Las amilasas, las amiloglucosidasas y las glucoamilasas participan en I cesos industriales en los que el medio de cultivo está relativamente bien
conversión del almidón en glucosa y diversos azucares invertidos. definido y por, consiguiente, puede utilizarse un extracto enzimático sin
purificar. Además, si el destino de una enzima o de un producto obtenido
La glucosa isomerasa cataliza la conversión de la glucosa en fructos por métodos enzimáticos es su administración a un paciente, resuelta evi-
durante la producción de jarabe de maíz partiendo de sustancias ricas e dente que el preparado debe contener las menores cantidades posibles de
almidón. material extraño para evitar probables efectos secundarios.
Industria del papel Aplicación de las enzimas en análisis clínicos
Las amilasas, las xilanasas, las celulasas y las ligninasas se utilizan en el pro Las enzimas se emplean como reactivos estándar en los laboratorios para
ceso de degradación del almidón para reducir su viscosidad. Las xilanasa el diagnóstico de enfermedades, para el control y el seguimiento de enfer-
reducen el blanqueador necesario para la decoloración. Las celulasas alisan: medades y de la respuesta del paciente hacia la terapia seguida y para la
las fibras, favorecen el drenaje de agua y promueven la eliminación d identificación y control de la concentración de drogas o sus metabolitos
en la sangre u otros fluidos corporales. Las técnicas de inmunoanálisis
24 Enzimas v cinetica enzimatica Fuentes de enzimas.Aplicacionesindustriales,médicas... 25
enzimático (ELlSA) representan un nuevo e importante avance al asocia
tualmente. Sin embargo, sí puede reproducirse una función importante del
anticuerpos específicos a enzimas como la peroxidasa o la galactosidasa hígado: la desintoxicación. A partir de células hepáticas se pueden obtener
cuya reacción genera el cromógeno por el que se mide la extensión de
varias enzimas microsomales capaces de llevar a cabo la desintoxicación de
unión del anticuerpo. De este modo se obtienen excelentes sensibilidade una gran variedad de compuestos.
sin recurrir a la radiactividad (radioinmunoanálisis). Las enzimas se emplean
rutinaria mente para diagnosticar enfermedades hepáticas, miocárdicas La administración intravenosa de L-asparraginasa para el tratamiento de
pancreáticas y prostáticas, anemias, leucemias, distrofia muscular, tumore ciertos neoplasmas que afectan a las celulasa sanguíneas ha sido utiliza-
y toxemias del embarazo. Estas aplicaciones se basan en el fenómen da con éxito, especialmente en el caso de la leucemia linfocítica aguda.
general de que las células enfermas rezuman más y pierden una parte d Despues del tratamiento con esta enzima los datos recogidos indican una
sus enzimas que eventualmente van a parar a la sangre. La elevación de I remisión completa de la enfermedad hasta en un 60% de los pacientes. Por
actividad enzimática del suero por encima de los niveles normales depend otro lado, los estudios realizados con animales señalan que esta enzima
primeramente de la extensión y gravedad del daño de las células. Así en la puede ser útil en el tratamiento de otras formas de leucemia yenfermeda-
enfermedades del hígado se miden la glutamato-piruvato transaminasa des relacionadas.
la glutamato-oxalacetato transaminasa; en el infarto de miocardio, apart
Algunas alteraciones de la circulación sanguínea se han tratado eficazmen-
de las dos ya mencionadas, se mide la lactatodeshidrogenasa y la creatin
te con enzimas. Así, la uroquinasa, una enzima aislada de orina humana, ha
fosfoquinasa. Las técnicas enzimáticas también se utilizan en la detección:
sido utilizadas con éxito para la eliminación de coágulos.
de drogas, análisis de antibióticos, detección de antígenos o anticuerpos
en la detección de enzimas y metabolitos en los fluidos intracelulares. La Un nuevo tratamiento enzimático lo constituye el aplicado al infarto de
técnicas enzimáticas son generalmente más rápidas que el inmunoanálisis miocardio (ataque cardiaco), utilizando preparaciones purificadas de
más específicas que los análisis fotométricos y más baratos que los croma hialuronidasa (hialosidasa o enzima GL). Un ensayo clínico ha demostrado
tográficos o los inmunoanálisis con sustancias radiomarcadoras. que los pacientes tratados con una unica dosis de la enzima, siempre que
sea dentro de las 6 horas siguientes al comienzo de los síntomas, presenta
índices de supervivencia significativamente mejores.
Tratamientos terapéuticos con enzimas
El fundamento de esta forma de terapia es simplemente la administració Aplicaciones farmacéuticas

de una enzima concreta a un paciente, esperando con optimismo qu
produzca una progresiva mejora en el mismo. El problema principal rela Las penicilinas semisintéticas son los principales productos farmacéu-
cionado con este método es que las respuestas defensivas del organism ticos obtenidos por tecnología enzimática. El método de fermentación
inactiven o eliminen los compuestos extraños incorporados. En consecuen tradicional permite producir la bencil-penicilina (penicilina G) como la
cia cualquier tratamiento que utilice la administración de una enzima, bie fenoximetil- penicilina (penicilina V) y en el pasado se han utilizado estos
por vía sanguínea o por cualquier otra, debe tener en cuenta este posibl dos antibióticos con gran éxito. Sin embargo, estos compuestos presentan
inconveniente. limitaciones en su eficacia contra ciertas bacterias patógenas.
Por ejemplo, para sustituir algunas funciones del riñón y el hígado se ha Los esteroides se utilizan en un gran número de preparados farmacéuticos
desarrollado órganos artificiales que contienen enzimas. Una lesión rena (por ejemplo la píldora contraceptiva y los antiinflamatorios), por lo que
crónica se trata con hemodiálisis periódica, a menos que sea posible e los procesos empleados en la producción de estas sustancias presentan
transplante del órgano. El hígado es un órgano multifuncional y serí una considerable importancia económica. Un avance mas reciente en este
imposible conseguir un sustituto artificial con la tecnología disponible ac campo lo han constituido las fermentaciones microbianas de diosgenina y
.~
26 Enzimas y cinetica enzimatica Extracción y purificación de enzimas 27

estigmasterol. El problema de este método es que la diosgenina solo se en
cuentra disponible en cantidades limitada. En sentido contrario, se conoce
otros esteroides que son fácilmente accesibles como subproductos de otro
procesos. La capacidad potencial que ofrecen las reacciones enzimática Capitulo 3
especificas permite esperar el aprovechamiento de estos precursores este
roidicos que se obtienen con facilidad.
,
Extracción y purificación
de enzimas
1. Extracción de las enzimas
Los microorganismos producen una enorme gama de enzimas, muchas

de las cuales son segregadas al exterior celular, en el medio de cultivo. Las
enzimas extracelulares se separan de las células mediante centrifugación,
siendo ésta la única etapa necesaria.
Para la obtención de enzimas intracelulares se aplican los siguientes méto-

dos principales:
Lisis celular
~álidO para células sin pared celular como las células de tejidos animales,
pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en sus-
pender las células en una solución hipotónica (más diluida que el interior
elular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la
élula, causando su hinchamiento y rotura.
¡ti Destrucción mecánica
ntre estos métodos (Fig. 10) se encuentran la homogenización (hacer pasar

as células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente);
oler en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas de vidrio, la
f¡ rensa de French (que hace pasar las células a gran velocidad a través de
n pequeño orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones de
Itrasonido).
Congelación-descongelación
La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de tempe-

ratura, congelando primero a -1960C (con nitrógeno líquido) y pasándolas
rápidamente a temperatura ambiente (Fig. 11). Tras la rotura o bien, si se
requiere, durante el proceso de rotura, se utilizan tampones de extracción
para solubilizar las proteínas.
Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta

a muchos agentes que pueden dañarla. Los cambios bruscos de pH, ácidos
y bases fuertes, temperaturas extremas y la acción de las proteasas (enzi-
mas que hidrolizan los enlaces peptídicos) son los principales factores que Fig.ll. Extracción de enzimas por congelación-descongelación
pueden desnaturalizar las proteínas. Para evitar o minimizar estos factores,
la manipulación de las proteínas durante el proceso de purificación suele
llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (40C) y 2. Purificación de las enzimas
se procura que el proceso sea lo más corto posible.
El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que Precipitación fraccionada

contiene una mezcla de enzimas, membranas y células rotas. Esta prepa-
ración se somete a centrifugación (10,000 - 15,000 rpm) para eliminar los La purificación de las enzimas con método de precipitación fraccionada
restos celulares y separar el sobrenadante del precipitado. La fase soluble recurre a diversos procedimientos, el cambio de pH quita las nucleoproteí-
constituye el extracto crudo donde se encuentra la proteína de interés. nas y el material grueso, con lo que se facilitan los pasos siguientes. Con el
empleo del calor a veces se logra la desnaturalización de material proteico
Para purificar una proteína es imprescindible tener un método para de- inactivo; por ejemplo, en la purificación de la transaminasa se añade el
tectar cuantitativa mente su presencia. Es deseable que este método sea sustrato de la enzima - ácido a-cetoglutárico - al homogenado y se calienta
específico y fácil de llevar a cabo. En este sentido es mucho más cómodo hasta 65°C, con lo que muchas enzimas se desnaturalizan y precipitan, lo
trabajar con enzimas, pues se detectarían mediante su ensayo de actividad, que no sucede con la transaminasa así protegida.
en caso de purificar proteínas no enzimáticas, se requieren métodos de
selección más específicos. En otros casos se emplean solventes orgánicos como el etanol o las sales,
como el sulfato de amonio, que es muy soluble en agua, por lo que se
puede manejar a elevadas concentraciones y en general no ataca la estruc-
tura de las enzimas. En unas condiciones específicas cada proteína podría
precipitar en un rango de concentración característico y estrecho de sulfato
deamonio.
Métodos cromatográficos
Sonicación
La cromatografia es un método en el cual los componentes de una mezcla
son separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyente.
.,....
Extracción y purificación de enzimas 31

eluidas con más rapidez que las proteínas más pequeñas que penetran por
Las separaciones cromatográficas de enzimas se basan en las diferencias de
los poros de las partículas y siguen un camino más tortuoso y más largo.
carga, tamaño o afinidad de las diferentes proteínas. Uno de los métodos
El tamaño de los poros internos depende de la naturaleza del polímero en
más habitualmente utilizados para la separación de proteínas es la croma-
cuestión y permite la entrada a proteínas por debajo de un determinado
tografía en columna, aunque también existe la cromatografía en papel yen
peso molecular.
placa.
Cromatografía de intercambio iónico (Fig.13)
La columna está rellena con un material sólido con las características quími-
cas adecuadas (fase estacionaria) y una solución tamponada se hace pasar
a través de la columna (fase móvil). El extracto crudo se aplica en la parte Mezcla de proteínas
superior de la columna y va poco a poco entrando en la columna con la
Partícula
fase móvil. Cada proteína migrará a distinta velocidad según su grado de
cargada
afinidad por la fase estacionaria.
\----
Generalmente estas cromatografías se rea-
lizan de una forma semiautomática: la fase
móvil se hace pasar a la columna a través
de una bomba peristáltica y un colector
de fracciones va recogiendo el eluyente
que sale de la columna. Este colector hace
que el tubo vaya cambiando cada cierto Proteínas de varias
cargas
número de gotas o de volumen. Después
hay que localizar en que tubo o tubos está
la proteína que se pretende purificar.
Existen distintos tipos de cromatogra-

fías. Algunos entre ellos: la filtración o
exclusión molecular, la cromatografía
de intercambio iónico, la cromatografía
Fig. 13. Cromatografía de intercambio iónico
hidrofóbica y la cromatografía de afinidad
se comentan a continuación.
Es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares ba-
Filtración en gel o cromatografía de exclu- sado en las propiedades de carga de las moléculas. En ella, la columna está
sión molecular (Fig. 12) rellena con un soporte al que van unidos grupos cargados positivamente
(intercambio aniónico) o negativamente (intercambio catiónico). Estos
La fase estacionaria esta constituida por grupos cargados normalmente están neutralizados por iones del tampón.
partículas de polímeros de diferente poro- Estos iones son reversiblemente reemplazados por las proteínas con más
sidad. La separación se basa en el tamaño Fig.12. Filtración en gel o
tendencia a unirse al soporte. Las proteínas cargadas pueden por lo tanto
de las partículas. Las proteínas más grandes cromatografía de exclusión
unirse a intercambiadores catiónicos o aniónicos dependiendo de su carga
que no pueden penetrar en los poros de molecular
neta. Las proteínas más cargadas se unirán más fuertemente al intercam-
las partículas de la matriz de filtración son
..-
biador y por lo tanto serán más difíciles de eluir. La afinidad con la que una saldrán de la columna con el tampón. En este caso también se utiliza el
proteína se une a un intercambiador iónico depende de la fuerza iónica del incremento de fuerza iónica para eluir las proteínas.
medio, debido a la competencia entre los grupos cargados de la proteína Todos estos sistemas pueden automatizarse, en base a sistemas croma-
y los iones de la fase móvil. Una vez pegadas las proteínas, para eluirlas tográficos tales como el FPLC,en el que se hace uso de bombas de alta
(retirarlas) de la columna, se suele ir subiendo la fuerza iónica de la fase presión (100-400 bares) y columnas con materiales que soportan altas
móvil (aumentando la concentración de sal, NaCl).De esta forma se eluyen presiones. Estesistema reduce notablemente los tiempos de purificación y
primero las proteínas mas débilmente retenidas y cuando la fuerza iónica utiliza fases estacionarias con mayor poder de retención, lo que incrementa
sea mayor saldrán las proteínas más cargadas y por lo tanto más retenidas. los porcentajes y rendimiento de las purificaciones.
Cromatografía hidrofóbica
Se trata de un método similar al Leyenda: Métodos electroforéticos

anterior con la única diferencia de
que la fase estacionaria es apolar
(hidrofóbica), es decir, la proteína
"•
proteína de
Interés
Ligando
Paracomprobar si la proteína de interés se ha separado del resto, es decir si
la proteína está pura, se requieren las técnicas electroforéticas. La electro-
se pega al soporte por los resto foresis es un método en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada
de aminoácidos apolares, cuanto con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica
más residuos de este tipo tenga a través de una matriz gelatinosa. La electroforesis de proteínas se lleva
en su superficie, más apolar será, a cabo generalmente en geles de poliacrilamida. Se trata de geles poro-
sos, cuya porosidad se puede regular en función de la concentración de
más se retendrá en la columna y
acrilamida. Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migración de
se eluirá más tarde. En este caso la
elusión se realiza aumentando la las proteínas es un campo eléctrico y el gel actúa como filtro molecular,
apolaridad de fase móvil. ralentizando la migración de las proteínas en función de su relación carga/
masa. A diferencia de lo que ocurría en la cromatografía de filtración, en
Cromatografía de afinidad (Fig. 14) las electroforesis las proteínas mayores son retardadas y se mueven más
lentamente a través del gel, ay que las va frenando el tamaño del poro y
Muchas proteínas tienen la capa-
las proteínas más pequeñas avanzan más rápidamente. En la Fig. 15 vemos
cidad de unirse específicamente a
un típico aparato de electroforesis. El gel se encuentra entre dos placas
ciertas moléculas, mediante unio-
(normalmente de vidrio). La colocación de un peine de electroforesis en
nes fuertes, pero no covalentes.
la parte superior antes de que la acrilamida gelifique permite la formación
En esta técnica la molécula que se
de unos pocillos, donde se colocarán posteriormente y una vez retirado
une específicamente a la proteína
se conoce con el nombre de ligan-
do y se une covalentemente a una
matriz inerte. Cuando el extracto
Se dea~ade la mezcla
protelnas a la
columna que contiene -1 .•.••
ligando especiñco
6
...
¡~.
el poUmero unld,o a uni¡~' ..'i.~.
i;
fJii~~~
~r,~. . r¡¡
' ,
oS
;;
,
el peine, las muestras, que se desplazarán por calles paralelas al aplicar el
campo eléctrico.
para la protelna de .' .. ,1~' ) 3 4 5 6 7 8 Las muestras de proteína se disuelven en una pequeña cantidad de una
con la mezcla de proteínas se Interés 1;)
1 2 3 4 5
La proteína de
Interés de eluye
solución tampón, que contiene glicerol, que hace que la muestra se sitúe
Las otras proteínas se lavan con la solución
aplica a la columna, la proteína a través de la columna del ligando en el fondo del pocillo y un colorante azul (azul de bromofenol) de pe-
buscada se unirá al ligando inmo- queño peso molecular que nos indica migración del frente. El tampón de
vilizado mientras que las demás Fig. 14. Cromatografía de afinidad
electroforesis cierra el circuito entre el cátodo (+) y el ánodo (-).Elsistema se
......-
34 Enzimas y cinetica enzimatica Propiedades cinéticas de las enzimas 35
conecta a una fuente de alimentación y las proteínas migran hacia el polo
positivo, situado en la base del gel. Después el gel se saca del recipiente
que lo contiene y se incuba en presencia del colorante adecuado (azul de
Coomassie), que tiñe por completo el gel. A continuación se destiñe con
una disolución de etanol/acético y el gel queda transparente y las bandas Capitulo 4
de proteínas quedan teñidas de color azul.
Propiedades cinéticas de las enzimas
1. Velocidad de reacción
Las enzimas, como catalizadores que son, aceleran las reacciones químicas,
pero ellas mismas no resultan irreversiblemente modificadas. El aumento
de la velocidad se atribuye al descenso de la energía de activación de la
reacción. Esto se explica por la unión del sustrato a la enzima en un "sitio
activo': formando un complejo. La energía de activación para la rotura de
este complejo es considerablemente menor que para la rotura del sustrato
solo. Partiendo de este concepto, podemos proponer el esquema de reac-
ción siguiente:
Enzima + Sustrato ~ Complejo -7 Enzima + Producto (1)
--lo.. ~
~ +
E+S ES E+P
E+S P ES ~E+P (2)

La etapa de formación del complejo se considera reversible, ya que el com-
plejo tiene un estado energético semejante a la mezcla enzima/sustrato.
La roture subsiguiente del complejo para rendir los productos se considera
exotérmica. Esta etapa puede ser prácticamente irreversible en muchos
casos. La expresión de velocidad para este tipo de reacción se obtiene
usualmente empleando una hipótesis de estado estacionario, esto es, la
concentración del complejo permanece constante. Por consecuencia, la
velocidad de la reacción.
Se puede aceptar que Km = Ks' solamente si k, > > k2• K, demuestra cómo
de afín es la unión entre el sustrato y la enzima.
k, k2
E+S~ES-)E+P (3) La ley de conservación de masa requiere que la concentración de enzima
k_1 [Ea] no cambie:
aceptando la hipótesis del estado estacionario, es:

[Ea]=[ES]+[E] (8)
d[!S] =k¡[E][S]-(k_¡ +k2)[ES]=O (4)

Por lo tanto,
formación rotura
Por lo tanto, [E] = [Eo]-[ES] (9)
k¡[E][S] = (k_¡ + k )[ES]

2 (5) Sustituyendo [El en la ecuación (6) y reordenando queda:
Para que esta hipótesis sea valida, la velocidad de reacción debe cambiar [ES] = [Eo][S] (10)
lineal mente, por lo tanto se determina usualmente tan próxima al tiempo Km +[S]
cero como sea posible, antes de que la concentración cambie apreciable-
mente (velocidad inicial).
La ecuación anterior puede ser reordenada para dar: Las dimensiones de esta expresión son unidades de concentración.
Multiplicando ambos miembros de la ecuación (10) por k, obtendremos

[E][S] _ k_¡ +k2 =K la velocidad de cambio de la concentración del producto con el tiempo
(6) en función de la velocidad máxima posible, la constante de Michaelis y la
[ES] - k¡ m,
concentración del sustrato:
donde Km es la constante de Michaelis (Michaelis-Menten).

v = dP =k [ES] = k [Ea][S]
2
(11 )
La constante de Michaelis-Menten no es igual a la constante de disociación dt 2 Km +[S]
Ks del complejo ES:
A concentraciones de sustrato elevadas ([S] > > Km)' la enzima se encuentra

K -- k., + k2 _--+--
k_¡ k2 _ K k
s+-2 (7) saturada por el sustrato y la velocidad ya no depende de [S]:
m k¡ k¡ k¡ k¡
v=k2 [Eo] (12)
Propiedades cinéticas de las enzimas 39
Por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto 50-1 /
k2 como [Eo] son constantes, podemos definir un nuevo parámetro, la velo-
cidad máxima de la reacción:
c: Vmax
k2 [ Eo] = Vmax
Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación (11), obtenemos

sión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:
(13)
la expre-
.~30~;
-o 40
Q)
1/ V
max
"'O
Vmax[S]
"'O
n:J 20
v (14) "'O
Km +[S]
'0 .)(
A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] «Km): ~ 10-1 j :/ m ,
>
v= kJEo][S] Vmax[S]
=-'=:..::........=. (15)
O, O
I
50
i i
100
I
150 200
Km Km
Concentración de sustrato
Como los términos Vmax yK m son constantes, la expresión queda reducida a:
Fig. 15. Efecto de la concentración del sustrato en la velocidad de la reacción
catalizada por enzima
v = const[ S] (16)
2. Determinación de las constantes cinéticas de las

con lo cual la reacción es un proceso cinético de primer orden.
reacciones enzimáticas
La representación gráfica de la ecuación de Michaelis-Menten (v frente a
[S]) es una hipérbola (Fig. 15). La Vmax corresponde al valor máximo al que La naturaleza hiperbólica de la curva de v frente a [S] hace difícil la deter-
tiende la curva experimental y la Km corresponde a la concentración de minación de las constantes cinéticas de la reacción enzimática (Km y Vmax)
sustrato a la cual la velocidad de la reacción es la mitad de la V : a partir de este grafico sencillo. Para determinar gráficamente los valores
max
de Km y Vmax se utilizan los siguientes métodos de linearización de la
ecuación de Michaelis-Menten:
Si v = Vmax => V = Vmax[S]
(17)
2 Km +[S] Método de Lineweaver-Burk
O Vmax = Vmax[S] => [S] = K La gráfica de Lineweaver-Burk (Fig. 16) o representación de doble recíproco
(18)
2 Km +[S] m es la forma más común de mostrar los datos cinéticos. Para ello, se toman
Propiedades cinéticas de las enzimas 41
los valores inversos a ambos lados de la ecuación de Michaelis-Menten: obtenemos:
1 Km 1 -s; +v[S] = Vmax[S]

--"'--+-- (19)
V Vmax[S] Vmax
Luego dividimos todo sobre [S]:
1 1 K 1
sea:y=ax+b, donde:y=-; x=-; a=_m_; b=--
V [S] Vmax Vmax vKm +v=V max
[S]
Obtenemos:
v (20)
v=-K -+V
m [S] max
<;«. sea: y = ax + b, donde: y

V
= V; X = [S]; a = - Km; b = Vmax
Vmnx
1
Vmax
Km\ v
1 tga=-K In
[S]
Fig. 16. Presentación de Lineweaver-Burk
Generalmente, las gráficas de Lineweaver-Burk distorsionan las medidas a

realizadas a bajas concentraciones de sustrato y esto puede dar lugar a
,,
estimaciones no muy exactas de la Vmax y de la K m.
Método de Eadie-Hofstee (Fig. 17)
De la Ecuación de Michaelis-Menten:
v/[S]
v= v max
[S]
K m+[S] Fig. 17. Presentación de Eadie-Hofstee
La presentación grafica de Hanes-Woolf es la más recomendada ya que no
Método de Hanes-Woolf (Fig. 18) esconde los errores experimentales como la de inversos.
Para obtener esta forma lineal, solo hay que multiplicar la Eq. (19) por la Método de Eisentha/ y Cornish-Bowden (Fig. 19)
concentración de sustrato [SJ:
Este método consiste en despejar de la Ec. de Eadie-Hofstee (Ec. 20) las va-
1 1 K riables como constantes y las constantes como variables. Por consecuencia:
[-=-+
V V T'
m
r~,
][S ]
max
V
Vrnax =-Km +v (22)
Por consequencia: [S]
[S] = _1_[S]+ Km
(21 ) sea: y s=ax+b, donde:y=v; x=[S]; a= [;]; b=v
V Vmax Vmax
sea: y=ax+b, donde:y=-;

[s] x=[S]; a=-; 1 b=_m
K v
V Vmax Vmax
Vmax
[S]
-v
I
I
I
I
I
IK• m
I
-K m [S] -[ S4]-[ S3]-[ S2]-[SJ [S]
Fig. 18. Presentación de Hanes-Woolf
Fig. 19. Presentación de Eisenthal y Cornish-Bowden
Tabla 2. Determinación de las constantes cinéticas de las reacciones enzi-
Métodos modernos máticas
En las investigaciones científicas actuales, todo tipo de linearización se sus-

tituyo por métodos más fiables basados en análisis de regresión no lineal 1 Km 1 y=l/v; x=l/[S];
Lineweaver-Burk -=--+-
(http://www.graphpad.com). V Vmax[S] Vmax a+K IV max >. b=l/V
m max
3. Significación de las constantes cinéticas V y = V; X = vi [S];

Eadie-Hofstee v=-K -+V
m [S] max
a=-K . b=V. max
m'
Cada enzima tiene un valor de Km característico para un determinado sus-
trato, el cual puede decirnos de cómo de afín es la unión entre el sustrato y
la enzima (a través de la relación: Km = Ks, para k; »k ).
2
Hanes-Woolf
[S] =_l_[S]+ Km I y=[S]/v; x=[S];
V Vmax Vmax a = 1 IV'max» b = K m IV max
Otra constante útil es k2 denominada también «:
(constante catalítica). Es
la capacidad de la enzima para llevar a cabo la transformación. Recibe tam- V y=v; x=[S];
bién el nombre de número de recambios (igual a la cantidad máxima de Eisenthal y Cornish-Bowden V =-K +v
max [S] m
moléculas de sustrato o de producto transformadas por unidad de tiempo a=v/[S]; b=v
por molécula de enzima o por número de sitios activos, en condiciones de
saturación de manera que la cantidad de sustrato no sea limitante). Se mide
en S-l. El número de recambios se calcula fácilmente: k t = V /[E]
ea max o
La constante de especificidad k ca("/Km mide la eficiencia con la que una

enzima convierte un sustrato en producto. Es un parámetro muy útil para
comparar diferentes enzimas o la misma enzima con diferentes sustratos. El
valor máximo teórico de la constante de especificidad es 108 _ 109 (M-I sol).
En este caso cada colisión de la enzima con su sustrato da lugar a la catálisis,
con lo que la velocidad de formación de producto no se ve limitada por la
velocidad de reacción, sino por la velocidad de difusión. Las enzimas que
poseen esta propiedad son llamadas enzimas catalíticamente perfectas o
cinéticamente perfectas. Ejemplos de este tipo de enzimas son la triosa
fosfato isomerasa, la anhidrasa carbónica, la acetilcolinesterasa, la catalasa,
la fumarasa, la f3-lactamasa y la superóxido dismutasa.
Resumen de los métodos de linearización aplicados para la determinación

de las constantes cinéticas de las reacciones enzimáticas (Tabla2)
46 Enzimas y cinetica enzimatica Factores que afectan a la velocidad de las reacciones enzimáticas 47
el incremento de la velocidad de desnaturalización térmica de la
enzima al sobrepasar una temperatura crítica.
De acuerdo con la Ec. 11, la velocidad de una reacción enzimática es: v= kJES].
Capitulo 5 Por lo tanto, la velocidad de la reacción dependerá de la concentración de
ESy el valor de k2• En un esquema simplificado, la variación de la velocidad
de la reacción enzimática con la temperatura puede ser descrita en térmi-
Factores que afectan a la velocidad nos de cambios en el valor de k2• Como en las reacciones químicas, esta
puede ser descrita por la relación de Arrhenius:
de las reacciones enzimáticas
.s.
k2 = Ae RT (23)
1. Efecto de la temperatura
donde: A es la constante de Arrhenius, Ea es la energía de activación, R es la
Al igual que ocurre con la mayoría de las reacciones químicas, la velocidad constante de los gases y Tela temperatura.
de las reacciones catalizadas por enzimas se incrementa, en general, con la
temperatura (Fig. 20, b), dentro del intervalo en que la enzima es estable y Si se han determinado A y Ea' k2 puede ser calculado para una temperatura
permanece totalmente activa (Fig. 20, a). La velocidad de muchas reaccio- dada. Alternativamente, si se mide Vmax en idénticas condiciones a dos
nes enzimáticas se duplica, aproximadamente, por cada 1OoC de aumento temperaturas, las constantes A y Ea pueden ser determinadas. Tomando
de la temperatura. logaritmos en la ecuación (23):
Aunque las reacciones cata liza- -la

das por enzimas parecen, con :::::.. .•. Ea
E
(a) .
,
lnk2 = lnA - RT (24)
frecuencia, poseer una tempe- ~
ratura óptima (Fig. 20, X), el pico :8 u
que se observa al representar ~ por lo tanto
la actividad enzimática frente ;;
a la temperatura (Fig. 20, c) se -(]) Ea
produce porque las enzimas, al
"O
"O (d) lnV~ax = lnA - RT' (25)

ro
ser proteínas, se desnaturalizan
'ü
"O
\
por la acción del calor y se o
Ea
inactivan cuando la elevación ~ X Temperatura.X " --lnA--" RT
lnVmax - (26)
de la temperatura sobrepasa un Fig. 20. Variación de la velocidad de la reacción
cierto valor (Fig. 20, d). enzimática con la temperatura restando obtenemos:
La aparente temperatura óptima es, por tanto, la resultante de dos procesos:
el incremento habitual de la velocidad de la reacción con la tem- 1 V~ax

n"
= In k~[EoJ = _ Ea (T' - T")
I ••
(27)
peratura; Vmax k2[EoJ R T T
48 Enzimas y cinetica enzimatica Factores que afectan a la ve/ocidad de las reacciones enzimáticas 49
En la práctica, es mas preciso realizar experimentos en un rango de tempe-

raturas y representar lnV (o logV ) frente liT. Los valores de Ea y de A se EH- P E2- + H+ ,K = [E2-][H+] = [E2-][H+]2 (30)
pueden deducir como sem(Jemuestraen las Figs. 21 y 22. 2
[EH-] [EH2]K¡
La forma activa de la enzima es EH y sólo el complejo EHS puede dar

3 I l<E-- LogA
productos.
-,
<E- LnA
La concentración total de la enzima es el sumatorio de las concentraciones

2 ¡;í
¡:j , E de las tres formas:
;..-E 'bo
j j 0,5
1 [ Ea] = [EHzJ + [EH- ] + [E2- ] (31)
J pendiente=-E./R
<, I pendiente=-E.l2.3R
° i
i I ° 3 3,2 3,4 Por consecuencia la concentración de la forma activa será dada por:
3 3,2 3,4 3,6 3,6
lOOO/T. h.'¡ lOOO/T. K'¡
[Ea]
[EH-] = [H+] ~ (32)
Figs.21 Y 22. Variación de la velocidad de la reacción enzimática con la
l+-+[H+]
temperatura (presentación de Arrhenius) K¡
La ecuación (32) describe el cambio de la actividad enzimática en función

2. Efecto de pH del pH. El grafico correspondiente es una curva con máximo. Por un valor
de pH igual a pK, + pK2 ,la concentración de la forma enzimática activa (EH)
El efecto del cambio de pH en las velocidades de las reacciones catalizadas es máxima. 2
por enzimas se puede observar en la Fig. 23. Se tiene un máximo y la prime-

ra explicación de este hecho fue dada por Michaelis. La idea básica es que el
Vmux
centro activo de la enzima puede existir en tres estados de ionización EH2'
EH Y W', dependiendo del pH:
K, K2
EH2 pEH- pE2-
(28)
4 5 6 7 8 9
Las constantes de disociación se representan por K¡ y K2:
pH
EH2 P EH- +H+,K¡ = [EH-][H+] Fig. 23. Efecto del cambio de pH en la velocidad de la reacción enzimática
[EH2] (29)
El efecto del pH sobre la actividad enzimática puede deberse también a la se une el sustrato; el sustrato y el inhibidor compiten para el acceso al sitio
desnaturalización de la proteína y al cambio en la forma iónica del sustrato. activo de la enzima (Fig. 24).
Este tipo de inhibición se puede superar con concentraciones suficiente-
3. Inhibición enzimática mente altas del sustrato, es decir, dejando fuera de competición al inhibi-
doroLos inhibidores competitivos son a menudo similares en estructura al
Un inhibidor enzimático es una sustancia que reduce, o elimina comple- sustrato verdadero.
tamente, la capacidad de la enzima para actuar como catalizador. Hay dos
clasesde inhibidores: (1) inhibidores reversibles, los cuales no forman enla-
ces covalentes con la enzima y permiten a la enzima recuperar la actividad
completa cuando se eliminan de la solución; e (2) inhibidores irreversibles,
que forman enlaces covalentes con la enzima y generalmente reducen la • 4--'"
actividad enzimática permanentemente.
Hay cuatro tipos principales de inhibición reversible: inhibición competiti-
11 G
va, inhibición acompetitiva, inhibición no competitiva e inhibición mixta.
En estos casosel inhibidor (J) forma un complejo (El) con la enzima (E) que
esta en equilibrio con la enzima libre y con el inhibidor libre del mismo
modo que un sustrato (S)forma un complejo enzima-sustrato:
E + lpEl (33)
La constante de disociación del complejo El, llamada constante de inhibi-

Fig.24. Inhibición competitiva
ción K¡se define de la siguiente manera:
En el caso sencillo del mecanismo de Michaelis-Menten (Km -;::;Ks)' debe
K¡=[E][I] (34)
considerarse un equilibrio adicional, es decir el esquema cinético de la
[El] inhibición competitiva es:
El valor de la constante de inhibición nos da idea de la eficiencia del inhi- S

kcat
bidor. Cuanto menor es la K, más eficiente es la inhibición de la actividad E~ ES E+P
enzimática.
Inhibición competitiva
11l K, K,
El
En la inhibición competitiva, el sustrato y el inhibidor no se pueden unir Resolviendo las ecuaciones de equilibrio y de velocidad utilizando:
a la misma enzima al mismo tiempo. Esto generalmente ocurre cuando el
inhibidor tiene afinidad por el sitio activo de una enzima en el que también [Eo] = [ES] + [El] + [E] (35)
obtenemos:
a b
= 1/V
v [Eo][S]kcat _ Vmax[S]
(36)
v 1_ v rnax
[S] + Km (1 + ~]) - «s; + [S] ,/
pendiente=-K
¡ [1]=0 ,/ m
[1]
[1] [1]=0
donde:
a = 1+ [1] ""dIe".~
(37)
K¡ -l/K,,, -l/K,,, 1/(5] v/[S]
Fig. 26. Análisis grafico de la inhibición competitiva

La inhibición competitiva afecta solamente a Km y no a V
max (Fig. 25) ya que a) presentación de Lineweaver-Bukr; b) presentación de Eady-Hofstee.
concentraciones infinitamente elevadas de S desplazan a / de la enzima.
Inhibición QcompetitivQ
v
En la inhibición acompetitiva el inhibidor no puede unirse a la enzima libre,
V1'l1a~ sino únicamente al complejo enzima-sustrato (ES) (Fig. 27). Una vez forma-
do el complejo con el inhibidor (E/S) la enzima queda inactiva.
[ll=P
1/2 V~",-( [1]
--.
G
•
1/2 v.:
+--
E+S~ES~E+P
+
K",Krn [5]
I
ilK,' liQ
EIS
Fig. 25. Inhibición competitiva: representación de velocidad vs. concentración de
sustrato.
El análisis grafico de la inhibición competitiva se efectúa aplicando varios Fig. 27. Inhibición acompetitiva
métodos, como se demuestra en la Fig. 26.
En la inhibición acompetitiva se modifican ambas K m y Vmax (Fig. 28), aun-
que su cociente permanece igual. Tanto la Vmax como la K m se alteran en
Factores que afectan a la velocidad de las reacciones enzimáticas 55
la misma proporción, lo que se manifiesta en la representación de dobles Inhibición no competitiva
inversos como rectas paralelas y por lo tanto con la misma pendiente
(Fig. 29, a). Los inhibidores no competitivos tienen afinidades idénticas por Ey ES (K¡ = K¡ ')
Y se unen tanto a E como a ES (Fig. 30).
[1]=0
v
V
1/2Vm ••
"'"
Vrn;n;
1/2V Mi'H
1../7' [1]
E+S~ES~E+P
+
1
+
1
e Q
--+
+---
K Km
ITI
1l K,
EI+S~ESI
1l K,' Gll ~ Q
llG
[5]
--+
Fig. 28. Inhibición acompetitiva. Representación de velocidad vs. concentración
+---
de sustrato
K,=K,'
~\
La velocidad de la reacción puede ser expresada como:
Fig. 30. Inhibición no competitiva
v= VmaJJ~] (38),donde:a' =1+ [/~ (39) Y K~ = [ES][/] (40)
Km + a [S] K¡ [E/S] La inhibición no competitiva no cambia la Km (es decir, no afecta a la unión
del sustrato) pero disminuye la Vrnax (es decir, la unión del inhibidor obsta-
K¡' es la constante de disociación del complejo E/S.
culiza la catálisis) (Fig. 31).
Por medio de análisis grafico se pueden evaluar las constantes cinéticas de
la reacción enzimática (Fig. 29). v I b
+- V v
max
•• pendiente=-Km v,••, [1]=0 :,..;;:-=-
,
[1]=0
[1] V
m"
v _ 1/2V [1]----
[1]=0 nH":
max
1N
1/2V m ••
-l/Km -l/K," Km [S]

1/[5] v/[S]
Fig. 29. Análisis grafico de la inhibición acompetitiva Fig. 31. Inhibición no competitiva. Representación de velocidad vs. concentración
a) presentación de Lineweaver-Bukr; b) presentación de Eady-Hofstee. de sustrato.
La inhibición no competitiva difiere de la inhibición competitiva en que el titiva. El término mixta se usa cuando el inhibidor se puede unir tanto a
inhibidor siempre se une a la enzima por un sitio diferente al centro activo la enzima libre como al complejo enzima-sustrato, pero sus afinidades por
de la enzima (este otro sitio se denomina sitio alostérico). En este tipo de estas dos formas de enzimas son distintas (K¡ -:¡:. K¡ 1(Fig. 33). En la inhibición
inhibición, el inhibidor se puede unir a la enzima al mismo tiempo que el mixta el inhibidor se une a un lugar distinto del sitio activo en el que se une
sustrato. No se observa competición entre en inhibidor y el sustrato, así que el sustrato. Con este tipo de inhibición K m decrece y Vmax decrece.
incrementar la concentración del sustrato no produce un aumento de la
e .-- Q
tasa de actividad enzimática.
Las constantes cinéticas de la reacción enzimática se pueden determinar

E+S~ES~E+P --+
+ +
usando los diagramas de Lineweaver-Burk y de Eadie-Hofstee (Fig. 32).
1 1
La velocidad de la reacción es:
II K¡ II K¡' Gil Q
ilG
v= Vmax[S,]
«s; +a [S]
(41), donde: a' =1+ [1~ (39) Y a =1+ [1] (37).
K¡
v
K¡
EI+S~ESI
K¡=K,'
.--
--+
En este caso a '= a: b

~ V
max Fig. 33. Inhibición mixta
a
lN
, [1]=0
La velocidad de la reacción puede ser expresada como:
vmax •...•• v= VmwJS,] (42),donde:a' =1+ [1~ (39) Y a =1+ [1] (37).
\ pendiente=-Km «s; +a [S] K¡ K¡
Para la determinación de las constantes cinéticas se aplican varios métodos

[1] \
(Fig.34).
pendiente-e-K
m
\ 1N • v
b
·lIK", l/(S] v/[S]
/
[1]
Fig. 32. Análisis grafico de la inhibición no competitiva

a) presentación de Lineweaver-Burk; b) presentación de Eady-Hofstee. p.ndl.nt.=-K
[1]=0- m
pendiente=-K [1]
m
Inhibición mixta
.1/K". -l/Km 11[5] v/[s]
La inhibición mixta se refiere a la combinación de dos tipos reversibles de Fig. 34. Análisis grafico de la inhibición mixta
inhibición enzimática, la inhibición competitiva y la inhibición no compe- a) presentación de Lineweaver-Bukr; b) presentación de Eady-Hofstee.
Factores que afectan a la velocidad de las reacciones enzimáticas 59
4. Determinación de las constantes de inhibición Resumen de las ecuaciones cinéticas que describen la inhibición enzimática
(Tabla 3)
Para la determinación de las constantes de inhibición se utilizan frecuen- Tabla 3. Ecuaciones cinéticas que describen los procesos de inhibición
temente las graficas 1Iv vs. [1] (presentación de Dixon, Fig. 35) o [S1lv vs. [1] enzimática
(Fig.36).
a v max[S] 1V 11+-[1] 1
I
b K m =a K m '=v
1/v I lIv Competitiva v=
«s; +[S] K '>K max max K¡
1 1 K¡
[S] 1 I [S]l m m
Vmax[S] 11+[1]1
Acompetitiva V K m '=K m".
K '<K
V '=V la'
mex mex
1 1 K'¡
Km +a'[S] K¡
mi m m
[S] 2 1/ -" [S] 2
Vmax[S]
No competitiva v=
«s; +a'[S] K m '=K m 1Vmex'=v maxla'll+[1] K¡ 11+[1~1 K=K'
[S]
iV
K¡ ¡ ¡
3
1 Vmax[S] K =a K la'l 1 [1]
Vmal<'=Vmax/a'1+-
11+-,
[1] 1 K¡t-K/
-KI I [1] -K = K'
I
I Mixta v=
«s; +a
,
[S]
m m
K m '<K m K¡ K¡
1 1 [1] 11
Fig. 35. Determinación de la constante de inhibición por el método de Dixon
a) inhibición competitiva; b) inhibición no competitiva. [SI]<[S2]'[S;J. ...
[S] Iv llv
" [S] 1 b
KI
Km N max ~(l--)Nmax
K'I
-K'
1
[1] -K, [1]
Fig. 36. Determinación de la constante de inhibición.

a) inhibición acompetitiva; b) inhibición mixta.
[SI]<[S2]'[S3] ....
60 Enzimas y cinetica enzimatica Aspectos de diseño de reactores enzimáticos 61
Km In [[~} + ([So] - [S]) = Vmaxt (47)
Capitulo 6
Reordenando:
[So]-[S] _ Vmax t-K (48)

Aspectos de diseño [Sol - In [So] m
de reactores enzimáticos In [S] [S]
o
t. Procesos discontinuos
[So]-[S] = k2[Eo] t-K (49)
Habiendo considerado la cinética de las enzimas en solución, podemos es- In [So] In [So] m
tudiar sus aplicaciones en el diseño de reactores enzimáticos. En su sentido [S] [S]
más simple, una celda de espectrofotómetro puede considerarse un reactor
enzimático discontinuo (batch). Si se registra el cambio en concentración
Como [So] es la concentración del reactante en el tiempo cero, [So]-[S] es
de producto o el correspondiente cambio en concentración de reactante,
igual a la concentración del producto en el tiempo t, asumiendo que la es-
esta variación tendera a seguir la relación descrita por la ecuación de
tequiométria de la reacción es 1:1. Por lo tanto, empleando la ecuación (48)
Michaelis-Menten (Ec. 14) integrada:
la concentración del producto puede ser expresada en función del tiempo.
La concentración de la enzima empleada se expresa en el termino de Vmax

d[S] _ Vmax[S] _ V max
----;¡¡- - Km + [S] - Km + 1 (43) (Ee 13: Vmax=k2[EJ).
[S] La expresión (49) podrá usarse para calcular los parámetros cinéticos de la
reacción enzimática (Km' Vmax' k2) y para estimar la cantidad de enzima y el
tiempo necesario para producir una cantidad de producto dada (Fig. 37 Y
s
- f (Km[S]
S
+ l)d[S] = f Vmaxdt (44)
Fig.38).
Por [So] »Km:

O
d[S] = Vmax = k 2 [E o ] orden cero (50)

-~ (Km In[S] + [S]) = Vmaxt (45)
-
dt
O
(Km In[So] + [SoD - (Km In[S] + [S]) = Vmaxt (46) - f ds = f k [Eo]dt

2
(51 )
So
Aspectos de diseño de reactores enzimáticos 63
[ SO] - [S] = k2 [ Eo Jt (52)

[S ] - [S]
O
In [S ] I[S]
o
Por [So] =«:
d[S] _ Vmax[S] = kz[Eo][S] orden 1 [S ]
I I
I
- ---;¡;- -
Km Km (53) o
I
1
•
pend,iente = k 2 [E o]
s I t
- sf Kmd[S]
[S]
= f kz[Eo]dt (54) t •. --
In [S ] I[S]
o
o
Km K + [5 ]
m o
k [E o] k [E o]
(55)
2 2
K In [So] =k [E ]t
m [S] Z o Fig. 38. Determinación de los parámetros cinéticos de la reacción enzimática
2. Procesos continuos
[S ] - [S] Si la enzima es inmovilizada resulta posible operar un reactor enzimático de
O
forma continua. Existen dos modelos generales de procesos continuos que
In [S ] I[S] orden cero ([S] grande)
o se presentan a continuación.
------.--~)1-i:-,-.. Reactor de Mezcla Total (Continuos Stirred Tank Reactor, CSTR)

[S ]
o ,
tiempo
.
o
,
:
I
En este caso se asume que el vaso del reactor está perfectamente mezclado,
orden 1 I de tal forma que la concentración de los componentes en el flujo de salida
pendienté = k2 es igual que en el volumen de fluido en el vaso (Fig. 39). Los efectos de la
\ o
o I [E o]t alimentación, drenaje y conversión se pueden considerar en términos del
/Km In [S ] I[S] balance del material que entra, se acumula y sale del reactor:
K + [S ] o
m o
acumulación entrada salida conversión
-K k
m 2 k
2
V d[ S] = Q[ S ] - Q[ S] - v V (55a)
Fig. 37. Determinación de los parámetros cinéticos de la reacción enzimática dt o
Q[50] Q[5] [P] Los parámetros que pueden ser controlados son D y [S], siendo V ID el
parámetro critico. Reordenando la ecuación, obtenemos: max
Vrnax = ([So]-[S])(Km + [S])

(59)
D [S]
o
v [5] [P]
k2[Eo] _ ([So] - [S])(Km + [S])
(60)
D [S]
~
Fig. 39. Representación esquemática de un reactor de mezcla total [Eo][S]

[S] = -Km +k2 ([So]-[S])D (61 )
=
donde: V volumen del reactor =
Q velocidad del flujo (m' S"); [So]
(m3); =
concentración de reactante en la alimentación (kg mol m"): [S] concen- =
tración de reactante en el reactor (kg mol rn'): v =
velocidad de reacción Los parámetros cinéticos se pueden determinar usando la presentación
(kg mol m" s'). . , [s]
de Ia f uncron =f [S] (F'Ig. 40) .
gra fi ca ([So]-[S])D
Reordenando:
Usualmente se expresa esta ecuación en términos de la fracción de conver-
sión:
d[S] =D([So]-[S])-v (56)
dt x = [So]-[S] (adimensional) (62)
[So]
donde: D = Q/V (s') es la velocidad de dilución.
Por lo tanto:
Por lo tanto D=lh:, donde 't es el tiempo de residencia del líquido en el
reactor. X[SJ=[SJ-[S] y [S]=[SJ-X[SJ (63)
En la práctica, un reactor continuo será operado en condiciones de estado
estacionario, esto es, sin acumulación de reactante o producto en el reactor, Por consecuencia, obtenemos:
por lo tanto el término acumulación se anula:
Vmax =K [So]-[S]+[S ][So]-[S] (64)
v = D ([So]-[S]) (57)
D m [S] O [So]
La expresión usada para describir v depende de la cinética presentada por
la enzima de interés. Si se asume una cinética simple de Michaelis-Menten, Sustituyendo en términos de X:
entonces:
Vrnax =K [So]X +[S]X
VmaJS] = D([So] - [S]) (58) D m[So] - [So]X O
(65)
K m +[S]
Reactor flujo-pistón (Plug Flow reactor, PFR)

[5]
En este caso se supone que no tiene lugar ninguna mezcla axial en el vaso
[S ]
o t y que el líquido pasa a través del reactor (Fig. 41).
I
,
I
I
pendiente = k 2 Q [So] Q [S] [P]
,
1
I
I
o I [E 0][5]
,1' K ([50] -[5]) O

/1' m K + [S ]
m o
l' k Fig. 41. representación esquemática de un reactor flujo-pistón (PFR).
/ 2 k
/ 2
l'
-K El reactor puede describirse empleando la ecuación de Michaelis-Mentes
m
integrada, reemplazando el tiempo de reacción por el tiempo de residencia
Fig. 40. Determinación de los parámetros cinéticos de la reacción enzimática
(Reactor de Mezcla Total)
V~V = K' In [So] + ([S] - [S])
Q m [S] O
(68)
Vrnax=K ~+[So]X (66)
D ml-X V/Q (el tiempo que cada elemento permanece en el reactor). Por lo tanto:
La inmovilización puede modificar la cinética de una preparación enzimáti- V se define como el volumen total del reactor. Sin embargo un reactor f1ujo-
ca de tal forma que Km y Vmax pueden cambiar. Puesto que estos cambios son pistón se construye como un lecho empaquetado de una enzima inmovili-
difíciles de predecir, las constantes aparentes deberían ser determinadas zada y por lo tanto la matriz de inmovilización puede ocupar una fracción de
experimentalmente realizando una serie de determinaciones a diferentes este volumen. Como el tiempo de residencia depende del tiempo invertido
concentraciones de reactante en la alimentación y midiendo la fracción de por el líquido en el reactor, es función del volumen líquido Y¡ más que del
conversión resultante. volumen total ~ot' La ocupación de la columna puede expresarse como:
Reordenando la ecuación (66):

V
&= _1 . V =&V (69)
V '1 tot
v'
[So]X=~-K' ~ tot
(67)
D ml_X
Por lo tanto, la forma corregida de la ecuación (68) se convierte en:
Por lo tanto, representando los valores experimentales de [S ]Xfrente a XI

(l-X) obtendremos un grafico con una pendiente de -K'm y una ordenada V~ax~ot& = K' In [So] + ([So] - [S]) (70)
de V'max ID. m [S]
De nuevo, esto se puede expresar en términos de la fracción de conversión: De estas consideraciones se desprende que la operación continua es
deseable donde sea posible. Cuando se diseña un reactor enzimático
, 1 continuo debe tomarse una decisión entre un modelo tipo mezcla total o
VmaxV;O¡G =K' ln--+[SJX
(71) flujo-pistón. Las ecuaciones de rendimiento ya se han descrito para ambos
Q m l-X
tipos, pero sus diferencias en términos de requerimiento de enzima, efectos
de la inhibición y las implicaciones de la estabilidad enzimática deben ser
también consideradas.
V~axV;O¡G = [So]X - K~ ln(l- X) (72)
Requerimiento de enzima
La ecuación de operación de un PFR (Ec. 72) puede reordenarse para el
cálculo de las constantes cinéticas a partir de los datos experimentales: Dependiendo de la concentración de reactante en el reactor, la cinética
exhibida puede variar del orden uno al cero. Si estos se consideran como
I los casos extremos, entonces:
[So]X = x; ln(l- X) + V maxV;O¡G (73)
(STR: V~ax =X[S ]+K' ~ (74)

1n(1-X) dará una recta con una
Por lo tanto, un grafico de [SoJX frente a
D o m l-X
pendiente de K'm y una ordenada en el origen V'max~ots/Q. Como ~o/Q es

equivalente a 1/D, este ultimo termino puede simplificarse a V' max ell).
PFR: V~ax =X[SJ+K~ln(1-X) (75)
D
3. Elección de tipo de reactor
Cuando [So]»K' m' los reactores están operando en la región de orden cero
Una de las ventajas de la inmovilización mas frecuentemente citadas es que
y el rendimiento en ambos casos es aproximadamente:
permite la reutilización del costoso catalizador enzimático. Sin embargo,
más significativamente, el empleo de enzimas inmovilizadas en reactores
(76)
continuos permite reducir el tamaño de los mismos.
V~ax = X[So]
En la industria alimentaria la glucosa isomerasa se emplea en un reactor de D
lecho empaquetado en flujo continuo para producir un jarabe rico en fructosa.
El requerimiento de enzima será similar por lo tanto ambos tipos de reactores.
El tiempo de residencia del líquido en la columna es de 20 minoTomando este
como un tiempo realista, consideramos una situación en la que se requieren 0.5 Cuando [So]«Km (primer orden), las ecuaciones pueden aproximarse por:
m3 de solución producto en unas 10 horas. Podemos realizar una comparación
del tamaño del reactor requerido para una operación continua y discontinua: (77)
(STR: V~ax = K' ~
un vaso con un tiempo de proceso discontinuo de 10 horas necesi- D m l-X
ta contener un volumen de 0.5 m3;
un reactor continuo con un tiempo de residencia de 0.33 h Y una veloci- PFR: V~ax = K~ 1n(1- X) (78)
dad del flujo de 0.05 m3 h" requiere un volumen del reactor de 0.0165 m', D
Si se emplea la misma preparación de enzima inmovilizada y la misma tasa

de dilución, entonces la relación entre ambas ecuaciones rinde:
Efectos de la estabilidad
Esta ecuación puede resolverse para cualquier fracción de conversión reque- La inactivación de la enzima en un reactor se describe usualmente median-
rida, para determinar la cantidad de enzima necesaria en cada uno de ellos. te una constante de inactivación de primer orden, de forma semejante a la
enzima en solución. Si se compara el rendimiento de un reactor a tiempo
k [E J TR / D
2 o CS
---==----"-=-'=.:.!....- = [EoJCSTR = K~X / (1- X) = -X (79)
cero y después de un periodo de tiempo t, se puede obtener una estima de
k2[Eo]PFR / D [EoJPFR -Km ln(l- X) (1- X)ln(1- X) la constante de inactivación kd para un CSTR:
Efectos de inhibición V' t ' X (80)

Tiempo t: max,
D
= X t [So l+ K m _t_
_ 1 X t
Los efectos de la inhibición pueden determinarse derivando las ecuaciones
de rendimiento empleando la expresión cinética requerida. Los ejemplos
(81 )
comunes se muestran en la Tabla 4. Como el CSTRopera en condiciones de v' o ' Xo
drenaje, esto es, la concentración del reactante en el reactor es la misma
Tiempo o: ~=X
D o
[S l+K
o
--
m 1-X
O
que la del flujo de salida, su rendimiento es menos afectado por la inhi-
bición por reactante que un PFR, donde el reactante entra en el reactor De nuevo, la relación entre ambas ecuaciones puede simplificarse si k2 y D
sin dilución. A la inversa, la inhibición por producto tiene un efecto más son idénticas:
pronunciado en los CSTR ya que en ellos existe una distribución homogé-
nea del producto en todo el reactor. Incluso en los PFR, donde existe poco
producto en la primera parte del reactor, la inhibición por producto tiene , X,
un efecto pronunciado en el rendimiento, en algunos casos aumentando Xt[SJ+Km
1-X
las necesidades de enzima en varios órdenes de magnitud. [Eolt = , Xt (82)
- K -o
[Eolo Xo[Sol + m 1-X
Tabla 4. Resumen de las ecuaciones de rendimiento de reactores mas comunes
o
La inactivación de la enzima libre puede describirse por:

Tipo
de inhibición
(STR: V'D:" _- PFR:
v·
max_
D - In [Eolt = -kdt (83)
[EJo
.X
X[Sol+Km l-X X[Sol + K~ ln(l- X)
Por lo tanto:
Reactante
X[Sol + K~ 1-:X + [~l2 (X - X2~ X[Sol + K~ ln(l- X) _ [:~2 (2X - X2) , X,
(acompetitiva) ¡ 1 ¡
XJSol+Km 1-X
2 t (84)
Producto X[Sol+K~~+ K~ [SolX X[Sol(l + K~) _ (1+ [Sol K~ ln(l- X)
k t = In K, X
__
(competitiva) l-X K¡ (l-X) K¡ K¡
- d o
Xo[Sol+ m 1-X
o
72 Enzimas y cinetica enzimatica Inmovilización de las enzimas 73
Una vez que se ha determinado el valor de kd, la V max para cada tiempo dado
se puede calcular mediante:
Capitulo 7
'v' exp( -kdt )
n-
Vmax,t _ max,O
D
Ecuaciones similares pueden derivarse para reactores flujo-pistón y calcular

Inmovilización de las enzimas
de esta forma el efecto del tiempo de funcionamiento en el rendimiento,
una vez la kd conocida. Una comparación de las kd calculadas indica que un
PFR se ve más severamente afectado por la inactivación de la enzima que 1. Aspectos generales
un CSTR. Sin embargo este debe ser contrastado con la mayor cantidad de
enzima requerida por un CSTR para un rendimiento dado. Los procesos catallzados por enzimas en la industria son cada día más nu-
merosos, ya que presentan una serie de ventajas frente a los catalizadores
convencionales no biológicos:
presentan una gran actividad catalítíca:

muestran una gran especificidad de sustrato (incluso estereoselec-
tividad y regioespecificidad);
son muy activos a temperatura ambiente y presión atmosférica.
A pesar de estas claras ventajas, el empleo de enzimas no se ha generali-

zado en los procesos químicos industriales debido a que la mayoría de las
enzimas no son estables en las condiciones de trabajo. Por otra parte al ser
solubles en agua, su separación de los sustratos y productos es difícil, y por
tanto, no se pueden reutilizar. Con la inmovilización de las enzimas se han
podido superar estos últimos inconvenientes, permitiendo que el proceso
biotecnológico sea económicamente rentable.
La inmovilización de enzimas es un proceso en el que se confina o localiza

a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar a formas
insolubles que retienen su actividad catalítlca y que pueden ser reutillza-
das repetidamente. Posteriormente esta definición se ha ampliado a aquel
proceso por el cual se restringen, completa o parcialmente, los grados de
libertad de movimiento de enzimas, orgánulos, células, etc. por su unión a
un soporte.
Como ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas podemos destacar: la gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden
el aumento de la estabilidad de la enzima; existir distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con un dife-
rente número de uniones al soporte;
la posible reutilización del derivado, por lo que disminuyen los
costes del proceso; siempre suele haber una pérdida de actividad de la enzima durante
la inmovilización;
la posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y
control, adaptado a la aplicación de la enzima inmovilizada. el biocatalizador es más caro que la enzima nativa.
Los diferentes tipos de reactores enzimáticos aparecen en la Figura 42.

2. Métodos de inmovilización de enzimas
Ta nque agitado Tanque agitado y alim entación continua leche fluidizodo y alimentación continua
En general, los métodos de inmovilización se suelen clasificar en dos gran-

Producto Producto des categorías: retención física y unión química.
;--0 --
o 0
0010 0100 00 0
~ 000
O O O
Sustrato
•
I Oc:b
O O
Sustrato O O 00
Métodos de inmovilización de enzimas por retención física
O O O
Los métodos de inmovilización de enzimas por retención física (Fig. 43)

lecho emoaauetado lecho empaquetado, Ta nque agitadoJ en continuo
y alim enta ción continua en continuo y con reciclado y recupera ción por ultrafiltraci ón
incluyen dos procedimientos principales: el atrapa miento y la inclusión en
Producto Producto membranas.
Retención física
":r O·.-
Producto
•• •• Atrapamiento Inclusion en
I
• membranas
• • • •
Sustrato
_ En capas En fibras Encapsulación Reactores
Sustrato Sustrato
Fig. 43. métodos de inmovilización de enzimas por retención física

Fig.42. Reactores enzimáticos
Atrapamiento
Estos reactores con enzimas inmovilizadas permiten el empleo de cargas
elevadas de enzima, la cual mantendrá su actividad durante más tiempo. Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de
Estos sistemas pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de una matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros fo-
productos con mayor pureza. toentrucruzables o polímeros del tipo poliacrilamida, colágeno, alginato,
Los principales inconvenientes del proceso de inmovilización son: carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a
cabo mediante la suspensión de la enzima en una solución del monómero.
la alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado Seguidamente se inicia la polimerización por un cambio de temperatura o
nativo; mediante la adición de un reactivo químico. El atrapamiento puede ser en
geles O en fibras, que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer
caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el
segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades Métodos de inmovilización de enzimas por unión química
de una fibra sintética. El atrapamiento, de gran sencillez desde el punto de
vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener deriva- Los métodos de inmovilización de enzimas por unión química (Fig. 44) se
dos activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteración basan a los procesos de unión a soportes (por adsorción física o por unión
covalente) y de reticulado.
en su estructura. De todas formas, el atrapamiento requiere un control
riguroso de las condiciones de polimerización, así como la comprobación
Unión química'
I ,
de que la naturaleza química del proceso no altera los grupos reactivos de
la proteína. Unión a soportes Reticulado
Inclusión en membranas , Adsorción Unión covalente Reticulado puro Co-reticulado

" , " - ,. ~
La inclusión en membranas es dividida en dos tipos: microencapsulacon y "
inclusión en reactores de membrana. Fig.44. Métodos de inmovilización de enzimas por unión química
En la técnica de microencapsulación, las enzimas están rodeadas de mem- Unión a soportes

branas semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y
producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden Son los métodos de inmovilización más utilizados y de los que se dispone
ser permanentes (originadas por polimerización interfacial) o no perma- de una mayor información. La elección del soporte y del tipo de enlace
nentes (generadas por surfactantes, también llamadas "micelas reversas"). resultan determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador.
Las microcápsulas obtenidas son de forma esférica, con tamaños compren- Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sus-
didos entre 1 y 100 urn de diámetro. Mediante este método se pueden trato, disminuya la inhibición, amplíe el intervalo de pH óptimo y reduzca
encapsular simultáneamente una gran variedad de enzimas, células o las posibles contaminaciones microbianas. Además el soporte debe tener
biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones resistencia mecánica adecuada a las condiciones de operación del reactor y
que suceden en múltiples pasos. ser fácilmente separable del medio líquido para que pueda ser reutilizado.
Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la
El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas atrapadas inmovilización de numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamaño,
ha despertado gran interés en la industria. Estos reactores emplean mem- densidad, porosidad y forma, aunque generalmente nos los encontramos
branas permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y en forma de cilindro, hojas, fibras y más corrientemente en forma de esferas.
obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece Los soportes pueden clasificarse en dos grandes grupos:
un flujo líquido de sustrato que atraviesa el reactor. En general, en esta
metodología, se procede inicialmente a la adsorción de la enzima sobre la Soportes inorgánicos
membrana que formará el reactor. Esta adsorción se puede realizar de dos Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes, que pue-
formas: mediante el paso de una solución tamponada de enzima a través den ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.) o
de la membrana o por contacto continuo de una solución de enzima con materiales manufacturados (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro
la membrana. controlado, vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.);
Inmovilización de las enzimas 79
Una variante dentro de la técnica de la adsorción consiste en emplear
Soportes orgánicos
resinas de intercambio iónico, las cuales contienen grupos funcionales y
Se pueden clasificar en: polímeros naturales, a su vez divididos en polisacá- contraiones móviles. Estos contraiones se pueden intercambiar reversible-
ridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, mente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios en
chitosan, etc.), proteínas fibrosas (colágeno, queratina, etc.), polímeros sin- la matriz insoluble.
téticos divididos en poliolefinas (como el poliestireno), polímeros acrílicos
La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de
(poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.) y otros tipos (alcohol
inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La meto-
polivinílico, poliamidas, etc.). Las enzimas se pueden unir a estos soportes
dología de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos
mediante adsorción o por unión covalente.
del soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas. De entre
En la adsorción, la enzima se une a un soporte sin funcional izar mediante los 20 aminoácidos diferentes que se encuentran en la estructura de las en-
interacciones iónicas, fuerzas de Van derWaals y por puentes de hidrógeno. zimas, los más empleados para la formación de enlaces con el soporte son
Los principales factores que influyen en la adsorción, son: principalmente la lisina, la cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor me-
dida la metionina, el triptófano, la arginina y el ácido aspártico y glutámico.
el pH del medio: controla el número y la naturaleza de las cargas
El resto de aminoácidos, debido a su carácter hidrófobo, no se encuentran
que presenta la superficie de la proteína y del sólido;
expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir
la fuerza iónica: al aumentar la fuerza iónica se produce la desorción en la unión covalente.
de la enzima, ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza
Este método presenta las siguientes ventajas:
al soporte que la proteína;
el diámetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tama- la manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla;
ño del eje mayor de la enzima; la carga de enzima permanece constante después de la inmovili-
la presencia de iones que actúen como cofactores de la enzima, ya zación;
que pueden incrementar la carga enzimática del derivado. los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empa-
quetados, de lecho f1uidizado o tanque agitado;
Como principales ventajas de este método destacan:
una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la tempe-
su preparación sencilla;
ratura, de los disolventes orgánicos o del pH, al tener estabilizada
su bajo coste; su estructura terciaria.
no hay cambios de especificidad enzimática; En cambio la inmovilización por enlace covalente también presenta una
los derivados son estables en medios de trabajo con bajo conteni- serie de inconvenientes:
do en agua. es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad

de superficie, ya que condiciona el número de uniones enzima-
Los inconvenientes de la adsorción son principalmente:
soporte y su geometría, que puede ser distorsionante y conducir a
la optimización de las variables que controlan la adsorción; derivados inactivos;
los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista el proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro
mecánico; activo. Para evitar esta posible alteración, se realiza la inmoviliza-
la unión al soporte es débil. ción en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo.
la inmovilización covalente no es aconsejable en aquellas enzimas diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas
muy sensibles a cambios de pH, fuerza iónica, etc. con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces
intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de
La formación de la unión covalente se basa en las siguientes reacciones: pH y temperatura.
o El co-reticulado, permite eliminar las pérdidas de actividad enzimática de-
n- OH CNBr n- o, _ H2N-E n- 11
O-C-NH-E bidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas
U-0H -U-O/C-NH - U-0H con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de lisina (por
ejemplo, la albúmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilización
rL R'-~H o-?! R'-~H muy común consiste en inmovilizar la enzima por adsorción sobre una
O- COCH + R-N=C=N-R"+W - U COO~I+ H/'l-E - C-NH-E+?=O + W resina de intercambio iónico o un soporte polimérico (con lo que se con-
sigue una elevada carga enzimática) y posteriormente añadir el reactivo
R"-N"'H R"-N"'H
O- o-C~-COOH
CH30H
W-
D- 11
o
HlJ-NH2
0-c~-C-OCH3 -
O- o
11
0-C~-C-NH-NH2
NaN02
W-
bifuncional.
Actualmente el método más novedoso de cross-linking consiste en la

cristalización de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehído
o o
O- 11
0-C~-C-N3 ---=-- D-
H N-E 11
O-C~-C-NH-E
(Cross-Linked Enzyme Crystals o CLECs).Elaumento de estabilidad se basa
en la obtención de un entramado cristalino, donde las moléculas de enzima
están rodeadas exclusivamente por otras moléculas de proteína. De esta
o- 0H+ N~
CI
C¡-AN)1.CI
_
~
O-r-::NyCl
NyN
CI
~
HN-E ~
D-fNyCI
N:yN
NHiE
manera la propia enzima actúa como soporte, y su estructura terciaria está
estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La estructura
cristalina posee canales microscópicos (20-S0Á) que permiten el paso de
sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza la reacción.
0-0 ~!J NH2

NaN02 ~
U ~
CI,_ H0-oCH-E
N=N ~ !J
rlF\..
.~N=N-'Lf
k E Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y pH extremos, así
como la acción de las proteasas. Estatecnología se ha aplicado a enzimas
-
HCI muy diferentes, las cuales se han utilizado en la obtención de compuestos
OH
enatioméricamente puros y en la síntesis de péptidos.
oxldacion
G SH-
E-SH
GS-S-E
3. Efectos de la inmovilización
A menudo, la inmovilización altera significativamente el comportamiento

Reticulado
de las enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En
segundo lugar, la enzima inmovilizada es un sistema heterogéneo en el
También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica cual todos los componentes que intervienen en el proceso catalítico (pH,
que ha sido ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas. sustratos, productos, inhibidores, cofactores, activadores, etc.) se encuen-
El método del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que tran en interfase: en el medio de reacción y en la fase constituida por el
originan uniones intermoleculares entre las moléculas de enzima. Como soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimática se ve
reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres,
afectada por efectos de tipo difusional, estérico y del microentorno.
cantidad necesaria de agua en su microentorno para mantener su
Efectos en la estabilidad conformación activa.
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas

después de su inmovilización, que se debe principalmente a las siguientes
razones:
una estabilización conformacional de la enzima debido a la exis-

tencia de uniones multipuntuales enzima-soporte; la estructura
terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez y se hace más
resistente a la desactivación térmica o química. Este tipo de es-
tabilización se obtiene únicamente en aquellos métodos en los
Fig. 45. La inmovilización estabiliza a la enzima
que intervienen enlaces de tipo covalente, como el reticulado o la
unión a soportes activados (Fig. 45). La inmovilización covalente
multipuntual se puede combinar con la adición de reactivos bifun- Efectos en la actividad enzimática
cionales que den mayor rigidez a la estructura de la enzima;
una protección frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso
unión de proteasas a un soporte elimina su capacidad proteolítica, perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimática
y evita su autolisis; puede ser debido a que:
se evita la agregación intermolecular al mantener las moléculas de la unión al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato
enzima retenidas en una determinada región del espacio; al centro activo está impedido;
existe una alteración del microentorno del enzima debida a la in- los grupos reactivos del soporte reaccionan con algún aminoácido
teracción de la enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima que forme parte del centro activo o que sea esencial para la activi-
sensible al oxígeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se dad catalítica de la enzima;
sitúa en la superficie de un soporte cargado, la fuerza iónica efec- la inmovilización puede originar un cambio conformacional que da
tiva en el microentorno de la enzima será muy alta y, como conse- lugar a una forma Inactiva;
cuencia, la concentración de oxígeno disuelto será mucho menor
en esa zona que en el medio de reacción. En otros casos el soporte las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturali-
tiene un efecto tamponador de tal manera que mantiene el pH óp- zación o desactivación de la enzima.
timo de la enzima en su microentorno, aunque en la disolución se Si la pérdida de actividad no es total después de la inmovilización, los
produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en aquellas cambios (disminución o aumento de la actividad enzimática) se deberán
reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de principalmente a efectos difusionales, electrostáticos, estéricos y/o del
disolventes orgánicos, la "acuofilia" del soporte o su capacidad para microentorno.
retener agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto mayor es
la acuofilia del soporte, más agua adsorbe y la enzima poseerá la
Efectos difusionales
El termino que refleja la difusión es: (K m + x;;ax)
Como consecuencia de la inmovilización, la difusión de los sustratos hacia
el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias de tipo
externo e interno. ye l termino
terrni que re fI eja
. Ios electos
~ e Iectrostatícos
' . es RT ,
RT-xzFV
resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el
medio de reacción, el sustrato deberá atravesar la película líquida donde x es el espesor de la capa de Nernst; T es temperatura (K); z es la va-
estacionaria (capa de Nernst o de disfusión) que rodea el soporte. lencia del sustrato; F es la constante de Faraday; R es la constante universal
En las proximidades de un soporte no cargado, la concentración de los gases y Ves el gradiente de potencial en el soporte.
de sustrato es menor que en el resto de la disolución, puesto que Se puede disminuir el valor de K m " variando tanto el término de difusión
existe un gradiente de concentración a través de la zona de difu- como el término electrostático. En el primer caso, la disminución del
sión. Por tanto, los valores de Km para las enzimas inmovilizadas son valor de Km' se consigue al disminuir el tamaño del soporte (con lo que
siempre aparentes (Km '); disminuye el término"x") o al aumentar el flujo o la agitación. En el término
resistencias difusionales internas: debido a que los sustratos tienen electrostático, si "z" y "v" tienen el mismo signo, es decir si el soporte y el
que atravesar el interior del gel, microcápsula, fibra o poro del so- sustrato tienen la misma carga, el término electrostático es menor de 1
porte donde se encuentra la enzima inmovilizada. y Km' aumenta. Si tienen cargas opuestas, la Km' disminuye. Si no poseen
carga, Km 'sólo dependerá del término de difusión.
Existen diversas maneras de minimizar estos efectos difusionales como por
ejemplo: disminuir el tamaño del biocatalizador, aumentar la concentra- Impedimentos estéricos o de tamaño de sustrato
ción de sustrato, incrementar la agitación o el flujo en el reactor, etc. Con
En un principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya una
estas medidas se consigue reducir el grosor de la capa de Nernst, y como
pérdida apreciable de su actividad. Este hecho suele ser válido en el caso
consecuencia, el valor de Km' disminuye.
de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos
Efectos electrostáticos con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada dis-
minuye drásticamente. Por ejemplo, muchas hidrolasas unidas covalente-
De los efectos electrostáticos resulta una repulsión si el sustrato y el soporte mente a soportes sólidos, a pesar de que son muy activas frente a sustratos
tienen la misma carga y una atracción si las cargas son opuestas. Cuando pequeños, muestran una actividad muy baja hacia proteínas, polisacáridos
el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de Km' aparente y ácidos nucleicos. Este "efecto estérico" se puede evitar mediante una
puede verse reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en diso- inmovilización covalente a través de un brazo espaciador enzima-soporte
lución. Hornby y cols. desarrollaron una expresión matemática que permite más largo.
calcular la actividad de las enzimas inmovilizadas, teniendo en cuenta tanto
los factores de difusión como los electrostáticos. La expresión de Michaelis- Efectos en el microentorno
Menten en este caso es:
La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual,
especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados eléctrica mente. El
Vmax[S]
(86) efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH óptimo de
V = K~ +[S]
la catálisis enzimática y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo
xV max RT de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una enzima unida a
donde: K~ = (K m + D )RT _ xzFV un soporte cargado negativamente (v.g. CM-sephadex) tendrá en su mi-
croentorno una concentración mayor de hidrogeniones que en el medio de todos más sencillos como el atrapamiento o la adsorción, donde la unión
reacción. Como resultado, la enzima inmovilizada será más activa a un pH de la enzima con el soporte es débil, originan derivados inmovilizados que
más alcalino. La enzima sería más activa a pH más ácidos si estuviera unida presentan pérdidas de actividad y que deben ser repuestos continuamente.
a un soporte cargado positivamente (v.g. DEAE-sephadex). Una vez elegido el método más conveniente, los derivados que prepare-
mos deben estar caracterizados según las indicaciones establecidas por
el Working Party on Immobilized Biocatalysts (1983) Guidelines for the
4. Elección del método de inmovilización
characterization of immobilized biocatalysts. Enzyme Microb. Technol. 5:
304-307 (Tabla 6).
Aunque se han desarrollado y aplicado muchas técnicas de inmovilización
a numerosos enzimas, se reconoce que no existe un método universal váli- Tabla 6. Caracterización de un derivado inmovilizado
do para todas las enzimas en todos los casos. No obstante, gracias a toda la
información disponible en la actualidad, se pueden hacer generalizaciones
sobre cada método de inmovilización (Tabla 5) y así, podremos seleccionar
el más adecuado para cada aplicación específica. La elección ha de tener en
cuenta las condiciones de la reacción biocatalizada, el tipo de reactor que Estabilidad
Esquema de Condiciones de Configuración del
se vaya a utilizar, el tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros de la enzima
reacción reacción biocatalizador
factores. almacenada
Tabla 5. Comparación de los diferentes métodos de inmovilización Enzimas a Rendimiento en Grado de Estabilidad
insolubilizar peso seco hinchamiento operacional
Tipo de Actividad Grado de Posibilidad

soporte residual del compresibilidad de
Preparación Intermedia Difícil Intermedia I Sencilla I Difícil empleado sobrenadante en columna reutilización
Fuerza de
unión
Débil Media
Débil-
Media
I Media I Fuerte
Método de I Abrasión en
Actividad
Media-Alta Baja Baja I Media I Alta
inmovilización I sistemas de
agitación
Grado de
conversión
enzimática
-
Regeneración
soporte
Posible I Imposible I Imposible I Posible I Dificil Velocidad minima
de f1uidización
I Limitaciones
difusiónales
Coste Medio-
proceso Alto
Medio I Medio I Bajo I Alto
Estabilidad General General Limitada General Limitada
Resistencia
Si Si Si No No
microbiana
En general, los métodos de preparación difícil y de mayor coste propor-

cionan biocatalizadores más estables y duraderos; en cambio aquellos mé-
88 Enzimas y cinetica enzimatica Biosensores 89
naturaleza del elemento de reconocimiento, el tipo de interacción entre
el elemento de reconocimiento y el analito, el método de detección de la
interacción y el sistema de transducción, como se demuestra en la Fig.47.
Capitulo 8
Biosensores
1. Aspectos generales
Un biosensor es un dispositivo compacto

de análisis que incorpora un elemento de sensores biocatatiticos I
reconocimiento biológico asociado a un
sistema de transducción que convierte la
señal producida por la interacción entre
+ Método de detección de la interacción
el elemento de detección y el analito, en
electrónica (Fig. 46).
++ + directo indirecto
El principio de detección de un biosensor
se basa en la interacción específica entre
el compuesto de interés y el elemento Sistema de transducción
de reconocimiento. En consecuencia de
esta unión se produce la variación de una
o varias propiedades físico-químicas (pH,
transferencia de calor, cambio de poten-
cial, de masa, variación de las propiedades
ópticas, etc.) que detecta el transductor. ,:Y: '{ i
Fig. 47. Clasificación de los biosensores en función de varios criterios
El transductor transforma la respuesta
del elemento de reconocimiento en una ' • '
El elemento de reconocimiento biológico proporciona la selectividad y
señal electrónica. Esta señal es indicativa
especificidad del biosensor. Su elección depende de las características del
de la presencia del analito sometido a es-
compuesto a analizar. Los bioreceptores mas empleados son las enzimas.
tudio o proporcional a su concentración
Procesador
en la muestra. Las enzimas pueden ser extraídas de una o más fuentes biológicas in situ
para aplicaciones específicas. Pueden usarse solas o con sus cofactores.
Los biosensores se pueden clasificar
Fig. 46. Biosensor Las enzimas comerciales se reproduces por lotes, tienen tiempo de vida y
de múltiples maneras en función de: la
características conocidas y disponibilidad inmediata. Las desventajas de las
Biosensores 91
enzimas purificadas son que no son siempre estables y necesitan a veces la aplicación y la capacidad de monitorización continúa. Estos dispositivos
presencia de sus cofactores para operar en forma propia. Además, su precio además presentan otras características interesantes: su capacidad de inclu-
es alto. sión en sistemas integrados, su facilidad de automatización, su capacidad
de trabajar en tiempo real y su versatilidad, entre otras.
Los transductores más empleados en el desarrollo de los biosensores son
los electroquímicos (potenciométricos, amperométricos y conductimétri- El primer biosensor descrito fue desarrollado por Clark y Lyon en 1962.
cos), termo métricos, ópticos y piezoeléctricos (Fig. 47). Se trataba de un sensor enzimático que determinaba la concentración de
glucosa en sangre.
Los transductores electroquímicos son más robustos y su fabricación es
más simple y económica que la del resto de transductores. Poseen un am- La gran diversidad de dispositivos que existen en la actualidad, con las
plio rango de linealidad y tiempos de respuesta muy cortos. Los equipos diferentes combinaciones entre los distintos elementos que los componen,
necesarios para procesar la señal son económicos, de fácil mantenimiento, permite un diseño a la carta de biosensores que cubre desde el punto de
manejo y miniaturización y son de uso común en la mayoría de los labora- vista técnico la práctica totalidad de las necesidades.
torios analíticos.
Sin embargo, es importante señalar que estos dispositivos no suponen
Los transductores amperométricos se basan en la proporcionalidad exis- una sustitución de las tecnologías analíticas convencionales (diferentes
tente entre la concentración de una especie electroactiva determinada y la cromatografías, por ejemplo) que permiten analizar amplios espectros de
corriente eléctrica registrada a oxidarse o reducirse sobre la superficie de compuestos, sino que representan alternativas interesantes para la detec-
un electrodo polarizado. ción y/o cuantificación de uno o unos pocos analitos, como respuesta a
problemas concretos.
Las medidas potenciométricas consisten en la determinación de una dife-
rencia de potencial en condiciones de circuito abierto entre un electrodo
de trabajo y uno de referencia. La diferencia de potencial se relaciona con la 2. Sensores enzimáticos
concentración del analito de acuerdo con la ecuación de Nernst.
Un biosensor enzimático es la combinación de un transductor y una capa
Los transductores conductimétricos se basan en la medida de cambios de
delgada enzimática, que se usa normalmente para medir la concentración
conductividad provocados por el analito.
de un sustrato. (Fig. 48). La reacción enzimática transforma el sustrato en un
Los transductores termometritos (termistores o termocuplas) miden la con- producto de reacción que el transductor puede detectar. La concentración
centración de un sustrato usando la variación de entalpía de una reacción de una sustancia se mide según cómo afecte su presencia a la velocidad de
enzimática. reacción enzimática.
Los transductores ópticos se basan en la medición de la variación de las

propiedades ópticas de un medio o un receptor inmovilizado.
Los transductores piezoeléctricos miden la variación de la masa depositada

difusión
en la superficie de un cristal piezoeléctrico, detectando la variación en la
frecuencia de resonancia del cristal.
Entre las ventajas que aporta un biosensor cabe destacar su especificidad,

s difusión y convección
su alta sensibilidad, su rápida velocidad de respuesta, simplicidad en la
Fig. 48. Transferencia de masa a través de la capa enzimática de un biosensor
La superficie sensible del transductor está en contacto con una capa peróxido de hidrógeno. Por ejemplo, la glucosa se oxida por la reacción
enzimática y se asume que no hay transferencia de masa a través de esta enzimática de la glucosa oxidasa (GOD)según:
interfase. La superficie externa de la capa enzimática está inmersa en una
solución que contiene el sustrato bajo estudio. El sustrato migra hacia el qlucosa-O, 1-1 () ) acido gluconico+H202 (87)
2
interior de la capa y se convierte en productos de reacción cuando reac-
ciona con la enzima inmovilizada. Para alcanzar un rápido equilibrio de
concentración, la membrana enzimática debe ser tan delgada como sea Tanto el 02 como sustrato y HP2 como producto pueden ser detectados
por vía electroquímica. El electrodo de glucosa consiste de un electrodo
posible. La solución debe agitarse para asegurar un suministro constante
de sustrato. En resumen, los diferentes pasos son: polarográfico con una capa de GOD inmovilizada cubierta por una mem-
brana permeable a glucosa, como se muestra en la Fig.49. Laconcentración
transporte del sustrato desde el seno de la solución hacia la capa de glucosa se mide por el cambio de la corriente del electrodo de oxígeno o
enzimática; del electrodo de peróxido.
difusión del sustrato en esta capa, acompañado por la transforma-
ción enzimática del sustrato en productos de reacción;
migración del producto hacia el transductor; Solución de KCI
Pt A
conversión de la concentración del producto en esta superficie en
una señal eléctrica por el transductor. Membrana permeable al O2
Los biosensores basados en enzimas pueden formarse usando principios

de transducción electroquímicos, ópticos, térmicos o gravimétricos. Los
basados en principios electroquímicos se denominan electrodos de enzima
glucosa
y miden la formación de un producto o el consumo de un sustrato, si el
producto o sustrato es electroactivo.
Fig.49. Electrodo de glucosa
El principio amperométrico se ha usado extensamente en electrodos de
enzima en los cuales se mide el consumo de oxígeno o la formación de
Los electrodos de enzima también se forman por electrodos ión selectivos
peróxido de hidrógeno. Por ejemplo, la glucosa se oxida por la reacción
(lSE) y transistores de efecto de campo de ión selectivo (lSFET),ambos
enzimática de la glucosa oxidasa (GOD)según:
basados en el principio potenciométrico. Consisten en un ISEo ISFETcu-
Los biosensores basados en enzimas pueden formarse usando principios biertos por una capa de enzima inmovilizada y una membrana protectora.
de transducción electroquímicos, ópticos, térmicos o gravimétricos. Los En los electrodos de enzima potenciométricos, se mide el producto de las
basados en principios electroquímicos se denominan electrodos de enzima reacciones enzimáticas. Por ejemplo, la hidrolización de urea es catalizada
y miden la formación de un producto o el consumo de un sustrato, si el por la ureasa:
producto o sustrato es electroactivo.
+ ureasa _
Urea+2H20+H )2NHt +HC03 (88)
El principio amperométrico se ha usado extensamente en electrodos de
enzima en los cuales se mide el consumo de oxígeno o la formación de
NH;+OH- ~ NH3+H20 (89)
Según estas reacciones la urea puede medirse a través de un electrodo de las industrias que demandan la tecnología de sensores: farmacéuticas y de
NH3. También hay otros electrodos potencio métricos para medir aminoá- productos biomédicos, medioambiente, agroalimentación, bioprocesado,
cidos, penicilina, etc. automoción, ejército defensa (militar), etc.
El principio termométrico también se utiliza para mediciones en algunos

electrodos de enzima debido a que las reacciones enzimáticas siempre Aplicaciones médicas
producen calor en un rango de 20 a 100 kJ mol-l. La cantidad de sustancia
puede estimarse del calor producido. Inyectando una muestra estabilizada El biosensor para la determinación de glucosa en sangre es, posiblemente,
a una temperatura en una pequeña columna con enzimas inmovilizadas el más estudiado y comercializado dentro de la industria biomédica. La
con una velocidad de flujo constante, puede medirse el calor producido diabetes es una enfermedad extendida a nivel mundial y el control de los
como la diferencia entre las terminales de entrada y salida de la columna. niveles de glucosa en sangre mediante un método rápido y sencillo es vital.
Las sustancias típicas que se analizan por principios termométricos son eta-
En 1975 la impresa YSI comercializa el primer biosensor para la determina-
nol, glucosa, lactato, ácido oxálico, penicilina, sucrosa, y urea. Un termistor
ción de glucosa en sangre.
recubierto con una enzima inmovilizada puede ser un biosensor simple y se
llama termistor unido a enzima. A lo largo de los años ochenta, con la introducción de tecnologías de mi-
niaturización y producción en masa, la comercialización de los biosensores
La mayoría de los biosensores usados en medicina son biosensores de
para la determinación de glucosa aumento de forma considerable. A finales
enzima debido a su especificidad, fácil implementación, y por la disponibi-
de esta década se comercializaron los primeros electrodos desechables
lidad comercial de enzimas y su correspondiente transductor. El uso in vivo
para este análisis (Fig. 50).
requiere la resolución de problemas de biocompatibilidad, especialmente
aquellos referidos al depósito de fibrina y plaquetas en la membrana enzi-
mática.
Electrodo de referencia Electrodo de trabajo de carbón 1
de Ag I AgCI recubjertc con qlucoxidesa y mediador
...•.•• r
Entre las aplicaciones se encuentra el sensor de GOD para determinar
glucosa en sangre y orina para el diagnóstico de diabetes. Otros biosen-
J: S c~ ¡ I ¡l~:::~~·.qUi
sores también son capaces de medir metabolitos en un medio biológico.
Los electrodos de urea y creatinina pueden controlar funciones renales; el
Electrodo de trabajo de carbón 2 recubierto Malla hidrófila pOI la qua SR
electrodo de colesterol se usa para la detección y prevención de arterioscle- b) de mediador pero sin enzima difundo h sangre a los electrodos
rosis; el electrodo de acetilcolina puede monitorear los neurotransmisores

relacionados a la transmisión química en la sinapsis; y el electrodo de Fig. 50. Medidor personal de glucosa
lactato puede evaluar esfuerzo muscular.
En los últimos años, el desarrollo de estos dispositivos se ha dirigido hacia
las medidas in vivo, mediante implantes subcutáneos que el mismo pacien-
3. Aplicaciones de los biosensores
te puede reemplazar.
La tecnología de los biosensores ha experimentado un gran avance en los Basándose en la misma tecnología desarrollada para el biosensor de gluco-
últimos años. Esta tecnología, muy desarrollada en áreas como la biome- sa, se han desarrollado dispositivos para la determinación de otros analitos
dicina, ha ido transfiriéndose a otros sectores como el medioambiental y (Tabla 7).
de forma más incipiente al agroalimentario. En la actualidad son diversas
Tabla 7. Biosensores comercializados por una determinada fábrica, permitiendo la toma rápida de decisiones
correctivas. También permiten detectar, en suelos yaguas, la presencia de
contaminantes orgánicos, compuestos orgánicos persistentes (plaguicidas,
bifenilos policlorados, hidrocarburos policíclicos aromáticos, entre otros),
Yellow Springs Inst. glucosa, lactato, etanol, lactosa
metales pesados, compuestos genotóxicos y disruptores endocrinos.
Medi Sense glucosa
Bioanalytical Systems H_O_,glucosa, lactato, colina
Via Medical glucosa
Aplicaciones en la industria alimentaria
Bayer (Matsushita) glucosa
En el agroalimentario, la aplicación de los biosensores se realiza principal-
mente en tres campos:
Aplicaciones medioambientales
en la calidad alimentaría (análisis de la composición de los alimen-
tos-contenido en azúcares,aminoácidos, colesterol, vitaminas, etc.,
La importancia de la calidad medioambiental es un hecho incuestio-
evaluación de la frescura y la vida útil y análisis de compuestos
nable en la actualidad, y por ello es necesaria una rápida medición de la
aromáticos);
posible contaminación para mantener un control del medio ambiente.
Aquí es donde juegan un importante papel los biosensores. En el ámbito en la seguridad alimentaría (detección de compuestos químicos
medioambiental, algunas de las principales sustancias contaminantes que nocivos -pesticidas, fármacos, metales pesados, dioxina; alérgenos;
son posibles detectar in situ por estos sistemas son metales pesados, bi- anti-nutrientes; microorganismos patógenos y toxinas);
fenilos policlorados, organofosforados, fenoles, hidrocarburos aromáticos
en el control de procesos industriales (control de azúcares en los
policíclicos y plaguicidas.
procesos de fermentación y pasteurización, para los alcoholes en
En los últimos 10 años los biosensores han sido integrados a los programas la fermentación alcohólica, el ácido láctico en la elaboración de
de control de contaminantes, implementándolos en sistemas de seguridad quesos, etc.).
ambiental en dos formas:
Dentro de la industria agroalimentaria es deseable que los biosensores
métodos de seguimiento capaces de predecir el posible peligro cuenten con las siguientes características: alta sensibilidad, incluso a con-
de efectos biológicos, como toxicidad, pudiendo medir una gran centraciones ppb, alta selectividad, alta fiabilidad, tiempo de vida largo,
cantidad de contaminantes en cortos períodos de tiempo; bajo coste, tiempo de análisis corto que posibilite una actuación rápida en
caso de detectar problemas, pretratamiento de la muestra innecesario, ma-
métodos de cribado (screening) que sirven para detectar la presen-
nejo sencillo, análisis en tiempo real (esta característica es importante en
cia de algún compuesto contaminante.
el control de procesos), requerimientos operativos mínimos, capacidad de
Entre sus principales aplicaciones se encuentra la detección de la demanda multi-análisis, versatilidad que permite el diseño de dispositivos a la carta.
bioquímica de oxígeno (DBO), parámetro de gran importancia en el cam- Además, deben ser portátiles (realización de análisis in situ), automatizables
po del tratamiento de aguas residuales. Con la tecnología convencional, (facilita su integración dentro de sistemas de monitorización de procesos
esta prueba requiere alrededor de cinco días, mientras que con el uso industriales) y miniaturizables.
de biosensores los resultados se obtienen en 20 minutos. Así mismo se
Los productos comercializados en el campo de la agroalimentación son to-
pueden usar biosensores ambientales conectados a sistemas de alarma,
davía escasos.Las principales barreras técnicas para la comercialización de
que alerten, de manera inmediata, el exceso de contaminantes emitidos
sensores químicos y biosensores provienen de la dificultad de integración
total del sistema sensor, colocación y unión adecuadas del componente
receptor del microdispositivo, ubicación reproducible de cantidades de
nanolitros de los componentes del receptor en microdispositivo, estabili-
zación y almacenamiento de sensores bajo diversas condiciones, mejora Apéndice 1
en la transferencia de electrones para eliminar el efecto de contaminantes
y desarrollo de métodos para producir sensores baratos, fiables y de alta
sensibilidad.
Problemas
1. La Km de una hexoquinasa para la glucosa es 10-4M. Si la concentración

de glucosa en el medio de reacción es 1.8 I-Ig rnl', cuál será la velocidad
de transformación de la glucosa expresada en función de la Vmax' El peso
molecular de la glucosa es 180.
2. Calcular qué velocidad se obtendrá en una reacción enzimática si la

velocidad máxima es igual a 100 Y la concentración de sustrato es a) 10 Km
b)K m13.
3. Qué información puede obtenerse a partir de una representación de

Lineweaver-Burk cuando la recta obtenida, extrapolada convenientemente
corta al eje OX en -40 (mol/l)'.
4. Calcular la Km y la Vmax a partir de una representación de dobles inversos

sabiendo que la recta obtenida corta al eje de ordenada en 5x103 (moles
rnin') y la pendiente de dicha recta es 120 min L',
5. En el siguiente experimento con la enzima fosfatasa ácida de semillas de

trigo germinadas se varió la concentración de la enzima a dos concentra-
ciones de sustrato y se obtuvieron los resultados siguientes:
a) ¿Como varia la velocidad de la reacción en función de la cantidad de

enzima añadida?
[E],
5
IlL -'-
V, (nmol min')
1.920
••• J
V, (nmol mín')
6.307
10 4.059 13.169
15 5.956 19.145
20 7.766 25.694
25 9.479 32.282
30 11.844 37.882
100 Enzimas y cinetica enzimatica Apéndice 1 Problemas 101
b) ¿Qué pasa si dividimos la velocidad registrada por la cantidad de Suponiendo que la concentración de peróxido de hidrógeno fue suficiente
enzima añadida al ensayo? para garantizar la saturación de la enzima, calcular la energía de activación
de la reacción con o sin enzima y discuta sus resultados. (R=1.987 cal rnol'
c) ¿Utilizando la ecuación de Michaelis-Menten explique sus respuestas
KI)
a las preguntas anteriores?
8. Se realizaron estudios de inhibición para dos enzimas diferentes presen-
6. La actividad de la acetil carboxilasa, medida con tres diferentes con-
tes en el suero bovino. Se varió la concentración de sustrato a en ausencia
centraciones de enzima y a diferentes concentraciones de sustrato fue la
y en presencia de tres concentraciones diferentes de inhibidores de cada
siguiente:
enzima. En cada caso encontrar:
a) El tipo de inhibición.
[S] (J..lM) I
0.1 I 0.2 I b) El valor de Km y Vmax•
v [umol rnin')
0.05 0.275 0.546 1.373 c) El valor de K¡ para el inhibidor.
0.14 0.482 1.001 2.502 Enzima: fosfatasa alcalina de suero bovino; inhibidor: oxalato de bromole-
0.23 0.580 1.185 2.891 vamisol
0.32 0.642 1.385 3.463
0.50 0.755 1.494 3.656
0.59 0.766 1.497 3.810
[S],mM
o
a) Calcular para cada experimento el valor de Km y el valor de Vmax•
Velocidades iniciales, urnln+mq Prot:'
b) ¿Son los valores de Km y Vmax iguales o diferentes? Explique. 0.231 I 0.210 I 0.191 I 0.158
0.1
c) Sabiendo que el peso molecular de la enzima es 220 000, haga una 0.3 0.431 I 0.369 I 0.309 I 0.239
gráfica de Vmax vs. urnol de enzima. Explique los resultados. 0.7 0.607 I 0.488 I 0.425 I 0.277
7. Para la enzima catalasa se realizó un experimento en el que se determinó 1.3 0.751 I 0.599 I 0.467 I 0.304
la velocidad de descomposición del peróxido de hidrógeno en ausencia ó 0.811 I 0.657 I 0.530 I 0.319
1.8
en presencia de 10 nM de enzima y temperaturas diferentes.
2.6 0.912 I 0.657 I 0.546 I 0.328
4.1 0.957 I 0.688 I 0.561 I 0.351
4 0.40E-08 0.0410 5.8 0.981 I 0.741 I 0.558 I 0.344
10 7.74E-09 0.0464
15 1.31 E-08 0.0476
20 2.09E-08 0.0497
25 3.52E-08 0.0530
30 5.74E-08 0.0598
b) El tiempo de residencia en un reactor continúo operando en estado
Enzima: alanina aminotransferasa;inhibidor: acido malico
estacionario para obtener el mismo grado de conversión con las mismas
concentraciones de enzima en el medio y lactosa en la alimentación.
11. ElViejo Pascuero descubrió otra enzima, que llamó tnavldasa" La navida-
[S],mM I 0.0 I 1.0 I 2.0 ~ sa permite convertir la renosa (complejo azúcar de la leche de reno) en un
Velocidades iniciales, Ilmin-lmg Prot." azúcar fermentable, pero se inhibe competitivamente con un compuesto
0.6 I 0.59 I 0.48 I 0.38 I 0.24 presente (1 mM, K¡ = 0.1 mM) en esta leche. Si la concentración inicial de
1
renosa es de 10 mM, con parámetros k2=0.6 mmol mg- mln' y Km=0.5 mM.
1.4 I 1.12 I 0.91 I 0.78 I 0.51
Determine:
2.9 I 1.63 I 1.43 I 1.19 I 0.87
a) El tiempo de reacción en operación batch en un reactor perfectamen-
5.2 I 1.94 I 1.70 I 1.64 I 1.19
te agitado si se necesita una conversión del 90% de la renosa, para una
8.0 I 2.19 I 1.94 I 1.94 I 1.56 concentración
1
de navidasa de 80 mg mL- •
10.3 I 2.28 I 2.06 I 1.99 I 1.74
b) El tiempo de residencia en un reactor continúo operando en estado
16.0 I 2.32 I 2.33 I 2.24 I 1.89 estacionario para obtener el mismo grado de conversión con las mismas
25.1 I 2.62 I 2.53 I 2.25 I 2.09 concentraciones de enzima y lactosa.
12. La cinética de conversión de lactosa por ~-galactosidasa se puede asumir

9. La cinética de conversión de lactosa por ~-galactosidasa se puede asumir sigue la cinética de Michaelis-Menten, con parámetros k2=0.6 mmol rng" enz
sigue la cinética de Michaelis-Menten, con parámetros k; = 0.6 mmol rnq' min" K =0.5 mM. La concentración de lactosa en la alimentación es de 10
m
=
enz min' y Km 0.5 mM. Si la concentración de lactosa en la alimentación mM. El compuesto B, presente en el preparado en una concentración de 1
es de 10 mM, calcule: mM, es un inhibidor no competitivo. K¡ = 0.05 mM.
a) El tiempo de reacción en operación batch en un reactor perfectamen- a) Determinar el tiempo de reacción en operación batch en un reactor
te agitado si se necesita una conversión del 95% de lactosa para una perfectamente agitado si se necesita una conversión del 85% de la lac-
1
concentración de enzima de 75 mg mL-1• tosa para una concentración de enzima de 75 mg mL- •
b) El tiempo de residencia en un reactor continuo para el mismo grado b) Determinar el tiempo de residencia en un reactor continuo para
de conversión con las mismas concentraciones de enzima y lactosa. igual grado de conversión con las mismas concentraciones iniciales de
enzima y lactosa.
10. El Viejo Pascuero ha descubierto una nueva enzima que, por razones
propias, denominó "pascualasa" La pascualasa permite convertir la renosa
(complejo azúcar de la leche de reno) en un azúcar fermentable. Lamenta-
blemente, esta curiosa enzima sufre de inhibición por sustrato (KS¡ =0.05
mM). Si la concentración inicial de renosa es de 10 mM, con parámetros
k2=0.6 mmol rnq" rnin' y Km=0.5 mM. Determine:
a) El tiempo de reacción en operación batch en un reactor perfectamen-
te agitado si se necesita convertir el 80% de la renosa presente, para una
concentración de pascualasa de 30 mg mí.'.
104 Enzimas y cinetica enzimatica Apéndice 2 Trabajos prácticos 105
se decanta el sobrenadante el cual contiene la enzima;
se repite el procedimiento para cada fruta e se identifica el extracto

en cada caso.
Apéndice 2
Para la evaluación de la actividad de la polifenol oxidasa se utiliza el méto-
do espectrofotométrico. A la celda espectrofotométrica se añaden 40 ~I del
sustrato catecol 0.06M, 100 ~I del sobrenadante (enzima) y 1 mi del buffer
Trabajos prácticos fosfato. Se agita rápidamente y se mide la absorbancia a 420 nm por tres
minutos a intervalos de 30 seg. Se repite el procedimiento para cada uno de
los extractos y se anotan los resultados. Se grafica el cambio de absorbancia
Extracción de polifenol oxidasa y determinación de su contra el tiempo. Una vez obtenida la absorbancia por minuto, se evalúa la
actividad " actividad enzimática.
Las polifenol oxidasas (PPO) son enzimas que se encuentran ampliamente Cinética de la reacción de hidrólisis enzimática de la urea
distribuidas en plantas y hongos. Catalizan la reacción dependiente de
oxigeno que transforma o-difenoles en o-quinonas. Las quinonas son muy La ureasa es una enzima que participa en el proceso de hidrólisis de la
reactivas y capaces de modificar un amplio abanico de especies del interior urea adicionada al suelo o nativa. Es un factor crítico en la regulación de
de las células que conduce a la formación de polímeros marrones o negros nitrógeno en el ecosistema forestal, debido a que existe una correlación
responsables de importantes pérdidas económicas en el mercado de frutas significativa entre el nitrógeno de biomasa microbiana con el nitrógeno
y vegetales. Esta es la razón fundamental por la que el contenido en fenoles mineralizable y la actividad ureasa. La principal función de esta enzima es
y la actividad polifenol oxidasa se consideran determinantes en la calidad actuar sobre enlaces C-N, en enlaces no peptídicos y en amidas lineales,
de frutos y vegetales. rompiendo dicho enlace en secuencias de dos, donde el carbamato es el
compuesto intermedio en la reacción, de manera que éste es el sustrato
El objetivo de este trabajo es: extraer polifenol oxidasa de diversos produc-
obligado para el segundo paso de la reacción hidrolítica total:
tos vegetales y evaluar su actividad.
Los materiales y reactivos incluyen: frutas (plátanos, manzanas, papas, NH2CONH2+ H20 ~ NH2COOH + NH3 ~ NH2COONH4+Hp ~ H2C03+ 2NH3
naranjas), buffer fosfato pH 6.5, solución de catecol 0.06 M, micropipetas,
En esta práctica trataremos la cinética de la reacción de hidrólisis enzimáti-
vasos de precipitado, celdas espectrofotométricas, espectrofotómetro,
ca de la urea (NH2CONH2) en disolución acuosa empleando como enzima la
tubos graduados para centrifuga, centrifuga.
ureasa. La medida de la velocidad de hidrólisis se hará a través de la medida
El procedimiento de extracción de la polifenol oxidasa se efectúa de la de conductividades de distintas disoluciones con distintas concentraciones
siguiente manera: de sustrato en diferentes tiempos. El objetivo final de la práctica es hallar
la constante de Michaelis-Menten Km y la velocidad máxima Vmax de la
se toma una porción de la fruta (1/2), colocándola en un extractor
reacción enzimática aplicando varios métodos gráficos (de Linweaver-Burk,
y se extrae el jugo;
Eadie-Hofstee, Hanes-Woolf y Eisenthal y Cornish-Bowden).
en un tubo graduado para centrífuga se agregan 3 mi del extracto
y 1 mi del buffer fosfato y se centrifugan 10 min;
Los materiales y reactivos necesarios son: frijoles macerados durante la valores de la constante de Michaelis-Menten Km y de la velocidad máxima
noche, etanol 30% v/v, urea, mortero, centrífuga, tubos graduados para Vmax de la reacción enzimática.
centrifuga, conductímetro, balanza analítica.
El procedimiento incluye: Determinación volumétrica de la actividad de las lipasas

Extracción de la enzima Cerca del20 % de las plantas contienen grasas en las semillas como principal
El extracto que contenga la ureasa se puede obtener de una serie de legumi- sustancia de reserva. Entre estas se encuentran el girasol, maní, palmiche,
nosas, las recomendadas son: frijol, habas, habichuela y frijol soya. Remojar soja, en las cuales puede acumularse del 20 al 60 % del peso seco. Para su
el material vegetal (frijoles) en agua, por lo menos 1 hora. Colocarlo en un utilización como fuente de energía, los mismos deben experimentar hidró-
mortero y macerar. Transferir S mi de la mezcla en un tubo y agregar S mi llsls por acción de las lipasas presentes en las semillas por cuya acción se
de etanol al 30 % (v/v). Centrifugar a 2500 rpm por 1S mino El sobrenadante convierten en ácidos grasos y glicerol, siendo su pH óptimo entre 4.7 y 5.0.
contiene la enzima ureasa.
H20 )
Preparación de las disoluciones del sustrato triacilglicérido ácido graso + glicerol
lipasa
Disolución 1: 0,4 g urea + 100 mi de agua destilada

Disolución 2: SO mi Disolución 1 + SO mi agua destilada El objetivo de este trabajo es: determinar la actividad de las lipasas por
Disolución 3: SO mi Disolución 2 + SO mi agua destilada valoración con NaOH de los ácidos grasos producidos.
Disolución 4: SO mi Disolución 3 + SO mi agua destilada Materiales y reactivos: semillas de girasol, higuereta, maní o soja, CH3COOH
0.1 M, etanol, NaOH 0.1 M, fenolftaleina, cristalería.
Disolución S: SO mi Disolución 4 + SO mi agua destilada
Disponga de dos frascos Erlenmeyer numerados e introduzca en cada uno 3
Disolución 6: SO mi Disolución S + SO mi agua destilada g de semillas oleaginosas desprovistas de sus cubiertas y trituradas. Añada
Medición de la velocidad de la reacción enzimática a cada uno 10 mi de agua destilada. En el frasco 1 añada 2 mi de CH3COOH
0.1 mol/L. En el frasco 2 hierva su contenido durante S minutos y luego
Medir la conductividad de cada una de las disoluciones del sustrato ponien- agregue 2 mi de CH3COOH. Tape y coloque en un termostato a 35 - 37°C
do SO mL en un vaso de precipitados + 250 m de ureasa (el sobrenadante) hasta el día siguiente. Al día siguiente añada a cada frasco 10 mi de etanol
e introduciendo la celda de conductividad. Anotar los valores de conducti- para eliminar la disociación hidrolítica del jabón que se forma durante la
vidad cada 30 segundos durante S minutos. valoración. Valore con NaOH 0.1 M los ácidos grasos producidos en los dos
frascos por acción de las lipasas. Anote el volumen gastado en cada caso y
La velocidad media de hidrólisis se determinará entre 100 s Y 200 s después
analice lo ocurrido.
de empezar la reacción calculando la diferencia de los valores de conducti-
vidad en esos tiempos para cada disolución y dividiendo por 100 s. La actividad lipolítica se determina de acuerdo a las umoles de sustrato
convertido por min:
Los resultados se grafican en coordenadas de Lineweaver-Burk, Eadie-
Hofstee, Hanes-Woolf y Eisenthal y Cornish-Bowden. Se determinan los 1000(V¡ - V2 )C
UI
r
Procedimiento:
Determinación de actividad a-amilásica en miel Incubar 1 ml de sustrato atemperado a 37°(, con 400 ul, de muestra en
baño de agua a 37°C. Realizar paralelamente un control. A los 7 min y medio
la actividad diastásica de la miel ha recibido considerable atención por exactos, se agrega 1 ml de reactivo de iodo. Se mezcla por agitación suave
años como indicador de "frescura': El tratamiento térmico (63°C/30 mino o y se retiran los tubos del baño. Inmediatamente se agregan 8 ml de agua
77°C/pocos seg), ha sido rutinariamente usado para destruir levaduras y destilada. luego se mezcla por inversión.
retardar la granulación en mieles. El Codex Alimentarius y el (AA exigen
Medir a 640nm, dentro de 1h. Si la temperatura ambiente es superior a
valores mínimos de diastasa como control de la exposición de la miel al
25°(, leer antes de los 20 mino Ajustar el cero del espectrofotómetro con
calentamiento.
agua destilada.
Tratamiento térmico de las muestras:
Esquemáticamente:
Sobre aprox. 2 g de miel se realizarán los siguientes tratamientos térmicos:
63°( a O, 15,30,45 Y 60 mino sustrato (ml)

85°( a O, 10, 15,30 Y 45 mino baño de aaua a 37°( x unos minutos
muestra (ul) I 400
luego del calentamiento, enfriar las muestras en baño de hielo. Pesar aprox.
aaua destilada (ul) I- I 400
1g de muestra y diluir a 10 ml con agua destilada. Realizar las determina-
incubar a 37°( x 7 min 30 sea exactos
ciones de actividad enzimática por duplicado.
iodo (ml)
Medición de la actividad enzimática: mezclar x aaitación suave v retirar del baño
El sustrato, almidón tamponado, al ser incubado con la muestra se hidroliza

aaua destilada (ml) I8 I8
mezclar x inversión
enzimáticamente. Esta se detiene por el agregado de reactivo de iodo, que
al mismo tiempo produce color con el remanente de almidón no hidroli- leer A (640 nm)
zado. la disminución de color respecto de un sustrato color (sin muestra)
es la medida de la actividad enzimática, que se expresa en UA (unidad
amilolítica: la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que Desarrollo de un biosensor amperométrico para la
puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 min): cuantificación de Hg2+
Reactivos:
la atención inadecuada al control de la contaminación conduce a una
Solución de sustrato: solución de almidón 500 mg L-¡, tamponada a degradación ambiental significativa, debida entre otras, a la contaminación
pH 7 con buffer fosfatos 0.1 mol L"l en NaCl 0.15 mol L-¡. Almacenar con metales pesados y pesticidas organofosforados. las herramientas
en heladera clásicas para la medición de estos compuestos (cromatografía de gases
con detector de flama, captura de electrones o espectro de masas, etc.) son
Reactivo de iodo: solución 0.01 eq l-¡ de 12 en ácido clorhídrico 0.02 costosos y consumidores de tiempo, inconvenientes para medidas expre-
mol L-¡. Almacenar en heladera.
sas, en campo y en línea. Además, requieren una mejora de la selectividad,
la precisión y la exactitud. Una alternativa a las técnicas convencionales
Apéndice 2 Trabajos prácticos 111
para la determinación de metales pesados y pesticidas la representan los Cuantificación de Hg2+
métodos electroquímicos basados en biosensores. A la solución restante en la celda electroquímica agregar 5 veces consecu-
Enesta práctica se contempla el desarrollo de un biosensor amperométrico tivamente 50 J..lLde la solución de HgCI2.Registrar cada vez la disminución
de la corriente de oxidación de la tíocolina a un potencial de +0.8 V/Ag, AgCI.
basado en acetilcolinesterasa para la cuantificación de Hg2+.
Resultados
Las reacciones involucradas son: hidrólisis de la acetiltiocolina a tíocolina,
catalizada por la acetilcolinesterasa inmovilizada (Ach): Losdatos obtenidos se utilizaran para:
a construcción de una curva de calibración de la acetiltiocolina;
(CH3)3 N+(CH2)2 SCOCH3 + H20 ~ (CH3)3 N+(CH2)2 SH + CH3COOH
la construcción de una curva de calibración de Hg2+.
y oxidación de la tíocolina a un potencial de +0.8 V/Ag, AgCl:
2( CH3)3 N+(CH2)2 SH ~ (CH3)3 W (CH2)2 S-S( CH2)2 W (CH3)3
La señal analítica que se registra amperométricamente es la corriente de

oxidación de la tíocolina, proporcional a su concentración. En presencia
de Hg2+,la concentración de la tíocolina producida disminuye, debido a la
inhibición de la actividad enzimática por los iones metálicos. Por lo tanto, la
corriente de oxidación de la tíocolina registrada disminuye con el aumento
de la concentración de Hg2+.
Materiales y reactivos: solución tampón Britton-Robinson pH 8, solución

de ioduro de acetiltiocolina 0.05 M, solución de HgCI2 0.005 M, solución
de acetilcolinesterasa 2.5 mg/ml, potenciostato, celda electroquímica,
electrodo de trabajo (disco de carbono), electrodo auxiliar de Pt, electrodo
de referencia de Ag, AgCI/CI-,micropipetas.
El procedimiento experimental incluye:

Modificación del electrodo de carbono por adsorción de la enzima:
Depositar 10 J..lLde la solución de la acetilcolinesterasa sobre la superfi-

cie del electrodo de trabajo. Dejar 30 mino Lavar el electrodo con agua
destilada.
Cuantificación de la acetilcolina
A 5 mL del tampón en la celda electroquímica se agregar 5 veces
consecutivamente 20 J..lLde la solución de la acetiltiocolina. Registrar
cada vez la corriente de oxidación de la tíocolina producida a un
potencial de +0.8 V/Ag, AgCl
Bibliografía
D. Voet, J. G. Voet, 2006. Bioquimica, 3a Ed. Medica Panamericana, Buenos

Aires.
P.Gacesa, J. Hubble, 1990. Tecnología de las enzimas. Acrlbla, Zaragoza.

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H. Christensen, G. Palmer, 1980. Cinética enzimática: curso programado para

estudiantes de medicina y ciencias biológicas. Reverté, Barcelona.
M. Bender, L. Brubacher, 1977. Catálisis y acción enzimática, Reverté, Barce-

lona

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m

Capitulo 1 Las enzimas 9

Capitulo 2 Fuentes de enzimas. Aplicaciones industriales,

Capitulo 3 Extracción y purificación de enzimas 27

Capitulo 4 Propiedades cinéticas de las enzimas 35

Capitulo S Factores que afectan a la velocidad de las reacciones

Capitulo 6 Aspectos de diseño

Capitulo 7 Inmovilización de las enzimas 73

Apéndice 2 Trabajos prácticos 104

Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteica. Las reacciones cata-

Antes del 1800: se utilizaron algunos procesos biológicos catalizados por

Entre 1800 y 1900: periodo de descubrimientos. Louis Pasteur llego a la con-

Las enzimas pueden actuar de diversas formas, siempre dando lugar a

mediante la creación de un ambiente en el cual el estado de tran-

Las coenzimas incluyen compuestos como el nicotinamida adenina dinu-

5. Clasificación y nomenclatura de las enzimas

El nombre de la enzima es derivado del nombre del sustrato o de la reacción

La Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular ha desarrollado

Tabla 1. Principales clases de enzimas

I:r<: I ;.~ ••.•~.~.~. I obtención de isómeros

2. Enzimas de origen animal

El uso de enzimas de origen animal es reducido por las siguientes razones

3. Enzimas de origen vegetal

Entre las enzimas de tipo vegetal se encuentran las siguientes:

papaina (CE 3.4.22.2) de papaya (Carica papaya);

bromelaína (CE 3.4.22.4) de piña (Ananas corosus);

proteasas de cardo (Cynara cardunculus);

alipoxigenasa (EC 1.13.11.12) de soja;

peroxidasa (CE 1.11.1.7) de rábano;

enzimas de cítricos con aplicaciones específicas.

Se observa un descenso en la utilización de enzimas de origen vegetal,

4. Enzimas de origen microbiano

Las enzimas del tipo microbiano provienen de bacterias, levaduras y hon-

las bacterias Thermoanaerobium spp., Bacillus subtilis, Bacillus Iiche-

5. Nuevas fuentes de enzimas

halofilos: se desarrollan en lagos salados y piscinas (Fig. 8).

Las enzimas producidas por organismos termófilos que se encuentran e

Fig. 8. Halobacterium. Se encuentra en el Mar Muerto

6. Aplicaciones industriales de las enzimas

d"'~:%"", ~ ,"e"t' as,12% 5%

Las proteasas eliminan la turbidez producida durante el almacenamiento

Las lipasas se utilizan para facilitar la eliminación de tintes grasos y oleosos.

Industria del papel Aplicación de las enzimas en análisis clínicos

El fundamento de esta forma de terapia es simplemente la administració Aplicaciones farmacéuticas

26 Enzimas y cinetica enzimatica Extracción y purificación de enzimas 27

1. Extracción de las enzimas

Los microorganismos producen una enorme gama de enzimas, muchas

Para la obtención de enzimas intracelulares se aplican los siguientes méto-

¡ti Destrucción mecánica

ntre estos métodos (Fig. 10) se encuentran la homogenización (hacer pasar

La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de tempe-

Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta

El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que Precipitación fraccionada

Extracción y purificación de enzimas 31

Existen distintos tipos de cromatogra-

Se trata de un método similar al Leyenda: Métodos electroforéticos

Propiedades cinéticas de las enzimas

Enzima + Sustrato ~ Complejo -7 Enzima + Producto (1)

E+S P ES ~E+P (2)

aceptando la hipótesis del estado estacionario, es:

d[!S] =k¡[E][S]-(k_¡ +k2)[ES]=O (4)

Por lo tanto, [E] = [Eo]-[ES] (9)

k¡[E][S] = (k_¡ + k )[ES]