1.

4 Conservación de cultivos microbianos

El éxito en la preservación de los cultivos microbianos es esencial para las actividades de

investigación o industriales basadas en la actuación de estos microorganismos. Las cepas
valiosas se tienen que conservar durante largos periodos de tiempo libres de cambios
fenotípicos adversos. Además, y tomando como ejemplo los procesos de elaboración de
alimentos fermentados donde participan cultivos microbianos, nos encontramos con que
el éxito de la producción depende principalmente y directamente de las técnicas de
procesamiento utilizadas, pero lo que permite estandarizar y mantener una calidad
uniforme del producto final es en una gran parte la correcta selección, conservación,
manipulación y resiembra o propagación de los cultivos (Tamime y Robinson, 1991).

La elección del método de conservación utilizado debe permitir mantener las

características del microorganismo por las cuales fue seleccionado (Stanbury et al., 1995).
En la industria alimentaria los cultivos microbianos se guardan en pequeñas cantidades
conocidas como cultivos de reserva. Cuando se reactivan para su utilización industrial, se
tienen que utilizar sistemas de siembra a gran escala con el objetivo de obtener el
volumen necesario para inocular los fermentadores de producción (Tamime y Robinson,
1991 y Salminen et al., 1998). Un cultivo de aplicación industrial tiene que reunir unas
determinadas características:

1. Contener el máximo número de células viables.

2. Estar libre de contaminantes.
3. Ser activo en las condiciones de procesamiento.

Por esta razón el mantenimiento de cultivos es extremadamente importante. No existe un

método universal para mantener los cultivos de microorganismos.

La selección del método tiene que basarse en la naturaleza del cultivo y en las ventajas e
inconvenientes del método escogido. Si el microorganismo aún no se conoce del todo es
aconsejable utilizar varios métodos de conservación (Dhingra y Sinclair, 1985). Los cultivos
de microorganismos se siembran en medios estériles y en condiciones de asepsia, y se
mantienen activos aplicando alguno de los siguientes métodos:

1. Reduciendo o controlando su actividad metabólica a través de la refrigeración. Este

método sólo es aplicable durante períodos cortos de almacenaje (por ejemplo en medios
líquidos o tubos inclinados de Agar nutritivo).

2. Conservación mediante
 Congelación
 Deshidratación

Normalmente se concentran o se separan de los productos residuales de su metabolismo,

a continuación se resuspenden en medio estéril y se procede a la etapa final de
conservación por alguno de los dos métodos mencionados. Este sistema permite
mantener los cultivos durante largos períodos de tiempo y la viabilidad de los cultivos
conservados depende de (Dhingra y Sinclair, 1985):

•El medio de cultivo base.

•El método de concentración.
•La rápida eliminación de metabolitos.
•La naturaleza del medio de suspensión.
•Las condiciones de deshidratación o congelación.
•La presencia de agentes crioprotectores (en la congelación).
•La velocidad de descongelación (en el caso de cultivos congelados).

1.4.1 Conservación en refrigeración

El objetivo general de la refrigeración es incrementar la vida útil de los cultivos, y en
consecuencia incrementar sus posibilidades de conservación (Casp y Abril, 1999).
Generalmente hace falta hacer resiembras en medio fresco a intervalos regulares. Es un
procedimiento laborioso y que consume mucho tiempo. El intervalo entre las
transferencias depende de la temperatura y la humedad de almacenamiento. Los tubos de
cultivos almacenados en contenedores que no permiten la perdida de humedad pero sí el
intercambio de gases, a una temperatura entre 5-8ºC necesitan transferencias cada 6-8
meses. Las condiciones que permiten que se dé una deshidratación rápida del cultivo
requieren intervalos de transferencia más cortos.

1.4.2 Conservación por congelación

La congelación se puede emplear como método de conservación de cultivos bacterianos,
por ejemplo, para la elaboración de productos fermentados. La mayor tasa de destrucción
bacteriana se observa inmediatamente tras la congelación, después se reduce
notablemente y llega a estabilizarse durante largos períodos de tiempo. Por eso, aunque
el número de supervivientes disminuya, la congelación es un método efectivo para
mantener la viabilidad de las bacterias. Cuanto menor sea la temperatura de
almacenamiento, mayor será la supervivencia de las bacterias. Para conseguir una mínima
destrucción de las bacterias interesa que la cristalización sea extracelular y que las
bacterias se deshidraten parcialmente impidiéndose la nucleación intracelular, pero no lo
suficiente como para que se reduzca su viabilidad. En los medios suelen incluirse, además,
agentes crioprotectores (glicerol, clara de huevo, leche, etc.) (Ordóñez et al., 1998).

El principal problema del mantenimiento de microorganismos a temperaturas por debajo

del punto de congelación es la muerte durante los procesos de congelación y
descongelación. Si los microorganismos pueden sobrevivir a temperaturas del orden o por
debajo de -20ºC seguidas de un recalentamiento rápido hasta la temperatura ambiente es
posible conservarlos congelados. La supervivencia de los microorganismos a los procesos
de congelación y descongelación depende de (1) el número inicial de células viables; (2) la
tasa de congelación y descongelación; (3) la temperatura de congelación y
almacenamiento (de 0 a -20ºC son más destructivas que <-20ºC); (4) tiempo de
almacenamiento; (5) presencia de protectores físicos. Los principales inconvenientes de
este sistema son los costes de los equipos y del mantenimiento, y los daños mecánicos
que se pueden provocar en las células (Dhingra y Sinclair, 1985).

Proceso de congelación
Al descender la temperatura las moléculas de agua tienden a agregarse en cristales. Esta
cristalización supone el paso de las moléculas de agua desde una distribución
desordenada (líquido) hasta un estado de ordenación molecular (sólido). El proceso de
ordenación molecular requiere el desplazamiento de las moléculas desde su posición
inicial hasta aquella que les corresponde en la estructura organizada, para ello será
necesario que dispongan de la suficiente movilidad y de tiempo. El proceso de congelación
incluye una serie de fases (Casp y Abril, 1999)

Subenfriamiento: Antes de que se produzca la cristalización hay que colocar al producto

en un estado termodinámicamente inestable que propicie al comienzo de la formación de
agregados submicroscópicos de agua que produzcan la interfase adecuada, necesaria para
la transformación de líquido a sólido. Esto se consigue con el subenfriamiento, o sea
enfriando el producto por debajo de su punto de congelación. El grado de
subenfriamiento necesario vendrá marcado por el inicio de la nucleación.

Nucleación: La cristalización se inicia cuando las condiciones son apropiadas para que se
produzca la agregación de un grupo de moléculas en una diminuta partícula ordenada,
que se conoce como núcleo de cristalización. La nucleación puede ser homogénea o
heterogénea. La nucleación homogénea se produce en sistemas puros y lleva a la
formación de cristales tridimensionales. La nucleación heterogénea es más importante en
los procesos de congelación. Este tipo de nucleación tiene lugar cuando el medio no es
totalmente puro, y los agregados de agua se unen sobre un agente de nucleación extraño,
como pueden ser las paredes del recipiente o más comúnmente alguna partícula de
material insoluble. Produce cristales bidimensionales.

Crecimiento de los cristales: Durante el subenfriamiento las moléculas de agua se

encuentran en un estado termodinámicamente inestable en el cual las fuerzas que
tienden a ordenarlas son más importantes que las que tienden al desorden. A partir del
momento en que lanucleación ya es efectiva, las moléculas de agua se mueven
rápidamente para alcanzar la estabilidad termodinámica como cristales de hielo. El
crecimiento de los cristales se produce cuando el número de moléculas de agua capaces
de difundirse a lo largo de la interfase, y de situarse orientadas en una posición de
crecimiento del cristal, es mayor que las que se separan del mismo. El mecanismo y la
velocidad de crecimiento de los cristales dependen de la morfología de su superficie.
Mientras la superficie sea rugosa y con muchos pliegues el crecimiento será continuo,
pero cuando se vaya alisando se reducirá la velocidad de crecimiento y comenzarán a
funcionar otros mecanismos. En condiciones de subenfriamiento ligero, la velocidad de
crecimiento de los cristales se ve favorecida por los defectos que éstos tengan. En el caso
de altas velocidades de enfriamiento, la existencia de defectos parece que tiene menos
importancia ya que entonces las moléculas tienen mayor probabilidad de orientarse
correctamente en ausencia de los pliegues.
En el caso de estructuras celulares, normalmente primero se produce la congelación del
medio extracelular y provoca la salida de agua del interior del citoplasma hacia el espacio
extracelular donde se congela. Dependiendo de la tasa de congelación, la célula pierde
diferentes cantidades de agua antes que se produzca la solidificación del contenido
intracelular.

Los cristales de hielo intracelulares provocan roturas mecánicas tanto en su formación

durante la congelación como durante la descongelación, debido a fenómenos de
recristalización, en los cuales el hielo se funde y se reorganiza en cristales más grandes
termodinámicamente más favorables. Una descongelación rápida aminora estos efectos.

Enfriamiento rápido: queda más agua retenida dentro de la célula susceptible de formar
cristales de hielo que provoquen daños físicos.
Pero si la tasa de enfriamiento es muy rápida se forman cristales muy pequeños que no
pueden dañar las estructuras celulares.

Enfriamiento lento: reduce este riesgo porque sale más agua de las células y por lo tanto
se forman menos cristales, pero tiene efectos negativos debido a que los cristales
formados son más grandes, al incremento de concentración intracelular de sales y a
cambios en la membrana celular. El encogimiento del protoplasto y la reducción del área
superficial puede hacer que, después de la descongelación, se rompan las membranas.
Para mantener la viabilidad de los cultivos el mejor método sería la combinación de una
tasa de enfriamiento intermedia (algunos estudios demuestran que la velocidad óptima se
encuentra entre -1 y -2ºC por minuto) y la adición de agentes crioprotectores (Dhingra y
Sinclair, 1985; Lamúa, 2000).

Agentes crioprotectores
Estos agentes facilitan el flujo de agua a través de la membrana celular y protegen
estructuras moleculares y supra-moleculares a través de diferentes formas de acción.
Son compuestos químicos no tóxicos, con facilidad para atravesar la membrana celular y
acumularse intracelularmente. Se mantienen en forma amorfa durante el proceso de
congelación y son capaces de unir electrolitos o moléculas de agua para retrasar la
congelación. Entre otros efectos protectores, sirven para compensar la diferencia de
presión osmótica que se genera cuando empieza a congelarse la superficie de la célula y
se incrementa la concentración de solutos en el medio que le rodea. De esta manera se
evita una pérdida excesiva de agua que podría provocar la deshidratación y destrucción
de las células (Dhingra y Sinclair, 1985).