UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

FAUSAC, AREA TECNOLÓGICA, SUBAREA PROTECIÓN DE PLANTAS

MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA
AUXILIAR. Jackeline Andrea Montes de Oca Córdova

PRÁCTICA 5
CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS NO FITOPATÓGENAS

I. INTRODUCCIÓN
Las bacterias benéficas de importancia en la Microbiología Agrícola cumplen funciones significativas
en la naturaleza, como: promoción de crecimiento, control biológico, mejoran la eficiencia de los
procesos de fitoremediación en la rizosfera, inducción de resistencia, entre otras. Las bacterias como
patógenos ocasionan daños importantes en la producción y así mismo en la economía de los
productores, por causar enfermedades graves, los síntomas expresados por la planta varían de manchas
foliares, mosaicos, pústulas en la hoja y frutos, o podredumbres fétidas de tubérculos hasta la muerte de
un vegetal.

La caracterización de bacterias es utilizada para establecer rasgos peculiares utilizados para la

taxonomía y diagnóstico de laboratorio. Identificándose bacterias por características de la colonia,
morfología, crecimiento bacteriano, requerimiento de oxígeno, a través de tinciones, pruebas
bioquímicas, electroforesis, serología, bacteriófagos, hospederos etc.

En ésta práctica se darán a conocer las principales características morfológicas y pruebas básicas
empleadas en la caracterización de bacterias asociadas a plantas como benéficas y patógenas, que son
usadas en las condiciones del laboratorio de microbiología agrícola de la FAUSAC.

II. OBJETIVOS

 Reconocer las principales características morfológicas utilizadas en el estudio de bacterias

benéficas y patógenas.

 Realizar pruebas básicas para la caracterización de bacterias benéficas y patógenas.

III. MARCO TEÓRICO

Las bacterias benéficas, son microorganismos que pueden incrementar el crecimiento y la
productividad vegetal. Llamadas bacterias promotoras de crecimiento vegetativo (BPCV), aisladas en
suelos donde predomina la vegetación de gramíneas. Los principales géneros de bacterianas asociadas
con gramíneas son, Azospirillum, Herbaspirillum, Acetobacter, Enterobacter, Azoarcus, Bacillus, entre
otros. Las bacterias asociadas a las plantas proveen crecimiento a través de la fijación de nitrógeno,
producción de sustancias reguladoras del crecimiento, incremento en el desarrollo de la raíz,
incremento en la disponibilidad del Fe en la rizosfera, inducción de resistencia sistémica a patógenos,
inhibición del crecimiento de organismos antagónicos e interacción sinérgica con otros
microorganismos.

Las bacterias como patógenos vegetales pueden causar enfermedades graves y daños económicos,
ocasionan síntomas como: manchas, mosaicos, pústulas en hojas y frutos, o podredumbres fétidos de
tubérculos hasta la muerte de las plantas. Las bacterias fitopatógenas generalmente son móviles, por la
presencia de flagelos. La mayoría de bacterias que ocasionan enfermedades en plantas son Gram
negativas encontrándose en este grupo: Xanthomonas, Pectobacterium, Pseudomonas y Rhizobium;
mientras que existen algunos géneros de bacterias fitopatógenas con reacción Gram positivas, siendo:
Leifsonia, Clavibacter y Streptomyces.

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS
La caracterización detallada de cualquier microorganismo en general depende de la determinación de
las características fisiológicas y bioquímicas específicas. En el trabajo de diagnóstico, las pruebas
bioquímicas son pruebas simples que están diseñadas para indicar en forma clara y concisa la presencia
o ausencia de una característica bioquímica, como una enzima (Brock, Smith, & Madigan, 1987).

La caracterización consiste en establecer cada uno de los rasgos particulares de cada grupo de bacterias
(morfológicos, bioquímicos, fisiológicos, moleculares, etc.) utilizados para la taxonomía y diagnóstico
de laboratorio.

Las bacterias son identificadas en base a características de las colonias en medios de cultivo:
apariencia, color, forma, velocidad de crecimiento, etc.; a través de tinciones, pruebas bioquímicas,
electroforesis, serología, bacteriófagos, rango de hospederos, etc.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE BACTERIAS

Las propiedades morfológicas conservan una gran importancia en la separación de varias bacterias. Si
bien no es exactamente una caracterización morfológica, la tinción de Gram agrupa en general con la
morfología, puesto que se puede determinar la tinción de Gram y algunos aspectos de la morfología al
mismo tiempo. Varios grupos de bacterias en Bergey´s Manual se dividen, de acuerdo a la morfología y
a la tinción de Gram, en bacilios grampositivos, cocos grampositivos, bacilios gramnegrativos, cocos
gramnegativos, en espiral grampositivo y bacterias curvas, etc. La endospora es una estructura de
características especiales y de importancia práctica, y todas las bacterias formadoras de endosporas se
clasifican juntas (Brock, Smith, & Madigan, 1987).

Figura 1. Morfología de bacterias. 1. Cocos; 2. Diplococo; 3. Cocos en cadenas; 4. Cocos en racimos;

5. Cocos en tetradas; 6. Cocobacilos; 7. Bacilos; 8. Bacilos bordes redondeados; 9. Bacilos bordes
rectos; 10. Bacilos fusiformes; 11, 12. Bacilos curvos; 13 al 15. Espiroquetas (Pírez & Mota).
En relación a la colonia que forma en medio de cultivo, las bacterias pueden ser de borde entero o
borde rizoide, micelioide u otro y ser compacta o translúcida.

CRECIMIENTO BACTERIANO
El crecimiento bacteriano se establece a través del incremento en el número de células de una
población y por el consiguiente aumento de la biomasa microbiana. La velocidad de crecimiento es el
cambio en el número de células o masa celular por unidad de tiempo. El tiempo requerido para que, a
partir de una célula se formen dos células, se denomina tiempo de generación. El tiempo de generación
varía ampliamente entre los microorganismos (Varela & Grotiuz).

La velocidad de generación que presentan las bacterias en los medios de cultivo enriquecidos,
contribuye a su determinación. Se considera de crecimiento rápido, aquellas que requieren de unas
cuantas horas hasta 24 horas para desarrollar, crecimiento medio hasta 2 días y crecimiento lento mayor
a 5 días hasta 2 semanas.

En un sistema cerrado o cultivo en medio no renovado se obtiene una curva de crecimiento típica que
se ha dividido en cuatro fases: fase de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte. La
fase de latencia se caracteriza por la adaptación de los microorganismos, no se presenta cuando el
inoculo es nuevo y si el inoculo proviene de un cultivo viejo, requiere de este periodo de adaptación. La
mayor parte de las bacterias crece de forma exponencial, aunque hay una serie de condiciones que
influyen (nutrimentos en el medio, temperatura, factores genéticos). En la fase estacionaria no hay una
modificación neta en el número de células, existe un frágil equilibrio que desaparece eventualmente
cuando aún las bacterias metabólicamente activas mueren, debido a productos tóxicos y falta de
nutrimentos (Molina López & Uribarren Berrueta, 2015).

Figura 2. Crecimiento bacteriano

(Molina López & Uribarren Berrueta, 2015)

REQUERIMIENTOS DE OXÍGENO
Básicamente se encuentran los tipos estrictamente aerobios o anaerobios, pero, están los anaerobios
facultativos y los microaerófilos. Para determinar esta característica se realiza la prueba de OF.
 Aerobias estrictas: dependen de oxígeno para su crecimiento.
  Anaerobias estrictas: se desarrollan en ausencia total de oxígeno.
 Anaerobias facultativas: pueden desarrollarse en presencia o ausencia de oxígeno, aunque
predominan en medios anaeróbicos.
 Microaerófilos: sólo se pueden desarrollar en presencia de bajas tensiones de oxígeno (menor
del 12% en lugar del 20% que es la atmosférica) y altas tensiones de oxígeno.

TINCIONES
Las coloraciones que se usan para teñir los preparados de bacterias, se pueden dividir en: simples,
diferenciales y especiales. Las simples como el azul de metileno, permite observar la existencia de
bacterias, su morfología, su agrupación, la presencia de esporos y la existencia de otros tipos celulares.
Las diferenciales (coloración de Gram y Ziehl Nielseen) además de lo anterior, permiten la
diferenciación de las bacterias porque usan diferentes colorantes que se comportan distinto según el
microorganismo en cuestión. Las tinciones especiales se usan para objetivar distintas estructuras como
la cápsula, el núcleo, los flagelos, los esporos, entre otros aspectos (Pírez & Mota).

La reacción a la tinción de Gram, sirve para diferenciar a bacterias Gram positivas de las Gram
negativas. Este procedimiento de tinción es de gran importancia en la taxonomía bacteriana. Se utiliza
cristal de violeta y solución de yodo separadamente; las bacterias Gram positivas retienen la
combinación de ambos colorantes, formando un complejo con ciertos componentes de su pared celular
y citoplasma. Mientras que las Gram negativas no son afines a la combinación de colorantes, siendo
removidos por el alcohol agregado.

OTRAS PRUEBAS
Como parte de un proceso de caracterización se utilizan diversas pruebas, siendo las comúnmente
utilizadas: crecimiento bacteriano a 40 ºC, producción de pigmentos, crecimiento sobre D-1 o D-1M,
hidrólisis de arginina, presencia de oxidasa, reducción de nitrato, crecimiento sobre YDC a 30 ºC, uso
de sucrosa, uso de L-ácido tartárico, uso de lactato, producción de 3-ketolactosa.

IV. MATERIAL Y MÉTODOS

MATERIAL Y REACTIVOS
 alcohol al 50-75%, asa bacteriológica, Alcohol al 95%, agua destilada, cristal violeta, lugol,
safranina, KOH al 3%, medio O-F, aceite mineral, aceite de inmersión, portaobjetos, agujas de
disección, tubérculo de papa y cajas petri.

EQUIPO
 Mechero
 Microscopio
 Estereoscopio

V. METODOLOGÍA

a. Observación de cultivos
Con las bacterias que purifico la semana pasada y las que se le brindara en el laboratorio, observar las
características físicas de la colonia como: tamaño, coloración, consistencia, forma de bordes, elevación,
etc. Asimismo la velocidad de crecimiento, considerando la fecha de siembra.
 b. Tinción de Gram
Además de permitir la observación de morfología y agrupamiento, esta coloración tiene valor
taxonómico ya que permite distinguir dos grandes grupos de microorganismos que difieren en la
composición de su pared celular.
 Con la ayuda de un asa, tomar una pequeña porción de bacterias a partir de la misma colonia.
 En el extremo de un portaobjetos, colocar una gota de agua destilada estéril.
 Diluir la asada de bacterias en la gota de agua, cuidando de que no quede ni muy concentrado,
ni muy diluido.
 Secar el montaje al medio ambiente o flameado ligeramente en un mechero.
 Cuando se haya secado completamente, colocar una gota de cristal violeta durante 30 segundos.
 Lave con agua el portaobjeto eliminando el colorante y posteriormente agregue una gota de
lugol por 30 segundos.
 Lavar con agua y aplique etanol al 95% hasta que no salga más colorante.
 Añadir una gota de safranina al 1% durante 30 segundos.
 Lavar el montaje con agua y seque como lo hizo anteriormente.
 Cocarlo al microscopio sin cubreobjetos y observar en 10x y 40x.
 Observar en 100x, previamente agregue una gota de aceite de inmersión sobre la preparación
realizada y luego desplace el lente sobre la gota y calibre con el macrométrico y luego con el
micrométrico hasta que sean visibles las estructuras en forma individual.
 Tomar datos y dibuje lo observado en los objetivos.

Resultado: gramnegativas presentan coloración rosada o roja, mientras que las grampositivas son de
color azul.

c. Prueba de hidróxido de potasio (KOH)

 Agregue una gota de KOH al 3% sobre un portaobjetos
 Extraer con un asa, una porción de bacterias del medio de cultivo.
 Distribuya las bacterias en el KOH y haga un movimiento circular para homogenizar.
 Luego tome el asa por un extremo, haga contacto con la gota de suspensión y levante el asa
aproximadamente 3 cm.

Resultado: la suspensión con las bacterias gramnegativa se torna de aspecto viscoso. En la pared de las
bacterias grampositiva no ocurre lisis en KOH 3% y la suspensión no tiende a presentar aspecto
viscoso.

NOTA: si deja por más de dos minutos el KOH con la bacteria puede confundir los resultados.

d. Prueba OF
Utilizada para determinar si una bacteria es anaeróbica facultativa.
 Prepare dos tubos para cada cepa.
 Con ayuda de una asa tome una porción de bacteria e inoculo el medio OF a una profundidad de
dos centímetros, en cada uno de los tubos. No lo repita más de una vez en el mismo tubo.
 Coloque un milímetro de aceite mineral en uno de los tubos inoculados, el cual debe estar
esterilizado en el horno, creando la condición de anaerobiosis. El otro tubo coloque un tapón de
algodón.
 Observe durante 5 días.
Resultado: si el tubo sin aceite cambia a color amarillo, pero, el tubo donde se aplicó aceite permanece
del mismo color, la bacteria es aeróbica. Si el color de los dos tubos cambia a amarillo, la bacteria es
anaeróbica facultativa. Si hay crecimiento bacteriano en el tubo con aceite la bacteria se considera
anaeróbica obligada.

e. Prueba de catalasa
El peróxido de hidrógeno es el producto final del metabolismo oxidativo de carbohidratos, a esta vía
metabólica recibe el nombre de metabolismo aerobio-oxidativo. La acumulación del peróxido es muy
toxico por lo que la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas exceptuando
a Streptococcus producen una enzima llamada catalasa que degrada el peróxido de hidrógeno
obteniendo agua y oxigeno gas (Telemedicina, 2009).

A partir del aislamiento realizado, con el auxilio de un asa tome una porción de bacteria, colóquela
sobre porta objetos y adicione dos gotas de H2O2 (peróxido de hidrógeno).

Resultado: si la colonia bacteriana es Staphylococcus, abundantes burbujas se verán inmediatamente.

Si no aparecen burbujas, la colonia es una especie Streptococcus.

f.Prueba de actividad pectolítica

 Lave un tubérculo de papa y desinfeste con alcohol.
 Realice Haga cortes para obtener rebanadas de 2 X 3 cm y 0.5 mm de grueso.
 Coloque dentro de una placa de petri con papel filtro humedecido en el fondo, coloque 2
rebanadas de papa encima de porta objetos o soporte. Alternativamente, añada agua destilada
estéril o algodón humedecido dentro de la placa a fin de mantener una cámara húmeda.
 Repita el proceso anterior.
 En una de las cajas petri aplique con ayuda de un asa una pequeña porción de bacteria en las
rebanadas de papa. Utilice otra sin inocular como testigo.
 Efectúe observaciones cada 24 h, observe la consistencia del tejido inoculado.

Resultado: pudrición blanda, género que ocasiona este síntoma se destaca Pectobacterium.
 VI. CUESTIONARIO
1. Preparar un reporte explicando lo observado en cada bacteria trabajada en laboratorio y
describir las características microscópicas observadas, el informe debe contener: resultados,
discusión de resultados, conclusiones y bibliografía.
2. ¿Cuáles son las diferencias entre las paredes de una bacteria Gram positiva y una Gram
negativa?
1. ¿Cuáles son los taxones de importancia para clasificación de bacterias?
2. ¿Qué importancia presenta caracterizar las bacterias en microbiología agrícola?
3. Mencione otras técnicas que utilizan laboratorios modernos para la caracterización de bacterias.

VII. BIBLIOGRAFÍA
Agrios, G. (1999). Fitopatología (Segunda ed.). Ed. Limusa.
Arai, N. (2001). Procedimiento simplificado para la identificación de bacterias fitopatógenas.
Guatemala: Universidad de San Carlos de Guatemala, Facultad de Agronomía.
Brock, T., Smith, D., & Madigan, M. (1987). Microbiología. México.
Loredo-Osti, C., López-Reyes, L., & Espinosa, V. (2004). Bacterias promotoras del crecimiento
vegetal asociadas con gramíneas. México: Sociedad Mexicana de la Ciencia del Suelo.
Obtenido de http://www.redalyc.org/pdf/573/57322211.pdf
Molina López, J., & Uribarren Berrueta, T. (30 de Moviembre de 2015). Departamento de
microbiología y parasitología. Obtenido de GENERALIDADES DE BACTERIAS:
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/bacteriologia/generalidades.html
Payne, W., & Brown, D. (1974). Microbiología una presentación programada. Buenos Aires: Médica
Panamericanas S.A.
Pírez, M., & Mota, M. (s.f.). Morfología y estructura microbiana. Obtenido de
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/MorfologiayEstructuraBacteriana.pdf
Stanier, Y., Ingraham, J., Wheelis, M., & Painter, P. (1992). Microbiología (Segunda ed.). España:
Editorial Reverté, S.A.
Telemedicina, C. d. (2009). Atlas de bacteriología. Obtenido de Universidad de Panamá:
http://www.telmeds.org/atlas/bacteriologia/cocos-gram-positivos-piogenos-de-importancia-
medica/prueba-de-catalasa-distinguir-staphylococcus-de-streptococcus/
Varela, G., & Grotiuz, G. (s.f.). Fisiología y metabolismo bacteriano. Obtenido de
http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/FisiologiayMetabolismoBacteriano.pdf