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Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá

Producción de Xilitol con Saccharomyces Cerevisiae

Departamento de Ingeniería Química y Ambiental, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá
Introducción a la Ingeniería Bioquímica
Camilo Andrés Carrillo Murcia Néstor Alfonso Quintero Rodríguez Sergio Esteban Meneses Diaz
caacarrillomu@unal.edu.co neaquinteroro@unal.edu.co semenesesd@unal.edu.co

Esteban Forero Castañeda Nicolas Puentes Urrego Jairo Leonardo Yepes Álvarez
eforeroc@unal.edu.co npuentesu@unal.edu.co jlyepesa@unal.edu.c

1. Xilitol

El Xilitol (C5H12O5) es un polialcohol de cinco carbonos el cual es obtenido por la hidrogenación catalítica de xilosa.
Este compuesto está presente en la naturaleza especialmente en frutas y algunas legumbres como la frambuesa, la
endivia, la ciruela amarilla, lechuga, espinaca, zanahoria, banano y cebolla, etc. También se encuentra presente en el
ser humano siendo una sustancia intermediaria en el metabolismo. La importancia del xilitol previene en que es un
edulcorante con propiedades similares a las de la glucosa pero con un 33 % menos de contenido calórico, lo cual lo
hace muy atractivo para personas que padecen de diabetes (su metabolización es independiente de insulina) ( Rafiqul
& Mimi Sakinah, 2013), y para personas con deficiencia en glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, además, cuenta con
características anticancerígenas (Martínez et al., 2001), es muy estable en la fabricación de alimentos, no fermenta y
no produce pardeamiento de Maillard (Ooi et al., 2002) y se ha demostrado que su uso como endulzante reduce la
aparición de caries y placa dental. Por lo anterior, las industrias farmacéuticas, de higiene oral y alimentaria tienen un
gran interés en el xilitol. En 1970, el xilitol ha sido ampliamente investigado y aceptado mundialmente como un
edulcorante natural aprobado por la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA) y la
Academia Americana de Odontología Pediátrica (American Academy of Pediatric Dentistry, 2010).

El xilitol se puede encontrar en ciertas plantas y frutas, pero su extracción es por debajo del 1% en peso seco.
Actualmente, el proceso de producción de xilitol se lleva a cabo mediante la hidrogenación química de xilosa pura en
presencia de un catalizador de níquel y en condiciones de alta presión y temperatura (Rafiqul & Mimi Sakinah, 2013).
Por este método, se puede llegar a una alta conversión de aproximadamente el 90% (Baudel, 2005), sin embargo, los
extensos procesos de separación y purificación y su costo asociado, dan como consecuencia un producto costoso
(Rafiqul & Mimi Sakinah, 2013). Otra alternativa para la obtención del xilitol es a través de procesos biotecnológicos,
en los cuales se obtiene una producción limpia, debido a que no generan subproductos tóxicos gracias a su naturaleza
específica.

Figura 1. Estructura química del xilitol. Fuente: PubChem

El mercado internacional del xilitol se puede estudiar desde los países productores y comercializadores. La demanda
mundial por este producto químico se debe principalmente por su aprobación en la industria alimenticia, es por ello
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que la producción de este polialcohol ha crecido en las últimas décadas, para el año 2006 se reportan un total de 80
mil toneladas producidas, 125 mil toneladas en el 2011 y para el año 2013 la cifra reportada fue de 161,5 mil toneladas
a nivel mundial. En el mercado de este producto intermedio para el 2015 el continente asiático participa con el 50 %
de la producción, y el 50% restante es generado por Europa y Norteamérica. En cuanto a los países productores se
destacan China, Estados unidos y Finlandia. (Da silva, 2012).

2. Saccharomyces Cerevisiae

Como se dijo anteriormente, la xilosa se produce de manera industrial a partir de la deshidrogenación catalítica de la
xilosa, el cual es un método muy costoso que consume bastante energía y es ambientalmente peligroso por el uso de
catalizadores de níquel (Granström, T.B, Suzumori, K, 2007). Los anteriores inconvenientes han llevado a que los
investigadores busquen procedimientos alternativos para la producción biotecnológica del xilitol. Los anteriores
enfoques biotecnológicos han llevado a usar la levadura Saccharomyces cerevisiae para fermentar la xilosa a partir del
uso de la xilosa reductasa que es dependiente de NADPH para la reducción de la xilosa a xilitol (Park, Y; Kim, S,
2014).

Las levaduras a través de los años siempre han sido los microorganismos más usados para la producción de alimentos
y productos como lo son vinos, repostería y alcohol. La levadura Saccharomyces cerevisiae es el microorganismo
eucariota más estudiado por su gran utilidad en procesos industriales para la producción de bioquímicos. Como
antecedentes se tiene que las cepas de S. Cerevisiae pueden ser usadas en condiciones de anaeróbicas, bajos pH y no
ser atacados por bacteriófagos. (Pereira, et al., 2014). Las cepas aisladas de procesos industriales han demostrado que
presentan una mayor capacidad para las fermentaciones y altas tolerancias al estrés; pero el único problema con las
levaduras S. Cerevisiae es que no son capaces de fermentar la xilosa naturalmente. (Pereira, et al., 2014).

Como se dijo anteriormente, las levaduras S. Cerevisiae no son capaces de sintetizar la xilosa de una manera eficiente,
pero se requiere de una modificación genética en la producción de la glucosa para que la levadura pueda usar la xilosa
como un sustrato para la producción de xilitol. Se conoce de una cepa de la levadura S. Cerevisiae llamada S. Cerevisiae
PE-2 la cual es ampliamente usada para la producción de alcohol, pero en trabajos recientes se ha visto que pueden
llegar a ser modificados genéticamente con el fin de poder aumentar la concentración final de xilitol en donde se una
elevada acumulación del mismo(15 g/L con un rendimiento de 0.36 g de xilitol por cada gramo de xilosa consumido)
(Romani et al, 2015).

Con respecto a la producción de xilosa a partir de la S. Cerevisiae se tiene que tiene ciertas ventajas con respecto al
uso de otros microorganismos para la producción del xilitol a partir de la xilosa. Aunque existan bacterias como lo son
Zimomonas mobilis o Escherichia Coli pueden llegar a ofrecer altos rendimientos y productividades en la fermentación
de la xilosa; se tiene que la S. Cerevisiae es un microorganismo GRAS (Dasgupta, et al., 2017), Donde se tiene que el
genoma de la levadura ha sido totalmente secuenciado y llegando a deducir que la levadura puede ser usada en
condiciones de pH bajo y en condiciones anaerobias.

Adicional a lo anterior se tiene que las bacterias como la Escherichia Coli poseen pirógenos en la pared celular que
son productos que no pueden ser destinados para la industria alimentaria (Almeida, et al., 2007). Entre otros
microorganismos usados para la producción de xilitol usan la xilosa como sustrato predilecto y en particular varias
levaduras además de la S. Cerevisiae se tienen otras levaduras pertenecientes del género Candida perteneciente de las
especies C. Boidinii, C.Guillermondii, C.Parapsilosis y C.Tropicalis (Mohamad, N.L, Mustapa Kamal, S; 2015).
Aunque Candida se consideran patógenos, estos tienen un gran rendimiento al producir xilitol.
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Para las bacterias se tiene que la conversión de xilosa a xilitol se lleva a cabo a partir de la enzima xilosa isomerasa la
cual genera la reacción en un paso. Esta xilosa isomerasa ha sido detectada en levaduras y mohos como lo son
C.Boidinii, Malbranchea pulchella, y Meurospora crassa (Rawat U, Phadtare S, et al; 1996).

En los hongos y levaduras se tiene la xilosa reductasa que es dependiente de NAD o NADP deshidrogenasa. A
continuación, se presenta el uso de microorganismos de la producción de xilitol. Del tipo salvaje S. Cerevisiae se sabe
que es una levadura que no fermenta en xilosa debido a que carece de la vía metabólica de la xilosa. Sin embargo, su
estatus GRAS (generalmente reconocido como segura) y la fuerte tolerancia a los inhibidores presentes en los
hidrolizados de lignocelulosa puede ser útil para la producción industrial de la xilosa (Hallborn J; Walfridsson WM et
al, 1991). En el año de 1991 se realizó un cambio genético con una recombinación genética de los genes de S.
Cerevisiae introduciendo el gen que genera el metabolismo del xilitol agregando el gen de la xilosa reductasa (XYL1)
clonado a partir de la Pichia stititis CBS 6054 transformando la S. Cerevisiae , se pudo ver que la anterior cepa pudo
lograr una conversión de la xilosa a xilitol a más del 95% (Hallborn J; Walfridsson WM et al, 1991). Hay otros
investigadores que buscaban estrategias que puedan sobre expresar la enzima de xilosa reductasa.

Para la producción del xilitol se requieren de ciertos cosustratos como el NAD que fueron evaluados en una S.
Cerevisiae. A partir de lo anterior se tiene que la presencia de glucosa, manosa y fructosa son importantes para el
transporte efectivo de la xilosa y la conversión de la misma. (Meinander NQ, Hahn-Hagerdal B, 1997).

Aunque la S. Cerevisiae sea una opción confiable, se tienen varias investigaciones en donde se ha escogido a la
Cándida como la mejor opción para la producción del xilitol en donde son naturalmente consumidores de xilosa
manteniendo una reducción por balance de oxidación del xilitol aunque se tenga un producción amplia, este xilitol no
puede ser usado en alimentos debido a su naturaleza patógena, para la candida se tiene que se logran conversiones del
98% usando glicerol como sustrato (Meinander NQ, Hahn-Hagerdal B, 1997).

Para el caso de la cándida se tiene que se introdujo el promotor en C. tropicalis. Esta levadura recombinante exhibió
un mayor rendimiento de D-xilitol que la cepa de tipo salvaje (Lee JK, Koo BS; 2003). En la optimización de la
Condiciones de fermentación del D-xilitol, como la aireación, temperatura y pH, la disponibilidad de oxígeno fue el
parámetro clave para la producción de D-xilitol desde D-xilosa.

En condición limitada de oxígeno transitorio, un el excedente de NADH inhibió la actividad del xilitol deshidrogenasa,
que dio lugar a la acumulación de D-xilitol (Lee JK, Koo BS; 2003). En general, la temperatura óptima y el pH. para
las levaduras productoras de D-xilitol fue de 30 a 37 oC y de 4 a 6, respectivamente (Meinander NQ, Hahn-Hagerdal
B, 1997).

A continuación, se presentan los diferentes cultivos usados para la producción de xilitol, donde:

Tabla 1. Levaduras usadas en la producción de xilitol.

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3. Rutas metabólicas para la producción de Xilitol

A continuación, se presenta un esquema en donde se representa la producción de xilitol, donde:

Figura 2. Ruta metabólica para la producción de xilitol y otros productos

A la actualidad se conocen tres rutas metabólicas con las cuales distintos microorganismos catabolizan la xilosa,
aunque solo dos han sido sintetizadas y cambiadas en S. cerevisiae. La xilosa puede pasar directamente a xilulosa por
la acción de una xilosa isomerasa (XI) (bacterias) o primero a xilitol por una XR dependiente de NADH o de NADPH
y luego a xilulosa por una XDH dependiente de NAD+ (hongos). En ambos casos la xilulosa es transformada a xilulosa-
5-fosfato (xilulosa-5P) por una xiluloquinasa (XK) dependiente de adenosín trifosfato (ATP), y metabolizada hasta
etanol por la ruta de las pentosas fosfato (PPP). Ya han sido introducidas en Saccharomyces cerevisiae. las XR y XDH
de varias levaduras fermentadoras de xilosa, como Candida shehatae o Pichia stipitis (Moysés, et al., 2016). A pesar
de que se ha visto que la levadura S. cerevisiae posee mecanismos para el transporte de xilosa, así como cierta actividad
xilosa reductasa [atribuida a una enzima aldosa reductasa no específica GRE-3 y xilitol deshidrogenasa (Moysés, et
al., 2016). Por tanto, es necesario modificarla genéticamente. Para la producción de xilitol es necesario introducir una
XR, que transforma la xilosa a xilitol. Además de introducir esta vía enzimática, otra estrategia para conseguir cepas
de S. cerevisiae productoras de xilitol es sobre expresar el gen endógeno GRE-3 (Kogje & Ghosalkar, 2016).

4. Producción de Xilitol a nivel industrial

Se han realizado investigaciones en la producción de xilitol modificado genéticamente otros microorganismos,

principalmente se han insertado genes en Saccharomyces cerevisiae para mejorar los resultados. En la Tabla 1 se
muestran algunos trabajos reportados en el mejoramiento de la producción de xilitol.

Tabla 2. Modificaciones genéticas realizadas a S. cerevisiae para producción de xilitol

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A pesar de los buenos resultados obtenidos por las levaduras modificadas genéticamente, estas solo han sido capaces
de llevar a cabo sus funciones metabólicas en medios sintéticos (xilosa y/o glucosa) y han mostrado ser afectadas de
manera severa cuando crecen en medios hidrolizados (Granström et., 2007). Por lo anterior, el uso de microorganismos
modificados genéticamente o bioconversión no ha mostrado resultados competitivos comparados respecto a la síntesis
química.

La síntesis química utiliza como materia prima xilosa pura obtenida a partir de desechos agrícolas, mediante una
hidrólisis del material fibroso con una solución de ácido sulfúrico (5%, T = 100°C), después el licor obtenido de la
hidrólisis contiene la D-xilosa, la cual deberá ser sometida a la hidrogenación a 30 bar y 400 °C para llegar al xilitol.
Previamente es necesario separarla del material sólido y proceder a la neutralización. Una vez neutralizado el
hidrolizado se concentra y desmineraliza (Rangel, 2006).

Según la materia prima empleada, la D-xilosa presente en la solución puede estar acompañada por otras pentosas
(arabinosa, ribosa), las cuales es necesario eliminar. Esta separación se efectúa por métodos cromatográficos como
columnas iónicas o de carbón ( Patente US 3,980,719 Buckl y Fahn, 1974; Patente US 4,008,285 Melaja y Hamalainen,
1975; Patente US 5,081,026 Heikkila et al., 1990).

Concluida la hidrogenación la solución se filtra para recuperar el catalizador Ni/Al2O3 (Choi et al., 2000), el que será
reutilizado en la hidrogenación sucesiva. La solución que contiene xilitol se concentra, el xilitol se cristaliza, se separa,
se seca y se envasa en bolsas o en recipientes idóneos para su almacenamiento y transporte. El producto final tiene una
pureza de 99,7%. Se presenta un esquema global del proceso químico en la Figura 2.

Figura 3. Producción de xilitol por vía química. Fuente: (Rangel, 2006).

La cepa de S. cerevisiae PE-2 ha sido modificada genéticamente para el consumo de xilosa (Romani, et al., 2015), y
reportó una elevada concentración de xilitol (15 g/L con un rendimiento de 0.36g de xilitol /g de xilosa consumida),
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mostrando una predisposición para la producción de este metabolito a nivel industrial. Por los anteriores resultados,
se seleccionó la cepa S. cerevisiae PE-2, como microorganismo para la producción de xilitol.

Para reducir los efectos inhibitorios de los componentes generados por la hidrólisis ácida de la materia prima de
origen, se lleva a cabo una adaptación del microorganismo al hidrolizado posterior a la activación. En la activación,
se toman tres muestras de la levadura que se encuentran en tubos con medio de conservación. Las cuales se
inocularon en matraces Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio de cultivo sintético (Tabla 2) se ajusta el pH a
un valor de 5.5 y se incuba por 24 horas a 250 rpm y 30 °C. Una vez transcurra el tiempo de activación, se realiza la
adaptación haciendo un pase del cultivo al medio hidrolizado, con la finalidad de inducir una adaptación de la cepa a
los componentes presentes en el medio. Se toman 6x10^6 células viables/mL y se inoculan en un matraz de 500 mL
con 200 mL de medio hidrolizado de materia prima de origen y se deja crecen en las mismas condiciones por 24
horas.
Posteriormente se toma de este matraz el inóculo para el fermentador de 9x10^6 células viables/mL.
El volumen del fermentador es de 3 litros. (Gastelum, 2007)

Tabla 3. Compuestos presentes en el cultivo sintético Fuente: (Gastelum, 2007)

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