Criobiologia Del Semen

Criobiologa del semen
1ra Edicin, Julio 2009 Impreso en Per Hvca
CRIOBIOLOGIA DEL SEMEN

(EN ANIMALES DOMESTICOS Y AVANCES EN ALPACAS)
Autores: Ing. Brian J. Ordoez Mulato briansiempre@hotmail.com Obra compilada, editada y publicada en la Universidad Nacional de Huancavelica E.A.P. de Zootecnia.
PREMBULO La presente publicacin nace con toda la intencin de hacer una difusin e incentivar tanto a estudiantes, docentes universitarios u otros investigadores, interesados en sumergirse al campo de la criopreservacin de gametos de alpaca. La mayor parte del contenido del presente posee fundamentos tericos compilados sobre criobiologa, explicaciones y efectos en las clulas reproductivas masculinas. En la segunda parte se mencionan los materiales, mtodos y procedimientos que se tomaron en cuenta para realizar un estudio en alpacas, as tambin se muestran resultados, que dan luces para poder concretar esta biotecnologa, desde luego sabemos que su importancia radica para emplearse en las comunidades alpaqueras, mediante la inseminacin artificial u otra biotecnologa similar; As para muchos que desconocamos, podemos entender que la razn por la cual no se efecta la inseminacin artificial en esta especie es no poseer semen criopreservado, de ah nace la investigacin y la presente publicacin.
AGRADECIMIENTOS Es necesario agradecer a personas que por sus diversos aportes muy importantes fue posible concluir este estudio: lvaro Lpez, Teodosio Huanca M. y Mario L. Gonzles C, INCAGRO Wilfredo Huanca.
CONTENIDO NDICE PREAMBULO INTRODUCCIN 1.1 ASPECTOS GENERALES. 1.2 Criobiologa del semen. 1.3 Factores que afectan la viabilidad espermtica durante el proceso de criopreservacin. 1.3.1 Cambios de volumen. 1.3.2 Shock de fro. 1.3.3 El crioprotector y el estrs celular. 1.3.4 Estrs osmtico. 1.4 Alteraciones a los espermatozoides durante el proceso de Criopreservacin. 1.5 Efecto de la criopreservacin sobre el espermatozoide. 1.5.1 Crio dao sobre la bicapa lipdica. 1.5.2 Crio dao sobre la integridad mitocondrial. 1.6 Procesamiento para el congelado del semen. 1.6.1 Los diluyentes o dilutores. 1.6.2 Refrigeracin. 1.6.3 Adicin del crioprotector. 1.6.4 Envasado o empacado del semen. 1.6.5 Congelamiento de semen. 1.6.6 Descongelamiento de semen y evaluacin post congelacin. MATERIALES Y MTODOS 2.1 Del lugar. 2.2 Materiales y equipos. 2.2.1 Materiales. 2.2.2 Reactivos o material qumico. 2.2.3 Equipos. 2.4 Metodologa. 2.4.1 Preparacin seminal pre congelamiento 2.4.1.1 Obtencin de la muestra de semen. 2.4.1.2 Evaluacin macroscpica y microscpica del semen. 2.4.1.3 Preparacin del dilutor. 2.4.2 Preparacin y proceso del congelamiento seminal. 2.4.2.1 Proceso de refrigeracin y agregado del crioprotector. 2.4.2.2 Proceso de congelamiento. 2.4.3 Evaluacin post congelamiento. 2.4.4 Anlisis estadstico. RESULTADOS Y DISCUSIONES
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3.1 Evaluacin seminal post congelamiento. 3.1.1 Resultado de motilidad del espermatozoide post congelamiento. 3.1.2 Resultado de mortalidad del espermatozoide post congelamiento. 3.1.3 Prueba de contrastes ortogonales para motilidad y mortalidad espermtica post congelamiento. CONCLUSIONES RECOMENDACIONES COMENTARIO REFERENCIAS
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INTRODUCCIN Para mejorar la calidad de fibra de las alpacas (Vicugna pacos), en este momento se cuenta con un moderno medio de mejoramiento gentico que actualmente nos brinda el uso de la biotecnologa reproductiva como es la inseminacin artificial con semen fresco diluido (INIA, 2004), el cual tiene la ventaja de efectuar con un solo eyaculado la posibilidad de inseminar un gran nmero de hembras pero, sin embargo se tiene el limitante de que el donador de semen tiene que estar en el lugar de obtencin; De lograr un protocolo de congelamiento seminal ideal en alpacas mediante un conservador o crioprotector viable, el semen congelado de esta especie podra ser considerado al presente una alternativa seria para fines de mejoramiento gentico, pues brindara una mayor rapidez al progreso gentico a nivel de los rebaos de nuestro pas, as mismo ayudara a obtener ejemplares de alto valor gentico; Pero las investigaciones realizadas concernientes a este tema son muy pocas por lo que hasta ahora no se cuenta con protocolo definido. En el Per la produccin de alpacas es la fuente de vida de miles de familias que directa e indirectamente se benefician econmicamente, as mismo contribuye al pas aportando el 2% del PBI, su demanda es importante debido a que actualmente se aprecia en el extranjero como una fibra extica y sus caractersticas textiles de calidad hacen que tenga un precio mayor frente a la lana de ovino en el mercado mundial. Dado el valor econmico actual y su demanda en el mercado exterior de la fibra hace que su produccin sea preponderantemente valiosa, es por ello que recin en los ltimos aos se esta dando el inters respectivo acerca de la finura de la fibra, pues segn estudios realizados en nuestro pas se cuenta con una alta produccin de fibra gruesa. En nuestros das se cuenta con el 87% de la poblacin a nivel mundial, ventaja que debe ser aprovechada por ahora, no solo el Per es el nico interesado en el desarrollo de alguna biotecnologa reproductiva como la inseminacin artificial, congelacin de semen, transferencia de embriones, entre otros, que funcionan muy bien en otras especies, uno de los ms grandes interesados es Australia, que ya para el 2005 contaba con 60,814 alpacas segn (Reyna, 2005) y ltimamente est invirtiendo mayores recursos econmicos en investigacin de este tipo, adems, estn EEUU, Gran Bretaa, Nueva Zelanda y Alemania, y los pases hermanos de Sudamrica el caso de Chile principalmente. En ese sentido la presente investigacin tiene como objetivo evaluar el efecto crioprotector que brindan el glicerol y el etilen glicol sobre la motilidad y mortalidad del espermatozoide de alpaca al post congelamiento. Los autores
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ASPECTOS GENERALES. El uso de la inseminacin artificial es considerado como un medio para acelerar el mejoramiento gentico de los rebaos, haciendo factible que unos cuantos machos seleccionados de buena calidad puedan donar semen para inseminar artificialmente a cientos de hembras dentro de su vida reproductiva y as lograr mejores generaciones. La inseminacin artificial es la tcnica individual ms importante creada para el mejoramiento gentico de animales y actualmente se prctica en vacunos, porcinos, ovinos y otras especies (Hafez, 1993). En las alpacas la mejora gentica es lenta en comparacin a otro ganado, debido a su fisiologa reproductiva que limita la aplicacin de alguna biotecnologa reproductiva la misma que funciona muy bien en otras especies, una de estas limitantes es el largo periodo de gestacin, otra restriccin es que los animales machos inician la pubertad al primer ao de edad y tienen problemas en la liberacin completa del pene que les impide realizar una copula normal y recin a los 3 aos el 100% de animales se encuentran libres de la adherencia peneprepucial, por tal razn sugieren trabajar con animales mayores (Reyna, 2005). Tambin hay otro problema importante pero ya casi superado acerca de la obtencin de semen de buena calidad, pues se ha intentando diversos mtodos por muchos aos, el empleo del maniqu y una vagina artificial modificada que en la actualidad viene a ser el mejor mtodo utilizado, con este procedimiento la copula es similar a la monta natural durando en promedio 20 minutos segn Tibary et al, (1999), como se sabe la monta natural es prolongada sosteniendo aproximadamente 25 minutos (Bustinza 2001). Acerca de las caractersticas seminales se indica que los eyaculados colectados de 3 o 4 das tienen un mejor volumen y concentracin. El volumen de semen vara de acuerdo a la tcnica de obtencin utilizada, a la individualidad y entre una coleccin a otra, tal es as que oscila de 0.8 ml a 1.0 ml y excepcionalmente se ha reportado 12 ml (Bustinza, 2001). Con respecto a la concentracin hay una variacin extensa desde 22.5 a 875 millones/ml (Vaughan et al, 2003). As tambin segn Sumar y Leyva, (1981) indica que en el semen de alpaca no hay motilidad masal por la baja concentracin relativa de espermatozoides y porque se ha observado una motilidad progresiva individual, esta ltima observacin obedece a que el plasma seminal es altamente viscoso por lo que el movimiento de los espermatozoides es lento en cuanto a su desplazamiento comparado con el ovino y bovino. A ello se agrega que la cuantificacin promedio de la motilidad individual en semen fresco es de 85% con rangos de 69% a 91% (Bustinza, 2001). CRIOBIOLOGA DEL SEMEN. La criopreservacin y su empleo para la inseminacin artificial han causado un gran impacto sobre la reproduccin animal. Innumerables cras de diferentes especies han nacido a partir del uso del semen congelado. Sin embargo constantemente se modifican los protocolos de congelacin a fin de obtener mejores resultados en relacin a la supervivencia y fertilidad del semen congelado. Mltiples
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factores afectan la sobrevivencia de los espermatozoides al descongelamiento como la concentracin espermtica en el diluyente, el envasado, la composicin del diluyente empleado, el shock de fro entre otros (Stornelli et al, 2005). Durante el proceso de congelacin y descongelacin se pierde aproximadamente el 50% de la poblacin inicial de espermatozoides debido a los efectos de criopreservacin sobre las membranas celulares, el citoesqueleto, aparato locomotor y ncleo del espermatozoide. Se considera que el principal sitio de dao asociado a los cambios de temperatura son las membranas espermticas, considerndose a esta causa como la ms asociada a la reduccin de la fertilidad del semen congelado durante los procesos de refrigeracin, congelacin y descongelacin. (Watson, 1995). La optimizacin del protocolo de congelacin debe contemplar no solo la obtencin de un alto nmero de espermatozoides sobrevivientes sino tambin la habilidad funcional de esta poblacin (Stornelli et al, 2005). La eficiencia para la congelacin del semen vara entre las especies y entre machos individuales de una misma especie. Estas variaciones se relacionan con las caractersticas biofsicas y bioqumicas de las membranas espermticas (Hafez, 2002). FACTORES QUE AFECTAN AL ESPERMATOZOIDE DURANTE EL PROCESO DE CRIOPRESERVACIN. Para obtener buenos resultados de supervivencia espermtica y fertilidad de los espermatozoides es necesario comprender a que tipo de estrs se ven sometidos los espermatozoides durante los procesos de congelacin y descongelacin as como la manera en que las clulas responden a las agresiones fsico-qumicas y medioambientales (Stornelli et al, 2005). CAMBIOS DE VOLUMEN. Cuando los espermatozoides son congelados y descongelados se ven sometidos a varios ciclos de deshidratacin e hidratacin lo que resulta en cambios significativos de volumen. El primer cambio de volumen ocurre cuando la clula es colocada dentro de un diluyente, el cual contiene sustancias crioprotectoras como glicerol, y posteriormente cuando la solucin es congelada. Mas tarde ocurren cambios de volumen cuando la solucin es descongelada. Estos cambios de volumen estn asociados a cambios de la concentracin de iones y electrolitos en las soluciones intra y extra celulares. La forma en que ocurren estas modificaciones determinan la mayor o menor capacidad de la clula para soportar el dao a la que se ve sometida. El cambio de volumen es solo uno de los factores de estrs a los que la clula se ve sometida durante el proceso de criopreservacin (Leivo y Dradey, 1999). SHOCK DE FRO. Es bien conocido que el enfriamiento rpido del semen entre 30 C y 0 C induce un estrs letal en algunas clulas, el cual es proporcional a la tasa de enfriamiento. Es as que el enfriamiento en este rango de temperatura debe ser realizado cuidadosamente (Watson, 1981). Este fenmeno es
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conocido como shock de fro y puede apreciarse durante el enfriamiento de espermatozoides de cualquier especie. En el porcino este fenmeno se manifiesta inmediatamente despus de la eyaculacin hacindose la clula cada vez ms sensible al mismo en las horas siguientes (Pursel et al, 1978). El estrs de la membrana puede continuar por debajo de 0 C sin que el cambio de fase sea completo, sin embargo es bien conocidoque los cambios de fase ocurren, en su mayora, entre los 5 C y 15C (Dobrins et al, 1993). En un estudio sobre la funcin de permeabilidad de la membrana del espermatozoide al criopreservar semen de verraco, se ha demostrado la importancia de la composicin lipdica del medio ambiente donde se encuentra la membrana plasmtica durante el enfriamiento, esto relaciona al componente lipdico en la participacin del paso de molculas en la membrana e interviene en el mecanismo del dao celular (Pettit y Bhur, 1998). El agregado de preparaciones lipdicas purificadas a los espermatozoides reduce significativamente el shock de fro y el dao producido por la congelacin descongelacin (Graham, 1987), por lo que usualmente se incluye yema de huevo en la preparacin de los diluyentes debido a que los fosfolpidos y las lipoprotenas de baja densidad poseen un efecto protector contra el shock del fro (Quinn et al, 1980). EL CRIOPROTECTOR Y EL ESTRS CELULAR. El crioprotector permite mantener una mayor proporcin de agua lquida intracelular a bajas temperaturas y en consecuencia una menor concentracin de electrolitos posibilitando la supervivencia celular durante el proceso de criopreservacin. Sin embargo, estos compuestos y los diluyentes producen un estrs transitorio pero importante sobre la membrana plasmtica de los espermatozoides (Stornelli et al, 2005). La magnitud de este hecho esta ntimamente relacionado con la capacidad penetrante de los crioprotectores (Gao et al, 1993). El crioprotector de eleccin es comnmente el glicerol, el cual produce una alteracin osmtica. A la vez se ha observado que la hiperosmolaridad producida por este compuesto posee un efecto estimulador para la reaccin del acrosoma (Aitken et al, 1983). Adems del glicerol existen otros compuestos que poseen propiedades crioprotectoras como por ejemplo el etilen glicol, propilenglicol, dimetil sulfxido o metanol (Navarro et al, 2004). ESTRS OSMTICO. El estrs, inducido por la formacin de cristales de hielo est asociado a los cambios en la presin osmtica de la fraccin no congelada (Watson, 1988). Cuando una solucin es enfriada por debajo del punto de congelacin los cristales de hielo se integran y el agua pura se cristaliza formando hielo. Los solutos permanecen disueltos en la fraccin de agua lquida y por lo tanto la presin osmtica de la solucin aumenta. La
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proporcin de agua cristalizada como hielo y la presin osmtica de la solucin restante depende de la temperatura, velocidad de descenso de la misma y el volumen de la fraccin no congelada (Stornelli et al, 2005). Por tal sentido la duracin de la exposicin a estos eventos debera minimizarse para lograr una ptima sobrevivencia, implicando entonces que el enfriamiento celular debera ser rpido. Sin embargo la tasa de enfriamiento debe ser suficientemente lenta como para permitir la salida de agua, y prevenir la formacin de cristales de hielo intracelular, lo cual es letal para la clula (Holt y North, 1991). As tambin refieren que el porcentaje de clulas que sobrevive a un proceso de congelacin esta determinado por la sensibilidad al estrs osmtico durante la adicin y remocin de crioprotectores durante el enfriamiento y el recalentamiento (Stornelli et al, 2005). Las clulas espermticas poseen mayor permeabilidad al agua que otros tipos celulares (Noiles et al, 1993). Si bien puede haber diferencias entre especies en la sensibilidad del espermatozoide a la criopreservacin, el eyaculado es heterogneo habiendo una resistencia variable al estrs osmtico entre las clulas espermticas (Katkov et al, 1998). Los signos de estrs manifestado por los espermatozoides luego de la descongelacin no se relacionan solo con el estrs osmtico sufrido en el descongelado sino tambin con el estrs sufrido durante el congelado (Holt y North, 1991). Es por eso que cada tipo celular posee una velocidad ptima de congelacin que garantiza su supervivencia luego de la criopreservacin. Si la velocidad de congelacin es demasiado rpida o demasiado lenta el estrs producido por el proceso de criopreservacin aumenta. Mazur, (1984) hizo un calculo emprico acerca del congelamiento de las clulas espermticas estimando un rango de 15 a 60 C/minuto como la velocidad optima de congelacin que permite mayor probabilidad de obtener una mejor tasa de sobrevivencia celular.
ALTERACIONES A LOS ESPERMATOZOIDES DURANTE EL PROCESO DE CRIOPRESERVACIN. Uno de los efectos comprobados producidos durante el proceso de criopreservacin es la disminucin de la motilidad del espermatozoide (Hafez, 2002; Stornelli et al, 2005). En tanto que una pequea parte de la poblacin celular exhibe un movimiento progresivo vigoroso, la mayora de las clulas muestran variables grados de alteracin de la motilidad post congelado en comparacin con la motilidad del semen fresco. Este hecho puede estar ntimamente relacionado con la pobre capacidad fecundante del semen congelado. En un estudio con semen criopreservado realizado en humanos se encontr que tanto la motilidad progresiva como el vigor del movimiento celular eran factores relacionados estrechamente con la fertilidad (Kelly et al, 1997).
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Si bien, estudios de fertilizacin in vitro han demostrado que los espermatozoides criopreservados son capaces de fertilizar, solo algunos acceden al proceso pero muchos otros estan estructuralmente afectados y son incapaces de fertilizar (Ellinton et al, 1999). EFECTO DE LA CRIOPRESERVACIN SOBRE EL ESPERMATOZOIDE. Una vez que los crioprotectores ingresan al citoplasma a favor del gradiente de concentracin, el fluido intracelular puede ser enfriado a temperaturas entre -5 y 15, sin que ocurra la formacin de cristales hielo, debido a que estas sustancias disminuyen el punto de congelacin por medio de la interaccin entre las molculas de agua, a estos rangos de temperatura los cristales de hielo comienzan a formarse en el medio externo. Cuando las temperaturas descienden por debajo de estos rangos, se inicia la formacin de cristales de hielo intracelular (Vincent et al, 1998). La temperatura a la cual deben ser incorporados los crioprotectores a la solucin de semen y el tiempo de exposicin celular, dependen del grado perjudicial del crioprotector principalmente en volmenes excesivos y de su velocidad de difusin a travs de la membrana plasmtica. Esta difusin puede verse afectada por el descenso de la temperatura, ya que durante este proceso la membrana celular aumenta la proporcin de colesterol con el propsito de lograr mayor estabilidad mecnica; sin embargo, este aumento del colesterol tambin disminuye la permeabilidad de la membrana a pequeas molculas, pudiendo afectar la penetracin del crioprotector en la clula de una manera efectiva (Spinel, 2002). Los mecanismos de accin especifica de los agentes crioprotectores a nivel celular no estn bien explicados, al parecer la interaccin ocurre en el mbito de la bicapa lipdica especficamente en la interaccin con los fosfolipidos, a lo indicado, no solo es importante establecer como interacta el crioprotector, sino que es necesario y mas imprescindible determinar el efecto perjudicial de estos para poder tomar el control celular (Medina et al, 2005). 1.5.1 CRIO DAO SOBRE LA BICAPA LIPDICA Las propiedades de la membrana estn dadas por la proporcin lipdica de un 70% de fosfolipidos, 25% de lpidos neutros (principalmente colesterol), y 5% glicolpidos (Muller et al, 1994). Los fosfolipidos al formar la mayor parte de la membrana, pueden conferir gran fluidez, pero tambin mayor inestabilidad, que es contrarrestada por las cantidades variables de colesterol (Holt, 2000). Se ha sugerido que el estrs trmico sobre la membrana plasmtica durante el enfriamiento resulta en la transicin de la fase lquida a una fase de gel en los fosfolipidos de la membrana, como resultado de esta transicin, las protenas integrales de la membrana pueden ser excluidas de los dominios de los lpidos de la fase de gel y son agrupadas, algunas veces de forma irreversible. La actividad de muchas enzimas asociada a las membranas se reduce, as como la tasa de difusin de protenas por lateralizacin dentro del plano de la bicapa, reduciendo de este modo la eficiencia de los procesos relacionados con la difusin (Labb et al, 1997).
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Durante la exposicin al fro se ha observado la reduccin en la proporcin de cidos grasos saturados e incremento en la proporcin de cidos grasos insaturados. Cuando aumenta la temperatura, la relacin de los fosfolipidos y los contenidos de colesterol se correlacionan positivamente; estos cambios originan una reorganizacin de la membrana, lo que ayuda a la clula a sobrevivir a las nuevas temperaturas (Labb et al, 1997). Se ha demostrado que un largo periodo de aclimatacin trmica induce a algunas modificaciones en los patrones de cidos grasos de los fosfolipidos de la membrana plasmtica de los espermatozoides. Sin embargo, esto podra ser el resultado del cambio fisiolgico que sufren los animales para mantener la fluidez de la membrana, donde la composicin de los cidos grasos y la proporcin de molculas de colesterol se modifica en funcin de la temperatura del ambiente. Se observ una mejor resistencia a la criopreservacin, los espermatozoides que se mantuvieron bajos en contenidos de colesterol en la membrana plasmtica, esta baja cantidad de colesterol se correlacion con una mejor capacidad de fertilizacin de los espermatozoides despus de la criopreservacin (Spinel, 2002). 1.5.2 CRIO DAO SOBRE LA INTEGRIDAD MITOCONDRIAL La integridad mitocondrial juega un papel importante. Los procedimientos de congelacin y descongelacin inducen una disminucin en la produccin de ATP, la cual vara con el crioprotector utilizado. Esta disminucin puede resultar del estrs osmtico durante la adicin del crioprotector o el congelamiento del agua externa. Las diferencias entonces, en la capacidad entre el glicerol y el metanol para prevenir la disminucin en la sntesis de ATP, pueden ser parcialmente explicadas por el hecho de que el medio de congelacin con glicerol permite los ms altos valores de osmolaridad y con el metanol los ms bajos (Ogier et al, 1997). Los cambios morfolgicos determinados por microscopia electrnica, revelan daos en la pieza media del espermatozoide en la fase de post descongelacin, conllevando a la formacin de protuberancias o ensanchamientos de la membrana en esta zona como resultado de la perdida de la envoltura densa de las mitocondrias. La formacin de protuberancias tambin ha sido determinada en el flagelo y la cabeza del espermatozoide, con prdida de cromatina nuclear, dndose una prdida de la funcionalidad mitocondrial y una disminucin de las reservas de energa necesarias para el movimiento flagelar del espermatozoide, comprometiendo la osmoregulacin celular (Yao et al, 2000). Aparentemente la toxicidad de los crioprotectores est dirigida sobre el estado bioenergtico del espermatozoide, interfiriendo con el balance entre sntesis y utilizacin de ATP, ya que frente a una deficiencia de ATP, durante la congelacin, el control metablico sobre los procesos celulares dependientes de iones podra verse afectado, ocasionando una inapropiada
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activacin de fosfolipasas y proteasas afectando un dao celular irreversible (Holt, 2000). 1.6 PROCESAMIENTO PARA EL CONGELADO DEL SEMEN. 1.6.1 LOS DILUYENTES O DILUTORES. Este medio debe realizar la funcin de aporte de nutrimentos como una fuente de energa, proteger contra el efecto nocivo del enfriamiento rpido, ser amortiguador de tal manera que impidan los cambios perjudiciales de pH, mantener la presin osmtica apropiada y el balance electroltico, inhibir la proliferacin electroltica, incrementar el volumen del semen y proteger a las clulas durante el congelamiento (Hafez, 2002), generalmente a este primer medio de solucin se denomina diluyente A. Prcticamente, todos los diluyentes para semen lquido o congelado tienen yema de huevo o leche descremada o una combinacin de estas dos, como componentes bsicos. Es posible que el suero sanguneo al igual que la yema de huevo ofrezca una proteccin a la membrana del espermatozoide al congelamiento, que consistira en una interaccin de la superficie celular ms con los lpidos que con las protenas, sealando que el suero posee una inclusin protenica de 7 gr/ml (Palacios y Zarco, 1995). A continuacin se mencionan varios ejemplos del empleo de dilutores en diferentes especies. En semen de carnero Angulo et al, (1999) utilizaron un dilutor conformado por tris 36.05 gr, cido ctrico 20.2 gr, fructuosa 14.88 gr, agua bidestilada 100 ml y 20% de yema de huevo. En el caso de toros Olivares y Urdaneta, (1985) emple un dilutor compuesto de 74 partes de citrato de sodio, 25 partes de yema de huevo, 1 parte de glucosa, 1000 UI/cc de penicilina y 500 mg/cc de estreptomicina. Por otro lado Cueto et al, (2003) en una dilucin de semen de caprino emplearon 10% de leche descremada en polvo (50 ml de agua bidestilada y 5 gr de leche), glucosa 1% (0.5 gr de glucosa), 1 gr de penicilina y estreptomicina (1000 UI) por mililitro de diluyente, en caso del caprino antes de unir al dilutor, se debe proceder a lavar el semen, es decir separar del plasma seminal mediante centrifugacin a 2000 rpm/10 minutos. En otro estudio con fines de congelacin se utilizaron dilutores para semen de cerdo compuesto a base yema de huevo y lactosa, previo a esta se mantuvieron a 15 C/24 horas y se centrfugo (250gr) a 1500 rpm/10 minutos (Goslvez et al, 2003). Antes de la dilucin debe mantenerse a 30C para evitar el shock trmico, se extrae una porcin de semen para su evaluacin y el resto puede mezclarse con tres o ms partes de diluyente a 30C, en toros el semen no congelado puede diluirse en una proporcin de 200 a 300 veces (Hafez, 2002). Bravo, (1998) indica que en camlidos, se viene an investigando dilutores adecuados para trabajos de congelamiento. Los dilutores que mantuvieron mayor nmero de espermatozoides vivos, en orden de importancia segn Vaughan et al, (2003), son: tris tamponado 70%; tryladil 65%; yema de huevo, glucosa y citrato 8%.
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As tambin Aller et al, (2003) utilizaron citrato sdico, yema de huevo, glucosa, penicilina, sulfato de estreptomicina para emplearlo en semen de llama. 1.6.2 REFRIGERACIN. Luego de la mezcla realizada se enfra gradualmente hasta 5C en todas las especies excepto en el verraco que suele mantenerse a 15C. El enfriamiento debe ser lento, tomando por lo menos 1 hora, este proceso suele realizarse protegindose con un recipiente en una camisa de agua para amortiguar el shock trmico (Hafez, 2002). El enfriamiento se realiza a razn de 2C cada 3 minutos y permanece a 5C durante 45 a 60 minutos antes de proceder al agregado del diluyente B que contiene el crioprotector (Cueto et al, 2003). Similarmente Angulo et al, (1999), sometieron el semen de carnero en un recipiente de 22C e introdujeron a refrigeracin a 0C durante 2 horas, tiempo suficiente que paulatinamente alcanza 5C, afirma que no sufre choque trmico con este procedimiento. Del mismo modo Medrano et al (2004), refrigeraron pajillas con semen de caprino hasta 5 C por dos horas. El procedimiento no tiene diferencia entre pajuelas, pellets u otro, en cuanto a refrigeracin. ADICIN DEL CRIOPROTECTOR. Por lo general se aade el crioprotector al semen despus de enfriarlo y esta incorporacin debe ser por etapas lo que permite una mayor proporcin de espermatozoides sobrevivientes (Gao et al, 1993). La cantidad final del crioprotector en las diferentes especies puede variar desde 5% en medios de yema de huevo o azcar a 10% en leche. En caso del verraco se utiliza 2% de glicerol (Hafez, 2002). Para el caso de toros Olivares y Urdaneta, (1985) emplearon 14% de glicerol en la fraccin B a base de yema y citrato, es decir quedando una concentracin final de 7% de glicerol, este proceso es general en la criopreservacin de semen, y para el periodo de estabilizacin un tiempo entre 3 a 6 horas. Angulo et al, (1999) mencionan, que para poder congelar semen de carnero debe utilizarse 5% de glicerol ms un dilutor a base de tris, yema de huevo y cido ctrico. Otro estudio en semen de cerdo fue realizado por Goslvez et al, (2003) quienes utilizaron 4% de glicerol mas yema de huevo y lactosa, dejando una proporcin final de 2% del crioprotector, que por lo general la concentracin de glicerol es baja en esta especie. Cueto et al, (2003) trabajando con semen de caprino us 6% de glicerol, agregado que fue en tres partes cada 10 minutos, teniendo en cuenta un pH entre 6.8 y 7.2. Hafez, (2002) afirma que la mezcla del semen y el diluyente en cualquier especie se debe dejar reposar durante varias horas antes de
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congelarla, para permitir que las clulas espermticas se equilibren con el diluyente, 4 a 6 horas como ptimo dependiendo del medio utilizado. Mientras Medrano et al, (2004) emplearon solo 2 horas antes de someter a congelamiento.
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ENVASADO O EMPACADO DEL SEMEN Se pueden realizar de 3 formas; a) En pajillas de 0.25 a 0.5 ml de semen diluido. b) En ampolletas de vidrio de 0.5 a 1 ml que son recipientes estriles que se pueden rotular, llenar y sellar de manera automtica y c) Por pldoras o pellets de 0.1 a 0.2 ml, que requieren poco espacio cuando se almacena masivamente y es una forma econmica, su principal desventaja es la dificultad para identificar cada pldora (Hafez, 2002). Por otro lado, en un estudio con semen de carneros se demostr que en pajillas de 0.25 ml puede envasarse el semen con 300 x 106 espermatozoides motiles (Angulo et al, 1999). CONGELAMIENTO DEL SEMEN. Olivares y Urdaneta, (1985) precisaron, que posterior al periodo de equilibrio con el crioprotector debe procederse a precongelar las pajuelas de semen, en vapores de nitrgeno a 120 C por 10 minutos y luego introducir a 196 C. Para realizar el congelamiento de semen de carnero Angulo et al, (1999) sometieron a 4.5 cm sobre el nivel superior del nitrgeno durante 10 minutos. Hafez, (2002) menciona que en caso de las pajillas suelen congelarse en vapores de nitrgeno y almacenados a 196C, a menudo las ampolletas se congelan a razn de 3C/minuto hasta 15 y este desciende hasta llegar a 150 C, es ah entonces donde se depositan a 196C. Para el mtodo de pldoras se colocan gotas en un volumen aproximado de 0.1 ml, en huecos de forma hemisfrica hechos en bloques de hielo seco (-78 C), este procedimiento muestra buena supervivencia al descongelado. En otra investigacin con semen de caprino se demostr que es posible el congelamiento en vapores de nitrgeno en pajillas o en pastillas (pellets) en hielo seco en volmenes de 0.2 ml por un tiempo de 1 a 2 minutos, por cualquiera de estos mtodos se conservan en termo de nitrgeno lquido (Cueto et al, 2003).
1.6.5
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Fig. N 01 : Espermatozoides en criopreservacin. 1.6.6 DESCONGELAMIENTO DEL SEMEN Y EVALUACIN POST CONGELACIN. Despus de congelarse, los espermatozoides no resisten un segundo congelamiento, pues no sobreviven como los que han sido congelados en una primera oportunidad por ello es necesario asegurarse la utilizacin del semen congelado (Stornelli et al, 2005). La motilidad espermtica es la primera caracterstica de evaluacin y una de las principales que se realiza, pues es un importante indicador de vida del espermatozoide que se realiza antes y despus de la criopreservacin (Hafez, 2002). Se estima que entre el 40% y 50% de la poblacin de espermatozoides sobreviven al proceso de congelacindescongelacin. As bien, parte de la poblacin de espermatozoides que sobreviven han sufrido daos que les convierte en incapaces de fecundar (Watson, 2000). Cuando el semen criopreservado se descongela, se transfiere del tanque de nitrgeno a 37C durante 3 a 5 minutos o a una unidad de descongelamiento automtico (Hafez, 2002). Cueto et al, (2003) por otro lado afirma que la evaluacin de un 10% de las dosis congeladas en semen de caprino es importante, lo cual debe ser sometida a varias observaciones y poseer una motilidad masal al descongelamiento superior al 30% y un vigor del movimiento igual o superior a 2.5 segn escala (1 - 5) enunciada por Hafez, (2002). Se han descongelado pajillas de semen de vacuno a 37C con buenos resultados, mientras que las pldoras se descongelan mejor en un medio lquido a 40C, en condiciones prcticas de campo (Hafez, 2002). Se obtuvieron buenos resultados al descongelar semen de cerdo a 42 C/20 seg, obteniendo una motilidad de 28.8% y manteniendo 36.2% de clulas con acrosomas normales (Goslvez et al, 2003).
21
Otro resultado al descongelar semen de carnero a 38 C por 8 segundos se obtuvo una motilidad progresiva de 51.2%, para ello se consider que el semen fresco deba tener mayor a 60% de motilidad (Angulo et al, 1999). Para congelar el semen en camlidos sudamericanos (caso de la llama) se utiliz yema de huevo, glicerol y tris a lo cual se hallo una motilidad de 10% al descongelamiento (McEvoy et al, 1992). Se ha indicado que el dilutor PBS ms 40% de suero sanguneo, 5% de yema de huevo y 5% de glicerina logra conservar al post congelamiento una motilidad de 34% a partir de un promedio inicial de 69% en semen de alpacas (Bustinza, 2001). Al congelar semen de llama y utilizando el dilutor a base de citrato sdico, yema de huevo, glucosa mas los crioprotectores el DMSO (dimetil sulfxido) a 6% y glicerol a 8% se alcanz una motilidad individual de 20.4 % y una viabilidad de 32,4 % al descongelado (Aller et al, 2003). Para la congelacin de semen de alpaca se sirvieron del dilutor comercial Biladyl A y B mostrando buenos resultados frente a otros dilutores comerciales empleados en otras especies, encontrando un rango de motilidad entre 10 y 40% con un promedio de 21.3%, los cuales fueron congelaron en pajillas de 0.5 ml, los resultados en pellets (pastillas) mostraron 10% menor actividad motil (Vaughan J. et al. 2003). Para someter a congelamiento el semen de alpaca y llama procedentes del conducto deferente, se utilizaron como componentes del dilutor: TRIS buffer, cido ctrico monohidratado, fructuosa y yema de huevo, como crioprotector el glicerol a 7.5 %, se obtuvo un promedio general de 41.0 % de motilidad individual progresiva y 43.0% de motilidad a 5% de glicerol en llamas, el procedimiento de descongelamiento fue a 37 C por 30 seg (Prez et al, 2004).
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MATERIALES Y MTODOS 2.1 DEL LUGAR Se realiz en el Banco de Germoplasma de Camlidos Sudamericanos Domsticos del C. I. P. Quimsachata, en el INIA-Puno que se encuentra a 15 04 00 de Latitud Sur y a 70 18 00 Longitud Oeste a una altitud 4200 m.s.n.m. cuenta con una rea 6,282.50 has. El acceso es por trocha carrozable a 12 km del Distrito Santa Lucia, Provincia de Lampa y Regin de Puno. 2.2 MATERIALES Y EQUIPOS. 2.2.1 MATERIALES. Se utilizaron los siguientes materiales: Maniqu de madera cubierto por piel de alpaca hembra. Vagina artificial de PVC de 2 pulgadas de dimetro. Funda recta de ltex de uso en vacunos. Funda cnica de polietileno. Tubo colector falcn graduado de 15 ml. Termos de capacidad de 2 litros. Jeringas descartables de 1, 5 y 10 ml. Cubre objetos de 0.8 x 0.8 cm. Porta objetos de 3.5 x 1.0 cm. Pipetas de 1 ml y 10 ml. Gradilla. Algodn. Cinta adhesiva masking type. Rotulador. Vasos de precipitacin de 500 ml. Guantes quirrgicos descartables. Tubos de ensayo. Viales de 2 ml. Mechero. Pinza.
Detergente. Caja trmica de tecnopor. Superficie plana de acrlico (8 x 15 cm). Inflador. Esponjas pequeas. Ligas de sujecin. Toallas. Baldes. Lavador. Cocina a gas.
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2.2.2 MATERIAL QUMICO. Dilutor: TRIS (hidroximethyl) aminomethan AR 99.5%, laboratorio GMBH. Penicilina - Streptomicina 1000 UI, laboratorio Gibco. Glucosa, laboratorio Merck. cido ctrico, laboratorio Mallenckodt. Yema de huevo fresco (no mayor a tres (03) das). Crioprotectores: Glicerol 99.5% pureza. Laboratorio SIGMA - ALDRICH Etilen glicol 99.5% pureza. Laboratorio Malunckrodt. Otros: Alcohol. Desinfectante. Nitrgeno lquido. Combustible (gasolina de 84 oct.) 2.2.3 EQUIPOS. Microscopio de contraste de fases con 4 objetivos, marca Micros. Termmetro digital marca Checktemp 1, con una escala de 50 a 150 C. Balanza de precisin, capacidad 0.01 gr a 200 gr, marca Ohaus. Frazadilla elctrica de 110V, fabricado en Mxico. Tanque de nitrgeno de 18 litros, GM. Selladora, marca Impulse Sealer. Cmara fotogrfica marca Olympus de 3.5 megapixeles. Generador de luz de 220 voltios, marca Honda 650. Refrigeradora marca National de 14 pies, a gas propano. 2.3 ANIMALES DONADORES DE SEMEN. Se utilizaron los siguientes animales: Cuadro N 01: Alpacas donadoras de semen. N ARETE RAZA COLOR EDAD 01 02 03 04 05 06 07 103298 13145 EEI-021 EEI-022 EEI-005 289298 2170294 Huacaya Suri Suri Huacaya Huacaya Huacaya Huacaya Caf Blanco Gris Caf Blanco Lf Api Adulto Adulto Adulto Adulto Adulto Adulto Adulto
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08 09 10
1299M 040299 14803
Huacaya Huacaya Huacaya
Lf Lf Blanco
Adulto Adulto Adulto
Fuente: Elaboracin propia.
2.4
METODOLOGA.
2.4.1 PREPARACIN SEMINAL PRE CONGELAMIENTO. 2.4.1.1 OBTENCIN DE LA MUESTRA DE SEMEN. En este proceso se utilizaron 10 alpacas machos adultos preparados como donadores de semen, adems se cont un maniqu que estuvo incorporado en su interior con una vagina artificial acondicionado con una frazadilla elctrica con la finalidad de mantener la temperatura constante a 38 C durante el tiempo de cpula, este procedimiento se repiti a intervalos de 3 das por cada animal para poder obtener muestras de calidad, una vez que se cuenta con una buena muestra de semen se someti a bao mara a una temperatura promedio de 36C segn INIA, (2004) enseguida se realiz el anlisis macroscpico y microscpico, es en esta evaluacin donde se determina si las muestras procedern con la investigacin.
Fig. N 02: Animales empleados.
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Fig. N 03: Muestra de semen una vez obtenida. 2.4.1.2 EVALUACIN MACROSCPICA Y MICROSCPICA DEL SEMEN. Para la evaluacin macroscpica se tom en cuenta un volumen mnimo de 0.5 ml. Para la evaluacin microscpica se evaluaron la motilidad y mortalidad. Para la evaluacin de la motilidad y mortalidad se realizaron observaciones objetivas empleando para ello un microscopio de contraste de fases, analizando las muestras en un mnimo de 10 observaciones por muestra en distintos campos para una mayor precisin, las muestras fueron observadas a aumentos de 40X para semen fresco y 100X para anlisis de viabilidad, los resultados se expresaron en porcentajes. 2.4.1.3 PREPARACIN DEL DILUTOR. Para la preparacin del dilutor A se mezclaron los siguientes agentes qumicos TRIS (0.36 gr), cido ctrico (0.19 gr), que similarmente usaron en ovinos y vacunos Angulo et al, (1999), Olivares y Urdaneta, (1985); Adicionalmente se emple glucosa (0.05 gr), agua bidestilada estril (8.5 ml), antibitico (0.1 gr de penicilina -streptomicina 1000 UI), utilizado tambin en ovinos por Cueto et al, (2003), y como ltimo componente se utiliz yema de huevo (1.4 ml) que representa el 14%. Para la preparacin del dilutor B, primero se incorpora el dilutor A ms la adicin de los crioprotectores en 8 %, 10 % de glicerol y etilen glicol respectivamente.
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Fig. N 04: Dilutor congelado, ntese la coloracin amarilla brindada por la yema de huevo. 2.4.2 PREPARACIN Y PROCESO DEL CONGELAMIENTO SEMINAL. 2.4.2.1 PROCESO DE REFRIGERACIN Y AGREGADO DEL CRIOPROTECTOR. En primer lugar se realiz la dilucin del semen en el dilutor A en una proporcin 1:1 (mezcla A) a 36 C, para mantener dicha temperatura se someti a bao mara, enseguida la mencionada mezcla A es sometida a refrigeracin por espacio de 2 horas y 30 minutos aproximadamente hasta llegar a una temperatura de 5 C, tiempo adecuado para poder estabilizar la muestra a dicha temperatura (Angulo et al, 1999; Hafez, 2002; Cueto et al, 2003; Medrano et al, 2004).
Fig. N 05: Muestras de semen y dilutor sometidas a bao mara.

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Una vez alcanzada los 5 C se procedi a agregar el dilutor B a la mezcla A, lo cual se aadi en 3 partes cada 15 minutos, todo ello en igual proporcin 1:1 formando la mezcla B (dilutor B y mezcla A) enseguida se deja en un periodo de tiempo de 2 horas para permitir el equilibrio con el crioprotector. 2.4.2.2 PROCESO DE CONGELAMIENTO. Concluida el tiempo de equilibrio, se procede a preparar una caja trmica con las siguientes dimensiones (24 x 13 x 15 cm), en dicha caja se deposito el nitrgeno lquido (NL) hasta una altura de 3 cm, enseguida se sumergi una superficie plana de acrlico con las medidas (20 x 10 x 0.3 cm), por un lapso de 10 segundos hasta que el NL cese de ebullir, e inmediatamente despus se eleva la mencionada superficie en posicin horizontal quedando ubicado a 2 cm sobre el nivel del NL y expuestos sobre los vapores del mismo; quedando listo para depositar la muestras que estuvieron a 5 C, para ello con la ayuda de una jeringa de 1 ml se ubican sobre la superficie en un volumen que vara desde 0.10 ml a 0.15 ml por un espacio de 2 minutos (precongelacin), luego las muestras en precongelacin junto a la superficie de acrlico se sumergen al nitrgeno lquido (196C) para alcanzar la congelacin, es en este medio que se separan por si solos los pellets de la superficie acrlica para luego proceder a depositar y envasar en viales de 2 ml debidamente identificados, para su posterior anlisis post congelamiento.
Fig. N 06: Obtencin de las muestras para su congelacin.
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Fig. N 07: Precongelacin en vapores de nitrgeno.

Tapa externa
Pellets o pastillas en pre congelacion
5 cm 4 cm 3 cm 2 cm 1 cm
Superficie solida
Nitrgeno lquido (-196 C)
Fig. N 08: Vista lateral del procedimiento realizado.

Tapa externa
5 cm 4 cm 3 cm 2 cm 1 cm
Superficie solida
Fig. N 09: Ntese los pellets sumergidos a NL .

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2.4.3
EVALUACIN POST CONGELAMIENTO. Las muestras se obtienen del tanque de nitrgeno y se procede a someter al bao preparado a 38 C por un espacio de 90 segundos, enseguida se deposita una alcuota entre una lmina porta y cubre objeto que previamente fue temperada a 37 para su observacin, los resultados de motilidad fueron expresados en porcentajes, para ello se efectu varias observaciones por muestra analizada. La evaluacin de la motilidad se ejecut con la misma metodologa mencionada en el item de evaluacin macroscpica y microscpica del semen. ANLISIS ESTADSTICO. Para la presente investigacin se evaluaron cuatro tratamientos: T1 = 8% glicerol, T2 = 10% glicerol, T3 = 8% etilen glicol y T4 = 10% etilen glicol, con 10 repeticiones cada una, haciendo un total de 40 muestras. Para el anlisis estadstico se emple un diseo completamente al azar (DCA), para la comparacin de grupos se utiliz la prueba de media de contrastes ortogonales. El modelo aditivo lineal que se utiliz fue: Y ij = + Ci + Eij Donde: Yij = Es el efecto del crioprotector en la criopreservacin del espermatozoide de alpaca despus del congelamiento. = Efecto de la media general Ci = Efecto del i-simo crioprotector: i1 = Glicerol 8% i2 = Glicerol 10% i3 = Etilen glicol 8% i4 = Etilen glicol 10% jr = 1,2,3r (r = 10 repeticiones) Eij = Error experimental.
2.4.4
30
3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
EVALUACIN SEMINAL POST CONGELAMIENTO. RESULTADO DE MOTILIDAD DEL ESPERMATOZOIDE POST CONGELAMIENTO.
Los resultados que se muestra en el cuadro N 02, evidencian principalmente que la mejor motilidad que se hall al descongelado fue con el tratamiento a 8% de glicerol, obteniendo 31.93% en promedio de motilidad individual, y el siguiente mejor resultado fue 24.04% a 10% de glicerol, los dos siguientes tratamientos a 8 y 10% de etilen glicol mostraron valores inferiores por lo que se puede formular que no ejercen igual capacidad crioprotectora a los espermatozoides. Al ejecutar el anlisis de varianza a los datos mencionados post congelamiento, se pudo determinar que existen diferencias altamente significativas entre los tratamientos evaluados en su motilidad por lo que se demuestra estadsticamente al menos uno de los tratamiento en cada caso es diferente frente a los otros. RESULTADO DE MORTALIDAD DEL ESPERMATOZOIDE POST CONGELAMIENTO.
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Los resultados que se muestra en el cuadro N 03, demuestran principalmente una elevada mortalidad con el empleo de 8% y 10% de etilen glicol, en el siguiente caso de las muestras de glicerol mostraron menor mortalidad con respecto al etilen glicol. Al ejecutar la desviacin estndar en el cuadro de mortalidad post congelamiento, se pudo determinar que las muestras de glicerol tienen menor grado de dispersin frente a las de etilen glicol. Para determinar en forma especfica que tratamiento es diferente se efectu la prueba de contrastes ortogonales que se muestra en el siguiente cuadro N 04.
Fig. N 10: Espermatozoide observados.
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PRUEBA DE CONTRASTES ORTOGONALES PARA MOTILIDAD Y MORTALIDAD ESPERMTICA POST CONGELAMIENTO.
En el cuadro N 04 al realizar las comparaciones de glicerol y etilen glicol se determina que hay diferencias altamente significativas (P<0.01) aseverando que el glicerol es superior en capacidad crioprotectora frente al etilen glicol a iguales concentraciones. As mismo se hall diferencias significativas (P<0.01) entre las concentraciones de glicerol al 8% y 10% donde resulto mejor la proporcin de 8% demostrando un mejor perfil crioprotector. Y al efectuar el anlisis entre los dos diferentes porcentajes de etilen glicol (8% y 10%) no existe ninguna diferencia significativa (P>0.01), afirmando que son similares y que estas concentraciones no ejercen un buen efecto crioprotector.
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El presente cuadro destaca cuando se observa el resultado de contraste entre 8% y 10% de glicerol donde resulta no significativo (n.s.) debido a su similitud o semejanza entre los promedios y el grado de dispersin que muestran las unidades mustrales. De igual manera los resultados restantes se mantienen igual al cuadro N 04 en su grado de significacin. El mejor resultado en la presente investigacin fue empleando glicerol a 8% logrando una motilidad promedio de 31.93%, alcanzando niveles mximos de 46%, trascendiendo mejor que varios estudios realizados en camlidos domsticos hasta la fecha. Investigaciones anteriores que mostraron resultados inferiores a la presente investigacin podemos mencionar los siguientes: como el caso de McEvoy et al, (1992) quienes intentaron criopreservar semen de llama encontrando motilidades desde 5 a 10%, as tambin Huanta et al, (1999) en otra oportunidad obtuvo una motilidad de 20% y 25% con glicerol y etilen glicol respectivamente; en otra ocasin Huanca y Sapana, (2000) congelaron semen de alpaca y obtuvieron 5.22% de motilidad, mientras Aller et al, (2003) obtuvieron en llamas resultados semejantes al presente estudio, encontrando 20.4% de motilidad utilizando los crioprotectores DMSO (dimetil sulfxido) y glicerol.
34
Sin embargo equivalentes resultados a la presente investigacin encontraron Vaughan et al, (2003) pero con un rango mas amplio desde 10 a 40% y un promedio general de 21.3% de actividad motil; concluyendo estas referencias varios investigadores atribuyeron estos resultados poco alentadores a las caractersticas seminales de la alpaca. En ese sentido se plantearon otras alternativas de obtencin de semen y que tambin alcanzaron resultados similares y ligeramente superiores, uno de estos intentos fue efectuado por Prez et al, (2004) que obtuvo semen procedentes del conducto deferente y usando como medio de dilucin yema de huevo, tris, cido ctrico y glicerol encontr un rango de motilidad a la descongelacin de 24.4% a 43.0% en distintas proporciones de yema de huevo y glicerol. Similar resultado encontr Canorio et al, (2006) al congelar semen epididimario hallando resultados de 34% de motilidad progresiva usando dimetil acetamina como crioprotector. En la presente investigacin se obtuvo semen casi en las mismas condiciones naturales y caractersticas propias de una copula normal, en los casos anteriores las muestras de semen fueron obtenidas de lugares no comunes del aparato reproductor del macho. Con estos resultados se confirm lo mencionado por Watson, (1995) que durante el proceso de congelacin descongelacin se pierde aproximadamente el 50% de la poblacin inicial. Al respecto Katkov et al, (1998) indicaron que a pesar de que optimicemos el proceso de criopreservacin y minimicemos el riesgo de muerte celular, una parte de la poblacin celular no es capaz de sobrevivir; y aun as algunas clulas sobrevivientes se convierten en incapaces de fecundar afirmaron Stornelli et al, (2001); por lo que es necesario concentrarse en la funcionalidad de la poblacin sobreviviente sugieren Katkov et al, (1998). Sin duda los mejores resultados en cuanto a criopreservacin de semen de la alpaca estn alrededor de 7.5 y 8.0% de glicerol despus del presente estudio podemos concluir que no debe estar lejos la concentracin mas adecuada para su criopreservacin y su empleo en la inseminacin artificial. Los ultimo estudios han reportado el empleo del glicerol a concentraciones que oscilan desde 2% a 10% en las diferentes especies domesticas como ovinos, vacunos, porcinos y otros segn Medrano et al, (2004); Cabrera, (2007) y Batista et al, (2007). El grado de concentracin de los crioprotectores es variable debido a las caractersticas seminales que varia entre especies, por ello no es posible generalizar y adecuar a cualquier especie un protocolo de congelacin que funciona en otra, y por lo que es necesario realizar algunos cambios y experimentar otros agentes crioprotectores o nuevas metodologas.
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Para hacer algunas comparaciones de motilidad con otras especies a los resultados obtenidos hay una serie de investigaciones en otras especies como lo efectuado en semen de toros donde obtuvieron resultados mayor al 50% de motilidad al descongelado (Cabrera, 2007). En carneros ya se ha encontrado motilidades de 58.3% y 56.7% en razas de costa y sierra respectivamente Flores y Mellisho, (2004). En otro estudio por Flores et al, (2004) en ovinos hallo 48.2% desde 80.9% de motilidad inicial en semen fresco. En caprinos Ceiro et al, (2006) al evaluar la respuesta a la criopreservacin de semen pudo hallar una motilidad de 24.61%. En cerdos la mayora de los casos, la motilidad es menor a 50% menciona Watson, (1996), no obstante se ha registrado una motilidad espermtica de 40 a 50% en pellets y de 20 al 40% en pajillas segn publicaron Pursel y Jonhson, (1975). Otro estudio en cerdos hall una motilidad de 28.8% de motilidad post congelamiento investigacin que fue efectuado por Goslvez et al, (2003) sin embargo mejor resultado a lo enunciado por Goslvez encontr Crdova et al, (2004) con 47.14% de motilidad post congelamiento a partir de una motilidad inicial de 80%. Snchez et al, (1999) al investigar semen de canino encontr resultados al descongelado de 47.4%, a partir de una motilidad inicial de 83.8% de motilidad progresiva. Por todo lo mencionado antes, por los diversos investigadores en cuanto a los resultados de congelamiento de semen podemos afirmar que varios protocolos son sensibles a cambios, pues los resultados post congelamiento en mejor de los casos estn alrededor de 40% a 50% emplendose as en la inseminacin artificial, fertilizacin in vitro y otros, desde luego dependiendo de la especie. Por estos resultados con que actualmente se cuenta se viene investigando el nivel de eficiencia con el uso de semen congelado en la inseminacin artificial en diferentes especies, a pesar de estas caractersticas de motilidad.
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CONCLUSIONES El crioprotector que brind mejor motilidad individual fue el tratamiento de 8% de glicerol. En cuanto al etilen glicol la concentracin que mostr mejor motilidad individual fue al 10%, pero muy inferior al glicerol. El 8% de glicerol produjo menor mortalidad, confirmando la mejor concentracin de crioprotector en la presente investigacin. La mayor mortalidad hallada al descongelado fue empleando con 8% de etilen glicol. RECOMENDACIONES Para seguir avanzando con este trabajo y tomando como base lo efectuado se sugiere los siguientes. Experimentar proporciones mas finas de glicerol de preferencia entre el rango 7.5, 7.6, 7.7 hasta aproximadamente 8.4, 8.5% de concentracin final, para poder determinar lo mas ptimo. Investigar otras distancias (alturas) menor o mayor a 2 cm sobre el nivel superior del nitrgeno lquido, al cual se estudio en el presente. Realizar pruebas de criopreservacin en pajillas de 0.25 ml. Como investigacin secuencial a la presente, se debe ejecutar pruebas espermticas para determinar la condicin de la membrana celular como la integridad del acrosoma, pruebas hipoosmticas entre otros y finalmente la fertilidad de estas clulas. COMENTARIO Este estudio como se menciona antes se efectu en pellets, al parecer los resultados positivos pudo haber sido influido por la forma de la pastilla, pues en el proceso de congelacin a nivel de la lamina slida fue posible notar que tiene unas 03 etapas antes de la solidificacin total, que se recreara mas adelante en un grafico, pero esto es simplemente una hiptesis que necesita ser tomada o desechada, en este sentido podemos concluir que talvez hay una proporcin til de la pastilla optima y otra 02 posiblemente con menor calidad de clulas vivas. De todas maneras en todo lo mencionado antes nos podemos dar cuenta que hay diversas partes en la metodologa que requieren ser afinados.
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