VII.

APLICACIÓN DE PREPARADOS ENZIMÁTICOS EN LAS DIFERENTES INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

1. Para comprender los principios y las ventajas de la suplementación de enzimas, es necesario observar estrechamente los factores envueltos: el substrato, los tipos y acciones de las enzimas y las propiedades que dará este agregado enzimático a los productos finales (3, 52). Debido a que la estructura espacial de la proteína participante de las enzimas (por ej., Helicoidal o globular) es muy sensible frente a las condiciones ambientales (temperatura, aire y agentes químicos), las enzimas son bastante lábiles, debiendo conservarse secas, en envases cerrados y a baja temperatura, si se almacenan por mucho tiempo. Sus soluciones deben ser recientes y se preparan en tampones apropiados con adición de adecuados reactivos de protección. 2. ENZIMAS QUE SE APLICAN EN LA INDUSTRIA MOLINERA Y PANADERA 2.1. ALFA y BETA-AMILASA. El nombre de diastasas corresponde a un sinónimo de las amilasas, aunque se usa principalmente para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales. Origen de alfa-amilasa: Fúngico (Aspergillus oryzae), bacteriano (B. stearothermophilus, B. subtilis), de cereales y del páncreas. Origen de beta-amilasa: cereales, soya y camote. La enzima alfa-amilasa se encuentra en poca cantidad en el trigo y abunda más en aquel que ha sido parcialmente germinado. La beta-amilasa, por el contrario, se encuentra en gran cantidad en este cereal. Acciones: Como es sabido, el almidón está formado por la fracción amilosa de cadena recta de moléculas de glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,4; en tanto que la fracción amilopectina, además de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosídicos 1,6. La alfa-amilasa cataliza la hidrólisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidón, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se la conoce como enzima dextrinogénica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca producción de maltosa. Por su acción, la alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0°C por 15 min. El pH óptimo de acción está dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancreática. La enzima es resistente al calor, pues a 70°C conserva un 70% de su actividad. Actúa sobre almidones crudos y gelatinizados. La beta-amilasa se la conoce con el nombre de enzima sacarogénica, pues actúa sobre la amilosa, rompiendo unidades 1,4, dando maltosa. Sobre la amilopectina actúa en las uniones alfa-1,4 de la cadena recta, y detiene su acción a distancia de 2 unidades de glucosa antes de atacar las uniones alfa-1,6. Se trata de una exo-amilasa, ya que actúa sobre el terminal de la

y cuya formación depende.aumento del volumen y textura del pan con una miga de porosidad más fina y de costra más uniforme y más coloreada. Por otra parte.aceleración de la fermentación. 2. Acción. La alfa-amilasa de origen bacteriano es más estable al calor que la de hongos y de cereales. Mientras los cereales germinados contienen ambas enzimas.y la beta-amilasa. en mejor forma que por adición de extracto de malta usado también para este objeto. aunque puede ser menos potente que la de bacterias o de cereales.desprendimiento gaseoso. la conveniencia de agregar proteasa queda generalmente restringida a harinas de trigo duro. se puede obtener con baja actividad de proteasa (desdobladora del gluten) y de maltasa. . de manera que no se inactiva totalmente en el horno panificador. PROTEASAS. mejorando su textura y simetría. siendo entonces conveniente su adición.molécula. al restringir durante el almacenamiento del pan la retrogradación de su almidón. La beta-amilasa no necesita de activador para actuar. En los casos en que la adición de proteasa es conveniente.2. La presencia de una cantidad suficiente de alfa-amilasa durante el esponjamiento y fermentación de la masa. 40). Desdoblamiento hidrolítico de proteínas y péptidos hasta aminoácidos. Aplicaciones: El uso de la alfa-amilasa para mejorar el valor panificador de harinas se basa en el hecho de que un adecuado y mantenido desprendimiento de anhídrido carbónico depende de la cantidad de maltosa y glucosa fermentescibles que estén presentes en la masa. tiene las siguientes ventajas: . Por este motivo. El pH óptimo de la beta-amilasa es de 4. mayor y uniformemente mantenido. muchas harinas de trigo son deficientes en alfa-amilasa. Aplicaciones: Como la adición de amilana y/o proteasa depende de la harina y otros ingredientes de la masa. Al sustituir la adición. la cadena ramificada de la amilopectina se conserva en un 40-45% sin hidrolizar (38). mientras que en harinas pobres o medianamente ricas en gluten puede originar un reblandecimiento exagerado de la masa. El pan resultante adquiere mayor volumen por una mejor retención de gas. . Streptococcus) y vegetal (Canica papaya L: Papaína). ricas en gluten (como las de Canadá y Rusia). mientras la amilosa es transformada totalmente en maltosa. de la acción sincronizada de la alfa. cuyas desventajas se han señalado anteriormente. . conservándose así la maltosa. sobre todo si se asocia a una adición de amilasa. inactivándose a 70°C por 15 min. Origen: Fúngico (Aspergillus oryzae). pero es menos estable al calor. acortándose el tiempo de amasijo y facilitando el amasijo mecánico (maquinofilia). de la amilasa por extracto. se produce una mayor extensibilidad y elasticidad de la masa. a su vez. esencial para la fermentación.mayor contenido de azúcares fermentescibles en la masa. una actividad residual de la alfa-amilasa bacteriana en el pan tiene la ventaja de suministrarle una mejor conservación.5. La alfa-amilasa de origen fúngico (como es la que se obtiene por crecimiento del micelio del Aspergillus oryzae en fermentadores de cultivo sumergido que permiten una agitación y una aereación intensas). debe tenerse presente la relativa termo-resistencia de su alfa-amilana y su considerable actividad proteolítica. jarabe o harina malteados. . esto último. causante del envejecimiento. bacteriano (Bacillus. como también sus condiciones de conservación y aun de aroma (40). su adición debe ser bastante cuidadosa para evitar una sobreproducción de dextrina residual y con ello una miga gomosa y pegajosa (38.

deben ser blandas y plásticas y poco elásticas para que se puedan moldear fácilmente. pues con contenidos más elevados se necesita más líquido para preparar la masa. conviene agregar ésta sólo durante el amasijo. terminan de desdoblar al almidón en Monómeros simples de Alfa-Glucosa que serán absorvidos por las vellosidades y microvellosidades intestinales para ser transportadospor la sangre a todas las células del cuerpo. Esto se puede conseguir en forma adecuada por medio de una enzima proteolítica como la papaína. 22%). tratamiento mecánico en el amasijo. Si no se dispone de una harina apropiada para estos fines. En algunos productos de panadería. Saludos . de la humedad. Esto tiene el inconveniente de la formación de una miga de. Lactasa. por otra parte. un 0. La enzima Amilasa es la encargada de degradar a los carbohidratos ricos en energía química. La 2º transformación química del almidón ocurre en el Intestino delgado( en la Ampolla de Vater una zona dilatada de este órgano donde desemboca el jugo pancrático rico en Amilasa pancreática quien termina por desdoblarlo en Disacáridos como sacarosa. grietas o fisuras en las galletas. pobre en proteínas totales (no más de 11 %) y en gluten húmedo (máx. relacionando con 100 kilos de harina. por lo cual su acción debe tener lugar durante el tiempo de reposo de la masa. Por este motivo se prefiere el uso de una harina "floja". La dosificación depende. puede regularse. poros más gruesos y un excesivo levantamiento del producto. que desdobla parte del gluten y permite obtener una masa blanda. la plasticidad de la masa frenando su desarrollo. es decir. Como toda enzima. pero. en todo caso. La cantidad por usar depende del contenido de gluten de la harina que se usa. Para asegurar una distribución homogénea es conveniente agregar la enzima al agua del amasijo.5%. 50-100 ml de Auxillase (un concentrado liquido de Merck) son suficientes. en general. submaxilares y sublinguales) comienza la degradación del almidón rompiendo los enlaces glucosídicos del mismo. como barquillos y galletas secas duras. maltossa y otros. de unos 15-20 minutos después de su adición. pH. La 3º transformación química ocurre en las glándulas intestinales por medio de la amilasa intestinal quien con otras enzimas colaboradoras como la Sacarasa. Su actividad comprende un margen de pH de 3 hasta 9 y alcanza un óptimo entre 40 y 70°C. el proceso de degradación química de esta Biomolécula comprende 3 transformaciones químicas: 1º La Ptialina o Amilasa salival secretada por las glándulas salivales( parótidas. Maltasa. formándose a menudo una superficie áspera. irregular o con ampollas. suave y extensible. la papaína se destruye con la temperatura del horno de panificación. y con menor tiempo de horneo. o. las masas deben elaborarse con una menor adición de agua.Como la proteólisis en la masa puede ser inhibida por la sal. composición y tiempo de reposo de la masa.

QUE CODIFICA LA PRODUCCION DE UNA ENZIMA DE ALFA-AMILASA. lo que significa que ella hidroliza los enlaces 1-4 en polisacáridos. ATCC 39251.5 Y 7. β-amilasa y glucoamilasa. CON LA ENZIMA ALFAAMILASA.6) glucosidasa La mayoría de las amilasas están clasificadas en sistema de IUPAC en las familias 13.4) glucosidasa. Cada una de estas familias incluye de forma preferente cada uno de los tres principales tipos de actividad amilasa: α-amilasa. Resultado de su acción va la formación de conjunto de dímeros de glucosa conocidos con el nombre da la maltosa. respectivamente. Para completar hidrólisis en las ramificaciones se necesita otra enzima. O A UN MICROORGANISMO QUE INCORPORA INFORMACION GENETICA DE LOS CITADOS MICROORGANISMOS. Alfa-amilasa (presente en el hombre) es una endohidrohilasa. 14 y 15.0 Y TEMPERATURA COMPRENDIDA ENTRE 50C Y 100C. En cambio beta-amilasa (de origen vegetal) es exohidrolasa específica para el penúltimo enlace α(1. y las de la familia 15 a bacterias y hongos. quiere decir que rompe enlaces glucosidicos dentro de la molecula de polisacárido. Nombre sistemático de la amilasa es (1. CONSISTE EN EL TRATAMIENTO DEL ALMIDON. Los enzimas de la familia 13 están representados en todo tipo de organismos vivos. . La presencia de enzimas de la familia 14 se limita a bacterias y plantas. DURANTE UN TIEMPO SUFICIENTE PARA PRODUCIR UNA DISOLUCION DE HIDROLIZADO DE ALMIDON. A LAS CEPAS MUTANTES DE LOS MISMOS. (1.4) del extremo no reductor de polisacárido. TIENE APLICACIONES PARA LA PRODUCCION DE JARABES QUE CONTIENEN GLUCOSA. A UN PH ENTRE 3. ATCC 39252. Resumen: METODO DE HIDROLISIS DE ALMIDON CON UNA ENZIMA DE ALFAAMILASA. LA ENZIMA ALFA-AMILASA SE DERIVA DE UN MICROORGANISMO CORRESPONDIENTE AL GRUPO CLOSTRIDIUM SP.

Actúa tanto en el día como por la noche aunque. La hidrólisis implica la ruptura de un enlace mediante la adición en medio del mismo de los elementos del agua. La actividad de ambas amilasas implica la incorporación de una molécula de H2O por cada enlace roto. El almidón se acumula a la luz del día cuando la fotosíntesis excede las tasas combinadas de respiración y translocación. La ð-amilasa ataca de manera aleatoria enlaces 1. numero que depende de la especie y las condiciones ambientales. Es un hidrato de carbono complejo (C6H10O5). En los órganos de almacenamiento. para formar las mezclas naturales de isomeros ð y ð. . en los cuales se forma después de la translocación de sacarosa u otro carbohidrato provenientes de las hojas. La ð-maltosa cambia con rapidez. En los vegetales. La amilosa. La ð-amilasa hidroliza al almidón en ð-maltosa. Las amilosas son más pequeñas y contienen de cientos a miles de unidades de glucosa. por lo que de nuevo que dan dextrinas. después parte de él desaparece por la noche. cuyas ramas se localizan entre el C-6 de una glucosa de la cadena principal y el C-1 de la primera glucosa en la cadena que forma la rama (enlaces ð-1. La formación de almidón ocurre sobre todo por un proceso que implica la donación repetida de unidades de glucosa provenientes de un azúcar nucleotidico similar al UDPG y que se denomina difosfoglucosa de adenosina. se acumula en los amiloplastos. Se presentan dos tipos de almidón en la mayoría de los granos amiláceos: amilosa y amilopectina. por lo que son enzimas hidrolasas. Gran parte de la ð-amilasa se localiza dentro de los cloroplastos. Las uniones ð-1. pero la degradación de amilopectina es incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de ramificación. ADPG. Es probable que la ð-amilasa tenga más importancia que la ð-amilasa para la hidrólisis de almidón. en forma de grano o polvo. se degrada casi por completo. es probable que actúen sobre los primeros productos liberados por la ð-amilasa. la enzima actúa primero solo sobre los extremos no reductores. por mutarrotación. que tiene pocas ramificaciones. 4 hacen que las cadenas de almidón se enrollen en forma de hélices. 6). por eliminación repetida de unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena. por supuesto.6 de las ramificaciones. el almidón se encuentra en uno o más granos amiláceos en un plastidio. Al parecer solo la ð-amilasa puede atacar gránulos de almidón intactos. La almidón fosforilasa esta ampliamente distribuida en la planta y a veces resulta difícil determinar que enzima digiere la mayor parte del almidón en las células de interés. ð-amilasa y almidón fosforilasa. ricas en almidón. el ataque repetido por la ð-amilasa produce maltosa. La reacción procede de manera consecutiva a partir del extremo no reductor de cada cadena principal o cadena ramificada hasta a unos residuos de glucosa de las uniones ð-1. durante la luz de día hay producción neta de almidón por la fotosíntesis. La amilopectina solo es degradada parcialmente por la acción del almidón fosforilasa. La amilopectina consta de moléculas muy ramificadas. la ð-amilasa no puede atacar los enlaces 1. Hidrólisis del almidón. Las amilasas están diseminadas en diversos tejidos pero son mas activas en las semillas que están germinando. Las tres primeras enzimas son una ð-amilasa. inodoro e insípido. La cantidad de almidón en diversos tejidos depende de muchos factores genéticos y ambientales. En cadenas de amilosa no ramificadas. En las hojas el almidón se acumula en los cloroplastos. 4. Muchas ð-amilasas son activadas por Ca+. de modo que no se pueden detectar síntesis de almidón por amilasas.Almidón. Las reacciones hidrolíticas no son reversibles. Sin embargo. lo cual es una de las razones por las que el calcio es un elemento esencial. por lo que la digestión de amilopectina cesa cuando aun quedan dextrinas ramificadas con cadenas de longitud corta. muchas veces unida a los granos de almidón que atacara. La mayoría de los pasos de la degradación de almidón a glucosa pueden ser catalizados por tres enzimas distintas.4 en las moléculas de amilosa y amilopectina. donde es un producto directo de la fotosíntesis. al principio creando huecos al azar en los granos de almidón y liberando productos que aun son grandes. un disacárido que contiene dos unidades de glucosa. ambos compuestos por unidades de d-glucosa unidas por enlaces ð-1.6 localizados en los puntos de ramificación de la amilopectina. Los polisacáridos de la dieta se metabolizan mediante hidrólisis a monosacáridos. El almidón es el principal carbohidrato de reserva en la mayoría de las plantas. La hidrólisis de amilosa por la ð-amilasa es casi completa. si bien hay otras más que se necesitan para completar el proceso. por lo que cuando participan la ð-amilasa y la almidón fosforilasa.

las semillas. Después el mismo procedimiento de germinación se aplicara a otras cuantas semillas limpias pero tres días antes de la práctica. posteriormente las semillas las pondremos a germinar en un frasco limpio. en el frasco se pondrá una capa de algodón. dependiendo de los estadíos de germinación en las semillas y de sus requerimientos energéticos. después se seleccionaron un par de semillas de 5. Determinaremos la actividad enzimática de las semillas de maíz. Se aplicara el método de Nelson-Simogy para la determinación de reductores totales. y se humedecerá el algodón. El alumno estudiara las diferencias en la actividad amilolítica. MATERIAL 1 mortero 1 bisturí 1 baño de agua hirviendo 6 tubos de centrifuga 5 pipetas graduadas de 10 ml 1 embudo de filtración de 5 cm de diámetro 1 caja de Petri de 9 cm 1 tripié con tela de asbesto 1 mechero 25 tubos de ensayo de 15X150 1 centrifuga 1 espectrofotómetro 1 gasa 30 semillas de maíz METODOLOGÍA  La preparación de las semillas de maíz. dependiendo de su tiempo de germinación. Se desinfectaran 10 semillas de maíz en cloro (hipoclorito de sodio) durante 20 minutos y las enjuagaremos muchas veces con agua hervida. lo anterior se hará macerando el endospermo de 2 semillas de 5 días de germinación. dando como producto final unidades de maltosa siendo este uno de los mecanismos que la semilla utiliza para obtener energía necesaria para germinar. para que solo nos quede el endospermo almidonoso. en un mortero de con 5 ml de succinato con pH 5. se llevara a cabo cinco días anteriores a la práctica.OBJETIVO Comprobar que las amilasas producidas por semillas de maíz hidrolizan al almidón. entonces se les quita el embrión y el escueto. Una vez limpios los maíces prepararemos un extracto enzimático de los respectivos días de germinación. de 3 y 0 días de germinación. Se hizo el mismo procedimiento  . Para empezar la practica se ponen a remojar en agua 2 semillas de maíz de ningún día de germinación.

RESULTADOS  Anotaremos las lecturas espectrofotométricas de cada tubo en la tabla siguiente.2945 Densidad óptica (520 nm) .25 0.212 0.25 0.299 0.25 0. los productos obtenidos de los macerados se colocaran en tubos de centrífuga. aquí se realizan las reacciones con los diferentes reactivos (I y II) y la determinación de azucares reductores totales que obtuvimos con la hidrólisis enzimática del almidón.377 0. según la relación del formato siguiente. dias de germinacion 0 0 3 3 5 5 tubo # 7 8 9 10 11 12 ml extracto diluido 0. Tabla 1.464 0.292 0. DENSIDAD OPTICA (nm) MUESTRA DUPLICADO MEDIA 0 0.25  El ultimo paso de la practica será la determinación de los reductores totales.25 0. Después de centrifugar se separara el sobrenadante de cada tubo.339 0. 0. Estas reacciones fueron de acuerdo a la tabla.259 0.297 0.090 0.088 0.33 Y [Maltosa ðg/mL] 0 0.088 0. para ser colocadas en los tubos numerados del 7 al 12.con las semillas de 3 y 0 días de germinación. de acuerdo con la ecuación: (Volumen inicial)(Concentración inicial) = (Volumen final)(Concentración final) (Tubo x)(500 ðg/ml) = (Patrón maltosa + Agua)( X ) Se anota la concentración en la columna X de la tabla siguiente y en la columna Y se anotan las lecturas espectrofotométricas obtenidas en los tubos 1 a 6.25 0.086 0.4845 TUBO 1 2 3 4 5 6  Determinaremos la concentración de maltosa en los tubos 1 al 6 correspondientes a la curva patrón. VALORES PARA CURVA PATRON X TUBO # 1 2 3 0 125 333.505 0 0. que se llevara a cabo con las diluciones de los extractos enzimáticos de la semilla de diferentes tiempos de germinación. también realizaremos la curva patrón.2945 0. lavando el mortero con el amortiguador en cada uno de los tres casos para centrifugar a 3000 rpm durante 20 minutos.2945 0.

0873x-0.0621.990 1.989 0.104 1.0230 0.833 0. es la parte en que hacemos la segunda incubación (reactivo 1). Los datos se registran en la siguiente tabla. se ajustan de ser necesario. CONCLUSIÓN .106 1. TUBOS DIAS PROBLEMA 0 0 3 3 5 5 7 8 9 10 11 12 1. TUBO # 7 8 9 10 11 12 DIAS 0 0 3 3 5 5 [MALTOSA ðg] 0.120 0.0356 0. pues por un descuido el agua hirvió y se derramo un poco.4845 Se trazara la grafica con los datos de las columnas X y Y.0370 0.139 Tomando en consideración los datos de la curva patrón donde Y ha sido corregida Y´ y recordando nuevamente que y=0.164 DENSIDAD OPTICA (nm) MUESTRA DUPLICADO MEDIA 1. esto se nota pues el mismo número de tubo pero del duplicado da una lectura más coherente.0342 0. provocando que a algún tubo le entrase agua y alterara una absorbancia.299 0.252 0.229 0.0373 En la siguiente grafica se encuentra la concentración de maltosa por los días de germinación de las semillas. se calcula la concentración de maltosa de los diferentes días de germinación. Creemos que nuestros resultados hubieran estado más precisos si la extracción del almidón no hubiera presentado algunas dificultades para obtener el endospermo. Por tanto con nuestros resultados y el texto consultado se demuestra que la actividad enzimática en la semilla es mayor si el tiempo de germinación es mayor.200 1.  En el siguiente cuadro anotaremos los resultados obtenidos de las lecturas de densidad óptica de los tubos problema (7-12). Esto lo pensamos ya que en las semillas de 0 y 3 días el endospermo presentaba partes más duras.4 5 6 750 2000 0 0.844 1. que hacían más difícil la extracción total.2945 0.0279 0.031 1. DISCUSIÓN En esta práctica se intento tener el mejor rendimiento respecto a los resultados. Debido a que los datos se presentan como una recta. Otra cuestión a destacar.071 1.1355 1.975 1.114 1.218 1.

la actividad enzimática es directamente proporcional a la producción de maltosa. ð(14) glucan 4-glucanohidrolasa BIBLIOGRAFÍA SALISBURY. Los azucares son capaces de reducir. a tales oxidantes se les denomina azucares reductores.) CUESTIONARIO 1. entonces. 3. mas almidón habrá. mayor es la actividad enzimática de la amilasa. En resumen y conclusión.QUE AMILASAS SE ENCUENTRAN EN LOS ORGANISMOS ANIMALES? ð-D-glucopiranosa ð-Amilasa.En esta práctica se esperaba y se observo la actividad enzimática de la amilasa sobre el almidón. se origina una mezcla de azucares -ácidos. después existe un incremento en su actividad al usar de semillas de tres días y por supuesto que la mayor actividad se registro en las semillas de 5 días. ð(14) glucan maltodeshidrogenasa 4.CUAL ES LA ESTRUCTURA DEL ALMIDON? 3 2. Observamos que al tener más tiempo de germinación una semilla.. Ag+ o ferricianuros. por acción de la hidrólisis enzimática de la amilasa sobre el almidón. FRANK ...QUE ES UN AZUCAR REDUCTOR? Cuando en una determinación cuantitativa de los monosacáridos se realiza frecuentemente. En los granos de cero días se manifestó una actividad de la enzima muy baja. todo esto con respecto a los días de germinación que tengan las semillas (entre mas días de germinación tenga las semillas.. ð(14) glucan 4-glucanohidrolasa ð-Amilasa. la actividad enzimática será mucho mayor.QUE TIPO DE ENLACES HIDROLIZAN LAS AMILASAS? ð-Amilasa. sería porque había mucho almidón para hidrolizar y poder producir maltosa. basándose en su observación en disoluciones alcalinas mediante Cu2+. B. Todas estas reacciones nos dejan una producción de maltosa. esto nos sugiere que si la enzima trabaja mucho. Se puede definir también a un azúcar reductor como cualquier carbohidrato que tiene libre un grupo carbonio y es susceptible de participar en otra oxidación.

Ed. MATHEWS. K.. Principios de Bioquímica. McGraw Hill. España. MICROSOFT® EXCEL 2002 (10. Inc. HILL. 2ª.. K.. P. R. BRITÁNNICA CD 2000 DELUXE Encyclopædia Britannica. Y VAN HOLDE. E. McGraw Hill Interamericana. R. Ed. WHITE. A.2625) . 1989. 1994.Fisiología Vegetal. 1998.. HANDLER.. Iberoamericana. E. C. LEHMAN. SMITH.2614. Bioquímica.

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