PROTOCOLO DE VALIDACIÓN GC-PV-05

Página 1 de 10
PARA VALORACIÓN DE NISTATINA POR
MÉTODO DE CILIDRO EN PLACA
VERSION 1

1.1.

2. RESPONSABILIDADES

3. PROCEDIMIENTOS A VALIDAR O A CALIFICAR

Metodología Analítica GCMA72 Valoración de Nistatina por el método de cilindro-placa.

4. CONDICIONES EXPERIMENTALES
Tabla 1. Equipos utilizados
Nombre Especificación No Inventario

Tabla 2. Cepa utilizada

Nombre ATCC LOTE Concentración

Tabla 3. Reactivos Químicos y Medios de cultivo utilizados

Nombre Lote Pureza

Anexo 1. Certificado de calibración de los equipos utilizados

Anexo 2. Certificado de análisis de cepas y reactivos.

5. METODOLOGÍA

5.1. ELABORACIÓN CURVA ESTÁNDAR Y ENSAYO DE LINEALIDAD

 PROTOCOLO DE VALIDACIÓN GC-PV-05

Página 2 de 10
PARA VALORACIÓN DE NISTATINA POR
MÉTODO DE CILIDRO EN PLACA
VERSION 1

La linealidad de un método analítico mide la capacidad que tiene el mismo de brindar resultados
proporcionales y confiables con una curva estándar teniendo el dato de una variable.
La curva estándar y en el ensayo de linealidad del sistema se elaboran mediante la medición de halos en
milímetros (mm) que producen cinco concentraciones de nistatina (43,2 UI/mL, 57,6 UI/mL, 72 UI/mL,
86,4 UI/mL y 100,8 UI/mL) elaboradas de acuerdo a la Ilustración 1.

Para realizar la medición de la linealidad del método, se realizan soluciones con las mismas
concentraciones de nistatina son elaboradas (Ilustración 2), sin embargo la solución Stock se realiza a
partir de placebo más el activo que es Nistatina y se realiza el proceso de extracción de acuerdo a la
metodología GCMA72.

El parámetro a evaluar es el Coeficiente de Determinación %R 2, que no debe ser menor al 90%, para
considerar como aceptable la regresión (˂81˃ USP 37). Los datos obtenidos son consignados en la tabla
4 para la Linealidad del Sistema y Método.

Tabla 4. Linealidad
Linealidad del Sistema

Concentración de Log10 (Concentración de Nistatina Media del Halo de Inhibición

Nistatina (UI/mL) (UI/mL)) Corregido (mm)

43,2 1,64
57,6 1,76
72 1,86
86,4 1,94
100,8 2,00
Ecuación de la Recta:

R 2:

Linealidad del Método

Concentración de Log10 (Concentración de Nistatina Media del Halo de Inhibición
Nistatina (UI/mL) (UI/mL)) Corregido (mm)
43,2 1,64
57,6 1,76
72 1,86
86,4 1,94
100,8 2,00
Ecuación de la Recta:

R 2:
 PROTOCOLO DE VALIDACIÓN GC-PV-05

Página 3 de 10
PARA VALORACIÓN DE NISTATINA POR
MÉTODO DE CILIDRO EN PLACA
VERSION 1

Ilustración 1. Esquema de diluciones para la elaboración de la curva estándar y linealidad del sistema.
 PROTOCOLO DE VALIDACIÓN GC-PV-05

Página 4 de 10
PARA VALORACIÓN DE NISTATINA POR
MÉTODO DE CILIDRO EN PLACA
VERSION 1

Ilustración 2. Linealidad del Método

5.2. EXACTITUD

La exactitud es el atributo que determina la confiabilidad de los datos obtenidos frente al real, y en
función del tipo de método a validar para lo cual se tiene en cuenta el rango de concentración de trabajo:
Riqueza de un principio activo en materia prima o en producto terminado: 80-120%
Impurezas: Desde el 50% del nivel de especificación hasta 120 de dicho nivel.
 PROTOCOLO DE VALIDACIÓN GC-PV-05

Página 5 de 10
PARA VALORACIÓN DE NISTATINA POR
MÉTODO DE CILIDRO EN PLACA
VERSION 1

Para esto se elaboran mínimo 3 determinaciones sobre 3 niveles de concentración del activo que cubra el
rango especificado; adicionado placebos inoculados con nistatina a concentraciones de nistatina de
57,6UI/mL, 72 UI/mL y 86,4UI/mL que corresponden a concentraciones del estándar de 80%, 100% y
120%, respectivamente. Se procesan como muestras normales siguiendo el esquema de dilución presente
en la ilustración 3.
Este atributo es analizado en términos de porcentaje de recuperación de la cantidad valorada con
respecto a la cantidad conocida de analito añadido a la muestra, o como la diferencia entre la medida de
la valoración y el valor verdadero aceptado según el intervalo de confianza (97-103%). El análisis de los
datos se hará a través de las herramientas estadísticas Test G de Cochran y la prueba T de Student,
donde el el valor Gs debe ser menor que el Gt y el Ts menor que Tt para que la concentración no influya
en los resultados. Los resultados deben consignarse en la tabla 5.

1,8 g Muestra= 180.000 UI/g

5 mL 5 mL

25 mL 25 mL 50 mL

En Dimetilformamida En Buffer pH 6,0

Ilustración 3. Esquema de diluciones de la muestra

Tabla 5. Resultados de exactitud del método

Analista: Concentración Teórica Concentración Teórica Concentración Teórica
(57,6UI/mL) 80% del (72 UI/mL) 100% del (86,4UI/mL) 120% del
estándar estándar estándar
Concentración Concentración Concentración
Obtenida (UI/mL) Obtenida (UI/mL) Obtenida (UI/mL)
Repetición 1
Repetición 2
Repetición 3
Media
Porcentaje de
Recuperación

El porcentaje de recuperación, se determina de la siguiente manera

 PROTOCOLO DE VALIDACIÓN GC-PV-05

Página 6 de 10
PARA VALORACIÓN DE NISTATINA POR
MÉTODO DE CILIDRO EN PLACA
VERSION 1

UI
Concentración Media de obtenida∗100 %
mL
% de Recuperacion=
UI
Concentraión Teórica
mL
5.3. PRECISIÓN DEL SISTEMA

La precisión del sistema se evalúa a través de la repetibilidad de los datos, que son resultados obtenidos a
través de 6 repeticiones del estándar procesado por una sola persona en un mismo día, la concentración
a evaluar es 72 UI/mL. Los resultados se consignan en la Tabla 6. La metodología se considera precisa si
los resultados obtenidos tienen una Desviación Estándar Relativa (%DSR) inferior al 10%.

Tabla 6. Resultados Precisión del Sistema

Repetició Resultado Repetición Resultado
n (UI/g) (UI/g)
1 4
2 5
3 6
%DSV

Analista:

5.4. PRECISIÓN DEL MÉTODO

La capacidad de un método de dar resultados reproducibles en diferentes condiciones se denomina

Precisión del Método, para evaluar este atributo, tres muestras diferentes son valoradas por dos analistas
diferentes en dos días diferentes. Los resultados son plasmados en la tabla 7, se considera que la
metodología cumple con la precisión del método cuando los datos de Desviación Estándar Relativa
(%DSR) son inferiores al 10%.

Tabla 7. Datos precisión del método

MUESTRA Resultado
Analista %DSR
(Concentración Teórica) (UI/g)

A:
Día1:
B:

A:
Día 2:
B:
 PROTOCOLO DE VALIDACIÓN GC-PV-05

Página 7 de 10
PARA VALORACIÓN DE NISTATINA POR
MÉTODO DE CILIDRO EN PLACA
VERSION 1

5.5. LÍMITE DE DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN

Aunque la USP 37 no exige la determinación del límite de detección y cuantificación de este tipo de
metodología analítica si se realizan estas evaluaciones con el fin de usar esta información para reportar
los resultados no detectables de los análisis de trazas en superficies limpias que han estado en contacto
con el producto, en términos del límite de detección.
El límite de detección es una característica de las pruebas de límite. Es la cantidad mínima del analito que
puede detectarse en una muestra aunque no necesariamente cuantificarse, en las condiciones
experimentales indicadas.
El límite de cuantificación es la mínima cantidad de analito en una muestra que se puede determinar con
exactitud aceptables.

Las pruebas del límite simplemente comprueban que la cantidad de analito se encuentra por encima o por
debajo del nivel determinado. Para evaluar este parámetro se evalúan tres concentraciones por debajo de
la menor concentración de la curva estándar (43,2 UI/mL). Las concentraciones a evaluar serán 36
UI/mL, 28,8 UI/mL y 21,6 UI/mL. Para evaluar el límite de cuantificación se evaluará la Desviación
Estándar Relativa (%DSR) y el Porcentaje de recuperación en estas concentraciones, el límite de
cuantificación será la mínima concentración a la que se recupere entre el 90% y el 110%. El límite de
detección será la mínima concentración donde se obtenga un resultado detectable. Los resultados se
consignan en la Tabla 8.

Tabla 8. Límite de detección y cuantificación

Analista: Concentración Teórica Concentración Teórica Concentración Teórica
(36 /mL) (28,8 UI/mL) (21,6 UI/mL)
Concentración Concentración Concentración
Obtenida (UI/mL) Obtenida (UI/mL) Obtenida (UI/mL)
Repetición 1
Repetición 2
Repetición 3
Porcentaje de
Recuperación
%DSR

5.6. SELECTIVIDAD

Para determinar la Selectividad del método, se evalúa la capacidad de este para detectar los posibles
compuestos de degradación, por lo cual se someten a condiciones extremas el estándar, placebo y el
producto.
Para todos los ensayos que se describen a continuación es necesario partir de las soluciones de estándar
y muestra con una concentración de 72 UI/mL, el placebo aunque no contiene principio activo se maneja
de la misma manera, siempre se debe manejar una solución estándar de nistatina sin someter a
tratamiento para tomarlo como referencia (Blanco), el porcentaje de degradación se hace con base en el
resultado obtenido con el Blanco, se considera que la degradación ha sido importante cuando ha sido más
del 20% del principio activo. Los ensayos se resumen en la ilustración 3.
 PROTOCOLO DE VALIDACIÓN GC-PV-05

Página 8 de 10
PARA VALORACIÓN DE NISTATINA POR
MÉTODO DE CILIDRO EN PLACA
VERSION 1

Ilustración 4. Diagrama de ensayos para evaluar Selectividad

I. Degradación Ácida

A las tres soluciones (Estándar, muestra y placebo) de 72 UI/mL se le adicionan 5 mL de HCl 0.1N,
posteriormente se lleva a calentamiento a 60ºC por 60 minutos; seguido a esto se adicionan 5 mL de
NaOH 0.1N, (para neutralizar el ácido) por último se lleva a volumen con Buffer pH 6 si es necesario. La
siembra de las muestras se realiza siguiendo la metodología analítica GCMA72. Los resultados se registran
en la tabla 9.

Tabla 9. Degradación Ácida

Tratamiento
Concentración Nistatina (UI/mL) Porcentaje de Degradación
Degradación Ácida
Blanco
Estándar
Muestra
Placebo

II. Degradación Básica

A las diluciones de muestra, placebo y estándar se les adiciona 5 mL de NaOH 0.1N, posteriormente se
somete la dilución a calentamiento a 60 °C por 60 minutos y se neutraliza con 5mL de HCl 0,1N.

Tabla 10. Degradación Básica

Tratamiento
Concentración Nistatina (UI/mL) Porcentaje de Degradación
Degradación Básica
Blanco
Estándar
Muestra
Placebo

III. Exposición A Rayos U.V 4W/366 nm

Las diluciones se someten a fotooxidación exponiéndolas a luz UV 4W/366 nm durante 12 horas, Se toma
 PROTOCOLO DE VALIDACIÓN GC-PV-05

Página 9 de 10
PARA VALORACIÓN DE NISTATINA POR
MÉTODO DE CILIDRO EN PLACA
VERSION 1

la última dilución de la muestra, se lleva a volumen con Buffer pH 6 nistatina y se expone a luz UV
durante 12 horas, al día siguiente se siembra la solución siguiendo la técnica difusión en agar por
perforación de medio (este procedimiento se realiza para la preparación de producto, placebo y estándar).

Tabla 11. Degradación por luz UV

Tratamiento
Concentración Nistatina (UI/mL) Porcentaje de Degradación
Fotoxidación
Blanco
Estándar
Muestra
Placebo

IV. Condición Térmica

Se debe elaborar solución del estándar y de la muestra con una concentración de 72 UI/mL cada una, el
placebo aunque no tiene activo se debe tratar en las mismas condiciones que la muestra, por lo que se
debe diluir de la misma manera; estas tres soluciones se someten a una temperatura de 60 °C durante
30 minutos, posteriormente se completa a volumen con Buffer pH 6. Por último se sigue la metodología
analítica GCMA72 para la siembra en cilindro en placa. Para la comparación se debe realizar una muestra
blanco que es estándar que no ha sido sometido a tratamiento térmico. Los datos deben consignarse en
la tabla 12.

Tabla 12. Degradación Térmica

Tratamiento
Concentración Nistatina (UI/mL) Porcentaje de Degradación
Térmico
Blanco
Estándar
Muestra
Placebo

6. ESPECIFICACIONES

Parámetro Especificación
Linealidad Coeficiente de Correlación : %R2 ˃ 90%
97% ˂ % Recuperación ˂ 103%
Pruebas estadísiticas
Exactitud
Test G Cochran Prueba T de Student
Gs ˂ Gt Ts ˂Tt
Precisión %RSD ˂10%
Límite de Detección Concentración mínima con %RSD ˂10%
 PROTOCOLO DE VALIDACIÓN GC-PV-05

Página 10 de 10
PARA VALORACIÓN DE NISTATINA POR
MÉTODO DE CILIDRO EN PLACA
VERSION 1

Concentración Mínima con:

Límite de Cuantificación %RSD ˂10%

97% ˂ % Recuperación ˂ 103%
Selectividad Degradación ˃ 20%

--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------