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DILUYENTE SEMEN EQUINO FRESCO INRA 96

Presentacin Frasco de 200 ml. Unidad de 200 ml. en envase PET ( material biocompatible e irrompible ). Caractersticas tcnicas Suspensin de aspecto blanco lechoso, estril. pH: 7,10+/-0,10. Osm : 330 a 360 m Osm /kg Composicin Los medios a base de leche existentes en el mercado contienen la totalidad de las proteinas solubles y micelarias. La originalidad del medio INRA 96 es la de contener nicamente la fraccin pura de las proteinas micelarias de la leche altamente protectoras de los espermatozoides. El medio INRA 96 contiene antibiticos ( Penicilina y Gentamicina ) y un fungicida ( Amfotericina B ). Indicaciones El medio INRA 96 permite la conservacin y por tanto el transporte de semen equino, sea a + 4C ( condiciones anaerbicas ), sea a + 15 C ( condiciones aerbicas ).

Precauciones de empleo Proceder a la dilucin del semen para obtener una concentracin final de 20x106 espermatozoides /ml. El volumen de la dosis es de 10 ml. El operador si lo desea puede utilizar cantidades superiores a 200x106 espermatozoides totales por dosis. Advertencia: no utilizar jeringas con pistn de caucho butyl negro por problemas de citotoxicidad frente a los espermatozoides. Conservacin antes de usar El medio INRA 96 puede ser transportado a temperatura ambiente inferior a + 34C. Para una conservacin prolongada, es necesario conservarlo entre +2C y +8C. Caducidad 1 ao a partir de la fecha de fabricacin ( n lote y fecha de caducidad indicadas en la etiqueta ). Certificado de calidad Trazabilidad ascendente y descendente Fabricacin bajo campana de flujo laminar clase 100 segn norma GMP

Control calidad por el INRA antes de su comercializacin. Control de esterilidad por laboratorio exterior homologado.

PRESERVACION DE SEMEN. A continuacin daremos las frmulas de dos de los diluyentes ms utilizados. Diluyente de Kenney I Leche descremada (tipo Molico).......................................2,4 g Glucosa..............................................................................4,9 g Penicilina G cristalina........................................................150000 UI Estreptomicina cristalina....................................................150000 g Agua destilada c.s.p...........................................................100 ml Diluyente de Kenney II Leche descremada (tipo Molico).........................................2,4 g Glucosa................................................................................4,9 g Sulfato de Gentamicina.......................................................100 mg 8,4 % NaHCO3....................................................................2 ml Agua destilada ....................................................................92 ml (1) Otros antibioticos que pueden utilizarse: Ticarcilina/Ac. Clavulanico 1mg/ml Amicacina 1 mg/ml En este caso se recomienda mezclar todos los lquidos antes de agregar la leche ya que la acidez del antibitico puede hacer coagular esta ltima. Para evitar el deterioro rpido de la viabilidad espermtica, es conveniente una vez diluida la muestra mantenerla a temperatura (20-22 C) hasta el momento de la inseminacin. El diluyente debe proveer un pH compatible con el semen, entre 6.6 y 7.4 preferentemente ligeramente cido (6.6-6.8) y una osmolaridad que vare entre 300 y 400 mosm/l. Clculo de la dilucin: para que la concentracin final de espermatozoides en el semen sea de 50 millones por mililitro, se debe calcular primero el factor de dilucin. Este se calcula dividiendo la concentracin espermtica (en millones/ml) por 50 millones/ml. Concentracin espermtica (millones / ml) Factor de dilucin = 50 millones/ml 6 Si por ejemplo, la concentracin espermtica es de 300 x 10 esp./ml, el factor de dilucin obtenido ser 6. Por lo tanto deberamos colocar 1 parte de semen en 5 partes de diluyente (1+5=6). El semen ya diluido se coloca en una bolsa plstica y se cierra evitando en lo posible que queden burbujas de aire en su interior, es decir, tratando de asemejar una situacin de anaerobiosis. Esta bolsa se coloca dentro de un vaso plstico; si el volumen de la bolsa con el semen no es suficiente para ocupar todo el receptculo, se agregan otras bolsas de lquido coloreado que las provee el mismo equipo. Dichas bolsas estarn a la misma temperatura del semen y tienen el objeto de evitar el espacio de aire para que la transmisin de la temperatura sea ms efectiva. Se colocan dentro del Equitainer dos latas que contienen lquido refrigerante previamente congeladas -20 C por 24 horas, y arriba de ellas el vaso plstico. Luego se cierra y se transporta. La preservacin de semen mediante refrigeracin esta siendo cada vez ms usada debido a que puede implementarse un programa de inseminacin artificial an cuando el padrillo se encuentra

a distancia considerable de las hembras a inseminar. Es importante tener en cuenta que la inseminacin se realiza a la misma temperatura del Equitainer, no se debe pre- calentar la muestra. Con el objeto de determinar qu cantidad de semen diluido habr que depositar en el tero de la hembra, debemos recordar que una dosis inseminante segura es de alrededor de 1000 espermatozoides con movilidad progresiva (dosis inseminante standard: 500 espermatozoides con movilidad progresiva). Ejemplo : Se desea inseminar tres yeguas con semen refrigerado. Se evala el eyaculado una vez extrado y filtrado y se obtienen los siguientes datos: a) Volumen: 50 ml b) Concentracin: 300 millones /ml c) Motilidad progresiva: 50 % Se realizan los siguientes clculos: 1) Clculo del nmero total de espermatozoides en el eyaculado Concentracin x Volumen 300 millones de espermatozoides / ml x 50 ml = 15000 millones de espermatozoides 2) Clculo del nmero total de espermatozoides con motilidad progresiva N total de espermatozoides x % de motilidad progresiva 15000 millones de espermatozoides x 50 % = 7500 millones de espermatozoides. 3) Clculo de cantidad de dosis en el eyaculado 7500 millones = 7,5 dosis 1000 millones 4) Volumen de la dosis 50 ml = 6,6 ml

7,5 dosis
5) Clculo del factor de dilucin 300 millones de espermatozoides / ml =6 50 millones de espermatozoides / ml 6 = 1 parte de semen + 5 partes de diluyente 6) Dilucin de la dosis inseminante 6,6 + 33 ml= 39,3 ml Sern necesarios en nuestro ejemplo, aproximadamente 40 ml de semen diluido para lograr una dosis inseminante de 1000 millones de espermatozoides con una movilidad progresiva pos refrigeracin del 50%.

http://tarwi.lamolina.edu.pe/~emellisho/IA_archivos/Recoleccion%20y%20evaluaci on%20de%20semen%20equino%20.pdf Aurich, C. (2005): Factors affecting the plasma membrane function of cooledstored stallion spermatozoa. Animal Reproduction Science, Vol. 89

Efecto de la congelacin y descongelacin de semen equino, en dos diluyentes comerciales


RICARDO AVILA AVILA Septiembre, 2009
Las bacterias en el semen equino han sido controladas con el uso de diluyentes comerciales que contienen concentraciones de antibiticos adecuados. Sin embargo, el efecto perjudicial de los antibiticos sobre la motilidad espermtica puede ser mayor en el almacenamiento (Jasko et al., 2004) Artculo de revisin

Espermatozoides tcnicas de manipulacin: Un kit de reproduccin asistida actual herramienta de la tecnologa en la fisiologa reproductiva
IP Ogbuewu , Ogundu UE , Opara MN , Okoli IC , DO Umesiobi , U. Herbert y Iloeje MU
RESUMEN

La aplicacin de las tecnologas en el campo de la fisiologa reproductiva masculina ha avanzado mucho durante el ltimo par de dcadas. Desde entonces, la llegada de semen congelado y la inseminacin artificial, los fisilogos reproductivos han intentado manipular las tasas de reproduccin masculinas de los mamferos a veces con xito ya veces no. Las ltimas cinco dcadas se ha traducido en una expansin fenomenal en la mejora de espermatozoides con aplicacin directa a la ganadera y la medicina. La espermatognesis se haba informado de que se induce en los animales machos con las drogas sintticas de fertilidad y extractos de plantas locales. La produccin de espermatozoides y funcin han sido mejoradas a travs del uso de los regimientos de nutricin, diluyente y la mezcla de billar semen. En la actualidad, el sexo del animal ha sido predeterminado con 85-95% de precisin por los espermatozoides de sexado. El xito actual registrada en la masculina las tcnicas de reproduccin asistida se produjo debido a los avances en ciencias de la computacin, la biofsica, biologa celular e ingeniera gentica. Esta revisin cubrir brevemente la evolucin y las modificaciones de las tcnicas existentes de esperma de manipulacin que tienen aplicaciones prcticas directas, hoy y en un futuro prximo en la ganadera y la bio-medicina.

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IP Ogbuewu, Ogundu UE, Opara MN, Okoli IC, Umesiobi DO, Herbert U. y MU Iloeje de 2010. Espermatozoides tcnicas de manipulacin: Un kit de reproduccin asistida actual herramienta de la tecnologa en la fisiologa reproductiva. Revista de Ciencias Mdicas, 10:. 110-123 DOI: 10.3923/jms.2010.110.123 URL: http://scialert.net/abstract/?doi = jms.2010.110.123 Recibido: 18 de junio 2010; Aceptado: 08 de julio 2010; Publicado: 22 de julio 2010

INTRODUCCIN Un gran progreso se ha realizado durante los ltimos 30 aos el campo de la fisiologa de la reproduccin a travs de la manipulacin de los espermatozoides para la mejora de la capacidad reproductora masculina. Manejo nutricional ( Herbert et al , 2005. ; Ogbuewu et al ., 2009a ), las drogas sintticas ( Herbert et al , 2000. ), la preservacin de semen y de almacenamiento ( Umesiobi et al , 1998. , 2002 , 2004 ; Umesiobi, 2004 ) y mezcla de semen de la piscina ( Ogbuewu et al ., 2007 ) son algunos de los mtodos ms recientes utilizados para mejorar la fertilidad masculina. La capacidad de seleccionar sementales superiores es otra manera de que muchos cientficos han mejorado el desempeo reproductivo del hombre. Congelacin de semen y los procedimientos de inseminacin han cambiado mnimamente en las ltimas dos dcadas. Sin embargo, los promedios de tasas de embarazo no han mejorado espectacularmente y, en el mejor de los casos, siendo alrededor del 50 y el 70% para la inseminacin a tiempo fijo (AI) y la cra de calor detectados, respectivamente. Las limitaciones en la sincronizacin del estro y la fertilidad del rebao cuenta las insuficiencias de las tasas de embarazo. El objetivo de los cientficos es desarrollar protocolos que minimicen los costos y el nmero de

veces que se manipulen animales, sin embargo, aumentar las tasas de embarazo a la gripe aviar Inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides (ICSI) es otra tcnica de reproduccin asistida de la eleccin. Como su nombre lo indica, el proceso incluye la recoleccin de la transformacin, la maduracin y la inyeccin de un solo espermatozoide en un ovocito. Inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides supera los problemas de fertilidad relacionados con cualquiera de los espermatozoides o el huevo. Para llevar a cabo la ICSI, el vulo se lleva a cabo por el vaco a un pequeo tubo de vidrio. Un espermatozoide individuo se carga en una jeringa de micro, que se gua cuidadosamente en el ovocito y el espermatozoide se inyecta en el vulo. Uno de los avances ms recientes de investigacin reproductiva es la capacidad de transferir las espermatogonias (las clulas espermticas precursoras) de un hombre a otro. Esta tcnica ha producido descendencia en ratones. El principio de la transferencia de esperma se abre la puerta a la posibilidad de utilizar los toros ms bajos de calidad como portadores de esperma de los machos de alto valor. El procedimiento consiste en la prestacin de los testculos del macho recipiente estril y volver a poblar el testculo con clulas madre de espermatogonias de un macho donante. Esta tecnologa es actualmente impracticable, pero si lo que se refiere a buen trmino, podra revolucionar la agricultura animal y la propagacin de la gentica de toros sobresalientes. Espermatozoides y manejo nutricional La eficiencia de la produccin de esperma, la libido y la calidad de los espermatozoides tienden a permanecer uniforme en toda la vida reproductiva de un animal, pero puede ser alterado de manera significativa por la edad, el estado de nutricin, medio ambiente y la salud ( Togun y Egbunike, 2006 ; Ogbuewu et al ., 2009a , b ). Entre estos factores, la nutricin es la ms prominente. El rendimiento ptimo de un animal depende de la disponibilidad de una buena nutricin ( Togun y Egbunike, 2006 ; Ogbuewu et al , 2009a. , b , 2010a ). La madurez sexual se sabe que se retrase por un regimiento de la mala nutricin durante el crecimiento ( Omole, 1982 ). Tambin se afecta a la edad de la pubertad y la estimulacin del hipotlamo para producir las clulas intersticiales hormona estimulante que acta sobre el tejido testicular ( Cogan et al ., 2004 ). Segn Luzi et al . (1996) , el protocolo de la dieta restringida reduce la libido y algunos rasgos de calidad de esperma. Sin embargo, el factor ms importante no es la cantidad de la dieta de la Fed, pero sus caractersticas qumicas. Las dietas con ms del 15% de protena cruda son adecuados para la produccin de esperma ( Nizza et al , 2000. ; Fodor et al ., 2003 ). En los espermatozoides de mamferos, una cantidad muy alta de los lpidos se asocian con la fluidez de la membrana y su competencia ( Apel-Paz et al ., 2003 ). Adems de la dieta de cidos grasos poliinsaturados n-3 modificado varios rasgos de conejo espermatozoides ( Castellini et al ., 2003 , 2004 ). En contrario, los niveles altos de colesterol en la dieta altera el metabolismo de las clulas de Sertoli y el proceso normal de la espermatognesis ( Yamamoto et al ., 1999 ). Los altos niveles saturados de la membrana de los espermatozoides hace que estas clulas muy susceptibles a la peroxidacin ( De-Lamirande al ., 1997 ), que degrada la estructura de la membrana espermtica, la integridad del ADN, el metabolismo de los espermatozoides y la produccin de esperma ( Jones et al ., 1979 ).

Espermatozoides y medicamentos para la fertilidad sintticas y naturales La calidad del semen se ha informado de que se mejora por parte de algunos medicamentos para la fertilidad como el citrato de clomifeno ( Herbert et al , 2000. ; Ndubeze, 2002 ) y la edad de madurez sexual fue reportado por Chibundu (2005) al ser reducido por el uso de estradiol en buck conejos. Sin embargo, el alto costo de estos preparativos les hizo totalmente inaceptable para los investigadores en el rea de estudio. La bsqueda de compuestos naturales de origen vegetal o planta que podra ser de beneficio como agentes de control de anticoncepcin y la fertilidad se encuentra en el aumento de hoy en da sobre todo en pases del tercer mundo por el costo elevado de estas drogas sintticas ( Atawodi et al , 1995. ; Adedeji et al ., 2006 ; Ogbuewu et al , 2009a. , 2010a ). Las plantas que antes se consideraban sin valor estn siendo investigados, evaluados y desarrollados en las drogas con efectos secundarios poco o nada ( Adedeji et al , 2006. ; Ogbuewu et al ., 2009a , 2010a ). Una de estas plantas es Azadirachta indica , Glycine max y Garcinia kola ( Adedeji et al , 2006. ; Ogbuewu et al , 2009a. , 2010a ). El aumento observado en calidad de esperma parmetros de animales machos administrados preparaciones vegetales locales se podra atribuir en parte por la actividad antioxidante de estas plantas ( Ogbuewu et al ., 2010a , b ). Espermatozoides y antioxidantes (tocoferol) Varios investigadores han logrado resultados positivos en la reproduccin masculina mediante la aplicacin de la vitamina E en sus estudios ( Marn-Guzmn et al , 1997. ; Mbaegbu, 2004 ; Oguike, 2004 ; Osuagwu, 2004 ; Ogbuewu et al ., 2010c ). La vitamina E puede afectar el desarrollo testicular o de los espermatozoides y la motilidad de los espermatozoides ( Marn-Guzmn et al ., 1997 ). La deficiencia de vitamina E puede afectar a diferentes aspectos de los procesos reproductivos del hombre y, posiblemente, la fertilizacin de los vulos en la mujer ( Cooper et al ., 1987 ). La vitamina E es necesaria para la produccin de testosterona ( MarnGuzmn et al ., 1997 ). En el semen, la tendencia de alfa-tocoferol es an ms complejo que en el plasma. El nivel estndar de alfa-tocoferol en el semen de conejo es relativamente baja (0.2 a 0,9 mmol L -1 ) ( Marn-Guzmn et al ., 1997 ). Marn-Guzmn et al . (1997) inform de que el alfa tocoferol, beta, gamma y delta no se distribuye homogneamente en fracciones de semen de conejo. Alfa-tocoferol es el antioxidante lpido principal en todas las fracciones, el gamma tocoferol, betatocoferol y delta-tocoferol son ms abundantes en las clulas germinales y el plasma seminal, respectivamente ( Marn-Guzmn et al ., 1997 ). Cabe sealar que el alfa tocoferol en conejos tiene una menor biodisponibilidad que en los seres humanos ( Gallis et al ., 2001 ), probablemente debido a la baja en grasas, alta en fibra de la dieta de conejo que limitan la absorcin de vitamina E ( Iuliano et al ., 2001 ) . Sin embargo, la biodisponibilidad del alfa-tocoferol en el semen y la sangre no es lineal ( Castellini et al ., 2002 ). La espermatognesis y fotoperiodismo La longitud de la manipulacin artificial de da es uno de los factores que influyen en la calidad y cantidad del semen ( Bodnar et al ., 2000 ). Fotoperiodismo afecta al eje hipotlamo-hipfisis y por lo tanto la liberacin hormonal y los espermatozoides de produccin. De acuerdo con Theau-Clemente et al . (1994) una longitud de la luz de largo (16L: 8D) programa aumenta la produccin de esperma

(aspectos cualitativos y cuantitativos), en comparacin con una longitud ms corta la luz (8L: 16D). Por el contrario, la intensidad de luz no afect significativamente las caractersticas del semen ( Besenfelder et al ., 2004 ). PRODUCCIN espermatozoides y frecuencia de la eyaculacin Varios autores han estudiado diversos ritmos de recogida de esperma que varan de uno a cuatro eyaculados por da ( Bodnar y cols , 1996. ; Bunaciu et al ., 1996 ), en horarios diarios o semanales que varan de una vez por semana ( Bencheikh, 1995 ; Bunaciu et al ., 1996 ) para la recogida diaria ( Bodnar et al ., 1996 ). La intensificacin de las tasas de recaudacin aument la cantidad de semen por semana, pero, inevitablemente, tuvo un efecto negativo en la calidad ( Bodnar et al ., 1996 ). Ritmos de recogida de esperma se considera intensiva cuando se implican dos eyaculados sucesivos (a menos de 15-30 minutos) tres veces por semana, extensas con slo dos eyaculados sucesivos, una vez por semana y semi-intensiva con dos eyaculados sucesivos, dos veces por semana ( Bodnar et al . , 1996 ). PRESERVACIN DE ESPERMATOZOIDES El esperma conservado es un componente importante e integral para el avance de la ciencia de la fisiologa de la reproduccin. En virtud de esta tcnica podra ser esperma almacenado indefinidamente, utilizado ampliamente y puede exportarse fcilmente. El esperma congelado facilita el intercambio internacional de material gentico, permite que la gripe aviar en dos de las estaciones reproductiva y no reproductiva, y extiende la vida til del aparato reproductor masculino valioso ms all de su propia vida. Desarrollo de la criopreservacin de espermatozoides de cabra, sin embargo, ha progresado a un ritmo ms lento que el ganado vacuno y ovino ( Abdullah et al ., 1997 ). La criopreservacin de espermatozoides es un proceso complejo, que conlleva un equilibrio entre muchos factores para la obtencin de resultados satisfactorios. Criopreservacin de semen es una tcnica difcil debido a la presencia del plasma seminal (secreciones de las glndulas bulbouretrales un lipasas), que interactan con un poco de diluyente (yema de huevo) para crear sustancias que son txicas para los espermatozoides ( Iritani et al ., 1964 ). Esta situacin no se ha observado en el semen de ganado ampliado con la yema de huevo ( Baldassarre y Karatzas, 2004 ). Hasta ahora, el uso de los diluyentes de crioconservacin de Tris-yema de huevo, tales como la descrita por Salamon y Ritar (1982) se recomienda, ya que es fcil de usar. Sin embargo, los diluyentes comerciales que no tienen componentes biolgicos se han desarrollado para mejorar la seguridad sanitaria en el tratamiento del esperma ( Hinsch et al , 1997. ; Gil et al ., 2003 ). Sin embargo, la adopcin de estas tcnicas en los pases del tercer mundo se ha visto obstaculizada debido al alto costo de estos preparativos y desarrollo de la infraestructura deficiente. Esto ha llevado al desarrollo de diluyentes de semen a partir de materiales locales a base de hierbas o plantas en Nigeria ( Umesiobi et al , 1998. , 2002 ; Umesiobi, 2004 ). Inyeccin Intracitoplasmtica de Espermatozoides Inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides es la insercin mecnica de un solo espermatozoide directamente en el citoplasma de una maduracin, los ovocitos metafase utilizando una aguja microscpica. Se trata de un tipo especial de in vitro fertilizacin (IVF) y una de las avanzadas tecnologas de reproduccin asistida que ahora es ampliamente utilizado para superar la infertilidad por factor masculino en los animales y los seres humanos. En esta tecnologa, un espermatozoide se recoge en una micropipeta y se inyecta directamente a travs de la zona pelcida en el

citoplasma del ovocito maduro ( Devroey y Van Steirteghem, 2004 ). La tasa de fertilizacin es generalmente muy alta en estos casos ( Shawky et al ., 2006 ). La ICSI ha demostrado su eficacia en la produccin de miles de bebs humanos, desde su primer xito en 1992 ( Palermo et al ., 1992 ). Ha habido varios estudios que comparan las tasas de embarazo entre los convencionales in vitro la fertilizacin y el ICSI ( Shawky et al ., 2006 ). Inseminacin intrauterina La inseminacin intrauterina se introdujo en la dcada de 1980 como parte del tratamiento de parejas infrtiles debido a varios problemas como la infertilidad por factor masculino, factor de moco del cuello uterino, los anticuerpos de espermatozoides e infertilidad inexplicable. En esta tecnologa el esperma se recoge en un recipiente estril. El esperma se lava luego y se concentr en 1-3 ml del medio de cultivo y se utiliza para la inseminacin intrauterina. El valor de esta tecnologa es tener una alta concentracin de esperma sin pasar por el factor de mucosidad cervical ( Ombelet et al ., 2003 ). Los espermatozoides depositados en el tero estar en las proximidades de las aberturas de las trompas y por lo tanto tendr ms rpido el acceso a los ovocitos. Ciertamente, el lavado de la esperma aumenta la capacitacin y ayuda a la tasa de fertilizacin ( Ombelet et al ., 2003 ). La tasa de embarazo en estas situaciones es entre el 30 y el 40% ( Ombelet et al ., 2003 ). El objetivo principal de la preparacin de los espermatozoides es aislar el mximo nmero de espermatozoides mviles, eliminar los espermatozoides muertos, las clulas amorfas, los leucocitos y plasma seminal separados de la eyaculacin, sin causar ningn dao a las clulas de esperma. Varios mtodos de preparacin de los espermatozoides de lavado se han utilizado como piscina,, nadar hacia abajo, la filtracin de lana de vidrio y centrifugacin en gradiente de densidad ( Henkel y Schill, 2003 ). INSEMINACIN ARTIFICIAL Inseminacin Artificial (IA) es un trmino que cubre una amplia gama de tcnicas, todos los cuales implican la colocacin de espermatozoides en el tracto genital femenino artificialmente. La inseminacin artificial es la primera generacin de biotecnologas reproductivas, tanto histricamente como en trminos de nmeros de todo el mundo. La introduccin de la gripe aviar en los animales de granja se vio obligado por razones sanitarias y las primeras aplicaciones a gran escala con un objetivo comercial se realizaron en los aos treinta del siglo pasado. Cinco tcnicas de inseminacin se utilizan en todo el mundo en los animales ( Leboeuf et al ., 2000 ). La inseminacin puede incluir la inseminacin intravaginal, la inseminacin intrauterina, inseminacin intracervical, la inseminacin intratubrica y la inseminacin intraperitoneal. ESPERMA SEXO Un rea que ha atrado importante esfuerzo de investigacin en los ltimos aos es la posibilidad de desarrollar tecnologa que permita el sexaje de espermatozoides en los otros para predeterminar el sexo del animal joven. En los mamferos, la informacin primaria para la determinacin del sexo est situado en el brazo corto del cromosoma ( Sinclair et al ., 1990 ). Los cromosomas sexuales se distribuyen equitativamente entre las clulas de esperma y la oportunidad de convertirse en una descendencia masculina o femenina es al azar a 50: 50 citas. Una tecnologa conocida como Tecnologa de Beltsville Sexado de espermatozoides ( Johnson, 1991 ) permite la identificacin de X o Y-cromosoma esperma que porta sobre la base de la diferencia relativa en el contenido de ADN y para determinar el sexo de las cras antes de la fertilizacin. El semen sexado Beltsville la tecnologa ha sido validada

sobre la base de los nacidos vivos, el laboratorio de re-anlisis de semen sexado, el contenido de ADN y la biopsia del embrin para la determinacin del sexo ( Johnson y Welch, 1999 ). HISTORIA DE SEXO ESPERMA Muchos avances importantes en las tcnicas de reproduccin se produjo a finales de 1970 y principios de 1980. La primera fue la medicin exacta del contenido de ADN de los espermatozoides mediante citometra de flujo ( Garner, 2001 ). En este sistema de medicin, fluorocromo manchado de esperma se hace fluir a travs del sistema de una manera precisa, de un solo archivo, de modo que el colorante que se une a cada celda puede ser excitado por una longitud de onda especfica de luz, con lo que emite una seal fluorescente. La fluorescencia de cada espermatozoide teido se recoge con un tubo fotomultiplicador y la informacin cuantitativa se transmite a un sistema computarizado en el que los espermatozoides se pueden clasificar de acuerdo a la intensidad de fluorescencia. Dicho sistema de medicin, que es capaz de hacer mediciones precisas y exactas de seales fluorescentes, se demostr que era tericamente capaz de medir la pequea diferencia en el contenido de ADN entre los espermatozoides X e Y-cromosoma del cojinete ( Van Dilla et al ., 1977 ) . Los primeros esfuerzos para usar este sistema de citometra de flujo para medir el contenido de ADN de los espermatozoides eran poco xito, en parte debido a que el ncleo del espermatozoide altamente condensada hace que la medicin de fluorescencia cuantitativa difcil debido a la inusual forma de la cabeza y compactacin de la cromatina ( Van Dilla et al . , 1977 ). Este problema fue conquistada en la dcada de 1980 por los instrumentos que sea orientada esperma durante la medicin o cuya medicin coaxial principal era esencialmente insensible a la orientacin de la clula ( Otto et al , 1979. ; Pinkel y col ., 1982 ). Un instrumento a medida utiliza una aguja biselada, aplanada a hidro-dinmicamente forzar cada espermatozoide en una orientacin similar, permitiendo as una medicin precisa de la fluorescencia de la superficie plana de los ncleos ms esperma ( Fulwyler, 1977 ; Dean et al ., 1978 ) . Esta instrumentacin proporcionan mediciones de alta resolucin del contenido de ADN de esperma de mamferos ( Pinkel y col ., 1982 ). Una pieza temprana de evidencia de que las mediciones de citometra de flujo podra diferenciar entre las clulas X e Y fue la deteccin de una diferencia en el contenido de ADN de esperma de ratones con una anormalidad gentica inducida qumicamente en comparacin con los de los ratones normales ( Gledhill et al , 1982. ; Pinkel et col ., 1982 ). Esta cepa inusual, llamado el ratn Cattanach, tena una translocacin de un fragmento del cromosoma 7 para el cromosoma X ( Cattanach, 1961 ; Disteche et al ., 1981 ). La diferencia en el contenido de ADN entre los picos bimodales de los espermatozoides desde el ratn Cattanach fue del 4,9%, mientras que la de los ratones normales fue del 3,3% ( Pinkel et al ., 1982 ). La diferencia en la determinacin del sexo gentico entre mamferos y aves proporcionan otra pista importante. En los mamferos, el sexo est determinado por el espermatozoide que fecunda el vulo, la X o Y que porta el cromosoma de gametos. En las especies de aves, sin embargo, el sexo es determinado por el ovocito, y no por el espermatozoide fertilizar. Especies de aves producen solamente Z - esperma. Los anlisis de citometra de flujo de esperma de gallo revel un solo pico, mientras que los de los mamferos tena dos picos ( Garner et al ., 1983 ). El mtodo de citometra de flujo se aplic de inmediato a la esperma de animales domsticos ( Garner et al ., 1983 ).

El mtodo de citometra de flujo se aplic de inmediato a la esperma de animales domsticos ( Garner et al ., 1983 ). Las diferencias de contenido de ADN en las poblaciones bimodales de los espermatozoides de toros, jabales, carneros y conejos fueron del 3,9, 3,7, 4,0 y 3,9%, respectivamente ( Garner et al ., 1983 ). Los mtodos de preparacin de esperma para el anlisis de citometra de flujo era destructiva porque la mayora de las colas y de las membranas y el citoplasma se retira, dejando el esperma biolgicamente inutilizable ( Gledhill et al , 1984. ; Gledhill, 1988 ). La citometra de flujo tambin se utiliz para probar la validez de las afirmaciones de que el semen se haba enriquecido tanto en la X o un espermatozoide Y por otros mtodos. Usando una variedad de tcnicas de separacin para el enriquecimiento, incluyendo la sedimentacin, electroforesis, filtracin, centrifugacin, los gradientes de albmina y conveccin-contador galvanizacin streaming, galvnica y las diferencias de carga elctrica, las muestras de semen se analizaron para determinar si cualquiera de las poblaciones de la X o Y esperma haba sido mejorado . Fisiologa bsica de los espermatozoides La espermatognesis en los animales es un proceso complejo que consta de varias divisiones celulares que con el tiempo separa los cromosomas X e Y en espermatozoides diferentes. Cada espermatozoide de mamferos tienen la misma oportunidad de llevar el cromosoma X que producen las hembras o el cromosoma Y, que se producen machos ( Amann, 1989 ). Por lo tanto, en los mamferos el sexo de la descendencia se determina en el momento en que el espermatozoide entra en el vulo. Es bien sabido que es necesario disponer de un cierto nmero de espermatozoides viables con el fin de lograr la fertilidad ptima ( Salisbury y Vandemark, 1961 ; Pace et al ., 1981 ). Cualquier tcnica que elimina o destruye en la X o Y teniendo espermatozoides se reduce el nmero potencial de hijos que un hombre puede engendrar a la mitad. Esto es porque el nmero de espermatozoides viables necesarios para dar fertilidad ptima sigue siendo el mismo con el semen sexado. ESPERMA SEXO El sistema de anlisis de citometra de flujo podran identificar la X e Y las poblaciones de espermatozoides, pero esta tecnologa no se podan separar los espermatozoides vivos. El sistema analtico desarrollado en el Lawrence Livermore National Laboratory sistema de medicin no lo hizo con eficacia X independiente intactas y los espermatozoides Y. Para alcanzar esta meta, un Coulter EPICS V basado en lser citmetro de flujo ortogonal / clasificador de clulas en el USDA en Beltsville, Maryland, fue modificado por el biselado de la inyeccin de la muestra la punta del tubo y la sustitucin de un detector de fluorescencia hacia el ngulo y un haz de fibra ptica para la dispersin de la luz detector de fluorescencia de modo que se poda medir con precisin ( Johnson y Pinkel, 1986 ). Este instrumento modificado se utiliz para reordenar la X y el primer cromosoma portador de ncleos de esperma ( Johnson et al ., 1987b ), que separa los ncleos en las poblaciones X e Y con una pureza del 95%. Tincin estequiomtrica de los ncleos de esperma utilizado tratamientos severos con dimetilsulfxido (DMSO) se lava para eliminar las membranas que rodean, fijacin en etanol y la digestin de proteasa para asegurar la disponibilidad de ADN para interactuar con colorante ( Garner et al , 1983. ; Johnson et al ., 1987b ). Esperma Chinchilla fueron los gametos de eleccin debido a una diferencia 7,5% en contenido de ADN entre el espermatozoides X e Y ( Garner et al , 1983. ; Johnson et al , 1987b. ). Este

procedimiento de clasificacin tambin se emplea un tinte nuevo ADN, Hoechst 33342, que se tie el ADN de los espermatozoides ms eficiente y precisa ( Johnson et al ., 1987b ) que previamente utilizado colorantes. El procedimiento de tincin Hoechst 33342 antes se ha mejorado para hacer el proceso menos perjudicial para los espermatozoides. Sonicacin de la muestra durante 10 segundos antes de la tincin eliminado la necesidad de preparar los ncleos de esperma por la exposicin a DMSO, etanol y proteolisis ( Johnson et al , 1987a. , b ; Johnson y Clarke, 1988 ). Ms tarde se encontr que los espermatozoides intactos podra ser cuantitativamente tieron con Hoechst 33342 sin causar un dao significativo a la morfologa celular o la motilidad ( Johnson, 1990 ). La adicin de yoduro de propidio a la mezcla de tincin proporcionan un medio para eliminar los espermatozoides muertos y daados a partir del producto ordenados. Yoduro de propidio, que se tie la membrana de los espermatozoides daados, ms tarde fue reemplazado con colorante de alimentos. Esto se hizo porque la mayora de los colorantes alimentarios apaga Hoechst 33342 con seguridad, haciendo la seal de Hoechst 33342 unido al ADN diferente en espermatozoides muertos que en los espermatozoides vivos ( Johnson et al , 1999. ; Rens y cols , 1999. ; Johnson y Welch, 1999 ) . ESPERMA SEXO Y VELOCIDAD Velocidad de clasificacin de esperma depende de la orientacin de los espermatozoides a travs del instrumento. Un sistema mejorado para la orientacin de los espermatozoides durante el proceso de clasificacin se desarroll en el USDA ( Rens y cols , 1999. , Johnson et al , 1999. , Welch y Johnson, 1999 ; Johnson, 2000 ). Este diseo de la boquilla aument la proporcin de espermatozoides que se podra medir correctamente un 25% a ms del 60% ( Rens y cols ., 1998 , 1999 ). La nueva boquilla fue adaptada para un clasificador de alta velocidad y el aumento de las tasas de clasificacin de 2 a 6x10 6 espermatozoides h -1 para cada sexo ( Rens y cols , 1998. , Johnson et al ., 1999 ). El Departamento de Agricultura de esperma orientadora de la boquilla se ha adaptado para su uso con Cytomations SX MoFlo y su capacidad de orientacin reforzada por las modificaciones desarrolladas en XY Inc. Implementacin de las modificaciones de estos y otros a la MoFlo SX de XY Inc. han aumentado significativamente la eficiencia de la clasificacin de espermatozoides X e Y . Este instrumento es capaz de modificar la clasificacin 15 x 10 6 espermatozoides bovinos h / para cada sexo ( Seidel, 2000 ; Schenk, 2001 ). BAJAS DOSIS DE inseminacin con semen sexado Clasificacin de flujo ha mejorado en 1996, por lo que era posible producir suficiente esperma sexado vivir que la inseminacin oviductal, fecundacin in vitro o inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides (ICSI) era viable ( Seidel et al , 1996a , b ). El nmero de espermatozoides disponibles, sin embargo, fueron insuficientes para la inseminacin artificial de rutina debido a la prctica habitual utilizada para la inseminacin en el orden de 20x10 6 dosis de esperma de -1 . Este nmero no parece razonable teniendo en cuenta que slo un espermatozoide es necesario para fertilizar un vulo. Los problemas asociados con el esperma de xito que atraviesa el tracto genital de la hembra fueron dejados de lado por inseminacin semen sexado, directamente en el istmo del oviducto ( Johnson, 1992 ). La probabilidad de que la colocacin de menor nmero de espermatozoides en un sitio ms cerca de donde ocurre la fertilizacin de un animal dado lugar a un experimento para probar el concepto de que menos de espermatozoides por dosis de inseminacin se podra utilizar si los gametos se colocaron de manera ms

ptima dentro del tracto femenino. Esto fue probado mediante el depsito de slo el 1-5x10 5 espermatozoides / dosis profundamente en el cuerno uterino de vaquillas con las traumticas, de apertura lateral vainas comnmente empleados en la transferencia de embriones ( Seidel et al ., 1996a , b , 1997 ). Estos embarazos precoces de la fbrica, esperma sexado fueron seguidos por la formacin de XY, Inc. y ha iniciado la instalacin de un clasificador de semen de alto rendimiento en Colorado para que pudiera estar a una distancia razonable de conduccin de animal a ser inseminada. El nuevo instrumento podra ordenar 500600 espermatozoides vivos por segundo. Suficiente X-seleccionado el esperma se prepararon de manera que 35 novillas podran ser inseminadas con 3x10 5 espermatozoides descongelados / dosis. Cuarenta y dos por ciento de las vacas inseminadas con semen sexado el se qued embarazada en comparacin con una tasa de embarazo del 54% para los controles inseminadas con 3 x 10 5 espermatozoides mviles sin congelar ( Seidel et al ., 1998 ). Dieciocho de los 19 animales nacidos a X-ordenados espermatozoides eran mujeres ( Seidel et al ., 1998 ). Las tasas de embarazo eran un 80% de lo que se logr con semen sexado ( Seidel et al ., 1998 ). USO DE esperma sexado CON EN VIVO LA FERTILIZACIN El informe de las cras de conejo vivo producido por el flujo ordenado de espermatozoides ( Johnson et al ., 1989 ) era la evidencia biolgica de que confirm la validez de las pruebas a principios de bioqumica. Los picos bimodales identificados por anlisis de citometra de flujo de contenido de ADN eran, de hecho, el X y Y las poblaciones de esperma. El X e Y - que porta el cromosoma espermatozoides de conejo fueron ordenados de acuerdo a su contenido de ADN y luego inseminadas artificialmente en el tero de conejas ( Johnson et al , 1989. ). Conejo se inseminaron con X-ordenados camadas de espermatozoides producidos que eran 94% mujeres, mientras que las inseminadas con Y-ordenados litros de esperma producidas que fueron del 81% de inseminacin masculina ( Johnson, 1990 , 1991 , 1992 ). Esto demostr que el sexo fenotpico puede ser predeterminado por la seleccin de espermatozoides en las poblaciones X e Y, antes de la inseminacin ( Johnson, 1990 , 1991 , 1992 ). La eficacia del procedimiento de seleccin se demostr tambin con los cerdos, pero la eficiencia fue menor ( Johnson, 1991 ). Los espermatozoides de cerdo intactos fueron ordenados en poblaciones relativamente puras de los espermatozoides Y y inseminado en el istmo del oviducto de las cerdas jvenes, lo que resulta en los lechones que fueron 68% hombres ( Johnson, 1992 ). El anlisis de la muestra de esperma, ordenados predijo que el 80% sera varones. Las muestras ordenados por espermatozoides X con una pureza del 80% fueron inseminadas, resultando en las hembras 74%. Esta es la primera demostracin en animales de granja de gran tamao que la proporcin de sexos de la descendencia podra ser alterado de manera significativa. USO DE esperma sexado CON IN VITRO Fertilizacin Espermatozoides ordenados por sexo se utiliza para in vitro fertilizacin (IVF) para generar embriones a partir de in vitro ovocitos madurados ( Cran et al ., 1993 ). Los espermatozoides se clasificaron empleando una versin modificada de Becton Dickinson FAC Star Plus clasificador de citmetro de flujo / celular. El esperma se tieron con Hoechst 33342 y ordenados a una velocidad de 100 clulas / segundo para obtener una poblacin de X-esperma de 79% de pureza y una poblacin de Y70% de pureza ( Cran et al ., 1993 ). Transferencias gemelas de 9 de sexo seleccionados los embriones producidos 4 embarazos, lo que resulta en 3 hombres

y 3 terneras ( Cran et al ., 1993 ), todos del sexo proyectada. Estos nacimientos demostrado que la esperma sexado podra dar lugar a descendencia viva. Otros estudios revelaron que una proporcin de sexos del 90% del sexo masculino se puede lograr ( Cran et al ., 1995 ). La proporcin de sexos sesgada de los terneros nacidos de estas transferencias era compatible con el sexo predeterminado, como se determina mediante el ensayo de reaccin en cadena de la polimerasa de las clulas extirpadas de blastocistos seleccionados de manera similar ( Cran et al ., 1993 , 1995 ). CRIOCONSERVACIN para el semen sexado El xito con el esperma sexado mantiene a cerca de 5 C fue seguida por un intento de criopreservar las clulas ordenados a 1x10 6 espermatozoides por dosis en pajuelas de 0,25 ml ( Schenk et al ., 1999 ). Este fue el doble de la concentracin que haba sido utilizado con xito para el esperma descongelado, sexado para compensar la muerte celular debido a la crioconservacin y descongelacin. Despus de la clasificacin, los espermatozoides se concentraron por centrifugacin a aproximadamente 80x10 6 ml -1 de modo que pudieran ser reconstituido a 20x10 6 ml -1 y se coloca en 0,25 mL pajas. Las tasas de embarazo con semen sexado, fueron criopreservados% idnticos, de 52 aos, a la lograda anteriormente, con un tercio ms que muchos espermatozoides descongelados ( Seidel, 1999a , b ; Schenk et al ., 1999 ). Con este avance, se hizo evidente que las instalaciones de clasificacin de esperma debe estar ubicado al lado de sitios de recogida de esperma ( Amann, 2000 ), de modo que el esperma sexado podra ser criopreservados. La criopreservacin de semen sexado permite una mayor flexibilidad en la distribucin del producto para la inseminacin. Aunque los procedimientos para la determinacin del sexo de espermatozoides en los resultados ligeramente ms bajos despus de la descongelacin y la motilidad de integridades acrosomal en comparacin con el esperma de control, este dao es menor en comparacin con la causada por el uso habitual de crioconservacin ( Amann, 2000 ). El nmero de sexado, los espermatozoides criopreservados utilizados para la inseminacin se han extendido de 1 a 6x10 6 espermatozoides / pajuela ( Seidel et al ., 1999 ). Las dosis normales de inseminacin por lo general son 10-20x10 6 espermatozoides. El esperma ahora pueden ser ordenados a tasas que se acercan 4000 por segundo de cada sexo, pero es ventajoso utilizar como pocos espermatozoides por inseminacin como sea necesario para lograr un embarazo. NORMALIDAD DE DESCENDENCIA Numerosos estudios ( Seidel, 1999a , b ; Cran, 2000 ) han reportado ms de 1000 nios nacidos vivos en seis especies de semen sexado sin anomalas graves que se observaron. A pesar de que los hijos nacidos de embarazos con semen sexado generados parece normal desde un punto de vista fenotpico general, rigurosos estudios epidemiolgicos deben llevarse a cabo para verificar y fortalecer estas observaciones. La preocupacin es que el proceso de determinacin del sexo de los espermatozoides puede daar el ADN de los espermatozoides y, por tanto, podra aumentar la incidencia de anomalas genticas. No hay un aumento en la muerte embrionaria entre 1 y 2 meses de gestacin se ha detectado, con muy pocos abortos se produce entre los 2 meses de gestacin y parto en las vacas ( Seidel et al ., 1999 ). EL PROBLEMA fertilidad asociado con espermatozoides ORDENADOS

A pesar de la experiencia la solucin tcnica que ha dado lugar a las tecnologas de los espermatozoides, el porcentaje de xito, en trminos del nmero total de nacidos vivos no es tan impresionante. Los investigadores clave reconocer que la fertilidad de los espermatozoides ordenados es algo menor ( Seidel y Garner, 2002 ) que la de los controles, pero sealan que los resultados de los estudios que demuestran esto se confunde con menos de sexado de espermatozoides por dosis de inseminacin que los procedimientos normales que dictan ( Seidel y Garner, 2002 ). Una de las principales limitaciones de la citometra de flujo de esperma de clasificacin es el tipo de clasificacin, lo que significa que los animales fertilizados con esperma sexado tienden a recibir dosis mucho ms bajas de espermatozoides que los animales se someten a la inseminacin artificial de rutina (AI). Por ejemplo, en el caballo, optimizar el flujo de clasificacin permite que aproximadamente el 10-20x10 6 espermatozoides para ser ordenados por hora, por lo que no es prctico para obtener el 500x10 8 esperma que normalmente se utiliza para inseminar a las yeguas con semen sin clasificar. Sin embargo, cuando un nmero similar de espermatozoides ordenados y no ordenados, fueron utilizados en un ensayo de inseminacin en vacas, las tasas de embarazo con el sexado de espermatozoides continu siendo 20 - 40% ms bajo que el control, sin clasificar espermatozoides ( Seidel et al , 1999. ). Tambin parece haber diferencias entre las especies en las tasas de fertilidad utilizando semen sexado, con algunas especies (por ejemplo, las ovejas; Hollinshead et al ., 2004 ) caballos, ( Buchanan et al ., 2000 ) cerdos ( Johnson et al ,. 2005 ), con bajas tasas de embarazo tras la inseminacin con esperma sexado en comparacin con la inseminacin con el esperma sin clasificar. Sin embargo, como las diferencias entre especies puede reflejar sub-ptimos procedimientos de inseminacin, as como problemas con el potencial de fertilizacin del esperma sexado. Los intentos para mejorar tasas de fertilidad en ESPERMATOZOIDES SELECCIONADOS Muchas de las iniciativas ms recientes de la industria parecen estar destinadas a mejorar las tasas de fertilizacin. Todos los aspectos de los procedimientos estn siendo examinados y analizados, incluyendo los posibles efectos del proceso de seleccin en s mismo ( Johnson et al , 1999. , Suh et al ., 2005 ), los efectos de su transporte y almacenamiento de esperma ( Lindsey et al , 2005. ) , la concentracin ptima de espermatozoides ( Xu et al , 2006. ), los posibles efectos de polispermia ( Wang et al , 2003. ), el modo y el momento de la entrega de los espermatozoides ( Wheeler et al , 2006. , Wilson et al ., 2006 ) y el sitio de la inseminacin ( Buchanan et al ., 2000 ), pero hasta el momento ms bajas tasas de fertilizacin siguen sin explicacin. Las menores tasas de embarazo parecen estar asociados con el uso de esperma sexado prcticamente en cada paso en el proceso, es decir, las tasas de fertilizacin de baja tienden a ser seguido, adems, por las tasas ms bajas de escisin y las menores tasas de desarrollo a la etapa de blastocisto ( Xu et al ., 2006 ). Cualquiera que sea la causa o las causas, la conclusin es similar a travs de una serie de estudios, a saber, que el esperma del sexo de clasificacin afecta negativamente la capacidad del embrin para desarrollarse normalmente ( Wilson et al ., 2006 ).

Por lo tanto se podra argumentar que los procedimientos asociados con el uso de esperma sexado an no estn totalmente refinados; que los resultados siguen mejorando ( Xu et al ., 2006 ) y que, junto con la generalizada subfertilidad, esta es una condicin suficiente explicacin de las tasas de fertilizacin de baja. Sea cual sea el resultado final, no hay duda de que esto es en la actualidad una posicin razonable sostener. Por otro lado, si el modelo bsico de la determinacin del sexo no es correcta, puede haber una manera de interpretar los datos que muestra la fertilidad despus de la utilizacin de semen sexado a ser mucho ms exitoso que se est viendo actualmente. La desventaja de esta nueva interpretacin sera que la actual y las nuevas tecnologas no puede contribuir tanto al aumento de la eficiencia como se esperaba. IMPLICACIONES PARA LA SELECCIN sexo por medio de esperma sexado Muchos estudios han sido publicados que muestran que a pesar de la aplicacin ms minuciosa y constante de las tcnicas, la fertilidad parece estar en peligro. Desde este punto de vista, los estudios en los que las tasas de xito se registran slo en trminos de nmero y sexo de los nacidos vivos, pero no mencionan el nmero de madres que no pudieron quedar embarazada en absoluto, no dan la informacin necesaria para realizar una evaluacin adecuada de la eficacia de los procedimientos. Otra cuestin que surge de la convencin actual de informar de los embarazos identificables en lugar de nacimientos, ya que otro factor desconocido es el punto en el que un embrin de un determinado sexo que tenga que ser compatible con, o, posiblemente, ratificado por el ambiente uterino. En la actualidad es difcil determinar si las bajas tasas de fertilidad son los mejores atribuible a factores asociados con el proceso de clasificacin (incluyendo dao a los espermatozoides), problemas con las tcnicas de inseminacin, o dosis bajas. Los experimentos con dosis emparejados de intento de semen sexado, y no ordenados, para abordar la cuestin del nmero total de espermatozoides utilizados, pero incluso estos experimentos no se pueden controlar los efectos de confusin de dao espermtico (como prematura la reaccin del acrosoma ( Moce et al ., 2006 ) que casi con toda seguridad introducido por el proceso de seleccin. Para llevar a cabo un juicio crtico de la seleccin de espermatozoides, en lugar de comparar el esperma clasificado y sin clasificar, las tasas de fecundacin de los espermatozoides ordenados y clasificados / re-combinar deben compararse. Si, por otro lado, el vulo tiene un papel en la asignacin de sexo, entonces no importa cmo tcnicamente xito las tcnicas de clasificacin de esperma, las tasas de fertilidad se mantendr bajo. Es decir, si un vulo se produce, cada ciclo, ya adaptado para recibir una X o un Y-esperma, la exposicin a cualquier nmero de la otra clase de esperma resultar en el fracaso para fertilizar o falta de desarrollo. Esto significara que la esperma sexado son tiles slo cuando un cliente deseaba que decir, la descendencia femenina, o nada. Con nuevas mejoras en los procedimientos de seleccin de espermatozoides, an es posible que el potencial de fertilizacin del esperma sexado podra ser elevado. Sin embargo, una explicacin alternativa a las bajas tasas de natalidad podra ser el que aqu se ofrecen, que la falla se encuentra en los supuestos sobre el modelo de la fertilizacin, ya que el vulo puede estar jugando un papel en la pre-determinacin del sexo de la descendencia. Polmica y dudas rodean a esta sugerencia, pero al final se trata de una cuestin a investigar. Son las tasas de fertilidad despus de la separacin de espermatozoides compatible con la hiptesis de que hay una influencia materna

pre-conceptual sobre la asignacin de sexo en los mamferos, o ser que, en ltima instancia, confirme el modelo de probabilidad de la determinacin del sexo?. COMERCIALIZACIN Todos los intentos anteriores de desarrollar el esperma sexado como un producto comercial que termin en fracaso ( Garner, 2001 ). Este problema biolgico bsico es muy atractivo desde los puntos de vista conceptuales y monetaria. Sin embargo, las diferencias de potencial entre el espermatozoides X e Y son relativamente pequeas y no son evidentes a excepcin de ADN. Una variedad de mtodos muy simplista complicados fueron juzgados ante el xito repetible primero se registr en 1989 con el flujo de clasificacin para el esperma sexado ( Johnson et al ., 1989 ). Este procedimiento determinacin del sexo, que se desarroll originalmente para los espermatozoides viven en el USDA Beltsville Agricultural Research Center de Johnson et al . (1989) , fue patentado por el USDA. La licencia comercial se emiti el primer al Mastercalf Ltd y este grupo demostr que los animales sexuados pueden ser producidos por el procedimiento de acoplamiento sexaje de espermatozoides con la FIV y la transferencia de los embriones resultantes a los beneficiarios ( Cran et al ., 1993 , 1995 ). Este enfoque, sin embargo, nunca lleg a ser comercialmente viable. Se estima que cerca de $ 20 millones han sido invertidos en el desarrollo de esta tecnologa, desde la conceptualizacin de los aos 1980 al esfuerzo de reciente comercializacin en el ao 2000. Aunque, otros enfoques estn siendo perseguidos ( Johnson y Seidel, 1999 ), el nico mtodo comprobado para la seleccin de los hijos el sexo es la clasificacin de citometra de flujo de los espermatozoides en relacin con el contenido de ADN. Esta tecnologa de esperma sexado, el cual fue patentado por el USDA, ha sido autorizada por el USDA para todos los mamferos no humanos a travs de la Colorado State University Research Foundation, de XY Inc., una empresa privada. En el ao 2000, la venta de esperma bovino sexado se inici en el Reino Unido. Ser interesante ver hasta qu punto los espermatozoides sexados penetrar en el mercado de semen. Este producto verificado sexado prepara el escenario para la comercializacin en todo el mundo en los pases productores ms importantes de los animales. Esta comercializacin de semen sexado se produjo casi 20 aos despus de la tecnologa para determinar con exactitud la proporcin de espermatozoides X e Y en el semen fue desarrollado en el Lawrence Livermore National Laboratory. Y sucedi que debido a los avances en el hardware y los componentes de software de ciencias de la computacin, la biofsica, biologa celular y fisiologa de la reproduccin aplicada, ms esfuerzos de los cientficos innovadores. Muchas personas han contribuido a hacer de sexaje de semen en los animales en una realidad comercial desde entonces equipo de investigacin de Bart Gledhill, Pinkel Dan Garner Duane, Lago Susan y Larry Johnson empez a dar seguimiento a los estudios de citometra de flujo de los primeros en el esperma humano por Friedrich Otto, Wolfgang Gohde y Marvin Meistrich y desde entonces muchos otros se ha unido el esperma sexado una empresa comercial. CONCLUSIONES El estado actual de las tecnologas de espermatozoides muestra una gran promesa. Las ltimas dos dcadas han cambiado drsticamente el campo de la fisiologa reproductiva, a travs del desarrollo y tcnicas de modificacin de esperma sexado. En lnea con la revisin en curso, algunas de las tcnicas de clasificacin ejemplo, los espermatozoides, la criopreservacin de espermatozoides, la comercializacin y la normalidad de los hijos todava tienen un amplio margen de mejora. Es esencial para mejorar la eficacia de estas tecnologas de esperma y tambin para resolver los problemas de fertilidad asociados con el uso de espermatozoides ordenados.

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Oscar Vera Muoz, Biol, MSc1; M. Gladys Muoz, Biol, Dr2. 1Instituto de Reproduccin Animal e Inseminacin Artificial, FCV, UCV. Maracay 2Dpto. Biologa de los Organismos.Universidad Simn Bolvar. Caracas. verao@ucv.ve, mmunoz@usb.ve Las condiciones de trabajo para colectar semen de bovino, el estado de salud del animal y la experticia del personal especializado que opera, son factores que deben tomarse en cuenta para mejorar la calidad del semen. Las deficiencias de estos aspectos pueden causar grandes prdidas econmicas para el ganadero y reducir la calidad original del semen, as como tambin difundir enfermedades que afectan no solamente al semental, sino tambin a las hembras inseminadas y a su descendencia. De nada sirve que el ganadero realice grandes inversiones en programas de mejoramiento gentico y reproductivo, si no se cumplen las medidas preventivas sencillas que se relacionan con los diferentes aspectos que sern tratados en este Captulo. Para cumplir con las premisas sealadas, en los Centros de Congelacin de Semen e Inseminacin Artificial, los reproductores que ingresan por primera vez deben permanecer aislados 60 das de los toros residentes. Se realizan controles durante el perodo de cuarentena y posteriormente se llevan a cabo controles semestrales para asegurar que los reproductores estn libres de las enfermedades infecciosas especialmente aquellas que puedan ser transmitidas sexualmente, las que se analizarn ms adelante en este trabajo.

COLECCIN DEL SEMEN


Condiciones del animal. Para incorporar a un semental a los programas de coleccin de semen debe tomarse en cuenta la edad, raza y peso del reproductor. El peso sigue siendo un buen indicador del estado de salud del animal y cuando no es posible pesarlo en la finca, la estimacin de su condicin corporal pasa a ser un buen indicador. Para mantener saludable a los animales se les debe proporcionar un ambiente adecuado, en cuanto a temperatura, luz, humedad y espacio suficiente para desplazar Congelacin del semen. Una vez establecida la calidad del eyaculado, se procede a realizar la dilucin, utilizando diluyentes que garanticen: la fuente de energa (nutricin), proteger contra el shock trmico, mantener el pH (pH 6,7-7,0), la presin osmtica y controlar la proliferacin bacteriana (antibiticos paina

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Utilizando un dilutor de PBS + 40% de suero fetal ms 5% de yema de huevo y ms deglicerina, (v/v) se congel semen y se lo compar con uno refrigerado y otro fresco: se obtuvo 33,3%, 42% y 46,15% de natalidad para semen congelado, refrigerado y fresco MANUALA DEL ALPAQUERO