UNIVERSIDAD CRISTIANA EVANGELICA

NUEVO MILENIO

ASIGNATURA: BIOLOGIA

CATEDRATICO: DR. JOSE ANDRES PAZ

TEMA: TINCIONES

CENTRO REGIONAL LA ESPERANZA

INTIBUCA

LUGAR Y FECHA: MARCALA LA PAZ

05/04/20
 Integrantes

Karen Leticia Garcia Quinteros

Heydi Yulissa Lorenzo Urquía
Rosa Elida Pérez
Lessy Danira Pérez Martínez
Carminda Lizeth Castillo Castro
Elmer Alejandro Gómez Reyes
 Índice

 Introducción
 Objetivo
 Tinción de gram
 Como hacer una tinción de gram
 Tinción Wright
 Resultado
 Tinción negativa
 Tinción simple
 Conclusión
 Bibliografía
INTRODUCCION

En el presente informe que presentamos damos a conocer algunas

de las tinciones que se utilizan en el laboratorio clínico ya que es
importante aprender y saber de dichas tinciones como estudiantes
de esta área.
Las tinciones son las primeras herramientas que se utilizan en el
laboratorio para el diagnóstico de las enfermedades infecciosas.
Desde hace más de un siglo han ayudado a resolver problemas de
etiología microbiana. Hay una gran variedad de tinciones, que se
han ido desarrollando para la detección de los diferentes agentes
infecciosos en los que se incluyen bacterias, parásitos y hongos. La
tinción de Gram se considera básica en la valoración inicial de
muestras para análisis bacteriológico, mientras que la tinción de
Wright se ocupa para el diagnóstico de enfermedades muy
particulares en el rubro de la parasitología. Las diferentes tinciones
en el laboratorio tienen una utilidad fundamental para el
diagnóstico y tratamiento oportuno de múltiples patologías de
etiología infecciosa. La tinción negativa de capsulas ya que es una
tinción estructural pone en manifiesto las capsulas y tiñe los
microorganismos.
Por esones una parte muy importante en el área de laboratorio
para poder diagnosticar a tiempo cualquier enfermedad y así
podemos ayudar mejor a nuestra población a nos ayuda nosotros
como estudiantes a conocer más.

Objetivos

Objetivos generales
 Desarrollar el proyecto sobre tinciones con el fin de que
aprender y saber como hacerlas.

 Identificar cada una de las tinciones a realizar de manera

rápida y segura.

 Observar a través de imágenes

Objetivos específicos
 Definir cada una de las tinciones a realizar.

 Adquirir destreza en el montaje empleando

técnicas de tinción simple, de Wright, Gram
positiva s, gran negativas
  Comprender la importancia de las buenas prácticas
de laboratorio.

Tinción de Gram
La tinción de Gram es una técnica muy sencilla que se basa en
el uso de un colorante que permite observar las bacterias
mejor que bajo el microscopio.
Las bacterias son microorganismos unicelulares que conviven
habitualmente con el ser humano. En muchos casos forman
parte de nuestra flora habitual y la de nuestro entorno sin
ocasionar ningún peligro para la salud. En otras situaciones,
las bacterias pueden ser patógenas, es decir, producen
infecciones de diversos tipos: cutáneas, abdominales, óseas,
etc. Para poder identificarlas y tratarlas es necesario
clasificarlas. Las diferentes clasificaciones atienden a diversos
criterios y características bacterianas: morfología,
metabolismo, presencia de pared celular, etc. Una de las
maneras de diferenciar a las bacterias es en base a la
presencia de una pared celular. Así, hay bacterias con una
pared gruesa (formada por peptidoglicanos) y otras con una
pared mucho más delgada. En qué consiste la tinción de Gram
se utiliza en microbiología desde finales del siglo XIX. Es una
técnica muy sencilla que se basa en el uso de un colorante
(tinción) y que tiene una gran utilidad en medicina.
La tinción de Gram es un tipo de tinción que se realiza sobre
las bacterias para observarlas mejor bajo el microscopio.
Según la distribución del peptidoglicano de la pared celular
que las envuelve, se tiñen de una forma u otra. Así, las
bacterias que no se tiñen mediante esta técnica se denominan
Gram negativas. Están formadas por una pared más fina
formada por menos capas de peptidoglicano y una segunda
membrana rica en lípidos (que repele la tinción Gram), al
microscopio aparecen incoloras. Las Gram positivas tienen
una pared celular mucho más gruesa, formada por un gran
número de capas de peptidoglicanos entre las que se inserta
la tinción Gram, dando un color violeta intenso al microscopio
y se clasifican como Gram +.La gran aportación práctica de la
tinción de Gram es que permite determinar el tipo de
antibiótico, así como su eficacia. El antibiótico de elección ha
de ser capaz de atravesar la pared bacteriana, en función de si
la bacteriana es gran Cómo hacer una tinción de Gram El
proceso es muy sencillo, y los pasos a seguir serían: Recoger la
muestra de bacterias a estudio mediante un isopo (bastón
estéril de algodón). Extender dicha muestra sobre un
portaobjetos y dejarla secar. Fijar la muestra mediante un
alcohol (metanol). Aplicar el tinte de violeta de genciana
sobre el portaobjetos y esperar un minuto.
Enjuagar la muestra con agua y aplicar un fijador del violeta
de genciana (lugol). El Lugol y el violeta de genciana forman
un complejo insoluble en agua capaz de penetrar en la pared
de las células bacterianas. Lavar de nuevo el portaobjetos con
una mezcla de alcohol y acetona durante unos segundos.
Opcionalmente se puede añadir una tinción de safranina o
fucsina para distinguir las gram negativas que aparecerán bajo
el microscopio (en lugar de incoloras) con un tono rosado o
rojo. Lavar con agua.
Ya se puede observar la muestra al microscopio donde se
visualizarán de color violeta las gram positivas y de color rosa-
rojizo las gram negativas. En el caso de las bacterias gram
positivas los complejos insolubles se quedan atrapados entre
las capas de peptidoglicano de la pared positiva o negativa se
seleccionará el antibiótico más eficaz
Otras pruebas diagnósticas
Como hacer una tinción
La tinción de Gram es una técnica muy sencilla que se basa en
el uso de un colorante que permite observar las bacterias
mejor que bajo el microscopio. Las bacterias son
microorganismos unicelulares que conviven habitualmente
con el ser humano. En muchos casos forman parte de nuestra
flora habitual y la de nuestro entorno sin ocasionar ningún
peligro para la salud. En otras situaciones, las bacterias
pueden ser patógenas, es decir, producen infecciones de
diversos tipos: cutáneas, abdominales, óseas, etc. Para poder
identificarlas y tratarlas es necesario clasificarlas. Las
diferentes clasificaciones atienden a diversos criterios y
características bacterianas: morfología, metabolismo,
presencia de pared celular, etc. Una de las maneras de
diferenciar a las bacterias es en base a la presencia de una
pared celular. Así, hay bacterias con una pared gruesa
(formada por peptidoglicanos) y otras con una pared mucho
más delgada
Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado
en los laboratorios donde se manejan pruebas
microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya
que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos
grandes grupos: bacterias Gram
negativas y bacterias Gram positivas.10 Fue desarrollada por
el científico danés Hans Christian Gram en 1884; hoy en día,
sigue siendo una de las tinciones más utilizadas
universalmente debido a lo económico, sencillo y eficaz que
resulta.11 En microbiología clínica resulta de gran utilidad, ya
que a partir de muestras clínicas directas provenientes de
sitios estériles se puede saber de manera rápida las
características de la muestra y hacer una diferencia de los
potenciales microorganismos causantes de una infección.12
Los principios de la tinción de Gram están basados en las
características de la pared celular de las bacterias, la cual le
confiere propiedades determinantes a cada microorganismo.
La pared celular de las bacterias Gram negativas está
constituida por una capa fina de peptidoglicano y una
membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram
positivas poseen una pared celular grueso constituida por
peptidoglicano, pero no cuentan con membrana celular
externa; así pues, la composición química y el contenido de
peptidoglicano en la pared celular de las bacterias Gram
negativas y Gram positivas explica y determina las
características tutoriales la tinción de Gram se basa
en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual
tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana.
Posteriormente, se coloca lugol, el cual
sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por
la formación de un complejo cristal violeta yodo que satura
los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. En
seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual
deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma,
también destruye la membrana externa de las bacterias Gram
negativas debido a que ésta es soluble a la acción de
solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol acetona. Las
bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de
peptidoglicano, retienen con mayor fuerza este complejo,
mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por
tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se coloca
safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de
contra tinción y sirve para teñir las bacterias que no pudieron
retener el complejo cristal violeta-yodo. Hay bacterias de un
mismo género que pueden observarse
en la misma muestra como Gram positivas y como Gram
negativas, a este evento se le llama tinción Gram variable
secundaria a alteración en nutrientes, temperatura, pH o
concentración de electrolitos.17 No todas las bacterias se
pueden teñir por esta técnica,
ya que carecen de pared celular (micoplasma) o su pared
celular tiene una composición química diferente
(micobacterias, que cuentan con una gran cantidad de ácidos
micólicos). Las muestras útiles para su uso son líquidos
estériles, biopsias para cultivo, abscesos, hisopados,
crecimiento de colonias aisladas en medios
de cultivo. Las bacterias Gram positivas se observan
de color azul
obscuro a
morado,
mientras que
las Gram
negativas se
observan de
color rosa a
rojo
Tinción de Wright

Las tinciones hematológicas se pueden definir como el

conjunto de técnicas necesarias para teñir y diferenciar los
distintos componentes celulares de la sangre. Estos
componentes conforman la fracción forme de la sangre, y
gracias a las tinciones se pueden diferenciar en un
microscopio óptico.
Las técnicas en que se basan las tinciones hematológicas
hacen uso de colorantes. Éstos interactúan con los
componentes celulares dispuestos a modo de frotis sanguíneo
sobre un portaobjetos. Los colorantes son sustancias capaces
de fijarse selectivamente según su afinidad química.
Un colorante tipo Romanowsky está basado en el uso de una
mezcla formada por un colorante ácido (eosina) y uno o varios
colorantes básicos (azul de metileno, azur A, azur B y azur C).
Las tinciones que se realizan con este tipo de colorante se
denominan tinciones panópticas o tinciones tipo
Romanowsky.
La tinción de Wright está catalogada como tinción tipo
Romanowsky. Del mismo modo que su colorante, que da
nombre a la tinción, está catalogado también como colorante
tipo Romanowsky.
Materiales
• Frotis sanguíneo seco y rotulado.
• Cubeta.
• Varillas paralelas.
• Frasco lavador con agua destilada.
• Pipetas Pasteur.
• Cronómetro.

Reactivos
• Colorante de Wright.

Técnica

1. Llenar de agua la cubeta para que los colorantes no se

peguen al fondo.
2. Colocar las varillas paralelas sobre los bordes de la
cubeta.
3. Colocar las extensiones sanguíneas sobre las varillas
paralelas.
4. Cubrir las extensiones con un volumen conocido de
solución de Wright durante dos minutos. Se producirá la
fijación de la extensión.
5. Añadir el mismo volumen de agua destilada, soplando
ligeramente con la pipeta para homogeneizar la mezcla,
durante 3-4 minutos. Se producirá la tinción de la extensión.
6. Lavar los frotis teñidos con agua destilada hasta eliminar
los restos de colorante.
7. Secar las extensiones al aire.
8. Observar las preparaciones al microscopio óptico para
comprobar la calidad de la tinción.

Resultados
Procediendo a la tinción.
Frotis teñidos secándose.
Artefacto. Cúmulo de células en el frotis. Objetivo 40X
(Resolución 400X).
Basófilo. Objetivo 40X (Resolución 400X).
En la primera imagen se pueden apreciar las extensiones
sanguíneas que se tiñeron con la solución de Wright. En la
segunda imagen podemos ver dos extensiones secándose al
aire, apoyadas sobre un frasco de un reactivo, probablemente
un colorante de otra tinción tipo Romanowsky.
La tercera imagen es una observación al microscopio óptico
de una de las preparaciones. Podemos observar un artefacto,
un cúmulo de células desconocidas que han adquirido una
coloración basófila. No se aprecia en la imagen, pero al
microscopio se podían observar hematíes sin teñir rodeando
el cúmulo celular.
La cuarta y última imagen revela un campo de una de las
extensiones, en la que se puede apreciar el leucocito más
difícil de visualizar, un basófilo. Este ejemplar de leucocito es
el que figura en menor proporción en sangre periférica, tal y
como podremos ver en futuras prácticas.
Observación
• La mala calidad de las imágenes se debe a que son
fotografías de imágenes impresas en la práctica que entregué,
en papel, en su momento. Desgraciadamente, las imágenes
originales he debido extraviarlas en algún momento porque
he sido incapaz de encontrarlas.
 • Durante la práctica, por necesidad, se utilizó agua
desionizada en lugar de agua destilada.
• Esta práctica se realizó paralelamente a otras tinciones
tipo Romanowsky. Otros grupos se encargaron de hacer las
tinciones de May-Grünwald, May-Grünwald-Giemsa y Giemsa.
• La tinción de Wright resultó ser la que mejor resultado
obtuvo. Junto a la tinción de May-Grünwald-Giemsa, son
consideradas las tinciones con mejor resolución de entre las
tinciones tipo Romanowsky.
• Los que optaron por usar sangre venosa con unos
cuantos días de antigüedad desde su extracción, se
encontraron con un problema. Debido a la vejez de la sangre,
los núcleos de los neutrófilos estaban picnóticos.
• Cometimos el error de colocar demasiados portaobjetos
encima de las varillas de tinción, provocando que contactaran
unos con otros, rompiendo la tensión superficial del colorante
sobre la superficie. El resultado del error fue la mala tinción
de algunos de los frotis sanguíneos, porque la cantidad de
colorante no estaba en su debida proporción, tal y como
marca la técnica. Finalmente, las preparaciones que no
entraron en contacto unas con otras, obtuvieron un resultado
mucho más acorde con lo que se esperaba.

Procediendo a la tinción.
 Frotis teñidos secándos

Artefacto. Cúmulo de células en el frotis.

Basófilo. Objetivo 40X (Resolución
400X).
Objetivo 40X (Resolución 400X).

Tinción de Negativa
La tinción negativa de cápsulas es una tinción estructural, ya
que pone de manifiesto las cápsulas y no tiñe los
microorganismos. Tiñe el fondo de color negruzco y permite
ver los microorganismos sin colorear sobre dicho fondo. De
este modo genera el contraste suficiente como para permitir
su visualización al microscopio.
Para esta tinción se pueden utilizar dos colorantes diferentes:
nigrosina o tinta china. En la práctica se utilizará la primera de
ellas.
La nigrosina es un colorante aniónico de color negro que es
repelido por las cápsulas, lo que imposibilita su penetración
dentro de los microorganismos. Permite la visualización de
cápsulas bacterianas y fúngicas.
Material y Reactivo
• Placa de Petri sembrada con la levadura sobre el medio
de cultivo agar-sangre.
• Asa de siembra de platino.
• Portaobjetos.
• Papel de filtro.
• Mechero Bunsen conectado a una toma centralizada de
gas.
• Microscopio óptico de campo brillante.
• Nigrosina al 1% previamente reconstituida.

Técnica

1. Tomar una pequeña muestra del microorganismo

sembrado en el medio de cultivo (levadura) y colocarlo en el
centro del portaobjetos.
2. Añadir al portaobjetos una gota de nigrosina o de tinta
china.
3. Mezclar con el asa de siembra estéril y realizar una
extensión.
4. Dejar secar la extensión a temperatura ambiente.
5. Observar la preparación en el microscopio óptico.

Resultado
En las preparaciones pudimos apreciar que había demasiada
carga de levaduras. Además, había apariencia de una cápsula
compartida entre las levaduras. Esa apariencia es muy
probable que sea debida a la alta carga de la extensión.
En una preparación posterior, con menor carga de
microorganismos, pudimos observar levaduras sueltas.
Incluso pudimos apreciar algunas en estado de gemación.
Observación
 • En la primera extensión, correspondiente a la primera
imagen, la preparación tenía mucha muestra. También se
echó poco colorante, de ahí la diferencia de contraste entre
una imagen y otra.
• En la segunda extensión la gota de nigrosina fue más
grande, y la impronta del microorganismo sobre el
portaobjetos más pequeña. De este modo pudimos obtener
una preparación de mayor calidad, en la que pudimos
apreciar, incluso, levaduras en estado de gemación

TINCIÓN SIMPLE

La tinción simple es un procedimiento de tinción rápido y sencillo

en el cual se emplea un solo colorante, por eso se denomina
simple. Se utiliza principalmente para determinar la morfología y la
organización de las células presentes en una muestra.
Naturalmente las células no tienen color, por lo que es necesario
hacerlas visibles de alguna manera cuando se observan en el
microscopio
Es importante destacar que los colorantes empleados en la tinción
simple deben ser básicos con carga positiva (catiónicos), para que
puedan unirse espontáneamente a la pared y al citoplasma celular.
Estas estructuras celulares están cargadas negativamente. Por esto
el colorante, cargado positivamente, se ve atraído por las células y
se une a estas de manera espontánea. Así, se colorean rápidamente
todas las células presentes en una muestra.
 Colorantes empleados en la tinción simple
Existen varios colorantes básicos que se pueden usar en el
laboratorio de microbiología. Los más empleados son:
– Azul de metileno.
– Violeta de cristal.
– Verde malaquita.
– Fucsina básica.
Todos estos colorantes funcionan bien en las bacterias porque
tienen iones de color (cromóforos) con carga positiva (catiónicos).
Los tiempos de tinción para la mayoría de estos colorantes son
relativamente cortos. Generalmente oscilan entre los 30 segundos
hasta los 2 minutos, dependiendo de la afinidad del tinte.

PARA QUE SE UTILIZA

Procedimiento
 Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una
pequeña alícuota de un
cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
 Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el
portaobjetos con el
asa de siembra. Dejar secar.
 Fijar la preparación, pasando a través de la llama del
mechero el portaobjetos.
 Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o
safranina) durante 1
minuto.
 Lavar el exceso de colorante con agua.
 Dejar secar al aire.
 Añadir una gota de aceite de inmersión.
 Observar con objetivo de inmersión (100 x).

Las células de bacterias son difíciles de ver al microscopio por

su poco contraste con el medio en el que se encuentran, así
que con colorantes resultará mucho más fácil observarlas. En
este caso sólo es necesario un colorante.
Células bacterianas acéticas en formación de racimo:
Aumento x100 al microscopio.
 El objetivo de aumento x100 se usa con aceite de cedro,
conocido como aceite de inmersión, esto es porque la
distancia focal de un objetivo tan potente es muy pequeña, y
entra muy poca luz, entonces se unta una gota de aceite, de
índice de refracción casi
igual al vidrio, los rayos de luz continúan su camino sin
desviación, consiguiendo así que una mayor cantidad de luz
llegue al objetivo y sea posible observar por él.

Conclusión

Es así como hemos llegado al final del presente informe que

hemos desarrollado, conociendo un poco ms sobre las
tinciones donde hemos aprendido en que se puede utilizar
como ser medios de cultivo y en diferentes análisis y esto
nos ayudara para poder enriquecer nuestros conocimientos
en esta área del laboratorio
 Bibliografia

 https://www.franrzmn.com/tincion-negativa-de-cpsulas

 https://www.prezi.com/5lt6bgzazqgv/tincion-de-wright/

 Wikipedia

 https://es.m.medigraphic

 https//labdemicrobiologia.wixsite.com