UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

ASIGNATURA:

ANÁLISIS INSTRUMENTAL

TEMA:

RESUMEN DE UV-VIS

PARALELO:

5-2

ESTUDIANTE:

JIMÉNEZ ZAMBRANO ANDREA ESTEFANÍA

NOMBRE DEL DOCENTE:

ING. AUGUSTA JIMÉNEZ

PERIODO LECTIVO:

2021-2022 CI
Principios básicos de la medición UV-Vis

Dentro de la espectroscopia está la radiación ultravioleta-visible, que es una parte de este

estudio de como la materia emite radiación electromagnética y cuando interactúa con esta
pueden ocurrir procesos de reflexión, dispersión, absorbancia, fluorescencia o fosforescencia.
Esta espectroscopia utiliza las regiones ultravioleta y visible del espectro electromagnético y
su longitud de onda tiene la energía de radiación más alta, la cual se puede ver mediante esta
ecuación:

𝑐(𝑣𝑒𝑙𝑜𝑐. 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑙𝑢𝑧)
𝜈(𝑓𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑒𝑛 𝑠𝑒𝑔. ) =
𝜆(𝑙𝑜𝑛𝑔. 𝑑𝑒 𝑜𝑛𝑑𝑎 𝑒𝑛 𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜𝑠)

La energía que se asociada a esta se define con esta fórmula:

𝐸(𝑗𝑢𝑙𝑖𝑜𝑠) = ℎ(𝑐𝑡𝑒. 𝑑𝑒 𝑃𝑙𝑎𝑛𝑐𝑘) × 𝜈(𝑓𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑒𝑛 𝑠𝑒𝑔. )

La absorbancia y transmitancia donde la cantidad de luz absorbida y la luz que pasa a

través de una muestra, se utilizan para la mayoría de aplicaciones de espectroscopia UV-Vis,
como en laboratorios de pruebas, investigación de materiales, química o petroquímica y
biotecnología o farmacéutica. Se definen como:

𝐼
%𝑇 = × 100 𝑻𝑹𝑨𝑵𝑺𝑴𝑰𝑻𝑨𝑵𝑪𝑰𝑨
𝐼0

𝐴 = – 𝑙𝑜𝑔𝑇 𝑨𝑩𝑺𝑶𝑹𝑩𝑨𝑵𝑪𝑰𝑨

Espectrofotómetro UV-Vis moderno

Estos instrumentos miden la luz absorbida por la muestra en cada longitud de onda utilizando
una fuente de luz, cuando ya la obtienen se puede:

 Identificar moléculas en una muestra sólida o líquida.

 Determinar la concentración de una determinada molécula en solución.
 Caracterizar la absorbancia o transmitancia a través de un líquido o sólido, en un
rango de longitudes de onda.
  Caracterizar las propiedades de reflectancia de una superficie o medir el color de un
material
 Estudiar reacciones químicas o procesos biológicos

En sus componentes tenemos:

 Una fuente de luz

 Un dispositivo de dispersión separa la radiación de banda ancha en longitudes de onda
 Un área de muestra, donde la luz pasa a través de una muestra o se refleja en ella.
 Uno o más detectores para medir la radiación transmitida

Fuente de luz

Genera una banda ancha de radiación electromagnética en todo el espectro UV-visible.

Están la lámpara de arco de deuterio que se utilizó para proporcionar un buen continuo de
intensidad en la región UV e intensidad útil en la región visible. Aquí podemos ver espectros
de intensidad de los diferentes tipos de fuentes de luz:
La lámpara halógena de tungsteno produjo una buena intensidad en todo el rango visible y
parte del espectro UV:

Más recientemente, se ha utilizado más ampliamente una sola lámpara de flash de xenón:

Monocromador

Estos constan de:

Una rendija de entrada y salida donde la luz de las longitudes de onda nominadas pasa a
través y hacia la muestra.
Un dispositivo de dispersión, para difundir la luz en diferentes longitudes de onda y permitir
la selección de una banda nominada de longitudes de onda.

La interferencia y difracción de la luz que incide sobre la rejilla se refleja en diferentes

ángulos que se superponen, dependiendo de la longitud de onda. Las rejillas holográficas
producen una dispersión angular lineal con longitud de onda y son insensibles a la
temperatura.

Ejemplo: en una habitación, con el sol brillando a través de una ventana. La luz del sol golpea
un prisma que separa la luz blanca en un arco iris. El arco iris cae sobre una ventana en el
lado opuesto de la habitación. A medida que se gira el prisma, la luz de diferentes colores es
decir, diferentes longitudes de onda, salen de la habitación a través de la ventana.

Espectrofotómetros de monocromador único y de haz único

Es de uso general y se puede integrar en un sistema óptico compacto. No puede seleccionar

las longitudes de onda de la luz con tanta precisión como un sistema de monocromador
doble. La luz del monocromador pasa a través de la muestra y luego al detector. Este diseño
simple significa que se utilizan menos componentes ópticos y permite reducir el tamaño del
instrumento y costo. Sin embargo, antes de que se pueda medir una muestra, se debe medir
una línea de base o una muestra en blanco.

Espectrofotómetros de doble monocromador

Los dos monocromadores están dispuestos en serie. La fuente de luz es dividida por el primer
monocromador y luego dividida por el segundo. La luz que se filtra al sistema, se reduce y la
precisión espectral aumenta.
Espectrofotómetro de doble haz

La luz emitida por el monocromador se divide en dos haces: un haz de referencia y un haz de
muestra. La luz generalmente se divide con un componente óptico, como una rueda giratoria
que tiene un segmento reflejado llamado divisor de haz. Cada haz entra en la cámara de
muestras a través de trayectorias ópticas independientes. La medición se puede corregir para
cualquier fluctuación del instrumento en tiempo real que ofrece una medición de alta
precisión. Con mejoras en la electrónica y el software, hay un diseño más reciente que
simplifica el proceso de medición y reduce la posibilidad de error del usuario debido a
cubetas no coincidentes o colocación incorrecta de la muestra, pero se utilizan más para el
grado de investigaciones.

El detector

Estos convierten la luz de la muestra en una señal eléctrica. Al igual que la fuente de luz,
debe dar una respuesta lineal en un amplio rango de longitudes de onda, con poco ruido y alta
sensibilidad. Contienen los siguientes:
Tubo fotomultiplicador (PMT)

Un detector PMT proporciona alta sensibilidad a niveles

bajos de luz. Para muestras diluidas, la mayor parte de la
luz que incide sobre la muestra pasará al detector. Para
detectar con precisión pequeñas diferencias entre las
mediciones del blanco y de la muestra, el detector debe
tener un ruido de señal bajo en estos

Silicon diode (Si)

Los detectores de fotodiodos tienen un rango

dinámico más amplio y son más robustos que los
detectores PMT, son usados en espectrofotómetros
más modernos. En un fotodiodo, la luz que cae sobre
el material semiconductor permite que los electrones
fluyan a través de él, agotando la carga en un
capacitor conectado a través del material.

Fotodiodo de arseniuro de galio indio (InGaAs)

Es un detector especializado que proporciona un rendimiento excelente para el rango de

longitud de onda visible y NIR. Los detectores InGaAs están disponibles en opciones de
banda estrecha y banda ancha. Estos detectores son útiles por su respuesta lineal y
sensibilidad en la región del infrarrojo cercano.

Detector de sulfuro de plomo (PbS)

En espectrofotómetros de alto rendimiento y amplio rango de longitud de onda, el detector

PbS a menudo se combina con un detector PMT para cobertura UV-visible. Cuando se
requiera una alta sensibilidad a las bajas frecuencias NIR, un detector de PbS puede
combinarse con un detector de InGaAs de banda estrecha y es el más común en los
espectrofotómetros.

Parámetros óptimos para sus mediciones UV-Vis

Selección de celda óptica

Estas cubetas o celdas que contienen las muestras liquidas, vienen en una variedad de diseños
para adaptarse a la aplicación:

Una celda óptica estándar de 10 mm de longitud de trayectoria con una capacidad de

alrededor de 3,5 ml, la celda tiene dos ventanas ópticas paralelas entre sí. Las ventanas
ópticas deben mantenerse lo más limpias posible y nunca tocarse.

Para volúmenes pequeños hasta alrededor de 0,5 ml, se puede utilizar una celda semimicro.
Estos tienen un canal estrecho en el interior para reducir el volumen de muestra requerido, la
máscara negra a ambos lados de la ventana óptica evita la reflexión interna dentro de la
cubeta. También se encuentran disponibles celdas ultramicro que contienen tan solo 0,5 µL.
Para medir varias muestras de líquido se puede utilizar una celda de flujo continuo. Las
celdas están conectadas a una bomba peristáltica que empuja la muestra a través de un tubo
conectado a la celda, llenando la celda para la medición. Luego se empuja una solución de
enjuague para limpiar la celda antes de bombear la siguiente muestra a la celda.

Las cubetas están disponibles con diferentes longitudes de paso. La longitud de camino que
debe utilizar depende de la absorbancia de su muestra:

 Las muestras concentradas con alta absorbancia (> 3 Abs) necesitan una cubeta de
paso corto o deben diluirse
 Las muestras diluidas con baja absorbancia (<0,2 Abs) necesitan una celda de paso
largo que aumentará la lectura de absorbancia. Esto también puede ayudar a reducir el
nivel de error

Material

Deben tenerse en cuenta las propiedades ópticas del material utilizado en las ventanas de las
cubetas. Para la gama de longitudes de onda más amplia, se prefiere el vidrio de cuarzo,
como el vidrio de cuarzo es más caro, se puede utilizar vidrio óptico o plástico. Las celdas de
poliestireno no son adecuadas para su uso a temperaturas elevadas. Para que un par de
cubetas coincidan, deben estar dentro de la tolerancia de transmisión aceptable a una longitud
de onda particular.

Limpieza

Limpie todas las huellas dactilares y los contaminantes con un paño suave y limpio antes de
usar una celda. Asegúrese de que el paño esté libre de detergentes o lubricantes.
Deben evitarse los ácidos fluorados como el ácido fluorhídrico (HF) en todas las
concentraciones, ya que atacarán el cuarzo y el vidrio. Las soluciones básicas fuertes también
degradarán la superficie de las ventanas y acortarán la vida útil de la cubeta.

Una vez que se haya realizado una medición en blanco, evite limpiar las ventanas ópticas de
su celda. Si se requiere limpieza, tome una nueva medida en blanco antes de continuar con
las medidas.

Termostatizar sus muestras

Los espectrofotómetros UV-Vis pueden equiparse con accesorios para controlar la

temperatura de las muestras. Los sistemas de control de temperatura más simples son
adecuados para mediciones de temperatura fija, estos sistemas utilizan un circulador de agua
termostatizado para hacer pasar agua caliente a través de un colector que contiene la cubeta
de muestra. Para un control de temperatura más preciso, se integra un calentador / enfriador
Peltier en el colector de muestras.

Para los sistemas controlados por Peltier, la temperatura del colector de muestras se
monitorea proporcionando retroalimentación para mantener la temperatura estable.

Agitando su muestra

La agitación de una muestra termostatizada es importante y asegura que se mantenga siempre

la homogeneidad tanto de la solución como de la temperatura. La eficacia de la agitación para
lograr la homogeneidad térmica depende en gran medida de la muestra, el disolvente y la
viscosidad de la solución. Para agitar las soluciones, se coloca una perla de agitación
magnética o una estrella en la parte inferior de la cubeta de muestra. Se encuentran
disponibles cubetas especialmente diseñadas con una base empotrada. Este hueco circular
contiene la perla de agitación y aumenta la eficiencia de agitación.

Al medir muestras a una temperatura inferior a la ambiente, se puede formar condensación

en el exterior de las cubetas. Esto puede interferir con la medición. La condensación se puede
prevenir purgando el compartimiento de la muestra del espectrofotómetro UV-Vis con un gas
limpio y seco.
Transparencia solvente

Al medir muestras líquidas o al disolver muestras sólidas para análisis UV, se debe
considerar la transparencia del solvente. Los disolventes se seleccionan en función de la
solubilidad de la muestra, la estabilidad, los requisitos de pH y la longitud de onda de corte
UV-visible. Para compuestos solubles acuosos, el agua es una excelente opción ya que
permite la medición en todas las longitudes de onda UV.

Ancho de banda espectral óptimo

Es una buena práctica utilizar un instrumento con un ancho de banda espectral como el SBW
que se establezca aproximadamente en una décima parte del ancho de banda natural del
analito. El SBW del instrumento se define como el ancho de la banda de luz a la mitad del
pico máximo, está relacionado con el ancho de rendija física del diseño del monocromador.

Luz parásita (SRE)

La luz parásita o energía radiante parásita se define como el porcentaje de radiación que llega
al detector cuyas longitudes de onda están fuera de la banda espectral seleccionada. Es
causado por un diseño deficiente del instrumento, la luz se filtra hacia el instrumento desde
las luces del laboratorio o la luz del día a través de las ventanas, o la luz no está bien separada
por el monocromador o por daños en el instrumento.

La luz parásita provoca una disminución de las lecturas de absorbancia y cambia la forma del
pico observado, como resultado la luz parásita provoca una desviación de la ley de Beer-
Lambert como se muestra en las siguientes figuras, lo que hace que las mediciones de
concentración no sean confiables. El rendimiento de luz parásita de un instrumento UV-Vis
también determina la máxima absorción que puede medir el instrumento.
Aplicaciones comunes de UV-Vis

Identificación: espectros y estructura

Los espectros UV-visible generalmente muestran solo unos pocos picos de absorbancia
amplios. Con solo unos pocos picos amplios, es difícil identificar un compuesto basado en un
espectro característico. La mayor parte de la absorción por compuestos orgánicos se debe a la
presencia de enlaces π. Un cromóforo es un grupo molecular que generalmente contiene un
enlace π. Otros parámetros, como el pH y la temperatura, también pueden provocar cambios
tanto en la intensidad como en la longitud de onda de los máximos de absorbancia.

Confirmación de identidad

Aunque los espectros UV-visible no permiten la identificación absoluta de un desconocido,

se utilizan para confirmar la identidad de una sustancia mediante la comparación del espectro
medido con un espectro de referencia. Cuando los espectros son muy similares, se pueden
utilizar espectros derivados.

Cuantificar una molécula

Ley de Beer

Si 100 fotones de luz entran en una cubeta y solo 50 salen del otro lado, la transmitancia es
de 0,5 o 50%. Si estos 50 fotones pasan a través de una cubeta idéntica, solo emergerán 25, y
así sucesivamente. Aquí se muestra la trasmitancia frente a la longitud de la trayectoria de la
cubeta.

𝐼
T= = 𝑒 −𝑘𝑏 (𝐾 𝑒𝑠 𝑢𝑛𝑎 𝑐𝑡𝑒. 𝑦 𝑏 𝑒𝑠 𝑙𝑎 𝑙𝑜𝑛𝑔𝑖𝑡𝑢𝑑 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜)
𝐼0

La ley de Beer es idéntica a la ley de Bouguer, excepto que se establece en términos de

concentración. La cantidad de luz absorbida es proporcional al número de moléculas
absorbentes a través de las cuales pasa la luz. La transmitancia frente a la concentración: Ley
de Beer:
La combinación de las dos leyes da la ley de Beer-Bouguer-Lambert:

𝐼
T= = 𝑒 −𝑘𝑏𝑐
𝐼0

Dónde C es la concentración de la especie absorbente, generalmente expresada en gramos por

litro o miligramos por litro. Esta ecuación se puede transformar en una expresión lineal
tomando el logaritmo:

A = – logT = – log(I ⁄ Io ) = log(Io ⁄ I) = ∑bc

El coeficiente de extinción (ε) es característico de una sustancia dada en un conjunto de

condiciones definidas con precisión, como la longitud de onda, el disolvente y la temperatura.
En la práctica, el coeficiente de extinción medido también depende parcialmente de las
características del instrumento utilizado. Por estas razones, los valores predeterminados para
el coeficiente de extinción generalmente no se utilizan para el análisis cuantitativo. En su
lugar, se construye una calibración o curva de trabajo para la sustancia a analizar utilizando
una o más soluciones estándar con concentraciones conocidas del analito.

Suponiendo que se obedece la ley de Beer para el espectro de orden cero, existe una relación
lineal similar entre concentración y amplitud para todos los órdenes de espectros derivados:

Orden cero: A = εbc

Primera derivada: dA/dλ = (dε/dλ)bc

Nth derivada: dnA/dλ’ = (dnε/ dλ’)bc

Cinética
La espectrofotometría UV-Vis es una técnica ideal para esta aplicación, ya que la muestra no
se destruye. Con un sistema UV-Vis de escaneo rápido, se pueden tomar múltiples escaneos
durante la reacción para permitir que la reacción sea visualizada y ayudar en la selección de
longitudes de onda seleccionadas para el cálculo de la velocidad.

Cinética de un solo punto

El análisis cinético de un solo punto es el método más simple para determinar la velocidad de
reacción. Se selecciona una sola longitud de onda y después de iniciar la reacción, la
absorbancia se monitoriza continuamente a esa longitud de onda. Esto da como resultado un
gráfico de absorbancia en función del tiempo. El control del cambio de absorbancia a lo
largo del tiempo le permite estudiar una reacción cuando la absorbancia deja de cambiar, esto
suele ser una indicación de que la reacción está completa.

La ventaja de una medición de un solo punto es que, para reacciones rápidas, se pueden
recopilar datos casi continuos, ya que el sistema no necesita moverse a otra longitud de onda
durante la medición. La velocidad de recopilación de datos del instrumento y el tiempo
promedio de la señal es el factor limitante en la cantidad de datos que se pueden recopilar.

Cinética de escaneo

Proporciona una impresión visual de la reacción a medida que se produce, esta medición
permite la flexibilidad de seleccionar cualquier número de longitudes de onda en el rango de
exploración para realizar un cálculo de la velocidad de reacción. Esto podría incluir analizar
el consumo de reactivos o la producción de productos de reacción a medida que avanza la
reacción.

Cinética de mezcla rápida

Las opciones incluyen la capacidad de cambiar la proporción de mezcla de las soluciones y la

capacidad de termostatizar tanto la celda de flujo como los reactivos. Dado que la velocidad
de recopilación es crítica, es importante seleccionar un sistema UV-Vis con una tasa de
recopilación de datos que sea lo suficientemente rápida como para recopilar una serie de
puntos de datos dentro del marco de tiempo de reacción.

Cuando se instalan en un espectrofotómetro UV-Vis, estos accesorios proporcionan una

entrega precisa de dos o más soluciones a una celda de flujo dentro del UV-Vis, donde se
produce la mezcla. Aquí se muestra una reacción monitoreada durante 3 segundos.

Consideraciones de medición cinética

La velocidad de una reacción puede verse influenciada por la temperatura. Por esta razón,
puede ser importante mantener una muestra a una temperatura constante.

La precisión y reproducibilidad de la temperatura deben considerarse cuidadosamente, ya que

ligeras variaciones de temperatura o la tasa de cambio de temperatura pueden tener un
impacto significativo en los resultados. Cuando se combina con retroalimentación al sistema
de control de temperatura, esto proporciona un mejor control de temperatura de la muestra.
Las sondas de temperatura en la muestra también se pueden usar para registrar la temperatura
de la muestra junto con los datos de absorbancia.
También es importante la agitación constante y reproducible de las muestras. Al medir
reacciones a temperatura ambiente, la agitación asegura que los reactivos se mezclen de
manera consistente durante la reacción. Para muestras termostatizadas, la agitación asegura
que no haya gradiente de temperatura en la muestra.

Medida de color

Nuestro ojo ve la luz transmitida a través o rebotando en una superficie, como se ve en la

primera figura.

Las longitudes de onda de la luz asociadas con diferentes colores (izquierda) y el color de la
luz absorbida y el color complementario asociado que ve el ojo humano (derecha), como se
ve en la segunda figura.

El color es una propiedad importante de un material. El color de la materia está relacionado

con su capacidad de absorción de longitudes de onda de luz específicas. El ojo humano ve el
color complementario al que se absorbe, como se muestra aquí:

En la práctica, tanto la generación como la sensación de color son muy complejas y dependen
de muchos factores, entre ellos:

 El espectro de la luz que incide sobre el objeto

 La estructura de la superficie de un material sólido
 El ángulo de visión

Un instrumento de medición de color tomará el espectro UV-Vis de una muestra y lo

convertirá en tres coordenadas de color que ubican el color en un espacio de color
tridimensional. Las tres coordenadas definen la luminosidad, el croma y el tono de la
muestra. La claridad es una medida de cuán claro u oscuro es un color. El croma es una
medida de la pureza del color y el tono es el color espectral dominante, similar a los colores
que se ven en un arco iris.

Además de utilizarse para mediciones de coincidencia de colores, por ejemplo, medir colores
de pintura en un artículo manufacturado, también se puede utilizar un espectrofotómetro UV-
Vis para medir un cambio de color en una solución. Los ensayos basados en color son una de
las aplicaciones más utilizadas para la espectrofotometría UV-Vis.

Temperatura de fusión de proteínas, ácidos nucleicos y Análisis multicomponente

La espectroscopía UV-Vis se usa comúnmente en las ciencias de la vida para el análisis de

biomoléculas como proteínas y ácidos nucleicos. El espectro de absorbancia de las proteínas
se debe a la absorbancia de los aminoácidos aromáticos triptófano, tirosina y fenilalanina. El
análisis multicomponente se puede utilizar para determinar cuántos de cada aminoácido
aromático están presentes en una proteína intacta.

Una proteína a temperatura ambiente tiene una estructura o conformación terciaria específica
que a su vez crea un entorno electrónico específico para los aminoácidos aromáticos. Otra
aplicación de la espectroscopia UV-Vis expone las proteínas al calor o desnaturalizantes
químicos. Esto, a cierta temperatura o concentración, hará que la proteína se despliegue o se
derrita y pierda su estructura.

Principio de aditividad

Todos los métodos cuantitativos multicomponente se basan en el principio de que la

absorbancia en cualquier longitud de onda de una mezcla es igual a la suma de la absorbancia
de cada componente de la mezcla en esa longitud de onda. La absorbancia de la mezcla en
cada longitud de onda es la suma de la absorbancia de cada componente en esa longitud de
onda, que a su vez depende del coeficiente de extinción y la concentración de cada
componente:

A′(x+y) = A′x + A′y = e′x bcx + e′y bcy

Estas ecuaciones se resuelven fácilmente para determinar la concentración de cada
componente.

Método de mínimos cuadrados

Este método permite el análisis de mezclas más complejas y de mezclas simples de

componentes con espectros similares. El residuo del cálculo de mínimos cuadrados es un
buen indicador de qué tan bien se ajustan los espectros estándar a los espectros de la muestra
y, por lo tanto, es un buen indicador de la probable precisión de los resultados.

Requisitos de muestra

Los métodos simples de ecuaciones simultáneas y mínimos cuadrados producen resultados

precisos solo si la calibración se realiza utilizando estándares puros o mezclas de estándares
para cada componente de la muestra que contribuye al espectro UV-visible. La muestra
desconocida no debe tener ninguna capacidad de absorción adicional.

Requisitos instrumentales

La cuantificación de un solo componente se realiza normalmente midiendo con el mismo

instrumento un estándar o una serie de estándares seguidos de uno desconocido. Este proceso
de calibración debería eliminar el sesgo instrumental, haciendo que la precisión absoluta de la
longitud de onda y la precisión fotométrica absoluta carezcan relativamente de importancia