VII.

APLICACIÓN DE PREPARADOS ENZIMÁTICOS EN LAS DIFERENTES INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

1. Para comprender los principios y las ventajas de la suplementación de enzimas, es necesario observar estrechamente los factores envueltos: el substrato, los tipos y acciones de las enzimas y las propiedades que dará este agregado enzimático a los productos finales (3, 52). Debido a que la estructura espacial de la proteína participante de las enzimas (por ej., Helicoidal o globular) es muy sensible frente a las condiciones ambientales (temperatura, aire y agentes químicos), las enzimas son bastante lábiles, debiendo conservarse secas, en envases cerrados y a baja temperatura, si se almacenan por mucho tiempo. Sus soluciones deben ser recientes y se preparan en tampones apropiados con adición de adecuados reactivos de protección. 2. ENZIMAS QUE SE APLICAN EN LA INDUSTRIA MOLINERA Y PANADERA 2.1. ALFA y BETA-AMILASA. El nombre de diastasas corresponde a un sinónimo de las amilasas, aunque se usa principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales. Origen de alfa-amilasa: Fúngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (B. stearothermophilus, B. subtilis), de cereales y del páncreas. Origen de beta-amilasa: cereales, soya y camote. La enzima alfa-amilasa se encuentra en poca cantidad en el trigo y abunda más en aquel que ha sido parcialmente germinado. La beta-amilasa, por el contrario, se encuentra en gran cantidad en este cereal. Acciones: Como es sabido, el almidón está formado por la fracción amilosa de cadena recta de moléculas de glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,4; en tanto que la fracción amilopectina, además de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosídicos 1,6. La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca producción de maltosa. Por su acción, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0°C por 15 min. El pH óptimo de acción está dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancreática. La enzima es resistente al calor, pues a 70°C conserva un 70% de su actividad. Actúa sobre almidones crudos y gelatinizados. La beta-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarogénica, pues actúa sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la amilopectina actúa en las uniones alfa-1,4 de la cadena recta, y detiene su acción a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-1,6. Se trata de una exo-amilasa, ya que actúa sobre el terminal de la

El pan resultante adquiere mayor volumen por una mejor retención de gas. mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa. . siendo entonces conveniente su adición. pero es menos estable al calor. bacteriano (Bacillus. El pH óptimo de la beta-amilasa es de 4. mientras que en harinas pobres o medianamente ricas en gluten puede originar un reblandecimiento exagerado de la masa. Mientras los cereales germinados contienen ambas enzimas.y la beta-amilasa. en mejor forma que por adición de extracto de malta usado también para este objeto. inactivándose a 70°C por 15 min. al restringir durante el almacenamiento del pan la retrogradación de su almidón. PROTEASAS. sobre todo si se asocia a una adición de amilasa.desprendimiento gaseoso. a su vez. 40). La presencia de una cantidad suficiente de alfa-amilasa durante el esponjamiento y fermentación de la masa. Aplicaciones: El uso de la alfa-amilasa para mejorar el valor panificador de harinas se basa en el hecho de que un adecuado y mantenido desprendimiento de anhídrido carbónico depende de la cantidad de maltosa y glucosa fermentescibles que estén presentes en la masa.aumento del volumen y textura del pan con una miga de porosidad más fina y de costra más uniforme y más coloreada. la conveniencia de agregar proteasa queda generalmente restringida a harinas de trigo duro. La beta-amilasa no necesita de activador para actuar. esto último. se puede obtener con baja actividad de proteasa (desdobladora del gluten) y de maltasa. tiene las siguientes ventajas: . jarabe o harina malteados. La alfa-amilasa de origen fúngico (como es la que se obtiene por crecimiento del micelio del Aspergillus oryzae en fermentadores de cultivo sumergido que permiten una agitación y una aereación intensas). y cuya formación depende.aceleración de la fermentación. esencial para la fermentación.molécula. En los casos en que la adición de proteasa es conveniente. . mejorando su textura y simetría. la cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar (38). Aplicaciones: Como la adición de amilana y/o proteasa depende de la harina y otros ingredientes de la masa. una actividad residual de la alfa-amilasa bacteriana en el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservación. ricas en gluten (como las de Canadá y Rusia). causante del envejecimiento. Acción. Origen: Fúngico (Aspergillus oryzae). . Desdoblamiento hidrolítico de proteínas y péptidos hasta aminoácidos. aunque puede ser menos potente que la de bacterias o de cereales. cuyas desventajas se han señalado anteriormente.mayor contenido de azúcares fermentescibles en la masa.5. Streptococcus) y vegetal (Canica papaya L: Papaína). muchas harinas de trigo son deficientes en alfa-amilasa. se produce una mayor extensibilidad y elasticidad de la masa. . debe tenerse presente la relativa termo-resistencia de su alfa-amilana y su considerable actividad proteolítica. mayor y uniformemente mantenido. como también sus condiciones de conservación y aun de aroma (40). su adición debe ser bastante cuidadosa para evitar una sobreproducción de dextrina residual y con ello una miga gomosa y pegajosa (38. La alfa-amilasa de origen bacteriano es más estable al calor que la de hongos y de cereales. de manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador. de la acción sincronizada de la alfa. de la amilasa por extracto. acortándose el tiempo de amasijo y facilitando el amasijo mecánico (maquinofilia). conservándose así la maltosa. Al sustituir la adición. Por este motivo.2. 2. Por otra parte.

composición y tiempo de reposo de la masa. La dosificación depende. relacionando con 100 kilos de harina. La 3º transformación química ocurre en las glándulas intestinales por medio de la amilasa intestinal quien con otras enzimas colaboradoras como la Sacarasa. formándose a menudo una superficie áspera. La cantidad por usar depende del contenido de gluten de la harina que se usa. el proceso de degradación química de esta Biomolécula comprende 3 transformaciones químicas: 1º La Ptialina o Amilasa salival secretada por las glándulas salivales( parótidas.5%. Para asegurar una distribución homogénea es conveniente agregar la enzima al agua del amasijo. Lactasa. la plasticidad de la masa frenando su desarrollo. Su actividad comprende un margen de pH de 3 hasta 9 y alcanza un óptimo entre 40 y 70°C. suave y extensible. en todo caso. de unos 15-20 minutos después de su adición. conviene agregar ésta sólo durante el amasijo. es decir. La enzima Amilasa es la encargada de degradar a los carbohidratos ricos en energía química. tratamiento mecánico en el amasijo. de la humedad. como barquillos y galletas secas duras. por otra parte. Si no se dispone de una harina apropiada para estos fines. pues con contenidos más elevados se necesita más líquido para preparar la masa. pero. terminan de desdoblar al almidón en Monómeros simples de Alfa-Glucosa que serán absorvidos por las vellosidades y microvellosidades intestinales para ser transportadospor la sangre a todas las células del cuerpo. un 0. En algunos productos de panadería. Esto se puede conseguir en forma adecuada por medio de una enzima proteolítica como la papaína. poros más gruesos y un excesivo levantamiento del producto. o. las masas deben elaborarse con una menor adición de agua. Como toda enzima. Por este motivo se prefiere el uso de una harina "floja".Como la proteólisis en la masa puede ser inhibida por la sal. 50-100 ml de Auxillase (un concentrado liquido de Merck) son suficientes. pobre en proteínas totales (no más de 11 %) y en gluten húmedo (máx. 22%). maltossa y otros. La 2º transformación química del almidón ocurre en el Intestino delgado( en la Ampolla de Vater una zona dilatada de este órgano donde desemboca el jugo pancrático rico en Amilasa pancreática quien termina por desdoblarlo en Disacáridos como sacarosa. en general. irregular o con ampollas. la papaína se destruye con la temperatura del horno de panificación. Esto tiene el inconveniente de la formación de una miga de. grietas o fisuras en las galletas. pH. puede regularse. Saludos . que desdobla parte del gluten y permite obtener una masa blanda. y con menor tiempo de horneo. por lo cual su acción debe tener lugar durante el tiempo de reposo de la masa. submaxilares y sublinguales) comienza la degradación del almidón rompiendo los enlaces glucosídicos del mismo. Maltasa. deben ser blandas y plásticas y poco elásticas para que se puedan moldear fácilmente.

LA ENZIMA ALFA-AMILASA SE DERIVA DE UN MICROORGANISMO CORRESPONDIENTE AL GRUPO CLOSTRIDIUM SP. 14 y 15. O A UN MICROORGANISMO QUE INCORPORA INFORMACION GENETICA DE LOS CITADOS MICROORGANISMOS. y las de la familia 15 a bacterias y hongos.4) glucosidasa. A UN PH ENTRE 3. TIENE APLICACIONES PARA LA PRODUCCION DE JARABES QUE CONTIENEN GLUCOSA. A LAS CEPAS MUTANTES DE LOS MISMOS. Para completar hidrólisis en las ramificaciones se necesita otra enzima.6) glucosidasa La mayoría de las amilasas están clasificadas en sistema de IUPAC en las familias 13. lo que significa que ella hidroliza los enlaces 1-4 en polisacáridos. β-amilasa y glucoamilasa. respectivamente. Resumen: METODO DE HIDROLISIS DE ALMIDON CON UNA ENZIMA DE ALFAAMILASA. Los enzimas de la familia 13 están representados en todo tipo de organismos vivos.5 Y 7. . ATCC 39251. Resultado de su acción va la formación de conjunto de dímeros de glucosa conocidos con el nombre da la maltosa. ATCC 39252. Cada una de estas familias incluye de forma preferente cada uno de los tres principales tipos de actividad amilasa: α-amilasa. (1. QUE CODIFICA LA PRODUCCION DE UNA ENZIMA DE ALFA-AMILASA.0 Y TEMPERATURA COMPRENDIDA ENTRE 50C Y 100C. DURANTE UN TIEMPO SUFICIENTE PARA PRODUCIR UNA DISOLUCION DE HIDROLIZADO DE ALMIDON. Alfa-amilasa (presente en el hombre) es una endohidrohilasa. Nombre sistemático de la amilasa es (1. quiere decir que rompe enlaces glucosidicos dentro de la molecula de polisacárido. La presencia de enzimas de la familia 14 se limita a bacterias y plantas.4) del extremo no reductor de polisacárido. CON LA ENZIMA ALFAAMILASA. En cambio beta-amilasa (de origen vegetal) es exohidrolasa específica para el penúltimo enlace α(1. CONSISTE EN EL TRATAMIENTO DEL ALMIDON.

Es un hidrato de carbono complejo (C6H10O5). En las hojas el almidón se acumula en los cloroplastos. por lo que de nuevo que dan dextrinas. por mutarrotación.4 en las moléculas de amilosa y amilopectina. es probable que actúen sobre los primeros productos liberados por la ð-amilasa. ricas en almidón. La almidón fosforilasa esta ampliamente distribuida en la planta y a veces resulta difícil determinar que enzima digiere la mayor parte del almidón en las células de interés. si bien hay otras más que se necesitan para completar el proceso. que tiene pocas ramificaciones. por lo que cuando participan la ð-amilasa y la almidón fosforilasa. La reacción procede de manera consecutiva a partir del extremo no reductor de cada cadena principal o cadena ramificada hasta a unos residuos de glucosa de las uniones ð-1. Sin embargo. Se presentan dos tipos de almidón en la mayoría de los granos amiláceos: amilosa y amilopectina. por supuesto. Muchas ð-amilasas son activadas por Ca+. ð-amilasa y almidón fosforilasa. durante la luz de día hay producción neta de almidón por la fotosíntesis. un disacárido que contiene dos unidades de glucosa.6 localizados en los puntos de ramificación de la amilopectina. En los órganos de almacenamiento. La ð-maltosa cambia con rapidez. 4 hacen que las cadenas de almidón se enrollen en forma de hélices. se acumula en los amiloplastos. En cadenas de amilosa no ramificadas. lo cual es una de las razones por las que el calcio es un elemento esencial. cuyas ramas se localizan entre el C-6 de una glucosa de la cadena principal y el C-1 de la primera glucosa en la cadena que forma la rama (enlaces ð-1. La cantidad de almidón en diversos tejidos depende de muchos factores genéticos y ambientales. para formar las mezclas naturales de isomeros ð y ð. donde es un producto directo de la fotosíntesis. La ð-amilasa hidroliza al almidón en ð-maltosa. Es probable que la ð-amilasa tenga más importancia que la ð-amilasa para la hidrólisis de almidón. en los cuales se forma después de la translocación de sacarosa u otro carbohidrato provenientes de las hojas. Las tres primeras enzimas son una ð-amilasa. numero que depende de la especie y las condiciones ambientales. La mayoría de los pasos de la degradación de almidón a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas distintas. Actúa tanto en el día como por la noche aunque. .Almidón. pero la degradación de amilopectina es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de ramificación. inodoro e insípido.6 de las ramificaciones. Las amilosas son más pequeñas y contienen de cientos a miles de unidades de glucosa. la ð-amilasa no puede atacar los enlaces 1. Hidrólisis del almidón. 4. El almidón es el principal carbohidrato de reserva en la mayoría de las plantas. La amilopectina solo es degradada parcialmente por la acción del almidón fosforilasa. La hidrólisis de amilosa por la ð-amilasa es casi completa. después parte de él desaparece por la noche. por lo que la digestión de amilopectina cesa cuando aun quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. ambos compuestos por unidades de d-glucosa unidas por enlaces ð-1. La formación de almidón ocurre sobre todo por un proceso que implica la donación repetida de unidades de glucosa provenientes de un azúcar nucleotidico similar al UDPG y que se denomina difosfoglucosa de adenosina. por eliminación repetida de unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. La hidrólisis implica la ruptura de un enlace mediante la adición en medio del mismo de los elementos del agua. La amilosa. Gran parte de la ð-amilasa se localiza dentro de los cloroplastos. en forma de grano o polvo. ADPG. se degrada casi por completo. La amilopectina consta de moléculas muy ramificadas. En los vegetales. Las amilasas están diseminadas en diversos tejidos pero son mas activas en las semillas que están germinando. Las uniones ð-1. Al parecer solo la ð-amilasa puede atacar gránulos de almidón intactos. de modo que no se pueden detectar síntesis de almidón por amilasas. muchas veces unida a los granos de almidón que atacara. por lo que son enzimas hidrolasas. La actividad de ambas amilasas implica la incorporación de una molécula de H2O por cada enlace roto. 6). Las reacciones hidrolíticas no son reversibles. Los polisacáridos de la dieta se metabolizan mediante hidrólisis a monosacáridos. la enzima actúa primero solo sobre los extremos no reductores. La ð-amilasa ataca de manera aleatoria enlaces 1. el almidón se encuentra en uno o más granos amiláceos en un plastidio. El almidón se acumula a la luz del día cuando la fotosíntesis excede las tasas combinadas de respiración y translocación. el ataque repetido por la ð-amilasa produce maltosa. al principio creando huecos al azar en los granos de almidón y liberando productos que aun son grandes.

dependiendo de su tiempo de germinación. Se desinfectaran 10 semillas de maíz en cloro (hipoclorito de sodio) durante 20 minutos y las enjuagaremos muchas veces con agua hervida. en un mortero de con 5 ml de succinato con pH 5. las semillas. después se seleccionaron un par de semillas de 5. dando como producto final unidades de maltosa siendo este uno de los mecanismos que la semilla utiliza para obtener energía necesaria para germinar. Se aplicara el método de Nelson-Simogy para la determinación de reductores totales. MATERIAL 1 mortero 1 bisturí 1 baño de agua hirviendo 6 tubos de centrifuga 5 pipetas graduadas de 10 ml 1 embudo de filtración de 5 cm de diámetro 1 caja de Petri de 9 cm 1 tripié con tela de asbesto 1 mechero 25 tubos de ensayo de 15X150 1 centrifuga 1 espectrofotómetro 1 gasa 30 semillas de maíz METODOLOGÍA  La preparación de las semillas de maíz. para que solo nos quede el endospermo almidonoso. se llevara a cabo cinco días anteriores a la práctica. lo anterior se hará macerando el endospermo de 2 semillas de 5 días de germinación. y se humedecerá el algodón. de 3 y 0 días de germinación. Después el mismo procedimiento de germinación se aplicara a otras cuantas semillas limpias pero tres días antes de la práctica. Una vez limpios los maíces prepararemos un extracto enzimático de los respectivos días de germinación. Determinaremos la actividad enzimática de las semillas de maíz.OBJETIVO Comprobar que las amilasas producidas por semillas de maíz hidrolizan al almidón. dependiendo de los estadíos de germinación en las semillas y de sus requerimientos energéticos. Se hizo el mismo procedimiento  . entonces se les quita el embrión y el escueto. Para empezar la practica se ponen a remojar en agua 2 semillas de maíz de ningún día de germinación. en el frasco se pondrá una capa de algodón. El alumno estudiara las diferencias en la actividad amilolítica. posteriormente las semillas las pondremos a germinar en un frasco limpio.

25 0.25 0.086 0.088 0.505 0 0.090 0.212 0.464 0. aquí se realizan las reacciones con los diferentes reactivos (I y II) y la determinación de azucares reductores totales que obtuvimos con la hidrólisis enzimática del almidón. Después de centrifugar se separara el sobrenadante de cada tubo.088 0. RESULTADOS  Anotaremos las lecturas espectrofotométricas de cada tubo en la tabla siguiente.297 0. que se llevara a cabo con las diluciones de los extractos enzimáticos de la semilla de diferentes tiempos de germinación.4845 TUBO 1 2 3 4 5 6  Determinaremos la concentración de maltosa en los tubos 1 al 6 correspondientes a la curva patrón. lavando el mortero con el amortiguador en cada uno de los tres casos para centrifugar a 3000 rpm durante 20 minutos. 0. para ser colocadas en los tubos numerados del 7 al 12. de acuerdo con la ecuación: (Volumen inicial)(Concentración inicial) = (Volumen final)(Concentración final) (Tubo x)(500 ðg/ml) = (Patrón maltosa + Agua)( X ) Se anota la concentración en la columna X de la tabla siguiente y en la columna Y se anotan las lecturas espectrofotométricas obtenidas en los tubos 1 a 6.25 0.25 0.con las semillas de 3 y 0 días de germinación. los productos obtenidos de los macerados se colocaran en tubos de centrífuga.2945 Densidad óptica (520 nm) . también realizaremos la curva patrón. VALORES PARA CURVA PATRON X TUBO # 1 2 3 0 125 333.377 0. según la relación del formato siguiente.2945 0.2945 0. Estas reacciones fueron de acuerdo a la tabla.25  El ultimo paso de la practica será la determinación de los reductores totales.259 0.299 0.292 0. dias de germinacion 0 0 3 3 5 5 tubo # 7 8 9 10 11 12 ml extracto diluido 0.339 0.33 Y [Maltosa ðg/mL] 0 0. Tabla 1.25 0. DENSIDAD OPTICA (nm) MUESTRA DUPLICADO MEDIA 0 0.

104 1. DISCUSIÓN En esta práctica se intento tener el mejor rendimiento respecto a los resultados.989 0.833 0.990 1. se calcula la concentración de maltosa de los diferentes días de germinación.0621.0356 0.106 1.120 0. TUBO # 7 8 9 10 11 12 DIAS 0 0 3 3 5 5 [MALTOSA ðg] 0.139 Tomando en consideración los datos de la curva patrón donde Y ha sido corregida Y´ y recordando nuevamente que y=0.844 1. Esto lo pensamos ya que en las semillas de 0 y 3 días el endospermo presentaba partes más duras.2945 0.0373 En la siguiente grafica se encuentra la concentración de maltosa por los días de germinación de las semillas.071 1.229 0.  En el siguiente cuadro anotaremos los resultados obtenidos de las lecturas de densidad óptica de los tubos problema (7-12).200 1.0370 0.4845 Se trazara la grafica con los datos de las columnas X y Y.031 1.0342 0. Por tanto con nuestros resultados y el texto consultado se demuestra que la actividad enzimática en la semilla es mayor si el tiempo de germinación es mayor.114 1. TUBOS DIAS PROBLEMA 0 0 3 3 5 5 7 8 9 10 11 12 1.0230 0.4 5 6 750 2000 0 0. esto se nota pues el mismo número de tubo pero del duplicado da una lectura más coherente.164 DENSIDAD OPTICA (nm) MUESTRA DUPLICADO MEDIA 1. CONCLUSIÓN .0279 0. pues por un descuido el agua hirvió y se derramo un poco.1355 1. se ajustan de ser necesario. Otra cuestión a destacar. Debido a que los datos se presentan como una recta.252 0.299 0. Los datos se registran en la siguiente tabla.0873x-0.218 1. es la parte en que hacemos la segunda incubación (reactivo 1). que hacían más difícil la extracción total. provocando que a algún tubo le entrase agua y alterara una absorbancia.975 1. Creemos que nuestros resultados hubieran estado más precisos si la extracción del almidón no hubiera presentado algunas dificultades para obtener el endospermo.

la actividad enzimática será mucho mayor.QUE ES UN AZUCAR REDUCTOR? Cuando en una determinación cuantitativa de los monosacáridos se realiza frecuentemente.. después existe un incremento en su actividad al usar de semillas de tres días y por supuesto que la mayor actividad se registro en las semillas de 5 días.En esta práctica se esperaba y se observo la actividad enzimática de la amilasa sobre el almidón. basándose en su observación en disoluciones alcalinas mediante Cu2+.CUAL ES LA ESTRUCTURA DEL ALMIDON? 3 2. FRANK . entonces. En resumen y conclusión. ð(14) glucan maltodeshidrogenasa 4. mas almidón habrá. Los azucares son capaces de reducir. Se puede definir también a un azúcar reductor como cualquier carbohidrato que tiene libre un grupo carbonio y es susceptible de participar en otra oxidación. a tales oxidantes se les denomina azucares reductores. En los granos de cero días se manifestó una actividad de la enzima muy baja. Ag+ o ferricianuros. Todas estas reacciones nos dejan una producción de maltosa.. por acción de la hidrólisis enzimática de la amilasa sobre el almidón. ð(14) glucan 4-glucanohidrolasa ð-Amilasa.) CUESTIONARIO 1.. ð(14) glucan 4-glucanohidrolasa BIBLIOGRAFÍA SALISBURY. se origina una mezcla de azucares -ácidos. mayor es la actividad enzimática de la amilasa.QUE AMILASAS SE ENCUENTRAN EN LOS ORGANISMOS ANIMALES? ð-D-glucopiranosa ð-Amilasa. 3. sería porque había mucho almidón para hidrolizar y poder producir maltosa.QUE TIPO DE ENLACES HIDROLIZAN LAS AMILASAS? ð-Amilasa. todo esto con respecto a los días de germinación que tengan las semillas (entre mas días de germinación tenga las semillas. esto nos sugiere que si la enzima trabaja mucho. B. la actividad enzimática es directamente proporcional a la producción de maltosa. Observamos que al tener más tiempo de germinación una semilla..

2614. McGraw Hill.. HANDLER. Principios de Bioquímica. E.2625) . 2ª. Y VAN HOLDE. WHITE.. E. HILL. 1994. C. Bioquímica. 1998. K. MICROSOFT® EXCEL 2002 (10. 1989.. Ed. McGraw Hill Interamericana.. SMITH. MATHEWS. A. LEHMAN. Inc. Iberoamericana. Ed.. K. BRITÁNNICA CD 2000 DELUXE Encyclopædia Britannica. P. R.Fisiología Vegetal. R. España.