- MENCIONE Y EXPLIQUE OTROS METODOS PARA PURIFICACION DEL ADN

Diferentes métodos de extracción resunta en diferente pureza y rendimiento de ADN.

Algunos de los métodos han sido evaluados sistemáticamente para aplicaciones
especificas tales como el suelo y sedimento 2, microbioma humano 3 y muestras fecales 4-
6.
Extracción orgánica
En este método convencional, ampliamente utilizado, las células son lisadas y los restos
celulares se eliminan generalmente por centrifugación. Las proteínas son
desnuralizada\digerida utilizando una proteasa y precipitadas con disolventes orgánicos
tales como el fenol, o una mezcla 1:1 de fenol y cloroformo, y el precipitado de proteínas
es eliminando por centrifugación. El ADN purificado suele ser recuperado por precipitación
con etanol o isopropanol. En presencia de cationes monovalentes como el NA+ y a
temperatura de -20°C, el etanol absoluto precipita eficientemente los ácidos nucleicos
poliméricos dejando atrás ácidos nucleico monoméricos y de corta cadena, incluyendo los
ribonucleótidos del tratamiento de ARNasa en solución, este método utiliza disolventes
orgánicos tóxicos, relevantemente laborioso, y el fenol o cloroformo residual pueden
afectar las aplicaciones subsiguientes tales como la PCR.
TECNOLOGIA BASADA EN SILICA
Este es un método ampliamente utilizado en los kits actuales, el ADN se absorbe
específicamente en membrana\esferas\partículas de silica en presencia de ciertas sales y a
un PH particular. Los contaminantes celulares son eliminados mediante diferentes pasos
de lavado. El ADN es eluido en un búfer de baja salinidad o búfer de elución, se utiliza
sales caotropicas para promover la desnaturalización de proteínas y extracción de ADN.
Este método puede ser incorporados en columnas de centrifugado y microchips, es
rentable, tiene un procedimiento más simple y rápido que la extracción orgánica, y es
compatible con la automatización.
SEPARACION MAGNETICA
Este método esta basado en la unión reversible del ADN a una
superficie\esferas\partículas sólidas magnéticas, las cuales han sido recubiertas con un
anticuerpo que une ADN o un grupo funcional que interactúa específicamente con el ADN.
Tras la unión del ADN, las esferas son separados de otros componentes celulares
contaminantes, lavadas y finalmente el ADN purificado es eluido utilizando extracción con
etanol, este método es rápido y puede ser automatizado. Sin embargo, puede ser mas
costoso que otras metodologías.
TECNOLOGIA DE INTERCAMBIO ANIONICO
Este método se basa en la interacción especifica entre los fosfatos cargados
negativamente presentes en los ácidos nucleicos y moléculas de superficies cargadas
positivamente en el substrato. Esta tecnología es utilizada más comúnmente en kits para
el aislamiento de plásmidos.
OTROS
Otros métodos incluyen la precipitación por sales, gradientes de densidad de cloruro de
cesio y resina chelex 100, los métodos de aislamiento de ADN suelen ser modificado y
optimizados para diferentes tipos celulares. El bromuro de centiltrimetiliamonio y el
tiocianato de guanidinio suele utilizarse en los protocolos de extracción de ADN de
 materias vegetales, y se analizan con mas detalle en la sección “extracción de ADN de
tejidos y células vegetales”

- ¿PORQUE ES IMPORTANTE LA PRURIFICACION DEL ADN?

La purificación de ADN es importante porque permite:
1. Identificar mutaciones
2. Ver características propias de los tipos de ADN (polimorfismo)
3. Para clonar (genes específicos, fragmentos de cromosomas o individuos)
4. Aislar DNA afectado y compararlo con uno bueno
5. Detectar en las muestras, la presencia de un largo espectro de agentes patogénicos
6. Identificar resistencia microbiana
7. Evaluar desordenes genéticos, neurodegenerativos, neoplásicos, inmunológicos
8. Medicina forense para identificación de personas
9. Para hacer test de paternidad

- ¿COMO Y CUALES SON LAS APLICACIONES AL EXTRENAR DNA?

Incubación del lisado para su uso
Una posible forma de aislar el ADN genómico es incubar el lisado crudo a temperaturas
entre 90-100° y luego usarlo directamente. Es evidente mediante este método del ADN
obtenido es de muy baja pureza y con aplicaciones muy reducidas. Otra desventaja de este
método son las perdidas del ADN por acción de las nucleasas y otros componentes de los
orgánulos que están en contacto con el ADN y pueden destruirlo, por lo que no es útil para
almacenar el ADN pues los contaminantes pueden degradar las moléculas de ADN
Lisis por ruptura mecánica y extracción con disolventes orgánicos
Si se opta por realizar el lisado de las células mediante un proceso mecánico hay que tener
en cuenta la posibilidad de las moléculas de ADN que se intentan separar por lo que este
debe bastar para lograr la lisis de las células, pero no ser muy agresivo para proteger el
ADN.
El lisado de células se puede extraer con cloroformo, alcohol isoamílico o fenol, este
método se puede usar para moléculas de ADN de alto peso molecular, obteniendo buenos
rendimientos de moléculas relativamente puras
Lisado y purificación con un detergente iónico
Este es un procedimiento básico para extraer ADN de vegetales, donde un detergente
aniónico puede romper la pared celular y así se produce las lisis de las células, el uso de
detergentes aniónico no solo se restringe a la extracción de ADN vegetal, puede ser usado
para ADN genómico de bacterias y otros tipos de organismos
Método de salting-out
Este método se utiliza frecuentemente la proteinasa k , TRIS-HCL para regular el pH y otros
reactivos químicos que aseguren la total inactivación de las enzimas que pueden actuar
sobre las moléculas de ADN
Este método es sencillo, pero no siempre es eficaz, por lo que el ADN obtenido en muchas
ocasiones debe ser purificado antes de ser usado en posteriores aplicaciones, la ventaja es
que se elimina el uso de disolvente orgánico
Uso de la proteinasa k y el dodecilsulfato de sodio
 El procedimiento conocido como PK-SDS por sus siglas en ingles proteinase k -sodium
dodecyl sulfate, es uno de las mas usados para la atracción del ADN ya que la digestión de
la muestra se puede realizar con proteinasa k que es activada por el dodecil sulfato de
sodio, también es usada en otros métodos
Método de extracción de ADN con yoduro de sodio como agente caotropico en un único
tubo
La compañía wako pone a disposición de los investigadores y empresas varios kits de ADN
que usa yoduro de sodio como agente caotrotipo, que tienen ventaja de que la extracción
se realiza en un único micro tubo de centrifugado, también provoca la lisis celular rompe
la capa de hidratación que rodea el ADN y logra que las cargas negativas de los grupos
fosfatos del ADN queden mas expuestas
Extracción con gradientes de cloruro de cesio- bromuro de etidio
El ADN genómico puede ser purificado por centrifugación a través de la generación de
gradientes de cloruro de cesio, se pueden visualizar las diferentes capas en las que se
agrupan los ácidos nucleicos según su densidad con luz ultravioleta. Este método a pesar
de dar un ADN de alta calidad tiene sus desventajas: es largo, imposible de automatizar,
requiera una ultracentrífuga y usa compuestas químicos tóxicos

- DE LAS TRES TECNICAS: A. ESTABLEZCA DIFERENCIA B. VENTAJAS Y DESVENTAJAS C.

USOS Y APLICACIONES

Diferencias
En las técnicas se utiliza diferentes métodos de extracción de ADN, como pudimos ver en
la técnica casera material vegetal los materiales son de casa y el aislamiento de ADN
usando el protocolo con sal común y lavaplatos es una alternativa simple, fácil, rápida,
económica y no contaminante. A cambio que la técnica de tejidos de hojas de tomates su
método es usar que precipitan con el agregado de etanol frio y por último la técnica
electroforesis se basa en gel de agarosa

Ventajas y Desventajas
La técnica de electroforesis en un laboratorio es básica e impredecible, tiene ventajas y
desventajas ya que el laboratorio debe estar equipado para cada técnica para lograr un
gran éxito en la extracción, sabemos de sus desventajas con ciertos reactivos como el
bromuro de etidio porque es toxico a elevadas concentraciones causando daño alas
personas con que trabajan

Usos y Aplicaciones

Técnica de tejidos de hojas: purificación simultanea de ADN y ARN total, el ADN genómico
purificado es adecuado para south, el ARN total purificado es adecuado para RT-PCR y RT-
PCR en tiempo real

Técnica casera en vegetales: proporciona ADN apto para digestión con enzimas de
restricción, RADT y AFLP protocolo rápido y simple
 Técnica de electroforesis: en los ácidos nucleidos la dirección de migración es de electrodo
negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el esqueleto azúcar
fosfato

Siglas
RAPD: Amplificación aleatoria de ADN polimórfico
AFLP: Polimorfismos en la longitud de fragmentos amplificados
RT-PCR: La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa

Características del código genético

El código genético es degenerado: existen mas tripletes o codones que aminoácidos, de
forma que un determinado aminoácido puede estar codificado por más de un triplete.

El código genético nuclear es universal: el mismo triplete en diferentes especies codifica

para el mismo aminoácido

Bases de datos biológicas

Los más relevantes en biología incluyen datos de secuencias de nucleótidos, proteínas,
estructura de proteínas, genomas, expresión genética, taxonomía, metabolismo etc.
Principales bases de datos se secuencias de nucleótidos:
NCBI (EEUU)
EMBL (Europa)
DDBJ (Japón)
A estas secuencias normalmente se les añade alguna información relevante y una interfaz
para poder acceder ala propia base de datos

Traducción en los eucariotas

El mecanismo de eucariota es básicamente el mismo que el de procariota, con la mayor
parte de las diferencias acumuladas en la iniciación

- El ribosoma y sus subunidades son mas grandes

- Los rRNA son mayores y hay más proteínas por subunidad ribosómica
- El ribosoma no tiene sitio E
- El mRNA es diferente y sus elementos distintivos son importantes
- Durante el viaje al citoplasma, el mRNA puede adquirir una estructura secundaria que el
ribosoma tiene que eliminar antes de traducirlo

Traducción en los procariotas

- Subunidad ribosómica 30s con sitio p

- Subunidad ribosómica 50s
- Translocación
- El aminoacil-tRNA reconoce el sitio A del complejo ribosoma\mRNA
- La fase de elongación en la traducción continua hasta el ribosoma reconoce un codón de
transmisión