LABORATORIO DE QUÍMICA UNI1VERSIDAD SANTIAGO DE CALI

CUANTIFICACION DE CAFEINA EN BEBIDAS COMERCIALES POR HPLC

Fecha de última sección: 24/10/23
Fecha de entrega: 07/11/2023
Bejarano O., Jose Miguel (1107834225), Daza L., Lina Natalia (1002836485), Rivera M., Angie Julieth
(1006102081) Tafurt S., Julián Mauricio (1105363720).
Facultad de Ciencias Básicas, Química Farmacéutica, Universidad Santiago de Cali, Cali Colombia.

jose.bejarano03@usc.edu.co. lina.daza00@usc.edu.co. angie.rivera00@usc.edu.co. julian.tafurt00@usc.edu.co,

Resumen

La cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) es una técnica de separación utilizada para la
separación, análisis y purificación de muestras. Mediante esta técnica se separó y se cuantificó la
diferentes concentraciones de cafeína presentes en café, coca-cola, vive 100 y fencafen. Por medio
de las soluciones estándar se realizó la curva de calibración en función de su concentración vs su
área de pico para poder cuantificar la concentración de las diferentes muestras. Para el café se
obtuvo una concentración de 1,151 mg de cafeína con un error del 21,16% , para la coca-cola de
0,070 mg/mL con un error de 27,08%, para el vive 100 de 789,5 con un error de 22,46% y
finalmente para la tableta de fencafen de 74,93 mg con un error de 25,07%.

Palabras clave: Cromatografía, HPLC, separar, cuantificar, área de pico.

INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS

La cromatografía líquida de alta eficacia es una técnica instrumental utilizada en análisis químicos
que permite separar diferentes mezclas, purificar y cuantificar los componentes de un analito, así
como también permite realizar otros estudios muy utilizados en laboratorios de análisis de calidad
en empresas farmacéuticas y la industria alimenticia. Su abreviatura HPLC se deriva del inglés
High Performance Liquid Chromatography. Esta funciona manipulando líquidos que consiste en
una mezcla compuesta por el analito y uno o más solventes que son la fase móvil (esta es la fase
que arrastra la solución con el analito por todo el equipo HPLC y la columna). [1]

La HPLC no depende de la gravedad para que el líquido moje la fase estacionaria, en lugar de esto,
el equipo tiene unas bombas de altas presiones que irrigan la fase móvil por la columna con mayor
intensidad y por esto no es necesario verter la fase móvil todo el tiempo por la columna, sino que el
sistema lo hace constantemente por sí solo. Su eficacia se debe a las partículas diminutas de relleno
que hacen parte de la fase estacionaria, pues, al ser más pequeñas, su área de contacto con la fase
móvil es mayor por lo que interacciona mejor con el analito y se logran separar más sus
moléculas.[1]
 Figura 1. Componentes del equipo HPLC.

En la figura 1 se puede observar un diagrama simplificado de cómo funciona el HPLC. Por lo

general, los componentes de un sistema HPLC se centran en una fase móvil (formada por una
solución y un solvente), sistema de bombeo que extrae el sistema de solventes de la fase móvil,
impulsándolo a altas presiones como se mencionó anteriormente. En este caso, el HPLC, puede
trabajar como elución isocrático, es decir, la fase móvil no varía y la gradiente de elucion, donde la
fase móvil si varía, la columna en donde ocurre la separación de componentes respecto a la
muestra, ya que la fase estacionaria puede ser sólido o líquido que es inmiscibles respecto a la fase
móvil y los detectores que perciben cuando un compuesto está presente y envía la señal al
ordenador. [1]

Cabe decir que al momento de separar cualquier mezcla por HPLC, se debe identificar el grado de
retención de la molécula, es decir, su polaridad y tambíen la carga eléctrica de las moléculas, pues,
si son iguales se van a repeler y si son diferentes se atraen entre sí. También, si las moléculas son
pequeñas penetran más rápido los poros de la columna que las que son grandes.

Respecto a la cafeína que es el componente de interés en esta práctica, pertenece al grupo funcional
xantina por su efecto estimulante en el sistema nervioso central, muchas industrias la utilizan para
efectos psicoestimulantes, broncodilatadores, entre otras funciones. La 1,3,7-trimetilxantina
también es conocida como cafeína, teína, mateína, guaranina, metilteobromina o metilteofilina. [2]

Figura 2. Estructura química de la cafeína.

El objetivo de esta práctica es separar y cuantificar por medio del equipo HPLC la cafeína presente
en muestras comerciales que contienen este analito, en este caso café, coca-cola, vive 100 y
fencafen, teniendo en cuenta la polaridad y la carga eléctrica para así determinar el área de los picos
cromatográficos en función de la concentración de las soluciones estándar.
DATOS, CÁLCULOS Y RESULTADOS

La determinación de la cantidad de cafeína en bebidas comerciales se llevó a cabo utilizando

cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC). En el proceso, se observaron distintos
cromatogramas en relación a la concentración de diversas soluciones, que se detallan a
continuación.

Se analizó la relación entre la concentración (ppm) y el tiempo de retención (min) de acuerdo con la
Tabla 1, con el fin de comprender la velocidad de respuesta de las áreas de pico de las soluciones y
detectar posibles fallos.

Tabla 1. Resultados de los tiempos de retención

Para calcular la concentración en ppm de las muestras problemáticas, se utiliza la respuesta relativa
del área de pico de cada solución estándar en relación a su concentración en partes por millón,
como se detalla en la tabla 2 que se encuentra a continuación.

Tabla 2. Resultados curva de calibración

Gracias a la tabla previamente mostrada se graficó la curva.

Gráfico 1. Curva de calibración, concentración vs área de pico

La curva de calibración posibilita la determinación de la concentración de cafeína a través de la

ecuación de la gráfica, sustituyendo (Y) con el valor del área obtenido en las muestras de la
siguiente manera.

Café:

El valor real se calculó como 95 mg de cafeína por 10 mg de café

Porcentaje de error:
Coca-Cola:

Factor dilución:

Porcentaje de error, teniendo en cuenta la etiqueta de la Coca-Cola:

Vive 100:

Factor dilución:

Porcentaje de error, teniendo en cuenta la etiqueta del vive 100:

Tableta fencafen:
Factor dilución:

Porcentaje de error, teniendo en cuenta que es una tableta de 100 mg.

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

La determinación de la cantidad de cafeína en las muestras comerciales se realizó utilizando

cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC). En primer lugar, se observa que los tiempos de
retención, que son los momentos en que se detectan los picos de cafeína en los cromatogramas,
varían entre las soluciones estándar y las muestras comerciales. Esto sugiere que hay diferencias en
la matriz de las muestras y las condiciones de análisis, lo que podría influir en la precisión de las
mediciones. La polaridad de la fase móvil es un factor importante en la separación y cuantificación
de la cafeína, y las matrices de las muestras comerciales pueden afectar significativamente esta
polaridad. Esto se refleja en los tiempos de retención y las áreas de los picos. [3]

En el caso de la cafeína, es una sustancia ligeramente polar debido a sus grupos funcionales, lo que
significa que interactúa de manera significativa con una fase móvil polar. La fase móvil está
compuesta por una mezcla de metanol y agua. El metanol es una sustancia polar, y el agua es
altamente polar, por lo que la fase móvil utilizada es adecuada para separar la cafeína. Sin embargo,
las muestras problemáticas, como la Coca-Cola, Vive 100 y la Tableta Fencafen, son productos
comerciales que pueden contener una variedad de componentes y aditivos. Estos otros componentes
pueden influir en la polaridad de la matriz de la muestra y afectar la interacción de la cafeína con la
fase móvil y estacionaria. [3]

La creación de una curva de calibración con una alta correlación (R^2 = 0,9996) entre la
concentración de cafeína y el área de pico es un paso fundamental para la determinación
cuantitativa de cafeína. Sin embargo, a pesar de este coeficiente de correlación, se observan
porcentajes de error notables al calcular la concentración de cafeína en las muestras comerciales.

En el caso del café, la concentración medida es de 1,151 mg de cafeína, mientras que el valor real
se estima en 0,95 mg. Esto da como resultado un porcentaje de error del 21,16%, lo que indica un
valor más alto del esperado de la concentración de cafeína en el café.

La Coca-Cola muestra una concentración calculada de 14,06 ppm, pero considerando la dilución, se
obtiene un factor de 0,070 mg/mL. El porcentaje de error, teniendo en cuenta la etiqueta del
producto es del 27,08%. Esto refleja una diferencia significativa entre la cantidad de cafeína
medida y la cantidad declarada en la etiqueta.

Lo mismo sucede con la muestra de Vive 100, la concentración calculada es de 78,95 ppm, y con la
dilución, se obtiene un factor de 789,5 mg/L. El porcentaje de error, teniendo en cuenta la etiqueta
de Vive 100, es del 22,46%, y finalmente con la tableta Fencafen, de la cual se obtiene una
concentración calculada de 14,59 ppm, y con la dilución, un factor de 74,93 mg. El porcentaje de
error, teniendo en cuenta que la tableta tiene 100 mg de cafeína, es del 25,07%. Los porcentajes de
error se encuentran entre 21,16- 27,08 % lo que se considera un valor alto para este tipo de análisis.

Estos resultados indican la presencia de errores sistemáticos en la determinación de la cafeína en las

muestras comerciales, estos errores pueden deberse a diversas fuentes, incluyendo la preparación de
las muestras, la dilución, la precisión del equipo de HPLC y la variabilidad en los tiempos de
retención debido a las diferencias en la matriz de las muestras.

CONCLUSIONES

Finalmente se puede inferir que al determinar cafeína en diferentes muestras, dentro de las que se
encuentran Coca-Cola, Vive 100 y Tableta Fencafen, los tiempos de retención variaron entre la
solución estándar y la muestra comercial, lo que indicó que hubieron diferencias en la matriz, lo
cual pudo variar la polaridad de la fase móvil y de esta manera, los tiempos de retención y los
picos. Además de esto las diferentes interacciones de las muestras anteriormentes mencionadas con
la solución de metanol y agua (fase móvil), pudo afectar también la polaridad de la matriz; por otro
lado, con respecto a los datos se pudo analizar que en la curva de calibración se obtuvo una alta
correlación, que fue de 0,9996; sin embargo esto no exceptuó los resultados que obtuvieron un alto
porcentaje de error como lo fueron en el caso del café, de un 21, 16%, siendo el valor experimental,
más alto que el teórico el cual es estimado de 0,95 mg.

Así mismo en el caso de la Coca-Cola se determinó un porcentaje de error de 27,08% y en la

muestra de vive 100 la cual obtuvo un porcentaje de error de 22,46% y finalmente con la tableta de
Fencafen cuyos porcentajes de error oscilaron entre 21,16- 27,08 %. Todo estos resultados
mencionados pudieron tener errores sistemáticos como la preparación de las muestras, la dilución,
etc.

Desarrollo de preguntas de la guía

1. ¿Por qué es necesario realizar una purga del equipo con la fase móvil antes de proceder a
hacer las inyecciones?

R/ Realizar una purga del equipo HPLC es esencial para reducir o eliminar la presencia de
contaminantes que puedan haber quedado de muestras anteriores que hayan pasado por el equipo,
por ejemplo productos de degradación, partículas sólidas o impurezas, por otro lado es importante
para estabilizar el sistema y garantizar un equilibrio térmico y de presión, lo que genera una mayor
confianza para generar resultados reproducibles. También, evita las interferencias generando
resultados con más exactitud y contribuye a mantener el equipo en buen estado y alargar su vida
útil ya que se evitan unas posibles obstrucciones o inconvenientes mecánicos.

Este procedimiento de purga arrastra los gases que se encuentren fuera de la disolución utilizando
burbujas de un gas inerte en su fase móvil; así mismo contienen un sistema para filtrar los solventes
y eliminar polvo o partículas sólidas que puedan dañar la bomba, sistemas de inyección o tapen la
columna [4]
2. El acetonitrilo empleado como parte de la fase móvil (acetonitrilo en agua) puede ser
reemplazado por metanol, sí es así, ¿qué proporción debe tener?

R/ El metanol puede ser utilizado como fase móvil, reemplazando al acetonitrilo, teniendo en
cuenta que la fase móvil del HPLC se divide en eluyente débil, fuerte y modificador, en donde
tienen que ser de alta pureza, compatibles con el detector, no puede ser reactivo con la muestra y
tener una baja viscosidad para poder mantener baja la presión realizada por el sistema. El metanol
cumple con estas condiciones anteriormente mencionadas y es utilizado como un eluyente fuerte,
ya que generalmente el débil suele ser agua, el metanol cuenta con una baja viscosidad, alta fuerza
elutrópica, es decir alta afinidad con el analito y por otro lado es considerablemente favorable ya
que permite la detección de UV en un rango de longitud de onda baja, es fácil de evaporar después
del aislamiento. La proporción varía dependiendo de las condiciones necesarias para cada análisis
como la muestra o la columna, sin embargo generalmente se podría hablar de una relación de 5% y
95% de metanol en agua; sin embargo hay que tener en cuenta que algunos compuestos presentan
mayor solubilidad por el acetonitrilo que por el metanol, por lo que esta elección de solvente puede
influir en la sensibilidad del análisis. [5]

3. Considera que el sistema de detección utilizado fue el correcto?¿Por qué?

R/ Para realizar la cuantificacion de cafeina en las diversas muestras de bebidas comerciales, este
método de HPLC es el adecuado, ya que permite una separación y cuantificación precisa de la
cafeína ante soluciones que puedan contener diferentes tipos de compuestos similares a la cafeína,
esto se puede realizar ante la elección de una columna adecuada, composición, flujo de la fase
móvil y el uso de detectores específicos o selectivos; por otro lado, este método presenta una alta
sensibilidad, lo que hace posible determinar y cuantificar la cafeína en bajas cantidades presentes
en la muestra, esto es de vital importancia para garantizar la seguridad y cantidad máxima
permitida por las reglamentaciones del ministerio de salud. Por último el cromatógrafo HPLC
contiene detectores de UV VIS, lo que garantiza una correcta cuantificación de moléculas con
anillos aromáticos. [6]

4. Los picos que se observan antes de la cafeína en las inyecciones de las muestras ¿A qué
pueden deberse?

R/ Los picos previos a los de las diferentes muestras con cafeína pueden deberse a la presencia de
contaminantes o residuos en el sistema HPLC ya sea en la fase móvil o la columna, etc, de igual
manera un lavado insuficiente puede generar este tipo de picos; además de esto, si se presentan
picos dobles estos pueden ser causados por la perturbación del flujo, así como en el caso de
compuestos polares, estos pueden requerir una inyección adicional para realizar un correcto análisis
individual [7]. Por último, si en el medio se encuentran compuestos con un factor de retención
similar esto puede afectar significativamente, así como la mala preparación o posible
contaminación de la muestra

BIBLIOGRAFÍA

[1] Bolívar, G. (2020, 18 enero). Cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC): fundamento,
equipo, tipos. Lifeder. https://www.lifeder.com/cromatografia-liquida-alta-eficacia/

[2] National Library of Medicine. (s. f.). Cafeína. https://medlineplus.gov/spanish/caffeine.html

[3] Libretexts. (2022, November 2). 2.3D: Teoría de la Separación. LibreTexts Español.
https://espanol.libretexts.org/Quimica/Qu%C3%ADmica_Org%C3%A1nica/T%C3%A9cnicas_de_Laborato
rio_de_Qu%C3%ADmica_Org%C3%A1nica_(Nichols)/02%3A_Cromatograf%C3%ADa/2.03%3A_Croma
tograf%C3%ADa_en_Capa_Fina_(TLC)/2.3D%3A_Teor%C3%ADa_de_la_Separaci%C3%B3n

[4] Camacho C. (2022) Encendido y apagado de un equipo de cromatografia de liquidos de alta resolucion
HPLC.https://www.studocu.com/es-mx/document/instituto-politecnico-nacional/optativa-3/practica-2encend
ido-y-apagado-de-un-equipo-de-cromatografia-de-liquidos-de-alta-resolucion-hplc/24527086

[5] Técnicas de desarrollo de métodos alternativos | Waters. (s. f.).

https://www.waters.com/nextgen/xg/es/education/primers/preparative-liquid-chromatography-primer/alternat
ive-method-development-techniques.html

[6] Correa J Y Moreno C. (2023) Determinacion de cafeina por cromatografia de alta resolucion (HPLC).
https://www.studocu.com/co/document/universidad-del-valle-colombia/analisis-instrumental/informe-determ
inacion-de-cafeina-por-hplc/70875469

[7]Waters (2008) Columnas preparativas Optimum bed density.

https://www.waters.com/webassets/cms/library/docs/720002336es.pdf