Revista de Investigaciones Veterinarias

del Perú, RIVEP

ISSN: 1682-3419
rivepsm@gmail.com
Universidad Nacional Mayor de San
Marcos
Perú

Sandoval M., Rocío; Santiani A., Alexei; Ruiz G., Luis; Leyva V., Víctor; Coronado S.,
Luis; Delgado C., Alfredo
CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN OVINO EMPLEANDO TRES DILUTORES Y
CUATRO COMBINACIONES DE AGENTES CRIOPROTECTORES PERMEANTES Y
NO PERMEANTES
Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú, RIVEP, vol. 18, núm. 2, julio-diciembre,
2007, pp. 107-114
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Lima, Perú

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=371838847004

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Rev Inv Vet Perú 2007; 18 (2): 107-114

CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN OVINO EMPLEANDO TRES

DILUTORES Y CUATRO COMBINACIONES DE AGENTES
CRIOPROTECTORES PERMEANTES Y NO PERMEANTES

OVINE SEMEN CRYOPRESERVATION USING THREE EXTENDERS AND F OUR

COMBINATIONS OF P ERMEANT AND NON P ERMEANT AGENTS

Rocío Sandoval M.1 , Alexei Santiani A.1,4 , Luis Ruiz G. 1 , Víctor Leyva V. 1 ,
Luis Coronado S.2 y Alfredo Delgado C.3

RESUMEN

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de tres dilutores y cuatro combinaciones
de dos agentes crioprotectores permeantes más dos no permeantes sobre la calidad del
semen ovino post-descongelamiento. Para esto, en una primera fase se evaluaron entre
tres dilutores (A, B y C) y el más adecuado se usó en una segunda fase, donde se
evaluaron las siguientes combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no
permeantes: 1) Glicerol - Trehalosa, 2) Glicerol - Sacarosa, 3) Etilenglicol - Trehalosa y 4)
Etilenglicol - Sacarosa. En el experimento 1, se encontró que el Dilutor A mantenía mejor
la motilidad progresiva, viabilidad e integridad acrosomal post-descongelamiento en
comparación con los dilutores B y C, por lo que el Dilutor A se empleó en el experimento
2. En este ensayo se encontró que la motilidad progresiva, la viabilidad e integridad
acrosomal, la termoresistencia y la integridad de membrana plasmática post-
descongelamiento fue mejor en los grupos con glicerol-sacarosa y glicerol-trehalosa en
comparación con los grupos con etilenglicol-sacarosa y etilenglicol-trehalosa. Esto de-
muestra que el glicerol es un mejor crioprotector permeante en comparacion con el
etilenglicol; sin embargo, no hubo diferencia en el uso de sacarosa o trehalosa. Se con-
cluye que un dilutor con las características del dilutor A, utilizando glicerol más trehalosa
o sacarosa, constituye una buena alternativa para la criopreservación de semen ovino.

Palabras clave: criopreservación, ovino, agentes crioprotectores permeantes y no

permeantes

ABSTRACT

The objective of the study was to evaluate the effect of three extenders and four
combinations of two permeant and two non permeant cryoprotectant agents on the
quality of post thaw ram semen. In Experiment 1, three extender were evaluated (A, B, and
C) in order to select the best for the next step. In Experiment 2, different combinations of
cryoprotectant agents were evaluated as follow: 1) Glycerol–Trehalose, 2) Glycerol–
Sucrose, 3) Ethylene glycol-Trehalose, and 4) Ethylene glycol–Sucrose. In experiment 1,

1 Laboratorio de Reproducción Animal, 2Laboratorio de Producción Agropecuaria, 3Clínica de Anima-

les Mayores, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima
4 E-mail: asantiania@unmsm.edu.pe

107
 R. Sandoval et al.

motility, viability and acrosomal integrity in extender A were higher than in extender B
and extender C, and therefore, extender A was used for experiment 2. In this assay,
motility, viability and acrosomal integrity, thermoresistance, and plasmatic membrane
integrity were higher in groups Glycerol-sucrose and Glycerol-trehalose in comparison
with groups Ethilene glycol-sucrose and Ethilene glycol-trehalose. However, there were
not significative differences between sucrose or trehalose. In conclusion, an extender
with characteristics of extender A using glycerol plus trehalose or sucrose constitute a
good alternative for cryopreservation of ram semen.

Key words: criopreservation, ram, permeant and non permeant cryoprotector agent

INTRODUCCIÓN Los crioprotectores permeantes son

Los resultados de la inseminación arti-
ficial con semen congelado resultan hasta
ahora insatisfactorios en ovinos. La fertili-
dad obtenida con semen congelado es me-
nor a la de semen fresco, debido principal-
mente a una baja viabilidad post-desconge-
lamiento y a un trastorno subletal en la pro-
porción de espermatozoides sobrevivientes
(Watson, 2000). Esto se debe a los daños
ocasionados en la membrana del espermato-
zoide durante el proceso de criopreservación,
donde se altera la función metabólica del es-
permatozoide, reduciendo así el número de
células viables y ocasionando una capacita-
ción espermática prematura (Maxwell y
Watson, 1996). Consecuentemente, los
espermatozoides sólo serían viables un corto
periodo de tiempo en el tracto reproductivo
de la hembra y, por lo tanto, tendrían una
menor oportunidad de poder fecundar los
ovocitos (Gillan y Maxwell, 1999).
Los daños producidos en los esperma-
tozoide durante el proceso de criopreser-
vación podrían ser prevenidos parcialmente
controlando la velocidad de congelamiento,
usando un dilutor adecuado y agregando
agentes crioprotectores apropiados. En la
criopreservación de semen ovino, se ha ve-
nido evaluando diferentes tipos de dilutores
y agentes crioprotectores (permeantes y no
sustancias que por su bajo peso molecular
pueden atravesar la membrana plasmática,
donde tienen la función de evitar la forma-
ción intracelular de cristales de hielo, así como
evitar la excesiva deshidratación causada por
la congelación lenta (Medeiros et al., 2002).
Entre los más utilizados está el glicerol y el
etilenglicol, siendo el primero el que ha mos-
trado mejores resultados en estudios de
criopreservación de semen ovino en relación
a la motilidad progresiva post-desconge-
lamiento (Salamon y Maxwell, 2000). No
obstante, el etilenglicol ha mostrado un efec-
to similar o mejor que el glicerol en otras es-
pecies (Mantovani et al., 2002). Por otro lado,
los crioprotectores no permeantes son sus-
tancias que por su alto peso molecular resul-
tan útiles cuando se aplican velocidades rápi-
das de congelación, ya que la acción
crioprotectora está asociada con su activi-
dad deshidratante y su interacción específica
con la membrana fosfolipídica (Aisen et al.,
2000). Éstos suelen usarse en asociación con
los agentes crioprotectores permeantes. Los
crioprotectores no permeantes más utilizados
para la congelación de semen de diferentes
especies son la sacarosa, rafinosa, trehalosa
y lactosa. La adición de trehalosa y sacarosa
al dilutor ha obtenido buenos resultados en la
criopreservación de semen ovino (Molinia et
al., 1994b; Aisen et al., 2000).
MATERIALES Y MÉTODOS

permeantes) obteniéndose resultados muy

variables (Molinia et al., 1994 a,b; Gil et al., El estudio se desarrolló en dos fases.
2000; Salamon y Maxwell, 2000). La primera fase permitió identificar y selec-

108 Rev Inv Vet Perú 2007; 18 (2): 107-114

 Criopreservación de semen ovino y agentes crioprotectores
cionar entre tres dilutores, el que sería incor-
porado en los tratamientos de la segunda fase
del estudio. En esta útima, se evaluó cuatro
combinaciones de dos agentes crioprotectores
permeantes y dos no permeantes.
El trabajo se ejecutó en el Laboratorio
de Reproducción Animal de la Facultad de
Medicina Veterinaria de la Universidad Na-
cional Mayor de San Marcos (FMV-
UNMSM). Se utilizaron 2 machos ovinos adul-
tos de la raza Merino y 2 Pelibuey, de 2 a 3
años de edad. Las colecciones de semen se
realizaron semanalmente en el establo de la
FMV-UNMSM, utilizando una vagina artifi-
cial de ovino.
Procedimiento experimental
Experimento 1: Efecto de tres dilutores
Se evaluaron tres tratamientos:
? Dilutor A (fracción 1: tris 27.1 g, ácido
cítrico 14 g, fructosa 10 g y yema de hue-
vo 10 %, diluidos en agua bidestilada csp.
1 L; y fracción 2: glicerol 6%, trehalosa
76 g y EDTA 1.5 g, diluidos en la frac-
ción 1 csp. 1 L).
? Dilutor B (fracción 1: tris 18.17 g, ácido
cítrico 9.6 g, fructosa 29.72 g y yema de
huevo 10%, diluidos en agua bidestilada
csp. 1 L; y fracción 2: glicerol 6%,
trehalosa 76 g y EDTA 1.5 g, diluidos en
la fracción 1 csp. 1 L).
? Dilutor C (fracción 1: leche descremada
9.5 mL y yema de huevo 0.5 mL; frac-
ción 2: fructosa 0.49 g, yema de huevo
0.5 mL, trehalosa 0.89 g, EDTA 0.02 g y
glicerol 1.47 mL, diluidos en la fracción 1
csp. 10 mL).
Se realizaron seis ensayos, empleándo-
se una muestra resultante de cuatro
eyaculados en cada ensayo. Se evaluó el efec-
to de cada dilutor sobre los porcentajes de
motilidad progresiva y de espermatozoides
vivos con acrosoma intacto post-desconge-
lamiento.
Rev Inv Vet Perú 2007; 18 (2): 107-114
Experimento 2: Efecto de diferentes com-
binaciones de agentes crioprotectores
permeantes y no permeantes
Se empleó como dilutor el que obtuvo
los mejores resultados en el Exp. 1. Los tra-
tamientos consistieron en las combinaciones
de agentes crioprotectores permeantes y no
permeantes: 1) Glicerol-Trehalosa, 2) Glice-
rol-Sacarosa, 3) Etilenglicol-Trehalosa y 4)
Etilenglicol-Sacarosa. Se realizaron ocho
ensayos. Se evaluó el efecto de los trata-
mientos sobre los porcentajes de motilidad
progresiva y de espermatozoides vivos con
acrosoma intacto post-descongelamiento,
termoresis tencia y de espermatozoides con
membrana plasmática íntegra.
En cada ensayo, se colectó semen a
los cuatro machos. Se trabajó únicamente
con las muestras de semen que tuvieron un
volumen >0.8 mL, motilidad masal >3 y una
concentración >1000 x 106 de esperma-
tozoides por mL. Los cuatro eyaculados se
mezclaron formando un pool de semen.
El enfriamiento del semen comprendió
2 fases: en la primera, se diluyó el semen
con la primera fracción del dilutor a 35 ºC,
luego se disminuyó la temperatura hasta lle-
gar a los 5 ºC en un lapso de 90 minutos. En
la segunda fase se agregó la segunda frac-
ción del dilutor (sustancias crioprotectoras),
y se incubó a 5 ºC durante 30 minutos para
estabilizar la muestra (Salamon y Maxwell,
2000). Luego, las muestras fueron envasa-
das en pajillas de 0.5 mL. A continuación,
las pajillas fueron congeladas con los vapo-
res de nitrógeno líquido; para tal efecto, se
disminuyó la temperatura de 5 a -25 °C en
un lapso de 6 minutos y finalmente fueron
sumergidas en nitrógeno líquido (-196 ºC)
(Byrne et al., 2000).
Mediciones post-descongelamiento
En el Exp. 1, se evaluó la motilidad pro-
gresiva y la viabilidad e integridad acrosomal,
mientras que en el Exp. 2, se evaluó; ade-
más, la integridad de la membrana plasmática
109
 R. Sandoval et al.
y la termoresistencia. El descongelamiento
se realizó sumergiendo las pajillas en agua
temperada a 37 °C por 10 segundos. Lue-
go, el semen fue diluido (1:10) con una so-
lución base isotónica (27.1 g de Tris, 14.0
g de ácido cítrico, 10.0 g de fructosa y
agua bidestilada csp. 1,000 mL) temperada
a 37 ºC. Luego de 20 minutos se procedió a
la evaluación.
Motilidad progresiva. Se diluyó el semen
con suero fisiológico a 37 ºC (1:20). Se colo-
có una gota sobre una lámina portaobjeto
temperada y se cubrió con una lámina
cubreobjeto. Se observó en microscopio óp-
tico a 400x, calculándose el porcetanje de
espermatozoides con motilidad progresiva.
Viabilidad e integridad acrosomal. Se uti-
lizó la técnica de doble tinción descrita por
Didion et al. (1989). Se incubó 50 µL de se-
men con 50 µL de Azul Tripan al 2% por 10
minutos y a 37°C; luego se realizaron 3 lava-
dos con PBS, centrifugando a 700 g durante
6 minutos. Se resuspendió el precipitado con
PBS y se extendió en un portaobjetos. Este
fue sumergido en solución Giemsa al 20%
por 40 minutos. Finalmente, se observó con
lente de inmersión (1000x) un mínimo de 200
espermatozoides en diferentes campos ópti-
cos y se calculó el porcentaje de espermato-
zoides vivos con acrosoma intacto, conside-
rándose como tales aquellos que presentaron
un coloración pálida o transparente en la par-
te posterior a la línea ecuatorial de la cabeza
y al mismo tiempo tenían el acrosoma teñido
de color fucsia.
Termoresistencia. Se empleó la técnica des-
crita por Smith y Kaune (2004). Las mues-
tras de semen diluidas en una solución base
isotónica fueron incubadas a 37 ºC durante 4
horas, para luego ser sometidas a la técnica
de la doble tinción. Se determinó el porcenta-
je de espermatozoides vivos con acrosoma
intacto.
Integridad de membrana plasmática. Los
espermatozoides fueron expuestos a un me-
dio hipoosmótico (Jeyendran et al., 1984),
110
compuesto por 0.735 g de citrato de sodio
dihidratado y 1.351 g de fructosa, disueltos
en 100 ml de agua bidestilada. Se mezcló 50
µL de la muestra de semen con 715 µL del
medio hipoosmótico y se incubó por una hora
(Santiani et al., 2004). Esta solución fue ex-
tendida sobre un portaobjetos. Se contabilizó
un mínimo de 200 espermatozoides y se cal-
culó el porcentaje de espermatozoides con
membrana plasmática íntegra, considerándose
como tales los que presentaron la cola hin-
chada.
Análisis Estadístico
Se empleó el programa estadístico
Prism® v. 3.0. Se empleó el análisis de
varianza (ANOVA), para determinar diferen-
cias estadísticas entre tratamientos, y la prue-
ba de Tukey para determinar diferencias en-
tre promedios. Previamente, todos los resul-
tados fueron transformados a valores angu-
lares (ángulo = arcoseno x ) para acer-
car los datos a la distribución normal.
Con la finalidad de uniformizar los valo-
res iniciales del semen fresco de cada ensa-
yo, los resultados se expresaron como las
proporciones entre los valores inmediatamen-
te descongelados con los valores del semen
fresco.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Exp. 1: Efecto de tres dilutores
Los resultados se muestran en el Cua-
dro 1. Se puede observar que el dilutor A ob-
tuvo los mayores porcentajes de
espermatozoides vivos con acrosoma intacto
y de espermatozoides con motilidad progre-
siva (p<0.05). Los resultados demuestran que
los dilutores que contenían Tris (A y B), tu-
vieron una mejor capacidad de amortiguación,
de regulación osmótica y baja toxicidad en
comparación con el dilutor que contenía le-
che descremada (C).
Rev Inv Vet Perú 2007; 18 (2): 107-114
 Criopreservación de semen ovino y agentes crioprotectores
Cuadro 1. Valores post-descongelamiento de semen ovino criopreservado con tres dilutores
Dilutores Motilidad Progresiva
A 69.29 ± 6.76 a
B 37.40 ± 5.76 b
C 23.39 ± 6.58 c
Semen Fresco1 89.05 ± 3.76
1
Sin diluir
a, b, c
Letras diferentes dentro de columnas indican diferencias significativas (p < 0.05)
Las diferencias encontradas entre A y
B pueden deberse a las diferencias entre las
concentraciones de Tris empleadas por cada
dilutor (224 versus 150 mM, para A y B, res-
pectivamente). En contraste, Molinia et al.
(1994b) encontraron una mejor motilidad pro-
gresiva con 150 mM de Tris, cuando compa-
raron diferentes concentraciones (100 a 300
mM). Sin embargo, los resultados encontra-
dos por Molinia et al. (1994a) son inferiores
a los reportados por Aisen et al. (2000), quie-
nes utilizaron un dilutor de las mismas carac-
terísticas del Dilutor A. Las diferencias en
las concentraciones de ácido cítrico y fructosa
entre los dilutores A y B, por la necesidad de
regular el pH y la osmoralidad de dichos
dilutores, podrían explicar en parte las ten-
dencias observadas entre ambos.
Los resultados obtenidos con el Dilutor
C son diferentes a otros estudios donde no se
emplearon crioprotectores no permeantes. Así
Gil et al. (2000), al emplear un medio en base
a leche descremada, obtuvieron valores de
motilidad progresiva superiores en compara-
ción a un dilutor en base a Tris. Este hecho,
presumiblemente se debe a que en el presen-
te estudio se empleó un crioprotector no
permeante (Trehalosa). Esto corrobora que
los altos niveles de calcio presente en la le-
che pueden afectar negativamente la acción
crioprotectora de la Trehalosa (Foote et al.,
1993), lo que alteraría la estabilidad de las
membranas de los espermatozoides durante
el congelamiento.
Rev Inv Vet Perú 2007; 18 (2): 107-114
Espermatozoides vivos con
acrosoma intacto
63.12 ± 4.64a
34.86 ± 6.50 b
23.22 ± 8.23c
86.58 ± 6.08
Exp. 2: Efecto de diferentes combinacio-
nes de agentes crioprotectores permeantes
y no permeantes
En este experimento se utilizó el Dilutor
A como dilutor base, dado que resultó ser
significativamente mejor que los otros dos
dilutores. Los resultados se resumen en el
Cuadro 2. Se puede apreciar que, indepen-
dientemente del tipo de crioprotector no
permeante empleado, la calidad del semen
post-descongelamiento fue significativamente
mejor en los grupos que utilizaron glicerol
como crioprotector permeante. Por otro lado,
no se observó diferencias significativas entre
los grupos glicerol-trehalosa versus glicerol-
sacarosa, ni etileglicol-trehalosa versus
etilenglicol-sacarosa.
La ventaja del uso del glicerol sobre el
etilenglicol como crioprotector permeante, en
la prevención de la pérdida de la motilidad
progresiva post-descongelamiento en semen
de ovinos ha sido corroborada en otros estu-
dios (Molinia et al., 1994a). Asimismo, en
semen caprino se ha encontrado una mejor
motilidad progresiva con glicerol en compa-
ración con etilenglicol (Bittencourt et al.,
2004). Sin embargo, en protocolos de
criopreservación de semen de otras especies,
como humanos (Gilmore et al, 2000), equinos
(Mantovani et al., 2002) y bovinos (Guthrie
et al., 2002), se ha encontrado mejores re-
sultados al usar etilenglicol.
111
 R. Sandoval et al.
Cuadro 2. Valores promedio (%) post-descongelamiento de semen ovino criopreservado con
cuatro combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes
Crioprotectores
Motilidad
permeantes + No
progresiva
permeantes
Glicerol + Trehalosa 64.1 ± 4.8 a
Glicerol + Sacarosa 64.2 ± 4.4 a
Etilenglicol + Trehalosa 44.1 ± 4.3 b
Etilenglicol + Sacarosa 48.5 ± 3.5 b
Semen Fresco1 83.6 ± 7.8
1
No diluido (control)
a,b,c
Letras diferentes dentro de columnas indican diferencias significativas (p < 0.05)
La reducción de la capacidad fecun-
dante del semen criopreservado no sólo se
debe a una disminución de la viabilidad
espermática, sino además, a los trastornos
subletales que experimentan los esperma-
tozoides sobrevivientes (Watson, 2000), de allí
la importancia de evaluar la viabilidad e inte-
gridad acrosomal, ya que es un indicativo
aproximado de la real capacidad fecundante
que poseen los espermatozoides post-
descongelamiento. En tal sentido, el semen
que fue criopreservado con glicerol (más
trehalosa o sacarosa), tuvo una mayor pro-
porción de espermatozoides vivos con
acrosoma intacto en comparación con el se-
men criopreservado con etilenglicol (más
trehalosa o sacarosa) (p<0.05, Cuadro 2).
De la misma manera, los agentes
crioprotectores permeantes empleados en
este estudio influyeron significativamente so-
bre la integridad de membrana plasmática.
Se obtuvo un mayor porcentaje de espermato-
zoides con membrana plasmática íntegra
cuando se utilizó glicerol en comparación con
etilenglicol. Este parámetro es un indicativo
de la funcionabilidad fisiológica de las mem-
branas espermáticas. La alteración en la ca-
pacidad de regular el flujo de iones y agua
112
Espermatozoides
Termo- Integridad de
vivos con
resistencia membrana
acrosoma intacto
57.8 ± 6.9 a 40.4 ± 4.4a 62.7 ± 2.8 a
55.7 ± 6.1 a 37.7 ± 6.2a 59.6 ± 1.3 a
37.5 ± 3.9 b 26.7 ± 6.6b 40.3 ± 8.3 b
41.5 ± 4.1 b 24.9 ± 3.1b 37.5 ± 3.6 b
82.5 ± 2.7 66.9 ± 3.6
por la membrana plasmática de los
espermatozoides, produciría cambios relacio-
nados con la capacitación prematura y la
exocitosis acrosomal (Sanocka y Kurpisz,
2004).
Las ventajas de la capacidad criopro-
tectora del glicerol sobre el etilenglicol en
espermatozoides ovinos podría deberse a una
mayor susceptibilidad de los espermatozoides
ovinos a los efectos tóxicos que podrían te-
ner las altas concentraciones de etilenglicol;
por lo tanto, sería conveniente probar el
etilenglicol a una menor concentración a la
usada en el presente trabajo (2.25%).
Los crioprotectores no permeantes
(trehalosa y sacarosa), no mostraron diferen-
cia significativa en lo concerniente a la
motilidad, viabilidad e integridad acrosomal,
integridad de membrana y termoresistencia;
hecho que coincide con otros reportes, en los
cuales se demuestra que protegen a las célu-
las espermáticas del efecto de la
criopreservación (Aisen et al., 1990). En ese
sentido, Aisen et al. (2000) encontraron que
la adición de trehalosa en un dilutor en base
de Tris mejoró la motilidad progresiva en un
19%.
Rev Inv Vet Perú 2007; 18 (2): 107-114
 Criopreservación de semen ovino y agentes crioprotectores
La trehalosa es un protector específico
de las membranas espermáticas que, como
resultado de su interacción con los
fosfolípidos, puede unirse con el hidrógeno
de las cabezas fosfolipídicas de la membra-
na, de una manera mas fuerte que el glicerol
(Foote et al., 1993). Además, posee una ac-
ción crioprotectora relacionada al efecto
osmótico, que protege al espermatozoide del
congelamiento (Aisen et al., 2002).
Los resultados del presente experimen-
to demuestran que la sacarosa tiene las mis-
mas cualidades de protección que la trehalosa
en el espermatozoide ovino durante el proce-
so de criopreservación. Esto se corrobora con
otros estudios, donde no existe diferencia
entre el tipo de azúcar (sacarosa, trehalosa)
utilizado en el diluyente sobre la motilidad
post-descongelamiento de espermatozoides
ovinos (Molinia et al., 1994b). Adi-
cionalmente, Aisen et al. (1995) manifiestan
que la trehalosa posee una capacidad pro-
tectora específica de la membrana que no
poseen otros disacáridos como la lactosa.
El presente trabajo es importante para
una mejor comprensión del desempeño de los
dilutores y agentes crioprotectores en la
criopreservación de semen ovino; sin embar-
go, aún se requieren otros estudios para me-
jorar la capacidad fecundante del semen
criopreservado. Se concluye que un dilutor
con las características del dilutor A, utilizan-
do glicerol más trehalosa o sacarosa, consti-
tuye una buena alternativa para la
criopreservación de semen ovino.
LITERATURA CITADA
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