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PRACTICA 3: La Coloracion de Gram

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Practica de Laboratorio dedicada a la tecnica de coloracion de Gram
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LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA PRÁCTICA NÚMERO 3

Facultad de Ciencias Médicas Cátedra de Microbiología Tercer Semestre

TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA

LA COLORACIÓN DE GRAM

REALIZADO POR: Sthefani Gualpa S. REVISADO POR: Dr. Roberto Aguirre.

Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador

UNIDAD DE COMPETENCIA: Identifica prácticamente los microorganismos patógenos con los alteraciones orgánicas por ellos producidas: con responsabilidad y orden. ELEMENTO DE COMPETENCIA: Comprende los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram además de reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, al igual de la aplicabilidad clínica de la tinción con orden e iniciativa. NÚCLEOS DE CONOCIMIENTO: Técnica de tinción – La Coloración Gram. Realización de tinción por el método de Gram a partir de colonias. Visualizar al microscopio de gérmenes Gram positivos y Gram negativos. Ver la utilidad clínica de la coloración por el método de Gram. ACTIVIDADES TRABAJO AUTÓNOMO: Guía de prácticas descriptiva. Realización de una coloración Gram individual y visualización en el microscopio. CRITERIOS DE EVALUACIÓN: Comprender la aplicabilidad clínica de la tinción Gram y la morfología bacteriana en cuestión de distinción entre Gram positivas y Gram negativas.

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja, se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.

Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador

COLORACIÓN DE GRAM.

OBJETIVO: ✔ Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram ✔ Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, al igual de la aplicabilidad clínica de la tinción.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA: La tinción de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX y puede utilizarse para separar la mayoría de las especies bacterianas en dos grandes grupos, a saber, las que captan el colorante básico, cristal violeta (es decir las bacterias gran positivas), y las que pierden ese colorante por el lavado con el decolorante alcohol o acetona (es decir las bacterias gram negativas). TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA. Preparación del extendido: Los métodos de tinción se utilizan en forma directa con las muestras del paciente o se aplican a los preparados obtenidos a partir del desarrollo de los microorganismos en cultivos. Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo que contiene el material del paciente o con una pipeta dentro de la cual se encuentra la muestra de líquido aspirado (Fig 1). El material que se va a teñir se coloca en forma de una gota (si la muestra es liquida) o se rota (si la esta e un hisopo) sobre la superficie de un portaobjeto limpio y seco.

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja, se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.

Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador A

B

Es por lo tanto, una vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos no estéril no debe utilizarse para la inoculación posterior de medios de cultivo. Para la tinción de los microorganismos que crecen en cultivos puede utilizarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad del cultivo desarrollado en un medio solido a la superficie del portaobjetos. Este material se emulsiona en una gota de agua o solución salina 0.9% estéril sobre el portaobjeto. En caso de cantidades pequeñas que puedan perderse incluso en una gota de solución fisiológica se puede utilizar n aplicador de madera estéril para obtener el material; luego este material se frota directamente sobre el portaobjetos que se va a teñir se deja secar y se fija al portaobjeto mediante su colocación sobre una platina caliente (a 60⁰C) durante por lo menos 10 minutos o cubriéndolo con metanol al 95% durante 1 minuto. Para examinar los microorganismos que crecen en medio líquido se aplica una muestra aspirada del caldo de cultivo sobre el portaobjetos, se seca y se fija antes de la tinción. La preparación de los frotis varía de acuerdo con el tipo de muestra que se va a procesar y con los métodos de tinción que se van a utilizar. No obstante la regla general para la preparación de frotis es que debe aplicarse una cantidad de material suficiente sobre el portaobjeto para maximizar las posibilidades de detectar y diferenciar los microorganismos. Por último, el método de tinción que se debe utilizar esta determinado por el tipo de microorganismo buscado. TINCION DE GRAM

Fig 1.- frotis obtenidos por rotación de un hisopo (A) y deposito con pipeta (B) de la muestralos medios de cultivo; importante evitar la contaminación de del paciente sobre un

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja, se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.

Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador La tinción de gram es la técnica principal utilizada para el examen microscópico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clínica pueden detectarse con este método. Las únicas excepciones son: Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las células huésped (p. ej., clamidias). Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y ureoplasmas). Los que tienen un tamaño insuficiente para ser observados por el microscopio óptico (p. ej., espiroquetas). Los que tienen una diferente composición en su pared y no captan los colorantes (p. ej., mycobacterias).

MATERIALES: ✔ Portaobjetos ✔ Cubreobjetos ✔ Asas de inoculación ✔ Mechero Bunsen ✔ Pipetas ✔ Hisopos ✔ Colorantes PROCEDIMIENTO: El procedimiento clásico de la tinción de Gram consiste en fijar el material orgánico a la superficie del portaobjetos del microscopio ya por calor o con metanol. Después de la fijación el primer paso en la tinción de Gram es la aplicación del colorante principal cristal violeta (metil rosanilina o violeta de genciana). Luego se aplica un mordiente, el yodo de Gram (lugol), para que el colorante alcalino se una a la pared celular a través de enlaces químicos. La decoloración distingue las bacterias grampositivas de las gramnegativas. Después de la decoloración los microorganismos aparecen como grampositivos retienen el cristal violeta y los gramnegativos lo pierden. El agregado colorante de contraste safranina (Contratinción) teñirá de color rosa o rojo las bacterias gramnegativas claras.

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja, se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.

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PRINCIPIO: Las diferencias de composición de las paredes de las bacterias grampositivas, que contienen una gruesa capa de peptidoglucano con numerosos enlaces cruzados de acido teicoico, y las paredes de las células gramnegativas, en las que la capa de peptidoglucano es más delgada, explican las diferencias de la tinción de Gram entre estos dos grupos principales de bacterias es probable que la gran cantidad de enlaces cruzados de acido teicoico de los microorganismos gram positivos contribuya a su capacidad de resistir la decoloración con alcohol.(Fig. 2) Si bien el colorante de contraste puede ser captado por los microorganismos gram positivos, su color violeta no se altera.

Fig. 2.- Estructura de paredes bacterianas GRAM(+) y

*Los microorganismos gram positivos que perdieron la integridad de la pared celular debido al tratamiento antibiótico, al envejecimiento o a la acción de enzimas autolíticas permiten que el violeta se elimine durante la decoloración y pueden aparecer como gram variables, con algunas células coloreadas de rosa y otras de violeta.

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Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador Sin embargo, con propósitos de identificación, estos microorganismos se consideran gram positivos verdaderos. Por otro lado, las bacterias gram negativas raras veces (o nunca) retienen el cristal violeta si el procedimiento de tinción se ha realizado de manera apropiada. Las células huésped, como los eritrocitos y los leucocitos (fagocitos), pierden el cristal violeta con la decoloración y aparecen de color rosa en los frotis preparados y teñidos de manera correcta. OBSERVACION DE LA TINCION DE GRAM. Una vez teñido el frotis se observa con el objetivo de inmersión (1.000x). Cuando el material orgánico se tiñe con Gram (p. ej., frotis directo) el portaobjetos se evalúa en busca de la presencia de células bacterianas así como de las reacciones Gram, (Fig. 3) las morfologías (p. ej., cocos y bacilos) y la disposición (p. ej., cadenas pares, racimos) de células observadas (Fig.4). Esta información a menudo proporciona un diagnostico preliminar con respecto a los agentes infecciosos y con frecuencia se utiliza para el tratamiento directo inicial del paciente.

Fig.3.- Reacciones Gram.

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Fig 4. Clasificación de las bacterias de acuerdo a su morfología

Si bien la evaluación de la tinción de Gram del frotis directo se utiliza de rutina como una ayuda en el diagnostico de las infecciones bacterianas, es posible que se detecten –y no deben ignorarsehallazgos inesperados pero importantes de otras etiologías infecciosas. Por ejemplo, las células y los elementos micóticos por lo general se tiñen como grampositivos pero pueden captar el cristal violeta de manera deficiente y aparecer como gram variables (p. ej., rosa y violeta) o gram negativos. Dado que con la tinción de Gram pueden detectarse otros agentes infecciosos además de las bacterias, todas las células o las estructuras inusuales observadas en el frotis deben evaluarse de nuevo antes de descartarse como no importantes. TINCIÓN DE GRAM DE LAS BACTERIAS QUE CRECEN EN CULTIVOS. (Frotis indirectos). La tinción de Gram también desempeña un papel clave en la identificación de las bacterias en crecimiento en cultivos. De manera similar a los frotis directos, en los preparados a partir del crecimiento bacteriano se evalúan las reacciones de Gram, las morfologías y las

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja, se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.

Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador disposiciones de las células bacterianas. Si se va a teñir más de una muestra en el mismo portaobjeto, puede utilizarse un lápiz de cera para crear divisiones.es útil dibujar una especie de “mapa” de ese portaobjetos de modo que los resultados de las diferentes tinciones de Gram puedan registrarse de manera organizada. Los resultados del examen del frotis se utilizaran para determinar comprobaciones ulteriores para la identificación y la caracterización de los microorganismos aislados a partir de la muestra del paciente. .

BIBLIOGRAFÍA 1.Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico panamericana, 2.Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual moderno, México, México 2002. 3.Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editorial Panamericana, Buenos Aires – Argentina, 2 004. 4. Salazar Wilson, Guías de práctica de Laboratorio de Microbiología, Depart. de publicaciones de la Facultad de Ciencias Médicas, Quito – Ecuador, 2007.

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