Dr.

REMY NELSON CAMACHO ZAMBRANA

HISTOLOGÍA

MICROSCOPIA

La microscopía es el conjunto de técnicas y métodos destinados a hacer visible los

objetos de estudio que por su pequeñ ez está n fuera del rango de resolució n del ojo
normal.

Si bien el microscopio es el elemento central de la microscopía, el uso del mismo se

requiere para producir las imá genes adecuadas, de todo un conjunto de métodos y
técnicas afines pero extrínsecas al aparato. Algunas de ellas son, técnicas de
preparació n y manejo de los objetos de estudio, técnicas de salida, procesamiento,
interpretació n y registro de imá genes, etc.

MICROSCOPIO

Un microscopio es un instrumento que aumenta los objetos que son demasiado

pequeñ os para poder verlos, produciendo una imagen en la que el objeto parece
má s grande. La mayoría de las fotografías de células se toman utilizando un
microscopio y dichas imá genes se conocen también como micrografías.

El tipo má s comú n y el primero que fue inventado es el microscopio ó ptico.

MICROSCOPIOS Y LENTES

Aunque las células varían de tamañ o, generalmente son bastante pequeñ as. Por
ejemplo, el diá metro de un gló bulo rojo humano típico es de alrededor de ocho
micrometros (0.008 milímetros). Poniéndolo en contexto, la cabeza de un alfiler es
de alrededor de un milímetro de diá metro, así que pueden alinearse unos 125
gló bulos rojos a lo ancho de la cabeza del alfiler. Con algunas excepciones, las
células individuales no pueden verse a simple vista, así que los científicos deben
utilizar microscopios para estudiarlas.

El microscopio es solo un tipo de lupa. De hecho, las lupas califican como

microscopios y, dado que tienen un solo lente, se les llama microscopios simples.
Los instrumentos má s sofisticados que visualizamos como microscopios son
los microscopios compuestos, lo que significa que tienen lentes mú ltiples. Debido a
la manera en la que está n colocados sus lentes, pueden refractar la luz para
producir una imagen mucho má s grande que la de una lupa.

En un microscopio compuesto con dos lentes, el arreglo de estos tiene una

consecuencia interesante: la orientació n de la imagen que ves está al revés del
objeto real que está s examinando. Por ejemplo, si estuvieras viendo un pedazo de
perió dico con la letra “e” impresa en él, la imagen que verías a través del
microscopio sería “ə”. Los microscopios compuestos má s complejos no producen
 una imagen invertida porque incluyen un lente adicional que vuelve a invertir la
imagen a su estado normal.

¿Cuá l es la diferencia entre un microscopio bá sico y la potente má quina utilizada

en un laboratorio de investigació n? Hay dos pará metros que son especialmente
importantes en microscopía: el aumento y la resolució n.

 El aumento es una medida de qué tan grande puede un microscopio (o el conjunto

de lentes en un microscopio) hacer que parezca un objeto. Por ejemplo, los
microscopios ó pticos utilizados normalmente en bachilleratos y universidades
aumentan hasta 400 veces el tamañ o real de un objeto. De este modo, si algo mide
1 mm de ancho en la vida real, en la imagen microscó pica sería de 400 mm de
ancho.

 La resolución de un microscopio o lente es la distancia má s corta a la que dos

puntos pueden estar separados y distinguirse como objetos separados. Mientras
menor sea este valor, mayor será el poder de resolució n del microscopio y mejor la
nitidez y el detalle de la imagen. Si dos células bacterianas estuvieran muy juntas
una de otra en una lá mina, podrían verse como un solo punto borroso en un
microscopio de poca resolució n, pero se verían como entidades separadas en uno
de alta resolució n. 
Tanto el aumento como la resolució n son importantes si quieres obtener una
imagen nítida de algo muy pequeñ o. Por ejemplo, si un microscopio tiene mucho
aumento pero baja resolució n, todo lo que obtendrá s será una versió n má s grande
de una imagen borrosa. Los diferentes tipos de microscopios difieren en su
aumento y resolució n.

MICROSCOPIO ÓPTICO

La mayoría de los microscopios para estudiantes se clasifica como microscopios

ó pticos. En un microscopio ó ptico, la luz visible pasa a través del espécimen (la
muestra bioló gica que está s mirando) y se curva por medio del sistema de lentes,
permitiendo al usuario ver una imagen ampliada. Una de las ventajas de la
microscopía ó ptica es que a menudo se puede realizar en células vivas, por lo que
es posible observar a las células llevando a cabo sus comportamientos normales
(por ejemplo, migrar o dividirse) bajo el microscopio.
Un microscopio ó ptico, del tipo encontrado comú nmente en los laboratorios de
biología y universidad.

Los microscopios de laboratorio para estudiantes suelen ser de campo claro, lo

que significa que la luz visible pasa a través de la muestra y forma una imagen
directa, sin modificaciones. Algunas formas un poco má s sofisticadas de
microscopía ó ptica usan trucos ó pticos para mejorar el contraste, lo que hace que
los detalles de las células y tejidos sean má s fá ciles de ver.

Otro tipo de microscopía ó ptica es la microscopía de fluorescencia, que se usa

para obtener imá genes de muestras que fluorescen (absorben luz de una longitud
de onda y emiten otra). La luz de una longitud de onda se usa para excitar las
moléculas fluorescentes y la luz de otra longitud de onda que estas emiten se
colecta y utiliza para formar una imagen. En la mayoría de los casos, la parte de la
célula o tejido que queremos ver no es fluorescente de manera natural, por lo que
debe ser marcada con una tinció n fluorescente antes de ponerla al microscopio.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO

Algunos tipos de microscopía ó ptica de vanguardia (má s allá de las técnicas que
acabamos de mencionar) pueden producir imá genes de alta resolució n. Sin
embargo, si quieres ver algo extremadamente pequeñ o a una resolució n muy alta,
quizá s prefieras utilizar una técnica diferente y de eficacia comprobada:
la microscopía electró nica.

Los microscopios electró nicos son diferentes de los ó pticos porque usan un haz de
electrones en lugar de uno de luz para generar la imagen de un espécimen. Los
electrones tienen una longitud de onda mucho má s corta que la luz visible y esto
hace que los microscopios electró nicos puedan obtener imá genes de mayor
resolució n que los microscopios ó pticos está ndar. Los microscopios electró nicos
pueden utilizarse para examinar células, pero también para ver las estructuras
subcelulares y los compartimientos que hay dentro de ellas.

Sin embargo, tienen una limitació n: las muestras a examinar bajo un microscopio
electró nico deben estar al vacío (y generalmente requieren una preparació n
mediante un largo proceso de fijació n), lo que significa que no es posible observar
células vivas.

Imá genes de bacterias Salmonella tomadas mediante microscopía ó ptica y microscopía

electró nica. Puede verse mucho má s detalle en la micrografía electró nica.
En la imagen anterior, puedes comparar có mo se ven las bacterias Salmonella en
una micrografía ó ptica (izquierda), con una imagen tomada con un microscopio
electró nico (derecha). Las bacterias aparecen como pequeñ os puntos de color
morado en la imagen del microscopio ó ptico, mientras que en la micrografía
electró nica, puedes ver claramente su forma y la textura de su superficie, así como
detalles de las células humanas a las que tratan de invadir.

Hay dos tipos principales de microscopía electró nica.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE BARRIDO (MEB), un haz de electrones se

mueve hacia adelante y hacia atrá s a lo largo de la superficie de una célula o tejido,
creando una detallada imagen tridimensional de la superficie. Este tipo de
microscopía es la que se utilizó para tomar la imagen de la bacteria Salmonella que
se muestra arriba, a la derecha.

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA DE TRANSMISIÓN (MET), la muestra se corta en

rebanadas extremadamente delgadas (utilizando un cortador con filo de diamante)
antes de ponerla al microscopio, y el haz de electrones pasa a través de la muestra
en lugar de barrer su superficie La MET se usa con frecuencia para obtener
imá genes detalladas de las estructuras internas de las células.

Los microscopios electró nicos, como el que aquí se muestra, son significativamente
má s grandes y caros que los microscopios ó pticos está ndar.

PARTES DEL MICROSCOPIO

UN MICROSCOPIO PRESENTA DOS SISTEMAS

Un sistema mecá nico y un sistema ó ptico.

SISTEMA MECÁNICO

Dentro del sistema mecá nico se incluyen todos los elementos estructurales que
dan estabilidad al microscopio y mantienen los elementos ó pticos correctamente
alineados.
Dentro de este sistema tenemos:
BASE O PIE: Es la pieza que se encuentra en la parte inferior del microscopio y
sobre la cual se montan el resto de elementos. Acostumbra a ser la parte má s
pesante para proporcionar suficiente equilibrio y estabilidad al microscopio. Es
habitual que incluya algunos topes de goma para evitar que el microscopio se
deslice sobre la superficie donde se encuentra.
BRAZO: El brazo constituye el esqueleto del microscopio. Es la pieza intermedia
del microscopio que conecta todas sus partes. Principalmente conecta la superficie
donde se coloca la muestra con el ocular por donde ésta se puede observar. Tanto
las lentes del objetivo como del ocular se encuentran también conectadas al brazo
del microscopio.
PLATINA: Esta es la superficie donde se coloca la muestra que se quiere observar.
Su posició n vertical con respecto a las lentes del objetivo se puede regular
mediante dos tornillos para generar una imagen enfocada. La platina tiene un
agujero en el centro a través del cual se ilumina la muestra. Generalmente hay dos
pinzas unidas a la platina que permiten mantener la muestra en posició n fija.

PINZAS: Las pinzas tienen la funció n de mantener fija la preparació n una vez esta
se ha colocado sobre la platina.
TORNILLO MACROMÉTRICO: Este tornillo permite ajustar la posició n vertical de
la muestra respecto el objetivo de forma rá pida. Se utiliza para obtener un primer
enfoque que es ajustado posteriormente mediante el tornillo micrométrico
TORNILLO MICROMÉTRICO: El tornillo micrométrico se utiliza para conseguir un
enfoque má s preciso de la muestra. Mediante este tornillo se ajusta de forma lenta
y con gran precisió n el desplazamiento vertical de la platina.
REVÓLVER: El revó lver es una pieza giratoria donde se montan los objetivos. Cada
objetivo tiene proporciona un aumento distinto, el revó lver permite seleccionar el
má s adecuado a cada aplicació n. Habitualmente el revó lver permite escoger entre
tres o cuatro objetivos distintos.
TUBO: El tubo es una pieza estructural unida al brazo del telescopio que conecta el
ocular con los objetivos. Es un elemento esencial para mantener una correcta
alineació n entre los elementos ó pticos.

SISTEMA ÓPTICO

El sistema ó ptico incluye todos los elementos necesarios para generar y desviar la

luz en las direcciones necesarias y así acabar generando una imagen aumentada de
la muestra.
FOCO O FUENTE DE LUZ: Este es un elemento esencial que genera un haz de luz
dirigido hacia la muestra. En algunos casos el haz de luz es primero dirigido hacia
un espejo que a su vez lo desvía hacia la muestra. La posició n del foco en el
microscopio depende de si se trata de un microscopio de luz transmitida o de luz
reflejada.
CONDENSADOR: El condensador es el elemento encargado de concentrar los
rayos de luz provenientes del foco a la muestra. En general, los rayos de luz
provenientes del foco son divergentes. El condensador consiste en un seguido de
lentes que cambian la direcció n de estos rayos de modo que pasen a ser paralelos o
incluso convergentes.
DIAFRAGMA: El diafragma es un pieza que permite regular la cantidad de luz
incidente a la muestra. Normalmente se encuentra situado justo debajo la platina.
Regulando la luz incidente es posible variar el contraste con el que se observa la
muestra. El punto ó ptimo del diafragma depende del tipo de muestra observada y
de su transparencia.
OBJETIVO: El objetivo es el conjunto de lentes que se encuentran má s cerca de la
muestra y que producen la primera etapa de aumento. El objetivo suele tener una
distancia focal muy corta. En los microscopios modernos distintos objetivos está n
montados en el revó lver. Este permite seleccionar el objetivo adecuado para el
aumento deseado. El aumento del objetivo junto con su apertura numérica suele
estar escrito en su parte lateral.
OCULAR: Este es el elemento ó ptico que proporciona la segunda etapa de
ampliació n de imagen. El ocular amplia la imagen que ha sido previamente
aumentada mediante el objetivo. En general, el aumento aportado por el ocular es
inferior al del objetivo. Es a través del ocular que el usuario observa la muestra. En
funció n del nú mero de oculares se puede distinguir entre microscopios
monoculares, binoculares e incluso trinoculares. La combinació n de objetivo y
ocular determina el aumento total del microscopio.
PRISMA ÓPTICO: Algunos microscopios incluyen también prismas en su interior
para corregir la direcció n de la luz. Por ejemplo, esto es imprescindible en el caso
de los microscopios binoculares, donde un prisma divide el haz de luz proveniente
del objetivo para dirigirlo hacia dos oculares distintos.

NORMAS PARA EL USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

1.-Quitar la funda protectora del microscopio.

2.-Enchufar/encender el microscopio.

3.-Colocar en primera instancia el objetivo de menor aumento para lograr un

enfoque correcto. Este paso en muy importante y se debe realizar siempre, ya que
permitirá la observació n de una panorá mica del preparado y la ubicació n de á reas
de interés para su aná lisis posterior.

4.-Subir el condensador utilizando el tornillo correspondiente.

5.-Colocar el preparado sobre la platina, con el cubre-objetos hacia arriba y

sujetá ndola con las pinzas/guías.

6.-Enfoque el preparado mirando a través del ocular y lentamente mueva el

tornillo macrométrico.

7.-Recorra todo el preparado y haga sus observaciones. Elija el sitio donde debe
seguir observando a mayor aumento.

8.-Cambie al objetivo de mediano aumento (20 X) y para lograr el enfoque siga

moviendo lentamente el tormillo macrométrico. Al cambiar de objetivo, la imagen
debe estar ligeramente enfocada gracias a que la mayoría de microscopios son
parafocales, es decir, una vez logrado el primer enfoque, al pasar al objetivo de
aumento inmediato superior la imagen queda en un foco aproximado y solo se
debe realizar un ajuste.

9.-Realice la observació n y haga sus anotaciones. Determine cuá l es la estructura

que va a observar a mayor aumento y coló quela en el centro del campo.

10.-Cambie al objetivo de mayor aumento. Si realizó el enfoque de manera correcta

con el objetivo anterior, al colocar el objetivo de mayor aumento la imagen solo se
debe enfocar girando ú nica y lentamente el tornillo MICROMÉ TRICO. NUNCA se
debe utilizar el tornillo macrométrico con los objetivos de mayor aumento, pues al
estar éste muy cerca del preparado, se corre el riesgo de partirlo.

11.-Al lograr el enfoque con el objetivo de mayor aumento debe realizar la

observació n moviendo constantemente el tornillo micrométrico para variar los
planos de enfoque. De igual manera, abra o cierre el diafragma para regular la
intensidad de la luz y mejorar el contraste.

12.-Una vez finalizada la observació n, aleje la platina y coloque nuevamente el

objetivo de menor aumento.
13.-Retire la muestra.

14.-Limpie la lente objetivo si usó medio de inmersió n, apague la/s lá mpara/s.

15.-Cubra el microscopio con la funda protectora.

Recomendaciones:

NUNCA dañ ar, rayar, dejar caer las lentes u otros componentes ó pticos.

NUNCA forzar los controles de foco.

NUNCA tocar las superficies ó pticas. Durante la clase se discutirá cuá l es el

procedimiento para limpiar las lentes objetivos correctamente.