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net/publication/340538133

Evaluación de las tasas de error de la tinción de Gram en el laboratorio de microbiología farmacéutica

Artículo · Abril 2020

DOI: 10.37521 / ejpps / 25102

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1 autor:

TimSandle

La Universidad de Manchester

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EJPPS - Revista europea de ciencias parenterales y farmacéuticas Volumen 25 Número 1

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https://doi.org/10.37521/ejpps

Evaluación de las tasas de error de la tinción de Gram en el laboratorio de microbiología farmacéutica

Tim Sandle Jefe de Microbiología, BPL, Reino Unido

Autor para correspondencia: Tim Sandle, Jefe de Microbiología

Laboratorio de Bioproductos

Inglaterra

Email: timsandle@btinternet.com
Abstracto

La tinción de Gram sigue siendo el método fundamental para la bacteriología determinante, dividiendo las bacterias en
organismos Gram-positivos y Gram-negativos. Esta prueba proporciona información sobre el origen de cualquier
contaminación y es un requisito previo para muchos métodos de identificación microbiana. A pesar de la longevidad de la
prueba, la prueba depende en gran medida de la técnica del analista y, por lo tanto, se producen errores. Si bien hay
algunos estudios que analizan los errores en el contexto clínico, la investigación no se ha extendido al contexto del
laboratorio de microbiología farmacéutica. En este estudio, presentamos una revisión de más de 6.000 tinciones de Gram
y establecemos una tasa de error de alrededor del 3%, siendo la razón más común de error un paso de
sobredecoloración que da como resultado organismos que deberían ser Gram positivos y aparecer como Gram- negativo.

Introducción

La tinción de Gram, una técnica de tinción diferencial, es de fundamental importancia para la identificación y clasificación de
bacterias y se utiliza ampliamente en los campos médico e industrial de la microbiología. A pesar de ser un método establecido
desde hace mucho tiempo, la técnica permanece abierta a errores ocasionales. Sin embargo, es raro que la tasa de error se
cuantifique y evalúe en función de los tipos de error (y los pocos estudios publicados se limitan al ámbito clínico) ¹, ². Errores
relacionados con problemas de técnica e interpretación. La interpretación de un portaobjetos con tinción de Gram es
intrínsecamente subjetiva. Si bien la interpretación se puede superar mediante un buen entrenamiento, quedan varios factores
que pueden afectar la obtención de una muestra correctamente teñida, incluida la fijación de la muestra, el protocolo de tinción y
el análisis de portaobjetos. Para evaluar el nivel de errores cometidos en un laboratorio típico, este documento evalúa los
diferentes tipos de errores que pueden ocurrir dentro de una instalación farmacéutica. Los datos se obtuvieron de una instalación
farmacéutica ubicada en el sureste de Inglaterra.

Las implicaciones de los errores con la tinción de Gram pueden influir en la selección del método de prueba (y el kit de prueba)
para la siguiente etapa de identificación, ya sea un método de identificación bioquímica manual (como API) o un método
semiautomático (como como Vitek u Omnilog). Obtener una identificación incorrecta podría dar lugar a un análisis de la causa raíz
incorrecto (que afecta a todos los tipos de procesamiento farmacéutico, incluidos los productos estériles) y a posibles errores
relacionados con la liberación del lote (especialmente con productos farmacéuticos no estériles en los que comprender la
naturaleza patógena del organismo es un problema). requisito clave).

La tinción de Gram

La tinción de Gram es una herramienta importante en el proceso de identificación bacteriana al dividir las bacterias en dos
grupos (las denominadas Gram-positivas y Gram-negativas) y al permitir que sus tipos morfológicos (cocoides o en forma
de bastón) se vean claramente ³ . El desarrollador de la tinción diferencial fue el bacteriólogo danés Hans Christian
Joachim Gram ⁴; Fue durante su estudio de los glóbulos rojos en 1884 que Gram desarrolló su método para teñir
bacterias ⁵.

El método de tinción policromática ha pasado por varias iteraciones desde su descripción inicial ⁶. Hoy en día, la
técnica de tinción implica los siguientes pasos ⁷:
 • Tomando una colonia microbiana y emulsionándola en un portaobjetos. Fijación del frotis

• al portaobjetos mediante la aplicación de calor. Tinción de células bacterianas con violeta

• cristal.

• Arreglar la mancha (usando un mordiente, químicos que ayudan a “fijar” un tinte, como el yodo). Usar un solvente
• para quitar la mancha de algunos tipos de bacterias, como acetona o etanol.

• Aplicar un tinte de mostrador.

La idea de una contratinción fue desarrollada algunos años más tarde por un patólogo alemán llamado Carl Weigert, quien
usó safranina como contratinción, que tiñó las células de rojo. El propio Gram nunca usó una contratinción ⁸.

El primer paso consiste en tomar colonias simples (puras) de una placa de agar de bacterias aún en crecimiento (a menudo de 18 a
24 horas de edad) y fijar con calor las células (que las mata) en un portaobjetos de microscopio. Después de esto, las células se tiñen
con un tinte básico, violeta cristal, que tiñe todas las células bacterianas de azul. En soluciones acuosas, el violeta cristal se disocia en
iones CV + y Cl - que penetran a través de la pared y la membrana de las células tanto Gram positivas como Gram negativas. El CV +
interactúa con los componentes cargados negativamente de las células bacterianas, tiñendo las células de púrpura ⁹.

Figura 1: Tinción de Gram positiva ( Micrococcus luteus) ( Imagen: Tim Sandle)

El segundo paso consiste en agregar una solución de yoduro de yodo y potasio. La solución de yodo entra en las células y
forma un complejo insoluble en agua con el tinte violeta cristal. Cuando se agrega, el yodo (I- o I3-) interactúa con CV + para
formar grandes complejos cristal violeta-yodo (CV-I) dentro del citoplasma y las capas externas de la célula. Para el tercer
paso, las células se tratan con alcohol o acetona disolvente en el que es soluble el complejo de yodo-cristal violeta. Después
del tratamiento con disolvente, sólo quedan teñidas las células Gram positivas. La membrana externa del Gram-
la célula negativa (capa de lipopolisacárido) se pierde de la célula, dejando expuesta la capa de peptidoglicano. Las células
gramnegativas tienen capas delgadas de peptidoglicano, de una a tres capas de profundidad, con una estructura ligeramente
diferente a la del peptidoglicano de las células gram positivas. Con el tratamiento con etanol, las paredes celulares Gram-negativas
se disuelven, y esto permite que los complejos CV-I grandes sean lavados de la célula, mientras que el peptidoglicano altamente
reticulado y multicapa de la célula Gram-positiva se deshidrata mediante la adición. del solvente. La naturaleza de múltiples capas
del peptidoglicano junto con la deshidratación del tratamiento con etanol atrapa los grandes complejos CV-I dentro de la célula ¹⁰.

Después de la decoloración, la célula grampositiva permanece de color violeta, mientras que la célula gramnegativa pierde el
color violeta y solo se revela cuando se agrega la contratinción. Después del procedimiento de decoloración, las células se tratan
con una contratinción, es decir, un colorante ácido rojo cargado positivamente como la safranina, para hacer visibles las células
gramnegativas (decoloradas) (a veces, la fucsina básica se confirma para la safranina; la fucsina, generalmente, tiñe las
bacterias más intensamente que la safranina. Además, algunas bacterias se tiñen mal con la safranina, como Haemophilus spp., Legionella
spp., y algunas bacterias anaeróbicas). Las células gramnegativas contrateñidas aparecen rojas y las células grampositivas
permanecen moradas. A continuación, el portaobjetos se examina microscópicamente con un aumento de 1000 ax (a través de
un ocular de x10 y un objetivo de x100) bajo inmersión en aceite (para mejorar el índice de refracción) ¹¹.

Figura 2: Tinción de Gram negativa (especies de Bacteroides) (Imagen: Tim Sandle)

Algunas bacterias no se pueden teñir con el método Gram, estas incluyen bacterias que existen casi exclusivamente dentro de
las células huésped, como las bacterias intracelulares (como Clamidia); los que carecen de pared celular (como los
Mycoplasmas); y aquellos de dimensiones insuficientes para ser resueltos por microscopía óptica (como las espiroquetas). En
estos casos, se pueden considerar tintes alternativos ¹².

Figura 3: Tinción de Gram mixta (actinomiceto termofílico) (Imagen: Tim Sandle)

Errores de tinción de Gram

Para una tinción de Gram eficaz, el número de células bacterianas iniciales debe ser suficiente (idealmente tomado de una colonia pura).

Para ser visibles en un portaobjetos, los organismos que se tiñen con el método Gram deben estar presentes en concentraciones de

aproximadamente 10 4 a 10 5 células. Aparte de esto, pueden ocurrir errores con la tinción de Gram y cuando los errores conducen a

identificaciones erróneas, estos pueden tener consecuencias graves.

El error principal es la identificación errónea de Gram-positivos como Gram-negativos y Gram-negativos como Gram-positivos. De estas dos

categorizaciones erróneas, la primera es más común. Las bacterias grampositivas pueden perder su capacidad para retener el violeta cristal

y teñir Gram negativamente debido al daño de las bacterias en la pared celular debido a la terapia con antibióticos o la fijación excesiva por

calor del frotis o por el uso de una solución de yodo que es demasiado vieja, que es donde el yodo se vuelve amarillo en lugar de ser de color

marrón. Sin embargo, el problema más común se relaciona con la descoloración excesiva del frotis del portaobjetos. La clave de la técnica se

relaciona con el tiempo que se aplica el disolvente durante la etapa de "decoloración", ya que una exposición demasiado prolongada elimina

la mancha de ambos grupos de bacterias ¹³. Una exposición prolongada al agente decolorante eliminará todas las manchas de ambos tipos

de bacterias. Algunas bacterias Gram positivas pueden perder la tinción con facilidad y, por lo tanto, aparecer como una mezcla de bacterias

Gram positivas y Gram negativas (Gram variable). Además, el fenómeno de la 'variabilidad Gram' (o 'Gram indeterminado') también se

muestra en las células envejecidas en las que el crecimiento logarítmico se ha suspendido, sigue siendo un problema. Lo que está

sucediendo es el adelgazamiento de la capa de peptidoglicano de la pared celular, que se produce a medida que algunos cultivos envejecen.

Otro factor es donde la tinción de Gram impone un gran estrés sobre la integridad de algunos organismos, lo que conduce a un debilitamiento

de la capa de proteína S ¹⁴. el fenómeno de la 'variabilidad Gram' (o 'Gram indeterminado') también se muestra en las células envejecidas

donde el crecimiento logarítmico se ha suspendido, sigue siendo un problema. Lo que está sucediendo es el adelgazamiento de la capa de

peptidoglicano de la pared celular, que se produce a medida que algunos cultivos envejecen. Otro factor es donde la tinción de Gram impone

un gran estrés sobre la integridad de algunos organismos, lo que conduce a un debilitamiento de la capa de proteína S ¹⁴. el fenómeno de la 'variabilidad Gram' (o 'G

También es posible que los gramnegativos aparezcan como grampositivos. Esto puede ocurrir cuando el frotis es demasiado espeso,
lo que hace que las bacterias gramnegativas no se decoloren por completo durante los pasos de decoloración y aparezcan como
bacterias grampositivas. Otros errores incluyen:

• Frotis mal fijado con calor.

• La solución de yodo es débil.

• No aclarar entre reactivos.

Los errores de detección también pueden ocurrir por no usar frotis de control positivo y negativo en el portaobjetos, lo que significa
que las inexactitudes del procedimiento pueden pasar desapercibidas.

Evaluación de la tasa de error de la tinción de Gram

Este artículo presenta un estudio de las tasas de error de tinción de Gram durante un período de dos años, en varios analistas de
laboratorio. Los analistas trabajaban en una importante instalación farmacéutica ubicada en el sureste de Inglaterra. Se evaluaron más
de 6.000 resultados de tinción de Gram separados para detectar errores y los errores se categorizaron, en un intento de establecer las
causas comunes de los errores. Con el estudio presentado en este artículo, los errores fueron evaluados por ¹⁵:

• Comparación del resultado de la tinción de Gram con la morfología de la placa

• Comparación del resultado de la tinción de Gram con la identificación posterior de especies

• Evaluación de la tinción de Gram mediante verificación de supervisión y posterior repetición de la prueba

Los tipos de errores se clasificaron en:

1. Manchas mal interpretadas (manchas positivas mal interpretadas como negativas y viceversa).

2. Cultivos mixtos.
3. Utilizando subcultivos envejecidos (en placa> 24 horas).
4. Sobre decoloración.
5. Fijación inadecuada (por ejemplo, la solución de yodo es demasiado débil).

6. Desorganización que provoca que las diapositivas se etiqueten incorrectamente y que se registre el resultado incorrecto para una

diapositiva determinada.
 7. Tamaño de muestra pequeño.

8. Bajo número de células bacterianas.

Resultados del estudio

Durante el transcurso del estudio, se revisaron los resultados de un total de 6.303 muestras (realizadas por diez analistas diferentes) en

busca de resultados discrepantes de la tinción de Gram de frotis, como se establece en la Tabla

1. Estas pruebas se realizaron durante un período de dos años (2016 a 2018). La incidencia de muestras
discrepantes fue de 216 (o el 3,2% de las muestras procesadas). El rango entre los analistas estuvo entre el 0% y el
6,4%, con una tasa de error media del 2,9%.

Tabla 1: Tasa de error por analista

Analista Número de tinciones de Gram No. (y porcentaje) de

preparado (n = 6.303) resultados discrepantes

1 1.030 36 (3,5%)
2 528 21 (3,9%)
3 374 14 (3,7%)
4 1,120 72 (6,4%)
5 905 33 (3,7%)
6 55 0 (0%)
7 327 11 (3,4%)
8 861 5 (0,6%)
9 1,005 22 (2,1%)
10 98 2 (2%)

En términos de los tipos de errores, la Tabla 2 clasifica los errores como resultados de tinción de Gram inicialmente registrados
como Gram-negativos (pero donde la bacteria era realmente Gram-positiva); donde los resultados de la tinción de Gram se
registraron inicialmente como Gram-positivos (pero donde la bacteria fue en realidad Gram-negativa); y donde no se puede decir de
manera concluyente que el resultado sea Gram negativo o Gram positivo debido a otros factores (como la edad del cultivo o debido
a un cultivo mixto).
Tabla 2: Tipos de errores registrados por el analista según el resultado incorrecto de la tinción de Gram

Analista No. (& porcentaje) No. (& porcentaje) resultados negativos No. (Y
que resultados positivos que deberían ser positivos porcentaje)
debe ser negativo indeterminado
manchas

1 32 (3,1%) 4 (0,4%) 0 (0%)

2 15 (2,8%) 3 (0,6%) 3 (0,6%)
3 14 (3,7%) 0 (0%) 0 (0%)
4 60 (5,3%) 10 2
5 33 (3,7%) 0 (0%) 0 (0%)
6 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
7 10 (3,1%) 0 (0%) 1 (0,3%)
8 4 (0,5%) 1 (0,6%) 0 (0%)
9 11 (1,1%) 6 (0,6%) 5 (0,5%)
10 2 (2%) 0 (0%) 0 (0%)
Total 181 24 11

Con la Tabla 2, los porcentajes se basan en el número de pruebas realizadas por el analista según la Tabla 1. La Tabla 2
muestra que el error más común fue producir un resultado Gram-negativo en error cuando la bacteria era realmente
Gram-positiva. Esto representó 181 de los 216 errores (83%). Este tipo de error es coherente con una decoloración
excesiva de la mancha. El segundo error, registrar los organismos gramnegativos erróneamente como organismos
grampositivos representó 24 incidentes (de los 216 errores), el 11% de las muestras. En unos pocos casos (11 de 204 o
5%) el resultado fue indeterminado.

La Tabla 3 proporciona un desglose adicional del motivo de los errores, basado en la evaluación de los supervisores y anotando
el desempeño de cualquier prueba repetida realizada.
Tabla 3: Desglose detallado de las causas raíz del error, por número

Analista Manchas mal leídas Cultivos mixtos Envejecido Encima Inadecuado Desorganización Insuficiente
subculturas decoloración fijación cultura
norte

1 1 2 1 32 0 0 0
2 1 3 2 14 0 1 0
3 0 0 0 12 1 0 1
4 2 4 2 60 0 4 0
5 1 1 0 31 0 0 0
6 0 0 0 0 0 0 0
7 2 0 0 9 0 0 0
8 2 1 0 2 0 0 0
9 1 5 4 11 0 0 0
10 0 0 0 2 0 0 0
Total 10 dieciséis 9 173 1 5 1
Según el análisis presentado en la Tabla 3, la razón principal de los errores se relaciona con la sobredecoloración, en 173
de las 216 tinciones de Gram discrepantes identificadas. A esto le sigue la mezcla del cultivo inicial, a los 16, y la lectura
incorrecta de las manchas (es decir, las que se realizaron correctamente pero que el analista leyó incorrectamente). El
rango de errores es:

1. Sobre decoloración
2. Cultivos mixtos
3. Manchas mal interpretadas

4. Subculturas envejecidas

5. Desorganización
6. Fijación inadecuada y cultivo insuficiente

En cuanto a los tipos de organismos con más probabilidades de ser susceptibles a errores, estos datos no se recopilaron
formalmente. Sin embargo, el patrón general sugiere que el exceso de decoloración de
Bacilo especies y géneros relacionados representaron el grupo bacteriano más grande propenso al error de Gramstain. Si no
se controla, esto podría conducir a Bacilo especies que están mal identificadas como organismos gramnegativos (como las
pseudomonas). En términos de tipos de muestra, tales identificaciones erróneas tendían a relacionarse con muestras de
monitoreo ambiental extraídas de ambientes de salas blancas donde se preparaban productos médicos.

Discusión

La tinción de Gram de células bacterianas no es una técnica precisa ni elaborada, pero sin embargo es
prácticamente útil para distinguir dos grandes dominios de especies de eubacterias: bacterias
Gram-positivas que incluyen la mayoría de Firmicutes, y bacterias Gram-negativas que incluyen el resto ¹⁶.
Incluso en la aparición de métodos de identificación microbiana más sofisticados, la tinción de Gram es
necesaria en muchas circunstancias. Además, incluso cuando los fabricantes de tecnologías de
identificación microbiana afirman que la tinción de Gram no es necesaria (como con algunas matrices
moleculares) ¹⁷ o el análisis de compuestos volátiles del espacio de cabeza ¹⁸, en caso de que surja un
resultado atípico o discrepante que se pueda hacer referencia a la tinción de Gram invariablemente resulta
útil a la hora de realizar una investigación.

Los datos presentados en este artículo demuestran que a pesar de la larga historia del Gramstain, todavía ocurren
errores con la técnica, incluso con analistas bien entrenados y que serían considerados profesionales avanzados.

Al comparar la tasa de error con un laboratorio de microbiología farmacéutica, se encontró que la tasa de error clínico era del
3,2% sobre la base de 6.303 muestras (basado en la discrepancia del cultivo) ¹⁹. En particular, hubo algunas diferencias con los
analistas en términos de su desempeño durante el período de evaluación de dos años. Los errores se dividieron en muestras
sin organismos informados en la tinción de Gram pero donde se observó un crecimiento significativo en el cultivo; organismos
informados en una tinción de Gram que no se recuperaron en cultivo; y resultados discrepantes debido a
error del lector, etc., como se indica en las Tablas 2 y 3. La razón principal del error se debió a una decoloración excesiva.

En términos de las mejores prácticas diseñadas para reducir la tasa de error, esto se puede abordar con procedimientos operativos estándar

claramente definidos y sometiendo a los analistas a regímenes de capacitación sólidos. La competencia del analista adquiere una

importancia aún mayor cuando se produce la centralización de las pruebas de microbiología y las actividades pasan a manos de

microbiólogos no tradicionales ²⁰. La formación puede apoyarse mediante la participación en planes de competencia ²¹. Además, una tinción

de Gram automática puede estandarizar el protocolo; aunque dicha tecnología no está exenta de limitaciones ²², ²³. Los errores también se

pueden reducir usando controles con cada portaobjetos (un organismo diseñado para producir una reacción positiva y otro organismo

diseñado para producir una reacción negativa). Los controles pueden prepararse en el laboratorio utilizando cultivos conocidos (como los

trazables a una colección de cultivos nacional) o utilizando portaobjetos comerciales con los controles preparados previamente como frotis

secos. Una práctica adicional para evaluar la diferencia entre organismos Gram-positivos y Gram-negativos es la prueba de hidróxido de

potasio, que evalúa la diferencia en la pared celular, y esto puede complementar el análisis microscópico ²⁴. Los errores también se pueden

reducir asegurándose de que se cumplan los pasos de tiempo para cada etapa del procedimiento de tinción, como mediante el uso de un

cronómetro. que evalúa la diferencia en la pared celular, y esto puede complementar el análisis microscópico ²⁴. Los errores también se

pueden reducir asegurándose de que se cumplan los pasos de tiempo para cada etapa del procedimiento de tinción, como mediante el uso

de un cronómetro. que evalúa la diferencia en la pared celular, y esto puede complementar el análisis microscópico ²⁴. Los errores también se

pueden reducir asegurándose de que se cumplan los pasos de tiempo para cada etapa del procedimiento de tinción, como mediante el uso de un cronómetro.

La investigación presentada tiene algunas limitaciones en el sentido de que las tasas de error obtenidas con este
enfoque solo pueden aplicarse al laboratorio específico (en lugar de una evaluación de múltiples instalaciones) y
dentro de un país. Es posible que la tasa de error real para las tinciones de Gram en otros laboratorios de
microbiología farmacéutica difiera de los datos presentados aquí (como de hecho pueden hacerlo los laboratorios
con diferentes funciones, como los laboratorios clínicos). Además, los datos presentados representan una
ventana de dos años, que en sí misma puede o no ser verdaderamente representativa. Mirar los datos totales no
permite evaluar si el desempeño de los analistas mejora con el tiempo (como pasar de un aprendiz a un analista
más experimentado). Sin embargo, los datos presentados en este documento son generalmente comparables a
otros estudios en el ámbito clínico. et al ( también 5%) ²⁵; con Munson y asociados para encontrar una tasa de error
del 6% ²¹. En diferentes investigaciones, Rand y Tillan registraron una tasa de error más baja de alrededor del 1%
²⁶.

Los datos establecidos pueden servir para establecer un punto de referencia para la incidencia de errores durante la realización de
tinciones de Gram en la industria farmacéutica y otras disciplinas y los tipos de errores identificados pueden considerarse y
abordarse a través de programas de capacitación de laboratorio, con el objetivo de buscar futuros mejoras con la técnica de tinción
de Gram.
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