Universidad Tecnológica de Santiago (UTESA)

Nombre:
Dayana Rodríguez
Matrícula:
1-17-0522
Materia:
Practica de infectología.
Maestro:
Dra. Heidy Adames Espinal
Grupo:
005
Tema:
Clasificación de las bacterias y sus tipos de tinciones.
Fecha:
15 de junio del 2021
 Introducción.
Las bacterias son organismos microscópicos unicelulares. Se encuentran entre las
formas de vida más antiguas conocidas en el planeta. Hay miles de tipos de bacterias
diferentes y pueden vivir en todos los medios y ambientes imaginables, en cualquier
parte del mundo. Viven en el suelo, en el agua del mar y en las profundidades de la
corteza terrestre. Se ha podido comprobar que ciertas bacterias pueden vivir, incluso,
en los desechos radiactivos. Muchas bacterias viven en y en los cuerpos de personas y
animales, en la piel y en las vías respiratorias, la boca y los tractos digestivo,
reproductivo y urinario, sin causar ningún daño. Estas bacterias se denominan flora
saprófita o microbioma. Hay al menos tantas bacterias en nuestra flora residente como
células en el cuerpo. Gran parte de la flora saprófita es realmente útil para las personas,
por ejemplo, ayudando a digerir los alimentos o al impedir el crecimiento de otras
bacterias más peligrosas.
Solo unos pocos tipos de bacterias causan enfermedades son las conocidas con el nombre
de patógenos. A veces, bajo ciertas condiciones, la flora bacteriana residente causa
enfermedad. Las bacterias causan enfermedades mediante la producción de sustancias
nocivas (toxinas), la invasión de tejidos o ambas cosas. Algunas bacterias pueden
desencadenar una inflamación que puede afectar el corazón, el sistema nervioso, los
riñones o el tubo digestivo. Algunas bacterias (como Helicobacter pylori) aumentan el
riesgo de cáncer.
Ciertas bacterias tienen el potencial de ser utilizadas como armas biológicas. Entre estas
bacterias se encuentran las que causan carbunco, botulismo, peste y tularemia.
Las bacterias se clasifican de varias maneras:

• Nombres científicos: las bacterias, al igual que otros seres vivos, se clasifican por
género (basado en la existencia de una o varias características comunes) y, dentro
del género, por especie. Su nombre científico se compone del nombre del género
seguido por el de la especie a la que pertenecen (por ejemplo, Clostridium
botulinum). Dentro de una especie, puede haber diferentes tipos, denominados
cepas. Las cepas difieren en su composición genética y en sus componentes
químicos. En ocasiones, ciertos medicamentos y vacunas solo son efectivos frente
a determinadas cepas.
• Tinción: las bacterias pueden ser clasificadas por el color que adquieren después de
que se les apliquen ciertos productos químicos (tinciones). La tinción de Gram es
un proceso de tinción comúnmente utilizado. Algunas bacterias se tiñen de azul, por
lo que se denominan grampositivas. Otras se tiñen de color rojo son
las gramnegativas. Las bacterias grampositivas y las gramnegativas se tiñen de
forma distinta porque sus paredes celulares son diferentes. También causan
diferentes tipos de infecciones, y hay distintos tipos de antibióticos eficaces contra
ellas.
• Formas: todas las bacterias se pueden clasificar en una de las tres formas básicas:
esferas (cocos), bastones (bacilos) y espirales o hélices (espiroquetas).
• Necesidad de oxígeno: las bacterias también se clasifican en dos grupos, según si
necesitan oxígeno para vivir y crecer o no les es necesario. Las que necesitan
oxígeno se denominan aerobias, y las que tienen problemas para vivir o crecer en
presencia de oxígeno se denominan anaerobias. Algunas bacterias, llamadas
bacterias facultativas, pueden vivir y crecer con o sin oxígeno.
• Composición genética: pruebas que permiten determinar diferencias en la
composición genética (genotipo) de las bacterias.
Tinción de Gram
Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se
manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza
dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas
y bacterias Gram positivas. Fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram
en 1884; hoy en día, sigue siendo una de las tinciones más utilizadas universalmente
debido a lo económico, sencillo y eficaz que resulta. En microbiología clínica resulta de
gran utilidad, ya que a partir de muestras clínicas directas provenientes de sitios estériles
se puede saber de manera rápida las características de la muestra y hacer una diferencia
de los potenciales microorganismos causantes de una infección.

La tinción de Gram es una prueba que busca bacterias en una parte del cuerpo donde se
sospecha una infección o en ciertos fluidos corporales, como la sangre o la orina. Esto
incluye la garganta, los pulmones, los genitales y lesiones en la piel.
Hay dos categorías principales de infecciones bacterianas, grampositivas y
gramnegativas. Las categorías se diagnostican según cómo reacciona la bacteria a la
tinción de Gram. La tinción de Gram es de color púrpura. Cuando la tinción se combina
con la bacteria en una muestra, las bacterias pueden seguir de color púrpura o volverse
rosadas o rojas. Si se mantienen púrpura, son grampositivas. Si se vuelven rosadas o rojas,
son gramnegativas. Las dos categorías causan tipos diferentes de infecciones:
• Las infecciones grampositivas incluyen el Staphylococcus aureus resistente a la
meticilina (SARM), las infecciones por estreptococos y el shock tóxico.
• Las infecciones gramnegativas incluyen salmonela, neumonía, infecciones del tracto
urinario y gonorrea.

La tinción de Wrigth
Es una técnica de coloración creada por el patólogo estadounidense James Homer Wright
en 1902, a partir de la tinción de Romanowsky. Como la tinción de Romanowsky era
inestable, Wrigth incorporó el metanol como disolvente y fijador.
Esta coloración es policromática, lo que quiere decir que genera varios colores
dependiendo de la estructura que absorbe el colorante. Esta técnica de coloración ha sido
muy utilizada para realizar recuentos diferenciales de glóbulos blancos y estudiar la
morfología de los glóbulos rojos, plaquetas y leucocitos en sangre periférica y médula
ósea.
Su aplicación es muy importante, ya que se pueden apreciar anormalidades en las
diferentes líneas celulares de la sangre, facilitando el diagnóstico de enfermedades como
la leucemia o infecciones bacterianas o parasitarias.
Quizás estas son las aplicaciones más comunes en la que es utilizada esta técnica, sin
embargo, no son las únicas. También es útil en otras muestras diferentes a la sangre y
médula ósea, como por ejemplo en muestras de secreción nasal, moco fecal, esputo, piel,
entre otros.
Fundamento de la tinción de Wright
La tinción de Wright nació de la tinción de Romanowsky, que consiste en una solución
de alcohol metílico de un colorante ácido (eosina Y) y otro básico (azul de metileno) y
sus productos de oxidación.
La mezcla de colorantes usados en la tinción de Wright provoca el efecto conocido como
Romanowsky, es decir, proporciona una hermosa coloración púrpura a los núcleos de los
leucocitos y a los gránulos neutrofílicos, mientras que los glóbulos rojos se tiñen de color
rosado.
Los componentes responsables de dar la gama de colores típica de la tinción de Wright
son el azul B y la eosina Y. El efecto observado dependerá del enlace de los colorantes a
las estructuras químicas y a las interacciones del azul B y la eosina Y.
Las estructuras ácidas tales como los ácidos nucleicos, las proteínas nucleares y el
citoplasma inmaduro reactivo de algunos tipos de células, fijan el azul B (colorante
básico).
Mientras que las estructuras básicas tales como la hemoglobina, los gránulos de los
segmentados eosinófilos, entre otras estructuras celulares, fijan la eosina Y (colorante
ácido).
El resultado de tinción puede ser influido por diferentes factores, como el pH del colorante
Wright, de la solución amortiguadora y de lavado; así como el tiempo de tinción y de
fijación.
Por ello, cada paso en la preparación de los reactivos es crucial y debe ser realizado
cuidando cada detalle.
Materiales
Colorante de Wright. Para 100 mL se requiere:
Pesar 0.3 gr de colorante de Wright, medir 97 ml de metanol y 3 ml de glicerol.
Preparación
En un mortero colocar la cantidad pesada del colorante de Wright e ir incorporando poco
a poco el glicerol hasta que el polvo quede totalmente disuelto.
Posteriormente se agrega el metanol, se mezcla y se vierte en un frasco ámbar.
Antes de usar se debe agitar la solución con movimientos suaves y filtrar.
Solución amortiguadora tamponada
En un litro de agua destilada se agrega 3,76 g de hidrofosfato disódico (Na2HPO4 2H20)
más 2,1 gr de fosfato de potasio dihidrogenado (KH2PO4).
Mezclar muy bien hasta disolver todos los reactivos incorporados. Ajustar el pH a
7,2. Verter en un frasco de vidrio y mantener a temperatura ambiente.
Componentes de la tinción de Wright
El metanol
El alcohol (metanol) sirve como un fijador del frotis sanguíneo al portaobjetos.
Básicamente es un reactivo reductor, deshidratador y fijador coagulante. Por tanto, su
función es coagular las proteínas y hacerlas insolubles, pero sin llegar a desnaturalizarlas.
El metanol es el reactivo más utilizado para fijar frotis en todos los laboratorios, ya que
proporciona mejores resultados que los obtenidos con el etanol. La concentración ideal
es a 99%.
El amortiguador
El amortiguador (solución tamponada), tiene como función ajustar o mantener el pH del
colorante, pues un pH ajustado a 7,2 es esencial para que las estructuras celulares puedan
absorber los colorantes adecuadamente.
Por otra parte, el paso de la fijación con metanol deshidrata las células y el amortiguador
ayuda a rehidratarlas.
Eosina (Y)
La eosina tiene afinidad por componentes básicos por ser un colorante ácido. Se conocen
dos tipos de eosina muy similares entre sí, tanto que pueden usarse cualquiera de las dos,
obteniendo el mismo resultado.
Una se denomina eosina Y, eosina amarilla o tetrabromofluoresceína y la otra eosina B,
eritrosina B azulada o dibromodinitrofluoresceína. Sin embargo, la eosina Y es la que se
utiliza con mayor frecuencia.
La propiedad más importante de este colorante es su polaridad negativa, esto hace que
sea atraído por estructuras celulares con carga positiva.
Azul de metileno
Es el colorante básico. Su principal propiedad es la metacromasia, es decir, no todas las
estructuras se van a teñir del mismo color, depende de la composición química de las
estructuras que está coloreando.
Algunas se tornarán azul claro u oscuro y otras de morado oscuro o lila pálido.
Técnica
1-Realizar el extendido de la muestra de forma que quede una película delgada, bien sea
en portaobjeto o cubreobjeto.
2-Dejar secar al aire por 2 horas aproximadamente.
3-Colocar el frotis seco sobre el puente de coloración o cubeta de tinción con el extendido
de la muestra hacia arriba.
4-Cubrir la lámina con el colorante de Wright gota a gota hasta abarcar toda la superficie.
Dejar actuar durante 5 – 8 minutos.
5-El colorante deberá cubrir completamente el portaobjeto, sin que se derrame por los
bordes. Si durante el tiempo de coloración se comienza a evaporar se deberán colocar
unas gotas adicionales.

La tinción de Ziehl-Neelsen
En una técnica de coloración para identificar microorganismos alcohol-ácido resistentes
(AAR). El nombre de este procedimiento de microbiología hace referencia a sus autores:
el bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo Friedrich Neelsen.

Esta técnica es un tipo de coloración diferencial, lo que implica el uso de distintos

colorantes con la finalidad de crear contraste entre las estructuras que se desean observar,
diferenciar y posteriormente identificar. La tinción de Ziehl-Neelsen sirve para identificar
ciertos tipos de microorganismos.
Algunos de estos microorganismos son micobacterias (por ejemplo, Mycobacterium
tuberculosis), nocardias (por ejemplo, Nocardia sp.) y algunos parásitos unicelulares (por
ejemplo, Cryptosporidium parvum). Muchas de las bacterias pueden clasificarse a través
de una técnica común llamada tinción de Gram.
No obstante, algunos grupos bacterianos requieren otros métodos para poder
identificarlos. Técnicas como la tinción de Ziehl-Neelsen requieren combinaciones de
colorantes con calor para fijar el primero a la pared celular.
Luego viene un proceso de decoloración que permite obtener dos resultados: resistencia
o sensibilidad a la decoloración por ácidos y alcoholes.
Fundamento
El fundamento de esta técnica de tinción se basa en las propiedades de la pared celular de
estos microorganismos. La pared está formada por un tipo de ácidos grasos llamados
ácidos micólicos; estos se caracterizan por presentar cadenas muy largas.
Cuando los ácidos grasos presentan estructuras muy largas, estos pueden retener los
colorantes con mayor facilidad. Algunos géneros de bacterias son muy difíciles de teñir
mediante tinción de Gram, debido al alto contenido de ácidos micólicos de la pared
celular.
En la tinción de Ziehl-Neelsen se utiliza el compuesto fenólico carbol fucsina, un
colorante básico. Este tiene la capacidad de interactuar con los ácidos grasos de la pared
celular, la cual es de textura cerosa a temperatura ambiente.
La tinción con carbol fucsina es mejorada en presencia de calor, debido a que la cera se
derrite y las moléculas de colorante se mueven con mayor rapidez hacia el interior de la
pared celular.
El ácido que se usa posteriormente sirve para decolorar las células que no fueron teñidas
porque su pared no era lo suficientemente afín al colorante; por lo tanto, la fuerza del
decolorante ácido es capaz de eliminar el colorante ácido. Las células que resisten esta
decoloración se llaman ácido-resistentes.
Colorante secundario
Después de la decoloración de la muestra, esta se contrasta con otro colorante llamado
colorante secundario. Generalmente se utiliza el azul de metileno o el verde de malaquita.
El colorante secundario tiñe el material de fondo y, en consecuencia, crea contraste a las
estructuras que fueron teñidas en el primer paso. Solo las células decoloradas absorben el
segundo colorante (contra-tinción) y toman su color, mientras que las células ácido-
resistentes conservan el color rojo.
Este procedimiento se usa frecuentemente para la identificación de Mycobacterium
tuberculosis y Mycobacterium leprae, las cuales son llamadas bacilos ácido-alcohol
resistentes.
Técnica

Nematodo visualizado con Ziehl-Neelsen

Procedimiento de tinción ácido-rápida
Preparar un frotis bacteriano
Esta preparación se hace en un portaobjetos limpio y seco, siguiendo las precauciones de
esterilidad.
Secado del frotis
Dejar que el frotis se seque a temperatura ambiente.
Calentar la muestra
La muestra se debe calentar aplicando fuego al portaobjeto por debajo. Se puede hacer
una fijación con alcohol cuando el frotis no se ha preparado con esputo (tratado con
hipoclorito de sodio para blanquearlo) y si no se va a teñir inmediatamente.
M. tuberculosis se elimina con lejía y durante el proceso de tinción. La termofijación del
esputo no tratado no matará a M. tuberculosis, mientras que la fijación con alcohol es
bactericida.
Cubrir la mancha
La mancha se cubre con la solución de carbol fucsina (colorante básico primario).
Calentar la mancha
Esto se hace durante 5 minutos. Debe notar un desprendimiento de vapor
(aproximadamente a 60 °C). Es importante no sobrecalentar y evitar quemar la muestra.
Con relación al calentamiento de la mancha, se debe tener mucho cuidado al calentar el
carbol fucsina, especialmente si la tinción se lleva a cabo sobre una bandeja u otro
recipiente en el que se hayan recogido productos químicos altamente inflamables de la
tinción previa.
Solo se debe aplicar una pequeña llama debajo de los portaobjetos usando un hisopo
encendido previamente humedecido con unas gotas de alcohol ácido, metanol o etanol al
70 %. Evitar usar un hisopo grande empapado en etanol porque esto es un riesgo de
incendio.
Lavar la mancha
Este lavado debe hacerse con agua limpia. Si el agua del grifo no está limpia, lavar el
frotis con agua filtrada o destilada, preferiblemente.
Cubrir el frotis con alcohol ácido
Este alcohol ácido debe estar al 3 %. La cobertura se lleva a cabo durante 5 minutos o
hasta que el frotis esté lo suficientemente decolorado, es decir, de color rosa pálido.
Hay que tomar en cuenta que el alcohol ácido es inflamable; por lo tanto, debe usarse con
mucho cuidado. Se debe evitar estar cerca de fuentes de ignición.
Lavar la mancha
El lavado debe ser con agua limpia, destilada.
Cubrir el frotis con colorante
Puede ser colorante verde de malaquita (0,5 %) o azul de metileno (0,3 %) durante 1 o 2
minutos, utilizando el tiempo más prolongado si el frotis es delgado.
Lavar la mancha
Nuevamente debe utilizarse agua limpia (destilada).
Drenar
Se debe limpiar la parte posterior del portaobjeto y colocar la mancha en un estante de
drenaje, para que esta se seque al aire (no usar papel absorbente para el secado).
Examinar el frotis en el microscopio
Debe usarse el objetivo de 100X y el aceite de inmersión. Escanear el frotis
sistemáticamente y anotar las observaciones pertinentes.
Interpretar los resultados
Teóricamente, los microorganismos que se tiñan de un color rojizo se consideran ácido
alcohol resistente positivos (AAR+).
Al contrario, si los microorganismos se tiñen de azul o verde, dependiendo del colorante
utilizado como contra-colorante, se consideran ácido alcohol resistente negativos (AAR-
).

La tinción negativa
Es un método de coloración especial para destacar la presencia de la cápsula en algunos
microorganismos —principalmente Streptococcus pneumoniae, Klebsiella
pneumoniae y Cryptococcus neoformans—, provenientes de muestras clínicas o de
cultivos puros.
La muestra directa comúnmente utilizada para aplicar tinción negativa es el líquido
cefalorraquídeo. Esta técnica representa una alternativa rápida para el diagnóstico
presuntivo de meningitis, especialmente por Cryptococcus neoformans.

A.
Así mismo, esta tinción puede ser aplicada sobre esputo y líquidos estériles en general,
así como también sobre cepas obtenidas de cultivos puros jóvenes. Esta técnica utiliza
nigrosina o tinta china para su ejecución; por tanto, es una metodología muy sencilla y
económica de aplicar que brinda información de gran valor diagnóstico en poco tiempo.
Fundamento
La nigrosina y la tinta china actúan de manera similar; por ello se puede usar cualquiera
de las dos sustancias indistintamente.
Esta técnica recibe el nombre de tinción negativa porque actúa de forma contraria al resto
de las técnicas de coloración. En esta lo que queda sin teñir es la estructura que se está
buscando o que se desea ver; es decir, los microorganismos.
Por lo tanto, la coloración se basa en teñir el fondo del frotis en un color oscuro. En este
escenario las estructuras capsuladas resaltaran en color claro o incoloro.
Por lo general las levaduras se observan refringentes, rodeadas por un halo claro que
corresponde a la cápsula. Esto ocurre porque la tinta china y la nigrosina son sustancias
incapaces de penetrar el polisacárido que conforma la cápsula de los microorganismos
vivos.
Vale destacar que tampoco penetran otras estructuras que pueden estar presentes en la
muestra directa, como leucocitos o hematíes.
Ahora bien, si los microorganismos están muertos, la tintura puede penetrar dentro de los
mismos, de tal manera que esta tinción también es útil para evaluar la viabilidad de los
microorganismos.
Técnica
Materiales
Nigrosina
La nigrosina debe su nombre al color negro que posee. Es una sustancia sintética que se
obtiene del calentamiento de la mezcla de compuestos orgánicos —tales como la
nitrobencina, la anilina y el hidroclorito de anilina—, utilizando en dicha reacción un
catalizador (hierro o cobre).
Tinta china
La tinta china es una sustancia utilizada principalmente por los asiáticos para la escritura,
la elaboración de obras de arte y la pintura monocromática. Es muy popular en la cultura
china.
Se obtiene de la tinta del calamar mezclada con carbón pulverizado, producto de la quema
de árboles poco resinosos.
También es posible prepararla a partir del hollín de la incineración de hidrocarburos
(aceites vegetales), junto con una gelatina proteica que le da la consistencia adecuada para
evitar la precipitación de las partículas de carbón.
Especificaciones para la toma de muestra
– No requiere ayuno.
– La muestra de LCR, esputo o líquido estéril debe contener al menos 1 ml de volumen y
debe ser trasladada a temperatura ambiente al laboratorio de forma inmediata.
– Las muestras de LCR y líquidos estériles deben ser tomadas por un médico
especializado.
– También puede ser un cultivo puro de una cepa sospechosa vinculada con los patógenos
ya mencionados.
Ejecución de la técnica con muestras directas
– Las muestras deben ser centrifugadas, luego se descarta el sobrenadante y se toma el
sedimento.
– En una lámina portaobjeto limpia se coloca una gota del material centrifugado
(sedimento) y una gota de tinta china o nigrosina.
– Debe mezclarse bien y cubrir con una lámina cubreobjeto, dejando que la gota se
extienda como una película fina sin que rebase los bordes.
– Posteriormente se monta la preparación en el microscopio.
– Si la preparación queda muy oscura, se puede diluir con agua.
 Conclusión
Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico
oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel importante
en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas. Se debe practicar
la tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en sospecha y el tipo de muestra
clínica. Las tinciones son herramientas elementales, vigentes y de uso universal que
coadyuvan al diagnóstico microbiológico.