VII.

APLICACIÓN DE PREPARADOS ENZIMÁTICOS EN LAS DIFERENTES INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

1. Para comprender los principios y las ventajas de la suplementación de enzimas, es necesario observar estrechamente los factores envueltos: el substrato, los tipos y acciones de las enzimas y las propiedades que dará este agregado enzimático a los productos finales (3, 52). Debido a que la estructura espacial de la proteína participante de las enzimas (por ej., Helicoidal o globular) es muy sensible frente a las condiciones ambientales (temperatura, aire y agentes químicos), las enzimas son bastante lábiles, debiendo conservarse secas, en envases cerrados y a baja temperatura, si se almacenan por mucho tiempo. Sus soluciones deben ser recientes y se preparan en tampones apropiados con adición de adecuados reactivos de protección. 2. ENZIMAS QUE SE APLICAN EN LA INDUSTRIA MOLINERA Y PANADERA 2.1. ALFA y BETA-AMILASA. El nombre de diastasas corresponde a un sinónimo de las amilasas, aunque se usa principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales. Origen de alfa-amilasa: Fúngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (B. stearothermophilus, B. subtilis), de cereales y del páncreas. Origen de beta-amilasa: cereales, soya y camote. La enzima alfa-amilasa se encuentra en poca cantidad en el trigo y abunda más en aquel que ha sido parcialmente germinado. La beta-amilasa, por el contrario, se encuentra en gran cantidad en este cereal. Acciones: Como es sabido, el almidón está formado por la fracción amilosa de cadena recta de moléculas de glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,4; en tanto que la fracción amilopectina, además de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosídicos 1,6. La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca producción de maltosa. Por su acción, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0°C por 15 min. El pH óptimo de acción está dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancreática. La enzima es resistente al calor, pues a 70°C conserva un 70% de su actividad. Actúa sobre almidones crudos y gelatinizados. La beta-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarogénica, pues actúa sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la amilopectina actúa en las uniones alfa-1,4 de la cadena recta, y detiene su acción a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-1,6. Se trata de una exo-amilasa, ya que actúa sobre el terminal de la

inactivándose a 70°C por 15 min. La presencia de una cantidad suficiente de alfa-amilasa durante el esponjamiento y fermentación de la masa. se produce una mayor extensibilidad y elasticidad de la masa. Al sustituir la adición. en mejor forma que por adición de extracto de malta usado también para este objeto. La alfa-amilasa de origen bacteriano es más estable al calor que la de hongos y de cereales. ricas en gluten (como las de Canadá y Rusia). Aplicaciones: Como la adición de amilana y/o proteasa depende de la harina y otros ingredientes de la masa.5.mayor contenido de azúcares fermentescibles en la masa. acortándose el tiempo de amasijo y facilitando el amasijo mecánico (maquinofilia). conservándose así la maltosa. a su vez.aumento del volumen y textura del pan con una miga de porosidad más fina y de costra más uniforme y más coloreada. bacteriano (Bacillus. mayor y uniformemente mantenido. . 2. aunque puede ser menos potente que la de bacterias o de cereales. tiene las siguientes ventajas: . debe tenerse presente la relativa termo-resistencia de su alfa-amilana y su considerable actividad proteolítica. PROTEASAS. de manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador. Acción. Desdoblamiento hidrolítico de proteínas y péptidos hasta aminoácidos. El pan resultante adquiere mayor volumen por una mejor retención de gas. Aplicaciones: El uso de la alfa-amilasa para mejorar el valor panificador de harinas se basa en el hecho de que un adecuado y mantenido desprendimiento de anhídrido carbónico depende de la cantidad de maltosa y glucosa fermentescibles que estén presentes en la masa. El pH óptimo de la beta-amilasa es de 4. se puede obtener con baja actividad de proteasa (desdobladora del gluten) y de maltasa. La beta-amilasa no necesita de activador para actuar. Streptococcus) y vegetal (Canica papaya L: Papaína). . al restringir durante el almacenamiento del pan la retrogradación de su almidón. su adición debe ser bastante cuidadosa para evitar una sobreproducción de dextrina residual y con ello una miga gomosa y pegajosa (38. En los casos en que la adición de proteasa es conveniente. 40). y cuya formación depende. muchas harinas de trigo son deficientes en alfa-amilasa. mejorando su textura y simetría. pero es menos estable al calor. cuyas desventajas se han señalado anteriormente.y la beta-amilasa. la conveniencia de agregar proteasa queda generalmente restringida a harinas de trigo duro. .molécula. mientras que en harinas pobres o medianamente ricas en gluten puede originar un reblandecimiento exagerado de la masa. Mientras los cereales germinados contienen ambas enzimas. como también sus condiciones de conservación y aun de aroma (40). jarabe o harina malteados. Por este motivo. mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa. La alfa-amilasa de origen fúngico (como es la que se obtiene por crecimiento del micelio del Aspergillus oryzae en fermentadores de cultivo sumergido que permiten una agitación y una aereación intensas). esto último.2. una actividad residual de la alfa-amilasa bacteriana en el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservación. .desprendimiento gaseoso. sobre todo si se asocia a una adición de amilasa. la cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar (38). Por otra parte. esencial para la fermentación. de la acción sincronizada de la alfa. de la amilasa por extracto. siendo entonces conveniente su adición.aceleración de la fermentación. causante del envejecimiento. Origen: Fúngico (Aspergillus oryzae).

la papaína se destruye con la temperatura del horno de panificación. las masas deben elaborarse con una menor adición de agua. Como toda enzima. 50-100 ml de Auxillase (un concentrado liquido de Merck) son suficientes. por otra parte. pobre en proteínas totales (no más de 11 %) y en gluten húmedo (máx. en general. deben ser blandas y plásticas y poco elásticas para que se puedan moldear fácilmente. como barquillos y galletas secas duras. La 3º transformación química ocurre en las glándulas intestinales por medio de la amilasa intestinal quien con otras enzimas colaboradoras como la Sacarasa. Maltasa. terminan de desdoblar al almidón en Monómeros simples de Alfa-Glucosa que serán absorvidos por las vellosidades y microvellosidades intestinales para ser transportadospor la sangre a todas las células del cuerpo. Esto tiene el inconveniente de la formación de una miga de. conviene agregar ésta sólo durante el amasijo. o. de la humedad. En algunos productos de panadería. maltossa y otros. un 0. que desdobla parte del gluten y permite obtener una masa blanda. de unos 15-20 minutos después de su adición. pero. La cantidad por usar depende del contenido de gluten de la harina que se usa. y con menor tiempo de horneo. submaxilares y sublinguales) comienza la degradación del almidón rompiendo los enlaces glucosídicos del mismo. en todo caso. Para asegurar una distribución homogénea es conveniente agregar la enzima al agua del amasijo.5%. el proceso de degradación química de esta Biomolécula comprende 3 transformaciones químicas: 1º La Ptialina o Amilasa salival secretada por las glándulas salivales( parótidas. Saludos . Si no se dispone de una harina apropiada para estos fines. Su actividad comprende un margen de pH de 3 hasta 9 y alcanza un óptimo entre 40 y 70°C. La enzima Amilasa es la encargada de degradar a los carbohidratos ricos en energía química. La 2º transformación química del almidón ocurre en el Intestino delgado( en la Ampolla de Vater una zona dilatada de este órgano donde desemboca el jugo pancrático rico en Amilasa pancreática quien termina por desdoblarlo en Disacáridos como sacarosa. formándose a menudo una superficie áspera. por lo cual su acción debe tener lugar durante el tiempo de reposo de la masa. Lactasa. puede regularse. suave y extensible. Por este motivo se prefiere el uso de una harina "floja". Esto se puede conseguir en forma adecuada por medio de una enzima proteolítica como la papaína. relacionando con 100 kilos de harina. pH. poros más gruesos y un excesivo levantamiento del producto. tratamiento mecánico en el amasijo. La dosificación depende.Como la proteólisis en la masa puede ser inhibida por la sal. la plasticidad de la masa frenando su desarrollo. irregular o con ampollas. grietas o fisuras en las galletas. es decir. composición y tiempo de reposo de la masa. 22%). pues con contenidos más elevados se necesita más líquido para preparar la masa.

Cada una de estas familias incluye de forma preferente cada uno de los tres principales tipos de actividad amilasa: α-amilasa. LA ENZIMA ALFA-AMILASA SE DERIVA DE UN MICROORGANISMO CORRESPONDIENTE AL GRUPO CLOSTRIDIUM SP. DURANTE UN TIEMPO SUFICIENTE PARA PRODUCIR UNA DISOLUCION DE HIDROLIZADO DE ALMIDON. β-amilasa y glucoamilasa. ATCC 39252. Para completar hidrólisis en las ramificaciones se necesita otra enzima. . Alfa-amilasa (presente en el hombre) es una endohidrohilasa. Resumen: METODO DE HIDROLISIS DE ALMIDON CON UNA ENZIMA DE ALFAAMILASA. Resultado de su acción va la formación de conjunto de dímeros de glucosa conocidos con el nombre da la maltosa. A LAS CEPAS MUTANTES DE LOS MISMOS. TIENE APLICACIONES PARA LA PRODUCCION DE JARABES QUE CONTIENEN GLUCOSA. La presencia de enzimas de la familia 14 se limita a bacterias y plantas.6) glucosidasa La mayoría de las amilasas están clasificadas en sistema de IUPAC en las familias 13. Nombre sistemático de la amilasa es (1. En cambio beta-amilasa (de origen vegetal) es exohidrolasa específica para el penúltimo enlace α(1. quiere decir que rompe enlaces glucosidicos dentro de la molecula de polisacárido. O A UN MICROORGANISMO QUE INCORPORA INFORMACION GENETICA DE LOS CITADOS MICROORGANISMOS. QUE CODIFICA LA PRODUCCION DE UNA ENZIMA DE ALFA-AMILASA.0 Y TEMPERATURA COMPRENDIDA ENTRE 50C Y 100C. ATCC 39251. 14 y 15.4) glucosidasa. lo que significa que ella hidroliza los enlaces 1-4 en polisacáridos. respectivamente. A UN PH ENTRE 3. (1. CONSISTE EN EL TRATAMIENTO DEL ALMIDON.4) del extremo no reductor de polisacárido. CON LA ENZIMA ALFAAMILASA.5 Y 7. Los enzimas de la familia 13 están representados en todo tipo de organismos vivos. y las de la familia 15 a bacterias y hongos.

por mutarrotación. La ð-amilasa ataca de manera aleatoria enlaces 1. Sin embargo. numero que depende de la especie y las condiciones ambientales. ricas en almidón. Al parecer solo la ð-amilasa puede atacar gránulos de almidón intactos. Gran parte de la ð-amilasa se localiza dentro de los cloroplastos. Las amilasas están diseminadas en diversos tejidos pero son mas activas en las semillas que están germinando. el ataque repetido por la ð-amilasa produce maltosa. Los polisacáridos de la dieta se metabolizan mediante hidrólisis a monosacáridos. La hidrólisis de amilosa por la ð-amilasa es casi completa. Se presentan dos tipos de almidón en la mayoría de los granos amiláceos: amilosa y amilopectina. La hidrólisis implica la ruptura de un enlace mediante la adición en medio del mismo de los elementos del agua. lo cual es una de las razones por las que el calcio es un elemento esencial. Muchas ð-amilasas son activadas por Ca+. para formar las mezclas naturales de isomeros ð y ð. por supuesto. El almidón se acumula a la luz del día cuando la fotosíntesis excede las tasas combinadas de respiración y translocación. por eliminación repetida de unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. ADPG. si bien hay otras más que se necesitan para completar el proceso. el almidón se encuentra en uno o más granos amiláceos en un plastidio. cuyas ramas se localizan entre el C-6 de una glucosa de la cadena principal y el C-1 de la primera glucosa en la cadena que forma la rama (enlaces ð-1. Las reacciones hidrolíticas no son reversibles. Las tres primeras enzimas son una ð-amilasa. 6). Es probable que la ð-amilasa tenga más importancia que la ð-amilasa para la hidrólisis de almidón. Las amilosas son más pequeñas y contienen de cientos a miles de unidades de glucosa. En las hojas el almidón se acumula en los cloroplastos. La amilosa. La actividad de ambas amilasas implica la incorporación de una molécula de H2O por cada enlace roto. un disacárido que contiene dos unidades de glucosa. ambos compuestos por unidades de d-glucosa unidas por enlaces ð-1. la enzima actúa primero solo sobre los extremos no reductores. La cantidad de almidón en diversos tejidos depende de muchos factores genéticos y ambientales. es probable que actúen sobre los primeros productos liberados por la ð-amilasa. en forma de grano o polvo. Actúa tanto en el día como por la noche aunque. se degrada casi por completo. se acumula en los amiloplastos. en los cuales se forma después de la translocación de sacarosa u otro carbohidrato provenientes de las hojas. por lo que la digestión de amilopectina cesa cuando aun quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. Es un hidrato de carbono complejo (C6H10O5). La formación de almidón ocurre sobre todo por un proceso que implica la donación repetida de unidades de glucosa provenientes de un azúcar nucleotidico similar al UDPG y que se denomina difosfoglucosa de adenosina. por lo que cuando participan la ð-amilasa y la almidón fosforilasa. En los órganos de almacenamiento. ð-amilasa y almidón fosforilasa. La amilopectina consta de moléculas muy ramificadas. que tiene pocas ramificaciones. La ð-maltosa cambia con rapidez. por lo que son enzimas hidrolasas. Las uniones ð-1. pero la degradación de amilopectina es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de ramificación. al principio creando huecos al azar en los granos de almidón y liberando productos que aun son grandes. la ð-amilasa no puede atacar los enlaces 1. durante la luz de día hay producción neta de almidón por la fotosíntesis. donde es un producto directo de la fotosíntesis.4 en las moléculas de amilosa y amilopectina. La reacción procede de manera consecutiva a partir del extremo no reductor de cada cadena principal o cadena ramificada hasta a unos residuos de glucosa de las uniones ð-1.Almidón. En los vegetales. La almidón fosforilasa esta ampliamente distribuida en la planta y a veces resulta difícil determinar que enzima digiere la mayor parte del almidón en las células de interés. Hidrólisis del almidón.6 de las ramificaciones. inodoro e insípido. después parte de él desaparece por la noche. La ð-amilasa hidroliza al almidón en ð-maltosa. 4. de modo que no se pueden detectar síntesis de almidón por amilasas. La amilopectina solo es degradada parcialmente por la acción del almidón fosforilasa. La mayoría de los pasos de la degradación de almidón a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas distintas.6 localizados en los puntos de ramificación de la amilopectina. 4 hacen que las cadenas de almidón se enrollen en forma de hélices. En cadenas de amilosa no ramificadas. . muchas veces unida a los granos de almidón que atacara. por lo que de nuevo que dan dextrinas. El almidón es el principal carbohidrato de reserva en la mayoría de las plantas.

Después el mismo procedimiento de germinación se aplicara a otras cuantas semillas limpias pero tres días antes de la práctica. dependiendo de su tiempo de germinación. MATERIAL 1 mortero 1 bisturí 1 baño de agua hirviendo 6 tubos de centrifuga 5 pipetas graduadas de 10 ml 1 embudo de filtración de 5 cm de diámetro 1 caja de Petri de 9 cm 1 tripié con tela de asbesto 1 mechero 25 tubos de ensayo de 15X150 1 centrifuga 1 espectrofotómetro 1 gasa 30 semillas de maíz METODOLOGÍA  La preparación de las semillas de maíz. El alumno estudiara las diferencias en la actividad amilolítica. Se aplicara el método de Nelson-Simogy para la determinación de reductores totales. en el frasco se pondrá una capa de algodón. de 3 y 0 días de germinación. para que solo nos quede el endospermo almidonoso. dependiendo de los estadíos de germinación en las semillas y de sus requerimientos energéticos. Para empezar la practica se ponen a remojar en agua 2 semillas de maíz de ningún día de germinación. las semillas. Una vez limpios los maíces prepararemos un extracto enzimático de los respectivos días de germinación. Se desinfectaran 10 semillas de maíz en cloro (hipoclorito de sodio) durante 20 minutos y las enjuagaremos muchas veces con agua hervida. después se seleccionaron un par de semillas de 5. posteriormente las semillas las pondremos a germinar en un frasco limpio. Se hizo el mismo procedimiento  . se llevara a cabo cinco días anteriores a la práctica. entonces se les quita el embrión y el escueto. y se humedecerá el algodón. en un mortero de con 5 ml de succinato con pH 5. dando como producto final unidades de maltosa siendo este uno de los mecanismos que la semilla utiliza para obtener energía necesaria para germinar. Determinaremos la actividad enzimática de las semillas de maíz.OBJETIVO Comprobar que las amilasas producidas por semillas de maíz hidrolizan al almidón. lo anterior se hará macerando el endospermo de 2 semillas de 5 días de germinación.

dias de germinacion 0 0 3 3 5 5 tubo # 7 8 9 10 11 12 ml extracto diluido 0.2945 Densidad óptica (520 nm) .299 0.25  El ultimo paso de la practica será la determinación de los reductores totales.292 0.090 0.088 0. lavando el mortero con el amortiguador en cada uno de los tres casos para centrifugar a 3000 rpm durante 20 minutos. los productos obtenidos de los macerados se colocaran en tubos de centrífuga.4845 TUBO 1 2 3 4 5 6  Determinaremos la concentración de maltosa en los tubos 1 al 6 correspondientes a la curva patrón. RESULTADOS  Anotaremos las lecturas espectrofotométricas de cada tubo en la tabla siguiente. también realizaremos la curva patrón. Tabla 1. para ser colocadas en los tubos numerados del 7 al 12.25 0.25 0.25 0.339 0. DENSIDAD OPTICA (nm) MUESTRA DUPLICADO MEDIA 0 0.25 0. según la relación del formato siguiente. que se llevara a cabo con las diluciones de los extractos enzimáticos de la semilla de diferentes tiempos de germinación. Estas reacciones fueron de acuerdo a la tabla.505 0 0.464 0. de acuerdo con la ecuación: (Volumen inicial)(Concentración inicial) = (Volumen final)(Concentración final) (Tubo x)(500 ðg/ml) = (Patrón maltosa + Agua)( X ) Se anota la concentración en la columna X de la tabla siguiente y en la columna Y se anotan las lecturas espectrofotométricas obtenidas en los tubos 1 a 6.088 0. 0.377 0.086 0.2945 0.2945 0. aquí se realizan las reacciones con los diferentes reactivos (I y II) y la determinación de azucares reductores totales que obtuvimos con la hidrólisis enzimática del almidón.33 Y [Maltosa ðg/mL] 0 0. Después de centrifugar se separara el sobrenadante de cada tubo.25 0.259 0.297 0.con las semillas de 3 y 0 días de germinación. VALORES PARA CURVA PATRON X TUBO # 1 2 3 0 125 333.212 0.

114 1. provocando que a algún tubo le entrase agua y alterara una absorbancia. DISCUSIÓN En esta práctica se intento tener el mejor rendimiento respecto a los resultados.200 1. Esto lo pensamos ya que en las semillas de 0 y 3 días el endospermo presentaba partes más duras.0342 0.164 DENSIDAD OPTICA (nm) MUESTRA DUPLICADO MEDIA 1.1355 1.0356 0.833 0.0230 0. se calcula la concentración de maltosa de los diferentes días de germinación.  En el siguiente cuadro anotaremos los resultados obtenidos de las lecturas de densidad óptica de los tubos problema (7-12).071 1.990 1.0279 0. Debido a que los datos se presentan como una recta.0873x-0. Otra cuestión a destacar.218 1.989 0.104 1.0373 En la siguiente grafica se encuentra la concentración de maltosa por los días de germinación de las semillas.229 0. TUBOS DIAS PROBLEMA 0 0 3 3 5 5 7 8 9 10 11 12 1.120 0.0370 0.4845 Se trazara la grafica con los datos de las columnas X y Y.106 1.299 0. CONCLUSIÓN .031 1. TUBO # 7 8 9 10 11 12 DIAS 0 0 3 3 5 5 [MALTOSA ðg] 0. Por tanto con nuestros resultados y el texto consultado se demuestra que la actividad enzimática en la semilla es mayor si el tiempo de germinación es mayor. Creemos que nuestros resultados hubieran estado más precisos si la extracción del almidón no hubiera presentado algunas dificultades para obtener el endospermo.0621.139 Tomando en consideración los datos de la curva patrón donde Y ha sido corregida Y´ y recordando nuevamente que y=0. Los datos se registran en la siguiente tabla.2945 0.844 1. esto se nota pues el mismo número de tubo pero del duplicado da una lectura más coherente.4 5 6 750 2000 0 0.975 1. que hacían más difícil la extracción total. se ajustan de ser necesario.252 0. es la parte en que hacemos la segunda incubación (reactivo 1). pues por un descuido el agua hirvió y se derramo un poco.

basándose en su observación en disoluciones alcalinas mediante Cu2+.CUAL ES LA ESTRUCTURA DEL ALMIDON? 3 2. ð(14) glucan maltodeshidrogenasa 4.QUE AMILASAS SE ENCUENTRAN EN LOS ORGANISMOS ANIMALES? ð-D-glucopiranosa ð-Amilasa. ð(14) glucan 4-glucanohidrolasa ð-Amilasa. Todas estas reacciones nos dejan una producción de maltosa. Observamos que al tener más tiempo de germinación una semilla. B. por acción de la hidrólisis enzimática de la amilasa sobre el almidón. Ag+ o ferricianuros.. la actividad enzimática es directamente proporcional a la producción de maltosa.QUE ES UN AZUCAR REDUCTOR? Cuando en una determinación cuantitativa de los monosacáridos se realiza frecuentemente. sería porque había mucho almidón para hidrolizar y poder producir maltosa. después existe un incremento en su actividad al usar de semillas de tres días y por supuesto que la mayor actividad se registro en las semillas de 5 días.. la actividad enzimática será mucho mayor.QUE TIPO DE ENLACES HIDROLIZAN LAS AMILASAS? ð-Amilasa. En resumen y conclusión. Se puede definir también a un azúcar reductor como cualquier carbohidrato que tiene libre un grupo carbonio y es susceptible de participar en otra oxidación. ð(14) glucan 4-glucanohidrolasa BIBLIOGRAFÍA SALISBURY.. a tales oxidantes se les denomina azucares reductores. esto nos sugiere que si la enzima trabaja mucho. Los azucares son capaces de reducir. entonces. FRANK . todo esto con respecto a los días de germinación que tengan las semillas (entre mas días de germinación tenga las semillas. se origina una mezcla de azucares -ácidos. mas almidón habrá.) CUESTIONARIO 1. 3. mayor es la actividad enzimática de la amilasa.. En los granos de cero días se manifestó una actividad de la enzima muy baja.En esta práctica se esperaba y se observo la actividad enzimática de la amilasa sobre el almidón.

. HANDLER. WHITE. A.Fisiología Vegetal. P. K.2614. Ed. E.. BRITÁNNICA CD 2000 DELUXE Encyclopædia Britannica. MATHEWS.. McGraw Hill. K. Y VAN HOLDE.2625) . HILL. E. R. SMITH. LEHMAN. C. 1998. Bioquímica.. 1994. 2ª.. España. Iberoamericana. 1989. MICROSOFT® EXCEL 2002 (10. McGraw Hill Interamericana. Inc. Ed. R. Principios de Bioquímica.

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