Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biologicas

Laboratorio de desarrollo de sistemas de suministro de farmacos

“Estudios de estabilidad a corto plazo de ampicilina y cefalexina en solución

acuosa y plasma humano: aplicación del método de mínimos cuadrados en la
ecuación de Arrhenius”

Equipo 3
9FM2
Alumnos: Profesores:
● Hernández Almaraz Mario ● Calderón Delgado Jose Luis
● Hernández Montes de Oca Ismael ● Días Ramirez Carmen Cristina
● Jacobo Luna Miguel Angel ● García Hernández Gabriela Marisol
● Jimenez Hernández Valeria
 Introducción

Las Cefalosporinas y Penicilinas han sido de los fármacos antimicrobianos usados

más ampliamente a lo largo de los años, siendo parte de los fármacos antibióticos
más representativos de este grupo.

Figura 1. Molecula de cefalexina. Figura 2. Molecula de ampicilina.

A pesar de su uso extenso, no existe una descripción completa de la estabilidad
de los antibióticos betalactámicos en fluidos biológicos.
 Los estudios de estabilidad tienen una gran relevancia en los sistemas biológicos para
evaluar la integridad química de fármacos.
La determinación de la cinética de degradación de analitos, incluido el seguimiento del
producto de degradación.

El artículo presenta datos analíticos

de betalactámicos en su solución
madre y en plasma humano a
diferentes temperaturas durante
estudios de estabilidad a corto plazo.

Figura 3. Producto farmacéutico Naxifelar (Cefalexina en solución acuosa)

Objetivo del artículo: Aplicar la ecuación de Arrhenius en el
estudio de estabilidad de ampicilina y cefalexina para para
determinar la temperatura adecuada y el tiempo de
almacenamiento de estos medicamentos mediante un análisis
estadístico .

Figura 4. Ecuación de Arrhenius

Figura 5. Ejemplo de gráfica de Arrhenius

 Estudios de estabilidad en solución madre

Figura 6. (A) Cromatograma de plasma libre de fármaco(a) y plasma enriquecido (b) con
(1) ampicilina (10 g / mL) y (2) cefalexina (10 g / mL).
Figura 7. Cromatograma de solución madre (1) de ampicilina (10 g / mL) y (2) cefalexina
(10 g / mL) después de 15 días de almacenamiento a 20 ◦C con detección de dos
productos de degradación (AMP A1 y AMP A2).
Figura 8. Cromatograma de solución madre separada de ampicilina (10 g / mL) (1) y
(2) cefalexina (10 g / mL) después de 10 días de almacenamiento a 20 ◦C.
 Cromatograma LC-UV-MS /
MS de ampicilina (10 g / mL)
y cefalexina (10 g / mL) con
detección de formas
diastereoisómeras de ácidos
ampiciloicos (AMP A1 y AMP
A2) en solución madre.

Cromatogramas en
detección MS / MS (A) y
(B) en modo de escaneo
(50-400 m / z).

Figura 9. Cromatograma LC-UV-MS / MS de ampicilina (10 g / mL) y cefalexina

(10 g / mL). Condiciones cromatográficas acetonitrilo: ácido fórmico (0,1%)
(10:90, v / v).
Figura 10. .Esquema que ilustra la conversión de ampicilina en dos formas diastereoisoméricas
del ácido ampiciloico, AMP A1 (5S, 6R) y AMP A2 (5R, 6R) en medio acuoso.
Metodología experimental

Agua
purificada Figura 11. Acetonitrilo Figura 12. Ampicilina
grado HPLC USP
Estandar de cefalexina Farmacopea
brasileña

Fosfato de
potasio

Figura 13. Ácido Figura 14. Ácido

fosfórico perclórico
Sistema de HPLC
● bomba LC-10AD
● columna horno (modelo CTO-10AS)
● detector de matriz de diodos (SPDM10A)
● automuestreador SIL-10AD
● módulo controlador SCL-10A (todos de Shimadzu)

acoplado a una computadora personal que ejecuta el software Shimadzu Class VP para adquisición de
datos.

● fase móvil consistió de acetonitrilo: fosfato de dihidrógeno (pH 3,5; 0,1 M) (12,5: 87,5, v / v). pH del
tampón fosfato se ajustó con ácido fosfórico al 4%.
● La separación se logró a 25 ◦C utilizando un Shimpak C18 columna
● Flujo de la velocidad se fijó en 1.0 mL min − 1
● canal discreto en el diodo detector de matriz configurado para adquirir datos a 215 nm.
● Inyector automático
● volumen de inyección de 40 L.
espectrómetro de masas

espectrómetro de masas de triple cuadrupolo para la determinación de ampicilina, su productos de degradación

relacionados y cefalexina.

● modo de ionización por electropulverización positiva con un voltaje capilar de 2,70 kV

● voltaje del cono de muestreo de 210V
● voltaje del cono de extracción de 3V,
● Temperatura del gas de desolvatación de 250 ◦C (N2)
● bloque de fuente temperatura de 110 ◦C.

La adquisición de escaneo completo se realizó en el rango de 40–400 m / z con el voltaje del multiplicador a
650V. preparación de la muestra Muestras de plasma humano Plasma humano (250 ml) extraído de volumen
Preparación de la muestra
Plasma Humano
Plasma humano (250 ml) extraído de voluntarios sanos
(almacenado en bolsas que contienen heparina como anticoagulante)

Solución de reserva
1. Se pesaron ampicilina y cefalexina (50 mg)
2. transfirieron cuantitativamente a un matraz aforado de 10 mL para obtener una (5 mg / mL) solución
madre en agua ultrapura.
3. diluciones para preparar muestras de control de calidad a concentraciones de 1.0, 2.5, 5.0, 10,0 y
50,0 g / mL.
4. almacenaron en crioviales. de 2,0 mL.

Estudios de estabilidad en solución madre y plasma humano

1. Alícuotas de 1.0 mL de las muestras de control de calidad (5.0, 10.0 y 50,0 g / ml) en solución madre o
plasma humano, denominado CQ1, CQ2 y CQ3
2. transfirieron a crioviales y se almacenaron a 20 ◦C, 2 ◦C y −20 ◦C durante 15 días, 30 días y 103 días,
respectivamente.
3. promover el envejecimiento de la muestra.
 Resultados

Figura 15 .Pérdida de masa cuantitativa de Ampicilina (A) Conversión simultánea en dos productos de
degradación AMP A1 y AMP A2 en solución; (B) Pérdida de masa cuantitativa de Cefalexina en solución.
 Dias

Ciclos de
congelación-
descongelación

Dias

Figura 16. Estudios de estabilidad de ampicilina y cefalexina en plasma humano almacenado a T. ambiente
(C) a -2°C (D), almacenados a −20 ◦C (E) y después de los ciclos de congelación-descongelación (F).
Figura 17. Estimación del intervalo de confianza del 95% (línea continua) y del intervalo de predicción del
95% (línea discontinua) para la extrapolación hasta la temperatura de −40 ◦C de la constante de velocidad
de degradación (k1) de ampicilina (G) y cefalexina (H) utilizando Parcela de Arrhenius.
Tabla 1. Determinación del orden de reacción, constantes de degradación y tiempo estimado de almacenaje a
temperatura bajo cero para ampicilina y cefalexina aplicando el método de mínimos cuadrados de la ecuación
de Arrhenius.
Tabla 1.1 Determinación del orden de reacción, constantes de degradación y tiempo estimado de almacenaje
a temperatura bajo cero para ampicilina y cefalexina aplicando el método de mínimos cuadrados de la
ecuación de Arrhenius.
 Conclusiones

● La ampicilina y la cefalexina presentaron inestabilidad en humanos. plasma después de

períodos cortos de almacenamiento a una temperatura de -20 ◦C.

● Esta clase especial de fármacos muy inestables en fluidos biológicos se consideró la

propuesta para determinar el tiempo adecuado y temperatura de almacenamiento en
estudios de estabilidad a corto plazo durante el paso de validación del método.

● Los betalactámicos, ampicilina y cefalexina, cuando se presentan a procesos naturales de

degradación en medio acuoso o condiciones biológicas han seguido el método clásico de
Arrhenius.

● La ecuación de Arrhenius fue útil para evaluar la cinética de degradación de betalactámicos y

estimar el tiempo y la temperatura ideales de almacenamiento, pero se deben emplear
herramientas estadísticas para evitar extrapolaciones y valores estimados fuera de los
límites de incertidumbre.
Referencias

Gomes. T, Oliveira. E, (2013). Short-term stability studies of ampicillin and

cephalexin in aqueous solution and human plasma: Application of least
squares method in Arrhenius equation, Journal of Pharmaceutical and
Biomedical Analysis 73 (2013) 59–64.