Cromatografía en fase ligada

Las partículas de relleno de la columna se definen por

1. Morfologia: El material puede tener diferentes formas y tamaños desde los
2-60 um, o mayor en cromatografía preparativa.
Hay columnas desde 10-15-25 cm rellenas con partículas entre 3-10 um, las
columnas de 3-6 cm tienen como relleno partículas de 3 um se denominan High
Speed.
Las partículas del relleno tienden a ser esféricas por resistencia mecánica: menos
sensible al desgate, mayor permeabilidad, generando menores presiones.
Porosidad: La porosidad es responsable de los fenómenos exclusión y la
velocidad de transferencia de masa de soluto, el diámetro de poro determina el
área superficial y por tanto los fenómenos, solo las partículas que penetran en los
poros participan en los procesos de separación. En general, a menor diámetro
mayor retención. Dependiendo del tamaño del poro hay microporos 20 A°,
mesoporos 20-500 A°, macroporos 500 A°.
El fenómeno de exclusión es mayor en poros menores de 60 A°, siendo una
columna menos eficiente en comparación con otra de mayor porosidad. Las
partículas con poros mayores a 500 A°, son más sensibles al desgate mecánico y
la erosion, tienen una vida media.
Estructura química superficial: Se constituye por grupos funcionales activos,
naturales, o inducidos. La silicagel la base más utilizada en RPLC
Características de la Silicagel
Silicagel: Solido amorfo, poroso, de gran área superficial, alto volumen de poro, y
un diámetro de poro uniforme. Oxido de silicio hidratado, sus átomos superficiales
grupos hidroxilos, constituyen grupos silanoles (Si-OH). Los sinaoles pueden ser
de tipo libre, vecinal o geminal, y son los responsables de la actividad superficial.
Es fuertemente higroscópica, y el agua se fija por los puentes de hidrógenos los
grupos sinaoles. El agua adsorbida puede ser desorbida con tratamiento térmico
entre 125-175 °C. Es insoluble en solventes no polares, soluble en agua y
aumenta mucho a ph mayores a 7.5 (limitado rango de estabilidad a la disolución
en función del ph).
Preparación de la fase Ligada:
La partícula de la fase ligada se compone de una base, a la que se une
químicamente un compuesto que contiene un grupo funcional determinado. El
mayor material usado es silicagel a la cual se le ha unido un grupo funcional por
unión covalente de tipo xilosano. Las uniones del grupo funcional son
básicamente 4:
Tipo ester: En LC fracaso por su baja estabilidad a la hidrolisis
Tipo amino: Mas estable que la tipo ester pero solo entre 5-7 ph.
Tipo carbono: Tampoco tiene difusión en BP.
Tipo xilosano: Prácticamente está en todos los rellenos
Dependiendo de la forma de preparación de la silicagel, es frecuente encontrar
diferencias en el grado de retención y en la selectividad de columnas del mismo
tipo, pero de diferente fabricante. Si se cambia de marca la columna el método
debe ser revalidado. Pag. 105 tipos de rellenos de la fase ligada.
Cromatografía en fase reversa.
Ventajas:
 Compuestos no iónicos, iónicos, e ionizables pueden ser separados en la
misma columna.
 La fuerza de atracción superficie no polar-soluto es débil
 La adsorción irreversible, frecuentemente en silicagel, raramente ocurre
 La fase móvil predominantes es el agua
 El modificador orgánico predominante es el metanol
 El orden de elución es predecible de acuerdo a la hidrofobicidad del analito
 Se necesita poco tiempo para el equilibrio del sistema después de un
cambio de fase móvil.
La fase móvil
Generalmente agua-modificador orgánico, al que se le puede agregar algún
aditivo, sales o buffers. A mayor relación del componente orgánico menor
retención (menor K’). Se considera que la selectividad depende del modificador,
de su capacidad dadora o aceptora de protones y momento dipolar, aunque esto
no puede ser siempre cierto. Los solventes se clasificaron en 8 grupos de acuerdo
al tipo y magnitud de estas interacciones. (agua-metanol-acetonitrilo-
tetrahidrofurano, acetona, dioxano, dimetilsulfoxido, isopropanol).
Mecanismo de retención
Se ha sugerido que el modo de interacción es de tres tipos, partición (partición
del soluto entre las fases), adsorción (sobre una fase estacionaria solida),
proceso mixto. La teoría solvobofica sugiere que la fuerza de retención se debe a
al aumento de entropía que acompaña la transferencia de soluto de la fase móvil a
la fase estacionaria. Es decir, la interacción de las moléculas de la fase móvil con
el soluto es más débil que la de las moléculas de la misma fase, por lo cual el
soluto sale expulsado y forzado a penetrar la fase estacionaria, que actúa receptor
pasivo.
Cadena hidrocarbonada
Al aumentar la longitud de la cadena C1 a C22 la retención aumenta en un factor
de 10 (entre mayor cadena mayor retención). Con un modificador orgánico la
retención disminuye en un factor de 2-3 por cada 10 % de modificador. La
retención de cada soluto aumenta con la cadena hasta un plateu (limite) donde
una mayor de longitud de cadena ya no tiene ningún efecto.
Entre mayor sea el tamaño de la porción hidrofóbica del soluto, corresponderá con
una mayor longitud de cadena critica. Cadenas largas permiten separar mejor
compuestos de gran tamaño con pequeñas porciones apolares. Las columnas C18
se utilizan para propósitos generales