Práctica Nº 5

Acción de Agentes Físicos, Químicos y Antibiograma.

Aislamiento de Staphylococcus aureus: Hisopado Faríngeo.
Agentes Físicos:

RAYOS UV
Dos máquinas UVR desinfectando un quirófano

CABINA DE SEGURIDAD BIOLOGICA CLASE II A 2

Agentes Físicos:

RAYOS X

Temperatura y Presión

100 ºC =
Esterilización por calor Seco y Húmedo: Placas Petri

A) Calor seco

HORNO ESTERILILADOR

- Horno Esterilizador (pupinel) calor seco

180 °C 90 MINUTOS (POR CONVEXION)

CALOR HUMEDO A PRESION

AUTOCLAVE VERTICAL AUTOCLAVE HORIZONTAL

121 ºC o 250 ºF 15 libras /cm 15 a 20 minutos

TEMPERARURA Y PRESION
 - Flameado

Agentes Químicos:

- Antibióticos: Antibiograma

- SE VERA AL FINALDE ESTA PRESENTACION

Aislamiento Staphylococcus aureus: Muestra Hisopado Faríngeo

Primer día
OBTENCION DE MUESTRA
Medios de Cultivo:
01 placa petri de Agar Manitol Sal común, por alumno

Fórmula* por litro de agua purificada

Extracto de carne bovina 1,0 g
Digerido pancreático de caseína 5,0 Digerido péptico de tejido animal 5,0
Cloruro sódico 75,0
D-manitol 10,0
Rojo fenol 0,025
Agar 15,0 pH 7,4 ± 0,2 * Ajustada y/o suplementada para cumplir los criterios de
rendimiento. .
Materiales:

01 Hisopo estéril por alumno

01 Baja lengua estéril por alumno
Alcohol Iodado
Algodón
Fósforos
Mechero con alcohol.
Equipos.

Incubadora

1 Dia
SE SIEMBRA Y SE INCUBA 18 A 24 HRS EN INCUBADORA

2 DIA
.
Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan
el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira
el indicador de pH ( ROJO DE FENOL) del color rojo al amarillo.

De Agar Manitol aislar una colonia amarilla en Agar Nutritivo inclinado estéril

Tercer día
De la cepa (A. Nutritivo), realizar una coloración de GRAM
Materiales:
Microscopio
Lámina porta objeto
Asa de Kolle
Mechero
Batería GRAM:
Cristal Violeta
Lugol
Alcohol Cetona
Zafranina
Aceite de inmersión

Prueba de catalasa:
Catalasa: es una enzima que contiene un grupo heme como grupo prostético y que en
presencia de H2O2, cataliza que se desdoble en agua y oxígeno, con desprendimiento de
burbujas.

Se puede realizar en forma directa del Agar Nutritivo o realizando una suspensión en solución
salina estéril:

Peróxido de Hidrogeno 3%
Lamina porta objeto
Asa de Kolle
Mechero

Interpretación: El desprendimiento de burbujas es indicio de la producción de enzima catalasa,

en ausencia de la catalasa no se observa desprendimiento de burbujas y el cultivo es
confirmado como Staphylococcus

La formación de la catalasa puede ser determinada por la unificación de la cantidad de

peróxido descompuesto por los cultivos de bacterias, es decir midiéndose el volumen de
oxigeno desprendido.

 Positivo (+) : burbujeo inmediato, observado con facilidad, formación de 02

 Negativo ( - ) : ausencia de burbujas; ausencia de 02.

Prueba de Coagulasa:

TECNICA O PROCEDIMIENTO PARA LA PRUEBA DE COAGULASA

Sembrar de las cepas a examinar con asa de kolle, en 2 ml de Caldo o Medio “Brain Heart
Infusión” (BHI), por inoculación Incubar por 18 a 24 hrs a 37 °C.

Cuarto Día

Se realiza la prueba de Coagulasa:

Plasma citratado .- este se obtiene a partir de sangre total tomada con anticipación y
centrifugada a gran velocidad durante 10' luego se diluye al medio.

Preparar el plasma con anticipación

Medir 0.5 cm de citrato de sodio al 3.8% en un tubo de ensayo de 13 x100.

Agregar 4.5 de sangre total, Mezclar y homogeneizar, dejar reposar 10 m, centrifugar por 5
minutos, luego separar el plasma.
En tubos de ensayo de 13 x 100 estériles:
Mezcle 0.5 mL de este cultivo con 0.5 mL de plasma citratado de ovejo o humano
Incubar 4 hrs a 37 ºC. Lecturas deben realizarse a la 1/2, 4 y al termino de 24 hrs.
Si la cepa es coagulasa positiva, la enzima es capaz de coagular el plasma de conejo o humano
citratado. (Formación de un coágulo).

Cultivo de BHI
Gradillas
Pipetas estériles
Tubos de ensayo de 13x100 estériles
04 Jeringas de 10 cm
Alcohol
Algodón
Ligadura
Reactivos:
Citrato de sodio 3.8%

Igualmente se realiza el Antibiograma

Método kirby Bauer
01 Frasquito con solución salina estéril

O1 placa Petri de Mueller Hinton

01 Multidisco para Antibiograma GRAM Positivos

01 Hisopo Estéril
01 Mechero
Fósforos
Del cultivo puro de bacterias patógenas que ha sido incubado durante 18-24 horas a 37ºC se
inocula en un frasquito con solución salina estéril, se siembra en una Placa de Petri CON Agar
Mueller Hinton Medium

El patrón 0,5 de McFarland es equivalente a una suspensión bacteriana que contiene

entre 1 x 10 8 - 2 x 10 8 UFC/ ...

siempre con técnica aséptica. Se coloca el multidisco para antibiograma GRAM Positivos. En
nuestros casos los antibioticos son:

Antibiograma:

GRAM POSITIVOS (+)

Te . Tetraciclina
Me : Eritromicina
Ox : Oxacilina
Dc : Clindamicina
Sxt : Sulfatrimetropina
Clp : Ciprofloxacino
Cez : Ceftaziclina
Ge : Gentamicina
P : Penicilina
C : Cloranfenicol
Las placas de Mueller Hinton o del antibiograma se incuban a 37ºc por 18 a 24 horas.
Leer los resultados; tomando en cuenta los halos de inhibición en crecimiento al torno a los
discos colocados en la placa. Se aconseja dividir los gérmenes en sensibles y resistentes según
su comportamiento frente al antibiótico (halo de inhibición).