UVM MEXICO Escuela de Ciencias de la Salud

Práctica número 12: Cromatografía de aminoácidos

Claudia Patricia Anaya Vargas, Andre Estefanía Bonilla Orellana, Alejandra Delgado
Medina, Sarahí Diosdado Solórzano, Stephanie Lucero González Hernández, Ingrid
Johana Martínez Saldaña
Lic. En Nutrición
Periodo 2018-1
Fecha de entrega: 23 de mayo del 2018
Docente: Anuar Salazar Gómez
Resumen: Está práctica se realizó para la identificación de aminoácidos por cromatografía.
Primero se cortaron las placas de SiO2 (dióxido de silicón) de 5cm x 2cm. Trazamos una línea
de 0.5cm de alto desde la base de la placa y trazamos una marca de 0.3cm desde lo alto de la
placa. Con un capilar colocamos 1 gota de alanina, glicina y tirosina al 1% previamente
preparadas respectivamente sobre la línea trazada desde la base. Introducimos la placa en una
cámara con una solución de butanol:ácido acético:agua (8:2:2) y esperamos hasta que la
solución (fase móvil) llegue hasta la marca del tope de la placa. Una vez que llegó a la marca,
sacamos la placa y la dejamos secar completamente. Aplicamos el revelador (ninhidrina) con
un algodón sobre la placa y dejamos secar nuevamente. Calentamos y observó una coloración
del revelado de los aminoácidos. La alanina y tirosina se tornaron rosadas y la glicina
amarilla.
Palabras clave: aminoácidos, solución, revelado, coloración
1.1 Introducción La tirosina es un aminoácido precursor de
las hormonas tiroideas y de la melanina.
Tirosina: Es uno de los 20 aminoácidos
(Daphne M., 2016).
que forman parte de las proteínas. Es un
aminoácido no esencial. La tirosina es Alanina: Uno de los veinte aminoácidos
precursora de ciertos neurotransmisores de origen natural codificados por el código
importantes. Tales como la dopamina, la genético, siendo por tanto uno de los
norepinefrina y la epinefrina los cuales componentes básicos de las proteínas de
regulan sensaciones como la seguridad, el los seres vivos. Es un aminoácido no
humor o la función mental. (Daphne M., esencial. (Daphne M., 2016).
2016).
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La L-alanina se crea en las células
musculares a partir del glutamato, en un
proceso llamado transaminación. En el
hígado, la alanina se convierte en piruvato.
(Daphne M., 2016).
Además, la alanina aminotransferasa
(ALT) cataliza la reacción en la que el
grupo amino de la alanina se transfiere al
α-cetoglutarato. (Daphne M., 2016).
Buenas fuentes de alanina son la carne, el
pescado y los huevos, así como algunas
plantas ricas en proteínas como los
aguacates. (Daphne M., 2016).
La glicina o glicocola (Gly, G) es uno de
los aminoácidos que forman las proteínas
de los seres vivos. En el código genético
está representada por los codones GGU,
GGC, GGA o GGG. Es el aminoácido más
pequeño y el único no quiral de los 20
aminoácidos presentes en la célula. Su
fórmula química es NH2CH2COOH y su
masa es 75,07. La glicina es un
aminoácido no esencial. Otro nombre
(antiguo) de la glicina es glicocola.”
(Daphne M., 2016).
Cromatografía de capa fina
Es una técnica analítica rápida y sencilla,
muy utilizada. Permite:
‐ Determinar el grado de pureza de un
compuesto. Se puede determinar así, por
ejemplo, la efectividad de una etapa de
purificación.
‐ Comparar muestras. Si dos muestras
corren igual en placa podrían ser idénticas.
Si, por el contrario, corren distinto
entonces no son la misma sustancia.
‐ Realizar el seguimiento de una reacción.
Es posible estudiar cómo desaparecen los
reactivos y cómo aparecen los productos
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finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo
la reacción ha acabado.
(Cañedo, 2015)
Determinación del Rf
La retención se puede explicar en base a la
competencia que se establece entre el
soluto a separar y la fase móvil por
adsorberse a los centros activos polares de
la fase estacionaria. Así, las moléculas de
soluto se encuentran adsorbidas en la fase
estacionaria y a medida que se produce la
elución van siendo desplazadas por la fase
móvil. La retención y la selectividad en la
separación dependen de los valores
respectivos de las constantes de los
diferentes equilibrios químicos que tienen
lugar, que están en función de:
‐ La polaridad del compuesto, determinada
por el número y naturaleza de los grupos
funcionales presentes. Los solutos más
polares quedarán más retenidos puesto que
se adsorben más firmemente a los centros
activos de la fase estacionaria.
‐Naturaleza del disolvente. Así, para un
mismo compuesto, un aumento en la
polaridad del disolvente facilita su
desplazamiento en la placa.
La relación entre las distancias recorridas
por el soluto y por el eluyente desde el
origen de la placa se conoce como Rf, y
tiene un valor constante para cada
compuesto en unas condiciones
cromatográficas. Debido a que es
prácticamente imposible reproducir
exactamente las condiciones
experimentales, la comparación de una
muestra con otra debe realizarse eluyendo
ambas en la misma placa.
(Cañedo, 2015)
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Para calcular el Rf se aplica la siguiente

expresión:
Rf = distancia recorrida por el compuesto
(X) / distancia recorrida por el eluyente
(Y)
(Cañedo, 2015)

1.2 Planteamiento del problema 1.4 Objetivos

Aplicar los fundamentos de cromatografía
en capa fina para la identificación de
aminoácidos (a.a), así como entender su
reacción con la ninhidrina.
1.3 Justificación
Nos dará experiencia para después ser
capaces de realizar la cromatografía en
capa fina para identificar los posibles a.a
presentes de cualquier alimento.
Realizar una cromatografía en capa fina
para la identificación de a.a
Calcular su RF así como entender la
reacción ninhidrina-aminoácidos.
1.5 Hipótesis
Si realizamos una cromatografía en capa
fina de 3 diferentes a.a y les rociamos
ninhidrina, entonces podremos notar una
coloración rosa para así saber su valor de
RF con la distancia recorrida de cada uno
de ellos, ganado experiencia para futuras
prácticas.
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2.Método

2) Trazar una línea horizontal

a 1.5 cm. de la base de la 3) Con una micropipeta
1) Colocar la placa placa con regla y lápiz. aplicar 1 gota de cada una de
cromatográfica sobre una Distribuir 4 marcas (M1, M2, las soluciones de
parrilla de calentamiento M3 y X) sobre la línea con aminoácidos y la muestra
durante 15 minutos. una separación de 2 cm. problema. Dejar secar
INDISPENSABLE USAR completamente
GUANTES.

6) Sacar la placa y marcar

4) Colocar la placa en forma
5) Dejar que el disolvente con un lápiz la línea donde
vertical en la cámara
fluya libremente hasta un cm llegó el disolvente, la
cromatográfica conteniendo
antes de llegar al borde distancia entre esta línea y el
el disolvente y cubrirla con
superior. borde inferior se llama
papel aluminio.
FRENTE DE DISOLVENTE.

8) Colocar la placa en una

7) Secar la placa al aire y 9) Con un lápiz delinear las
parrilla de calentamiento
rociarla con ninhidrina con un manchas reveladas por la
hasta que aparezcan las
aspersor ó atomizador. ninhidrina.
manchas correspondientes.

10) Medir la distancia del 11) Calcular el Rf para cada

centro de la mancha al punto mancha e intentar identificar
de aplicación. Esta distancia la identidad de la muestra
es el FRENTE DE SOLUTO. problema.
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3.Resultados 2.3
c) 𝑅𝐹: = 0.575
4

El RF de T: tirosina en un sistema de
elución butanol:ácido acético:agua es de
0.575
4.Análisis de resultado
En esta práctica identificamos los
aminoácidos por medio de cromatografía,
utilizando compuestos polares como
disolventes, o que ayuda a desplazar los
aminoácidos a través de la placa de
cromatografía. “El uso de la cromatografía
en papel para la separación e identificación
de aminoácidos es de gran importancia, la
fase móvil empleada generalmente es una
mezcla de n‐butanol/ácido acético/agua.
La separación implica que los aminoácidos
cuya cadena lateral (R) tenga un carácter
Figura 1. Cromatografía en capa fina para más apolar, tendrán tendencia a
la identificación de a.a donde A es alanina desplazarse con la fase móvil, mientras
con una distancia de 1.5, G es glicina con que los aminoácidos que sean polares, ya
una distancia de 1.0 y T es tirosina con una sean con carga o sin carga, serán retenidos
distancia de 2.3. por la fase estacionaria. Ello es así, porque
la fase móvil está formada por solventes
De acuerdo con la fórmula para sacar el que son más apolares que el agua, que es
RF: el solvente de la fase estacionaria.”
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 (Coralía Aguiar T y colab.,2014).
𝑅𝐹:
𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑒𝑙 𝑒𝑙𝑢𝑦𝑒𝑛𝑡𝑒 En esta práctica se realizó una de las
Donde: técnicas más sencillas para identificación
de aminoácidos que fue la combinación de
1.5
a) 𝑅𝐹: = 0.375 la cromatografía en capa fina con la
4
reacción de la ninhidrina con la cual se
El RF de A: alanina en un sistema de pueden identificar los aminoácidos por la
elución butanol:ácido acético:agua es de tinción color morado o magenta que se
0.375 presenta en ellos, excepto con la prolina la
1.0 cual, da un tono amarillo al reaccionar con
b) 𝑅𝐹: = 0.25 la ninhidrina debido a que no produce
4
amonio al reaccionar con ella, lo que
El RF de G: glicina en un sistema de
indica que los demás aminoácidos si
elución butanol:ácido acético:agua es de
presentan esta reacción.
0.25
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“La cromatografía se engloba dentro de las
llamadas técnicas de separación y permite
el análisis de mezclas complejas de
compuestos muy estrechamente
relacionados químicamente. La
separación se lleva a cabo según la distinta
interacción que presenta cada uno de los
componentes de una muestra respecto a
dos fases: una estacionaria y otra móvil
que fluye sobre ella. Esta interacción
puede ser de varios tipos que a su vez dan
lugar a distintas subclases de
cromatografía: de absorción, de reparto, de
cambio iónico, de afinidad, etc.” (Coralía
Aguiar T y colab.,2014).
Logramos observar en el papel
cromatográfico varias manchas redondas
amarillas a las que se denomina prolina su
coloración se debe a que estas no presentan
reacción ya que no tienen el grupo amino
libre y por lo tanto no reacciona con la
ninhidrina, en cambio los que son
rojos/rosas se debe a la propiedad de la
ninhidrina. “Por la estructura peptídica y
la presencia de determinados grupos
(grupos R), las proteínas pueden
reaccionar con una variedad de agentes
originándose productos coloreados. Estas
reacciones son la base para la
determinación cuantitativa y cualitativa de
las proteínas. Por presentarse variaciones
en la composición de los aminoácidos de
las diferentes proteínas, se manifiestan
diferentes colores y grados de intensidad
para una misma reacción, íntimamente
relacionado con la naturaleza de la
proteína analizada. La ninhidrina es un
poderoso agente y reactivo común para
visualizar las bandas de separación de
aminoácidos por cromatografía o
electroforesis, también es utilizada con
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fines cuantitativos para la determinación
de aminoácidos. Reacciona con todos los
aminoácidos alfa cuyo pH se encuentra
entre 4 y 8, dando una coloración que varía
de azul a violeta intenso. Este producto
colorido (llamado púrpura de Ruhemann)
se estabiliza por resonancia, la coloración
producida por la ninhidrina es
independiente de la coloración original del
aminoácido. Esta prueba es positiva tanto
para proteínas como para aminoácidos. en
aquellos casos donde no da positiva la
prueba de biuret y da positiva la de
ninhidrina, indica que no hay proteínas,
pero si hay aminoácidos libres.” (Daphne
M., 2016).
5.Conclusiones
En esta práctica identificamos
aminoácidos mediante pruebas de
cromatografía, la cual es una técnica
analítica que permite separar sustancias
químicamente semejantes utilizando su
distinta capacidad de ser arrastradas por
una fase móvil (compuestos polares) y de
ser retenidas por una fase estacionaria, al
terminar el proceso de colocarlo en la
cámara, dejarlo secar, colocamos un
revelador la ninhidrina que reacciona al
calentarlo con el grupo amino produciendo
amonio en este caso en la tirosina y la
alanina dando un color magenta excepto
en el caso de la glicina que presento un
cambio de color a amarillo ya que sus
características no son las adecuadas para
reaccionar con la ninhidrina para así
mostrar la distancia recorrida de los
diferente aminoácidos sacando el valor de
RF respectivamente, para así poder
identificar los a la hora de repetir este
proceso con cualquier alimentos que se
interese saber su composición.
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6.Referencia Teresa Cañedo. (2015). Cromatografía en

capa fina. 2018, de UAM Sitio web:
Coralía Aguiar T. (20 de junio del 2014.).
https://www.uam.es/docencia/jppid/docu
Cromatografía de aminoácidos. 16/05/18,
de Escuela Superior Politécnica de mentos/practicas/actuales/guion-p6.pdf
Chimborazo Facultad de Ciencias Escuela
de Bioquímica & Farmacia. Sitio web:
https://sites.google.com/site/laboratoriosb
ioquimica/bioquimica-i/cromatografia-de-
aminoacidos
Daphne M. (2016). Pruebas Cualitativas
para Aminoácidos y Proteínas. 16/05/18,
de Bioquímica. Sitio web:
http://webcache.googleusercontent.com/s
earch?q=cache:http://biokimik2011.blogs
pot.com/2011/09/objetivos-aplicar-
pruebas-cualitativas.html