Seminario de Biología n°1: Dictado por Giusti

Mantenimiento y variabilidad del genoma humano

Teorías y modelos

Mecanismos moleculares que permiten explicar cómo es posible que la célula transmita su genoma a las células hijas, o en un organismo
que un individuo, trasmita su genoma a la generación siguiente con un mínimo nro. de cambios. El genoma humano tiene 3mil millones de
pares de bases, y la estabilidad con la que trasmite es asombrosamente alta para un genoma tan grande

¿Cuáles son los mecanismos que permite esa fidelidad de copias?Y de manera complementaria, en aquellos casos que ocurren lo grandes
cambio, ¿cuáles son los mecanismos por los cuales ocurre?

La biología molecular es una rama de la biología, que estudia el modo que el genoma controla la fisiología humana.

Paper 1953 Watson y Crick donde interpretaron experimentos de otros autores y realizan una propuesta de un modelo de la estructura de
ADN y lo unen en un modelo integrador

Se sabía que existía una información llamada genética, que esa información que se trasmitía de célula a células hijas, y de un individuo a la
generación siguiente. También se sabía que esa información genética determinaba el número de aminoácidos de las proteínas, pero se
desconocía la molécula que lo realizaba, creían que eran las propias proteínas que creían que tenían esa información. Del ADN se
sospechaba que era una molécula de bastante gran tamaño e inerte y la función era desconocida. Se sabía que poseían nucleótidos unidos
entre sí, pero se desconocía la estructura. Se creía era una estructura de 3 cadenas, donde los grupos fosfatos unían a la base nitrogenadas
y donde los grupos fosfatos estaban en el centro y las bases miraban hacia afuera. NO existía un modelo de complementariedad de bases.
En experimentos previos al modelo de Watson Y Crick, utilizaron un experimento de Chargaff donde sabía que la cantidad de timina era
parecida a la cantidad de adenina, siendo también que la concentración de citocina siempre era similar a la cantidad de guanina, en una
muestra de ADN.

Esta relación de 1:1, usaron para la complementariedad de bases.

La estructura de doble hélice, en la que las bases hidrogenadas miran hacia el centro, se obtuvo de una difracción de rayos X, en una
muestra cristalizada. Crick fue el intérprete de la imagen y Wilkins que era el dueño del laboratorio. Franklin era la científica que aisló los
cristales de ADN y generó las imágenes.

“Hemos notado que apareamiento especifico de las bases de nuestro modelo, sugiere posible copiado para el material genético”

Si el ADN tiene 2 hebras complementarias, la información de una de las hebras determina la secuencia de bases de la otra hebra. Dado que
existe complementariedad de bases. Una hebra sería el molde de la otra hebra complementaria.
Demostró que la teoría tenía gran valor heurístico. Y permitió nuevos experimentos que demostraron la certeza del nuevo modelo
planteado.

Heurístico= una teoría ayuda a generar estrategias para diseñar nuevos experimentos. Obtiene un valor orientador.
Luego se realizaron nuevos experimentos para demostrar la manera de replicación del ADN.

Modelos propuestos para explicar la replicación del ADN

Se diseñaron 3 propuestas de modelos.

 Modelo de Replicación conservativa: luego de una rueda de replicación, la nueva hebra estaría compuesta por 2 hebras nueva
conservando la hebra parental por 2 hebra viajas.
 Modelo Dispersiva: donde al cabo de la primera replicación las 2 hebras hija contendrían fragmentos de las hebras viajas y nuevas
entremezcladas.
 Modelo Semiconservativo: en el cual, cada molécula tendría una hebra nueva y una hebra viaja (parental).

Experimentos de Meelson y Stahl: pusieron a prueba el modelo de replicación.

Usaron como modelo biológico al genoma de la bacteria de la Escheriquia Coli. En donde la bacteria se replica y debe también replicar su
genoma.
Pusieron a punto una metodología, que les permitiera distinguir los momentos diferentes en la replicación del genoma. Para ello
manipularon el medio liquido donde iban a crecer y proliferar las bacterias del experimento.

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A uno le agregaron a todos los componentes que tuvieran nitrógeno, tuvieran una variante pesada. Ósea un isotopo pesado de Nitrógeno
(15). A otro le agregaron una variante liviana de Nitrógeno. Al replicar el genoma se utilizan N del medio para realizar la replicación, por lo
que la bacteria al cabo de un tiempo tendrá en su genoma ya replicado N que incorporo del medio en que se encuentre. Entonces hicieron
que ciertas bacterias replicaran su genoma en el medio que tiene la variante liviana, y a otras en la variante pesada, para así tener genomas
con los 2 distintos isotopos de Nitrógeno.

Luego se imaginaron un modo de separar, físicamente las hebras que contuvieran la variante pesada, de las que contuvieran la variante
liviana de Nitrógeno. Para ello, lisaron a las bacterias en una solución de ClCe a 6M. En esa solución se encuentran fragmentos del genoma
de las bacterias que crecieron en los 2 medios diferentes mezclados en una única solución.
Y luego de centrifugar por un largo tiempo y por altas velocidades, se obtendrá debido a la fuerza gravitatoria de la centrifugación que los
iones de ClCe quedando en el fondo se encontrará la parte más concentrada que la de arriba que estará menos concentrada. Este
gradiente de concentración se verá reflejando también en el gradiente de densidad. Por lo cual, la parte que este más concentrada también
serán más densa, desde el punto de vista de las propiedades del líquido. En tanto las que estén menos concentradas con ClCe, serán menos
densas.

Se puede visualizar, agregando una determinada solución e iluminando con luz ultravioleta una imagen con 2 bandas negra que
representan las posiciones donde se colocan las moléculas del genoma liviano y del genoma pesado.
Inicialmente hicieron crecer a las bacterias, varios ciclos bacterianos en una solución con nitrógeno pesado, para que el total del genoma
este marcado con el nitrógeno pesado. Luego las hicieron crecer en un medio liviano. Durante un tiempo determinado, controlando el
dicho tiempo. Y se van tomando muestras de ese medio liviano y analizando su composición. Teniendo en cuenta que el tiempo de
replicación de un ciclo bacteriano durante entre 20-30 min.

Pudieron observar a lo largo de diferentes tiempos de replicación, 3 tubos que contenían 3 pesos posibles: pesado, liviano y uno
semipesado.
Se pudieron observar al cabo de una generación donde se las hizo crecer en un medio pesado que existía un único tipo de ADN:
Semipesado. Comparado con las distintas teorías, se esperaban diferentes tipos de ADN. Comparado con la teoría Conservativa que
esperaba 2 tipos de ADN, uno pesado y uno liviano, por lo que se descartó a esta teoría que no ocurrió lo que predecía. Comparado con la
siguiente teoría Dispersiva, la cual predice que tiene fragmentos de ambas hebras hijas y parental, por lo que su peso será semipesado. Lo
cual podría a llegar a ser verdadero este modelo. Comparando con la última teoría Semiconservativa, la cual predice que cada molécula de
ADN posee una hebra parental y una hija, lo cual su peso será semipesado. Esta teoría también podría ser cierta en dicho experimento.
Al cabo de 2 generaciones, y se pudieron observaron 2 tipos de pesos de ADN, liviano y semipesado. Comparando con las teorías
Dispersiva, decía que se obtenía un solo peso del ADN, en cambio en la semiconservativa, se obtenían 2 peso de ADN, por lo que se pudo
demostrar que esta teoría era la verdadera.

Mecanismo molecular de la replicación en células eucariotas

Concepto de orígenes de replicación, se descubrieron como secuencias específicas de ADN que se posicionaban la maquinaria proteica que
luego iba a ejecutar los primeros pasos de la replicación.

Se sospechaba que no podría existir un único origen de replicación no podía ser compatible con los tiempos de replicación y con el gran
tamaño del ADN, para ello tardaría semanas en completar la replicación del total del genoma, siendo que en medios de cultivos la
replicación dura aproximadamente 24hs.Se descubrieron entonces, múltiples orígenes de replicación. En las últimas investigaciones
sugieren que son alrededor de 30-50 mil orígenes de replicación por cada célula humana.

La activación efectiva de la replicación que comienza en los orígenes de replicación es un proceso que se da en 2 fases:
 Licenciamiento de los orígenes de replicación: que implica el contacto inicial, el reclutamiento de zonas específicas del ADN de un
conjunto de proteínas que van a dar para que comience el proceso de replicación del ADN. En el ciclo celular, este proceso ocurre en
G1, anterior a la replicación del genoma nuclear (durante la fase S). El primer contacto con los orígenes de replicación es el complejo,
llamado ORC (Complejo de Reconocimiento de los Orígenes). Este complejo a su vez permite el reclutamiento de otras proteínas. Una
de ellas son las Helicasas, de la familia MCM, son las responsables de abrir/romper la doble hélice y exponer las bases que sirven como
molde para enlaces de unión peptídicas. Estas helicasas se localizan antes de que ocurra la replicación en la fase G1, por lo que
permanecen inactivas, y necesitan de una señal especifica de la célula para activarse.
 Activación de los orígenes al comienzo de la fase S: en donde las helicasas se van a activar y van a abrir la doble hélice para que
comience la replicación genómica. Generando 2 horquillas de replicación bidireccionales en las hebras del ADN. El mecanismo por el
cual se activan las helicasas, se denomina fosforilación, que depende de un grupo de enzimas, llamadas quinasas, que fosforilan a las
helicasas y activan así el inicio de la replicación. Fosfatasas son aquellas que remueven los grupos fosfato de las enzimas y las vuelven
inactivas.

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Flexibilidad de los orígenes de replicación.

En los mamíferos, en la etapa del ciclo celular de G1, lo orígenes se licencian, pero no todos los que se licencian en esta fase van a ser
activados, se activan 1 de cada 3 orígenes de replicación. También difieren de un tipo celular a otro, los que se activan. Se desconoce
porque se activan ciertos orígenes de replicación y no otros, se sospecha que dependería con el grado de condensación de la cromatina o la
actividad transcripcional de una región del genoma y esto estaría vinculado con la activación de ciertos orígenes de replicación.
Las burbujas de replicación crecen de manera bidireccional, en direcciones opuestas. Donde las polimerasas son las que se pegan al ADN y
lo polimerizan; y las helicasas son las encargadas de romper la doble hélice para que las polimerasas puedan realizar su actividad.
Se sabe que, por cada ciclo celular, la replicación del ADN se da una única vez. Pero surgió de manera experimental la pregunta ¿qué
impide a la célula que no replique más de una vez el ADN, siendo que tiene todas las proteínas necesarias para la replicación? O ¿Qué
impide que un origen de replicación no se active luego de hacer ocurrido la replicación, y genere una nueva replicación del ADN?
El mecanismo por la que la célula, replica su ADN, una única vez por ciclo celular se debe a que depende de la familia de las proteínas
MCM.

Las quinasas activan a las helicasas, fosforilándola y luego éstas se pegan a los orígenes de replicación. Cuando se produce el inicio de la
replicación, las proteínas accesorias al complejo ORC, se despegan de los orígenes de replicación y son degradadas por moléculas activadas
en el ciclo S de la célula. O sea que una vez que el inicio de la replicación se produjo en un origen de replicación, las helicasas no pueden
volver a unirse ya que las proteínas accesorias que las uniones fueron degradadas, evitando así que en un mismo sitio se produzca más de
una replicación. Si este fenómeno fallara estaríamos en una situación llamada, re-replicación, generando así una amplificación del genoma
en ese sitio que fallo este mecanismo de control. Este fenómeno de re-replicación, en mamíferos en general no es fisiológico.

Existen otras proteínas cooperativas de las helicasas que mantienen abiertas las burbujas de replicación, ya que ambas hebras tenderán a
reunirse espontáneamente por medio de puente de hidrogeno, son las Proteínas de Unión a la Simple Cadena de ADN, como SSB-
proteína/RPA.

Otras proteínas: topoisomerasas I, producen cortes que permite aliviar la tensión del sobregiramiento de la doble hélice, evita el
superenrollamiento.

Existen componentes centrales, que realizan la replicación del ADN, que son las ADN polimerasas, descubiertas en el año 1952. Solo copian
al ADN, no lo generan de novo, por lo que dependen de un molde de ADN, para continuar la replicación. Tenemos al menos 14 tipos de
ADN polimerasas.

Existió un experimento de Kornberg, en el cual, encontrar las enzimas que realizan la síntesis del ADN. Aislaba bacterias rotas para
encontrar una enzima que tuviera la función de ADN polimerasas, agregando nucleótidos marcados. Fallando varias veces hasta que agrego
producto para ayudar a la formación del producto, por lo que encontró una gran actividad en uno de los tubos, lo que no sabía es que las
ADN polimerasas solo copian al ADN, pero no lo generan de novo.

Las ADN polimerasas solo copian al ADN, no lo generan de novo, por lo que dependen de un molde de ADN, para continuar la replicación.
Nuestro genoma codifica al menos para 14 tipos de estas enzimas. α – β - δ- γ - ε. Y otras más. Solo un subgrupo participa en la replicación
del ADN, como la α- δ y ε. La ADN polimerasa γ participa en la replicación del ADN mitocondrial. La ADN polimerasa β participa de la
reparación del genoma nuclear.

Condiciones para la replicación:

 Sustratos: son aquellos que desaparecen o se consumen para obtener un producto.

 Requerimientos: son aquello que ayudan a obtener el producto, como la hebra molde de ADN.
 Sustratos:
 dNTP´s: Nucleótidos + un grupo de 3 fosfatos + un azúcar desoxirribosa + base nitrogenada (adenina, citosina, guanina, o timina)

ACLARACION:
o Desoxirribonucleótidos difosfatos: Nucleótidos + un grupo de 2 fosfatos + un azúcar desoxirribosa + base nitrogenada.
o Desoxirribonucleósidos: base nitrogenada trifosfato + un azúcar desoxirribosa + un grupo de 3 fosfatos.

Requerimientos

 Molde de ADN de cadena simple, es esencial, ya que la ADN Polimerasas no generan ADN de novo.
 Molde de ARN, para polimerizar los extremos, que utilizan las Retrotranscriptasas.

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 Cada extremo es diferente, están polarizadas.
 Extremo 5´fosfato, un grupo fosfato unido al C5 de la desoxirribosa.
 Un extremo 3´Oh, posee un OH libre unido al C3. Es donde comenzará la polimerización y desde se podrá desde ahí. Este será el punto
de entrada de la ADN polimerasa. SE dice que se polimeriza el extremo 3´

Las cadenas se caracterizan por tener dirección antiparalela, ya que en los extremos opuestos tendrán las mismas características que en un
mismo sitio de acoplamiento. Por eso también es que se unen, por medio de uniones complementarias.

Existen un concepto, llamado procesividad: se le atribuye a las ADN polimerasas y significa que tiene la capacidad de mantenerse unido al
ADN por mucho tiempo y poder así replicar mucho más desoxirribonucleótidos. Una de las proteínas con mejor procesividad es la PCNA.
Los PCNA son factores de procesividad que tienen la capacidad de acercarse al ADN, y retener cercano a él a las ADN polimerasas α y δ,
para que no se despeguen. PCNA significa antígeno nuclear de células proliferativas. En la fase S se encuentra en alta concentración. Se
usan como indicador del grado de un tumor, ya que indica que ciertas células se encuentran en proliferación y ello determina que si hay
una excesiva concentración de esta molécula significará que el tumor está en crecimiento.

Teniendo en cuenta que las ADN polimerasas que no sintetizan de novo. Sino que sintetizan a partir de un molde que lo sintetizan las
primasas. Las primasas son ARN polimerasas que se encargan de crear un pequeño molde de ARN o cebadores o primers para que las ADN
polimerasas comienzan a replicar el ADN. Tienen la capacidad de sintetizar de novo, perdiendo la fidelidad a la hebra molde.
El avance de las ADN polimerasas se da siempre en sentido 3´-5´, y de ahí surge un inconveniente ¿cómo sintetizan a la hebra que va de 5´-
3´, si se da en sentido opuesto al avance de la horquilla de replicación? Se creía que existía una polimerasa que sintetizaba a partir del
extremo 5´ fosfato, aunque esa teoría resulta ser falsa.

Se sabe ahora, que en realidad hay otro mecanismo de síntesis, con 2 procesos diferentes para las hebras de la doble hélice del ADN. Uno
se da a partir del extremo 3´ OH siguiendo el avance de la horquilla de replicación, y por ende será continua, que también se denomina
Hebra Adelantada, y sólo escindirá un solo primer de ARN. Y otro se da, a partir de una serie de fragmentos, conocidos como Fragmentos
de Okazaki. Estos fragmentos serán sintetizados en sentido contrario al avance de la hebra misma, O sea siguen el sentido del avance de la
horquilla de replicación. Llamándose hebra Retrasada o discontinua.

La ADN Polimerasa α, tiene en su estructura subunidades adheridas de Primasa, que generar el primer a partir del cual comienza la
replicación. Luego la ADN polimerasa α en sí misma va a ser quien elongue ese primer, alrededor de 50-100 nucleótidos serán los que
sintetice.
 En la hebra Adelantada, la ADN polimerasa ε será la que finalice la síntesis de esta hebra.
 En la hebra Retrasada, la ADN polimerasa δ, finaliza la síntesis de la hebra.

Simultáneamente está ocurriendo la síntesis de histonas y la formación de nucleosomas, es decir la cromatina se está formando a
eucromatina a medida que va ocurriendo la replicación del ADN.

Problema en la replicación en el extremo 3´de los cromosomas

En los extremos, es decir en los telómeros, se encuentran secuencias no codificantes o secuencias repetitivas. Existe una secuencia
repetitiva en mamíferos TTAGGG, se llama secuencia telomérica y es característica de los telómeros.

Lo que sucede en cada replicación es que, en cada síntesis de los telómeros, se va acortando una pequeña porción en cada división celular
hasta llegar al punto de que la secuencia es demasiado corta que provoca que la célula no pueda dividirse y entre en el proceso de
apoptosis. Es señal de senescencia celular. Este acortamiento telomérico no se hereda en la próxima generación, ya que lo que se
transmite en la siguiente generación depende de las células sexuales y la senescencia telomérica ocurre a nivel de las células somáticas.
Los telómeros pueden replicarse en ciertos tipos celulares por una maquinaria especial que no dependen de las ADN polimerasas, sino a
una enzima denominada telomerasa. La telomerasa es una ribonucleoproteína, es decir tiene un componente proteico y un componente
de ARN y tiene actividad de retrotranscriptasa. Las retrotranscriptasas pueden sintetizar ADN utilizando ARN como molde. El molde de ARN
que utiliza es un pequeño fragmento que está contenido en la enzima misma. Entonces, la telomerasa puede elongar los extremos de los
telómeros utilizando el pequeño molde que ella misma posee.

Mantenimiento del ADN nuclear

Los mecanismos de reparación para el mantenimiento del ADN nuclear.

Se sabe que las ADN polimerasas poseen un alto grado de fidelidad, por lo cual se debe conocer cuáles son las fallas que llevan a la
reparación del ADN.

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Errores al momento de la replicación

Errores o daños que se ocurren, en un momento diferente de la replicación.

Existe una distinción en los tipos de errores, dependiendo de si ocurre en una de las cadenas, o sea errores de simple cadena, donde podrá
utilizar “como guía” a la otra hebra por complementariedad de bases. Y errores que ocurren en ambas cadenas, llamados también errores
de doble cadena.

Errores en la replicación:

Por deformación de la doble hélice, las polimerasas pueden cometer errores en la polimerización de un nucleótido que no sea
complementario con su molde. Por lo que este nucleótido tenderá a despegarse y no formará los puentes de hidrógeno con la hebra
complementaria. Este mal apareamiento puede ser detectado por la ADN polimerasa misma si es que se encuentra en esta región del ADN.
Varias ADN polimerasas tienen una actividad enzimática de reconocer un mal apareamiento y escindir/clivar/remover ese mal
apareamiento, realizando en el sentido contrario a la síntesis de 5´-3´. Mecanismo como Profreading o lectura de prueba. Este sería el
primer mecanismo de reparación del ADN.

La ADN polimerasa α que sintetiza una pequeña cantidad de ADN, no posee esta actividad de profreading, en cambio aquellas polimerasas
que sintetizan una enorme cantidad como las ADN polimerasas δ y ε, si poseen la actividad de profreading.
En los casos que hubo mal apareamientos o mismatches y donde la ADN polimerasa no detecto a tiempo y continuo la polimerización del
ADN, quedando así dicho error, existe otro mecanismo de corrección.

1- Sistema de reparación de mal apareamiento de bases o REBA:

Detecta el error: El mal apareamiento producirá una deformación tridimensional de la doble hélice, y donde un conjunto de proteínas que
monitorean a la doble hélice reconociendo esta deformación y uniéndose fuertemente.
Reconoce cuál es la hebra molde y cuál es la hebra nueva, así podrá remover el nucleótido correcto, pero tiene cierto tiempo para hacerlo,
ya que pasado un tiempo luego de la replicación se produce una metilación.
Se dice entonces que este sistema es post replicativo temprano.

2- Sistema de reparación por escisión de bases o REBA:

Daños que ocurren espontáneamente y que se dan en cualquier momento del ciclo celular. Como, por ejemplo; algunos nucleótidos
pueden perder sus bases nitrogenadas, como las purinas y este fenómeno se lo conoce como despurinación, otro ejemplo donde muchos
nucleótidos pierden grupos aminos y se convierten en bases nitrogenadas que no son naturales del ADN. En el caso de una citosina que
pierde su grupo amino la convierte en uracilo. Fenómeno llamado desaminación.
Este sistema debe actuar antes que ocurra la próxima replicación ya que si no lo hace se introducirá un error en la nueva replicación.
Detectan las bases nitrogenadas que no son naturales del ADN. Como por ejemplo Uracilo o aquellas que hayan perdido la base
nitrogenada. Luego remueven las bases no naturales del ADN, quedando un “hueco”, que es rellenado por la ADN polimerasa β.
Este sistema no depende de si es la hebra molde o la hebra nueva.

3- Sistema de reparación por escisión de nucleótidos o REN:

Por la exposición de los rayos UV puede generar un daño, provoca la formación de dímeros de pirimidinas. Es decir, cuando existen 2
pirimidinas cercanas entre sí forma los enlaces covalentes entre ellas. Esto provoca una deformación particular. Por lo que si no se repara a
tiempo la ADN Polimerasa no podrá sintetizar y se producirá una ruptura, no reconocerá esa unión. Este sistema tampoco no depende de si
es la hebra molde o la hebra nueva. Detecta la unión de dímeros de pirimidinas. Remueven ese fragmento. Las ADN polimerasa δ y ε
participan de la reparación del fragmento dañado.

Cuando la se produce roturas de doble cadena. Si este daño no es reparado, la célula activa una serie de señalizaciones que activan la
muerte celular programada. Existen 2 mecanismos por los que pueden repararse:

4- Sistema de unión de extremos no homólogos: donde une a 2 fragmentos que se han roto y pudiendo introducir algunas
mutaciones.

5- Recombinación homologa: utiliza la información de una de las hebras homologas que tenga alta identidad con la hebra que se
rompió. Este sistema tiene alta fidelidad de copiado.

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Seminario de Biología n°2: Dictado por Giusti

Ciclo celular

Características:

Organismos vivos con un sistema autónomo de la replicación del genoma.

2 eventos claves en el ciclo celular:
Una célula debe replicar su genoma antes de dividirse, y existen mecanismos de fidelidad dado por:
 Estructura del ADN
 Fidelidad de las polimerasas en la replicación

Mecanismos de reparación. Dando como resultado unas 3 mutaciones en un genoma de 3 mil millones de pares de bases.
Si la célula “madre” no expresa la enzima telomerasa, las células hijas sufrirán un acortamiento de los telómeros, al cabo de un
determinado número de replicaciones no podrán dividirse más y entrarán a un proceso denominado senescencia celular.
Segregación de cromosomas replicados en las células hijas.

Se analizarán 2 aspectos:
 Concepto de la proliferación celular en organismo multicelulares, poseen altas restricciones y pueden eliminar la arquitectura
funcional. La proliferación celular está restringida a ciertos tipos celulares.
 Mecanismos moleculares que controlan el avance del ciclo celular

Proliferación en el contexto de un organismo multicelular

Los tejidos poseen células con diversos tipos de diferenciaciones anatómicas y funcionales que las caracteriza que van a alcanzar por un
proceso de diferenciación celular. La diferenciación implica una regulación génica de cada una de esas células. Existe también una
organización particular de esas células que caracteriza a determinado tejido, es decir a la forma que en se organizan para interactuar entre
sí.

En tejidos adultos, solo un subgrupo retiene la capacidad proliferativa, manteniéndose en un equilibrio entre células que están en
proliferación y otro grupo que sufrirán apoptosis. Esta apoptosis no siempre se debe a daño celular, sino que está determinado
genéticamente, hay señales que pueden inducir activamente la muerte celular programada y esto ha evolucionado para permitir en el
tiempo la funcionalidad de los tejidos, eliminado células que podrían obstruir esa arquitectura precisa.
En los tejidos adulto el proceso de proliferación no se da para un crecimiento, sino para mantención, ya que las células viajas son
eliminadas y reemplazada por células nuevas.

Existen distintos mecanismos por los cuales los tejidos sufren proliferación. Por ejemplo, en aquellos que tienen una alta tasa de
renovación, como en el epitelio intestinal. Epitelio simple que recubre la luz que da el intestino. Existen distintos grupos de células, en
donde algunas llegaron a su máxima diferenciación como células absortivas, o las células caliciformes que secretan mucus. Pero también
existe un subgrupo que permanecen en un estado indiferenciado, que conservan la capacidad proliferativa y serán las células madres de
ese tejido.

Concepto de célula madre:

 Mantienen capacidad proliferativa.
 Estado pobre de diferenciación.
 Capacidad de autorrenovación, es decir que al menos una célula hija mantiene las mismas características que la célula progenitora, el
mismo rasgo de potencialidad.
O sea, la célula progenitora en su división producirá una célula madre con sus mismas características y una célula hija que luego se
diferenciará por ejemplo en una célula absortiva.

Otros tejidos tienen una estrategia similar, poseen un subgrupo de células madres, pero tienen una tasa de renovación muy baja. Es un
ejemplo de un tejido muy diferenciado como el tejido muscular esqueléticas. Sus células están muy diferenciadas, por lo que no se dividen,
pero se pueden encontrar entremezcladas entre las fibras musculares, en la periferia a las células satélites son células madres con una
limitada capacidad proliferativa inducidas por una ruptura muscular.

Existe una excepción: Las células que forman el parénquima del hígado, los hepatocitos son células diferenciadas pero que conservan la
capacidad proliferativa inducidas por un daño o una remoción de una porción del tejido, y pueden reingresar en el ciclo celular y culminar
en una división celular.

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Existe en el organismo que la capacidad de proliferación es casi nula y se encuentra en el músculo estriado cardíaco. Implica que un daño
en ese tejido no puede ser regenerado. Y ello implica un grave problema para ese tejido.

Otro tejido con casi nula proliferación es el tejido nervioso, pero cumple una función, como la preservación de la memoria, si el tejido
nervioso estuviera generándose todo el tiempo, la función de la memoria no podría existir porque ésta depende de un circuito estable, de
la permanencia en el tiempo de las mismas neuronas y de sus conexiones. En los últimos años se ha descubierto que existen regiones muy
localizadas del cerebro que mantienen la capacidad neurogénesis, pero se duda de la relevancia que existen en individuos adultos.
Estudio descriptivo de la proliferación

Para estos estudios se usan líneas celulares inmortalizadas, células aisladas que pueden ser de algún animal o de seres humanos, en el caso
de una muestra tomada por una biopsia en humanos, se trata de células tumorales por lo que se dicen que son inmortalidad replicativa, ya
que expresan en todas sus células la enzima telomerasa y por ende no tendrán un número limitado de divisiones celulares antes de entrar
en senescencia celular.

Esto permite que en un medio de cultivo y agregando nutrientes puedan mantener en una estufa de cultivo de 7°C en condiciones de CO2
controladas a las células proliferando en una placa de Petri. Se puede medir la capacidad proliferativa en el tiempo colocando un número
relativamente bajo de células y así se puede analizar el grado de confluencia, es decir, en que proporción pueden cubrir la superficie de la
placa a lo largo del tiempo. Y medir el tiempo en que una línea celular llega al grado de confluencia y será directamente proporcional a la
velocidad que una línea celular puede atravesar el ciclo celular.

Otra forma es la citometría de flujo, implica generar a partir de la disociación de tejidos o de levantamiento y disociación de células que
están creciendo en un medio de cultivo, generar una suspensión de células; células que no estén en el fondo de la placa o que no están
adheridas entre sí, por conexiones o matriz extracelular. Esa suspensión se pasa al citómetro, y que posee un conducto tan delgado que
solo deja pasar una célula por vez, y se pueden pretratar a las células con una tinción que se intercala en las bases del ADN y que emite
fluorescencia con una determinada luz de cierta longitud de onda. La cantidad de fluorescencia que emita cada una de ellas dependerá de
la cantidad de ADN que contengan cada una. El citómetro de flujo podrá medir entonces, la fluorescencia de cada una de esas células y
podrá analizar estadísticamente el perfil de la línea celular estudiada.

Esto se verá reflejado en un ejemplo de coordenadas cartesiano. Donde, por ejemplo, se mostrarán 2 picos uno de menor tamaño que el
otro, y también picos de tamaños intermedios que estos. En el cual, el pico de mayor tamaño representara las células que ya atravesaron la
fase S, es decir que pueden estar en la fase G2. Y el de menor tamaño representara a las células que no han comenzado la fase S. y los picos
intermedios, representan los estadios intermedios de la fase S, es decir, que están en diferentes pasos de la mitosis.
Otro estudio, que se realiza en un tejido es analizar el índice mitótico, mide la proporción de células que están en mitosis en cierto tejido
en un momento dado y que se cuantifica en relación con las células que están haciendo mitosis sobre el número de células totales. Esto se
realiza a partir de cortes histológicos teñidos con la técnica de rutina. Este método es importante, ya que en un tumor el índice mitótico
representa el grado de agresividad.

Se sabe que los tumores tienen una fase exponencial y luego una fase estacionaría, aunque siempre depende de cada tipo de tumor. La
fase estacionaria implica que el tumor ha crecido demasiado y ha acabado sus nutrientes. Esto se conoce como descripción gompertziano:
El crecimiento tumoral radica en función del tamaño del tumor.
La fracción de crecimiento tumoral disminuye al aumentar el volumen del tumor.

Mecanismos moleculares que controlan el ciclo celular

Hatwell estudio a la levadura de cerveza, un hongo unicelular, pudo identificar algunos genes con función de regulación la progresión del
ciclo celular. Podía observar directamente el proceso del ciclo celular bajo el microscopio teniendo una gemación significa que está a punto
de replicarse. Podía identificar células puntuales que tenían problemas de proliferación. Y podía inducir problemas en el genoma, que es
haploide, cada gen está en única copia. Por lo que al haber un gen mutado habrá una manifestación fenotípica. Logro identificar los genes
que denominó Genes CDC (ciclo de división celular), estas células mutantes tenían problemas proliferativos, entonces estos genes deben
de estar codificando para productos proteicos que son esenciales en el control del ciclo celular. De modo tal que una mutación en las
proteínas codificadas por esos genes detiene en puntos específicos de ese ciclo celular.

El paso del tiempo no implica que la célula pase de una fase a la otra, sino que depende de otros mecanismos. Se dice que deben atravesar
cambios drásticos para pasar ciertas fases del ciclo celular, llamadas transiciones reguladas. Los cambios drásticos, se creía que dependía
de factores que activaran o desactivaran para pasar de una fase a la otra.
 Una de las transiciones reguladas, son los llamados Puntos de Restricción, que se da en fines de G1 y principios de la fase S. Es un
punto muy difícil para célula atravesar esa transición.
 Otra transición, G2 a la fase M

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 Mitad meiosis, de la anafase a la metafase.

Estos procesos de cambios drásticos están mediados por mecanismos de fosforilación, que realizan las enzimas Quinasas obteniendo el
fosfato de la molécula de ATP. Proceso que ocurre postraduccional de las proteínas La fosforilación son una de las modificaciones que
pueden sufrir las proteínas que pueden tener un efecto dramático sobre su estabilidad o su actividad, por ejemplo, una proteína que se
encuentra en un estado inactivo, luego de la fosforilación, este grupo fosfato añade un cambio conformacional en la estructura
tridimensional y volverla activa. También puede darse el caso contrario. Otro ejemplo, es donde una proteína es sujeta a degradación
constante y una fosforilación la vuelve inaccesible a la maquinaria de degradación y permitir su acumulación en el tiempo. La característica
principal de la fosforilación se debe a la enorme rapidez. La fosforilación es un proceso reversible, por lo que, si las quinasas añaden grupos
fosfatos, existen otras enzimas que los remueven y son las fosfatasas. Cabe destacar que la fosforilación se da en residuos de serina,
treonina y tiroxina, dado que no cualquiera puede hacer este grupo con cargas negativas.

Existen quinasas que regulan procesos que permiten los cambios drásticos a lo largo del ciclo celular, que se denominan Cdk-Ciclinas
(quinasas dependientes de ciclinas. Su estructura funciona es un heterodímero, un complejo de 2 polipéptidos diferentes unidos por
uniones no covalentes. De esas 2 subunidades, una es la que tiene la actividad catalítica, la Cdk es la que es capaz de unir covalentemente
el fosfato del ATP al residuo de treonina, tiroxina o serina, es la que tiene la capacidad de fosforilación. La otra, la ciclina, es la subunidad
regulatoria, regula que la subunidad Cdk adquiera la estructura tridimensional adecuada para ser funcional.
Hay 4 familias principales, y su nombre lo adquieren del momento del ciclo celular que regulan:
 G1-Cdk
 G1/S-Cdk
 S-Cdk
 M-Cdk

Paul nurse, fue el que descubrió por primera vez la actividad de las Cdk, como los productores del avance del ciclo celular, también se dio
cuenta que los genes que codificaban para estas ciclinas eran los mismos genes que describió Hatwell no solo estaban en las células de las
levaduras, sino que se encontraban en todas las células eucariotas.

Otro grupo de investigación descubrió en experimentos a la hoy conocida M-Cdk, que promueve la segregación de los cromosomas y
denominaron Factor Promotor de la maduración, luego se descubrió que ambos eran la misma molécula. Utilizaron ovocitos de rana miden
entre 1-3mm, se podía inyectar “cosas” a los ovocitos por su gran tamaño. Las ranas tienen la capacidad de producir y almacenar grandes
cantidades de ovocitos que quedan almacenados en G2, en la profase I. Si se inducía por inyección hormonal de progesterona, entrarían a
la fase M lo ovocitos. Tomaron citoplasma que entro a la mitosis y se los inyectaron a otros que no fueron inyectados, también entraban en
mitosis. Por lo que concluyeron que se debía a moléculas que se encontraban en el citoplasma lo que inducia el cambio de fase.

¿Cómo se regula la actividad de las Cdk?

Se debe a la estructura misma, y se debe a las ciclinas. Aunque no siempre se encuentran presentes, se encuentran en momento precisos
en gran cantidad y luego disminuyen. Varía dependiendo de que fase se encuentre la célula y por ende se incrementaran las ciclinas de la
fase siguiente para regular dicho cambio de fase. También están reguladas por el sistema ubiquitina-proteasoma, permite que ciertas
proteínas se degraden de manera muy rápida e implica que esa proteína debe unirse de manera covalente con una molécula muy pequeña
que es la ubiquitina, si se añaden cadenas de ubiquitina a lo largo de ciertas proteínas proceso llamado ubiquitinación, conducirán al
mecanismo de degradación por medio del proteasoma.

Tim Hunt fue quien descubrió y describió de las ciclinas.

Transición regulatoria de anafase a metafase.

En anafase ocurre la separación de las cromátides hermanas, que se debe a la ruptura de las cohexinas que lo mantiene unidas a lo largo
del cromosoma a las cromátides hermanas, aparte del centrómero. Separasa es la que lleva a la separación de las cohexinas, pero se
encuentra unida a la securina y para que la separa realice su actividad, se necesita que la securina sea degradada previamente.
El complejo promotor de la anafase (APC) induce la ubiquitinación de la securina, su degradación en el proteasoma y la liberación de la
separasa. El AP es un complejo activo formado por 2 subunidades, el complejo promotor de la anafase que se al complejo Cdc-20.
Cdc-20 se va a acumular cuando se encuentre activa la ciclina que activa la Fase M. El Cdc-20 es fosforilado y así activado, por la M-Cdk.
APC también ubiquitina a la M-Cdk, o sea que existe un feed back negativo, porque rápidamente disminuye la cantidad de ciclinas de la
fase M.

Existen también una manera de activar este sistema de una manera máxima, que es fosforilando las Cdk-ciclinas, por medio de otras
proteínas.
Existen proteínas inhibitorias se unen al complejo Cdk-ciclinas e impiden que se unan a su sustrato, son ejemplo:

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 p 27
 p 21
 p 16
 p 53
También ellas pueden estar a procesos de regulación, por lo que si son ubiquitinadas liberarán al complejo Cdk-ciclinas y éstas podrán
unirse a su sustrato.

Puntos de control

Señalizaciones intracelulares que se activa en aquellos momentos en que la célula no ha replicado la totalidad de su genoma o cuando hay
daños en el ADN.
p 53 es una proteína inhibitoria muy importante, ya que detiene el ciclo celular, inducido por daños en la doble cadena de ADN. Se
encuentra sometida a degradaciones constantes. Si se fosforila puede acumularse y así regular el ciclo. Un factor de transcripción, p 21
cumple la función de inhibir a Cdk-ciclina que induce la transición de G1-S.

¿Cuáles son los requisitos que se necesita para pasar el Punto de restricción?

Se necesitan ciertos factores mitógenos, no necesariamente necesitaran de nutrientes para pasar este punto.
El rol de los mitógenos o factores de crecimiento
Mitógenos y factores de crecimiento, no son sinónimos, sin embargo, algunos factores de crecimiento actúan como mitógeno, aunque
tengan otras funciones involucradas en otros procesos.
Son ejemplos:
 FGF
 EGF
 PDFG
 Eritropoyetina
 Interleuquinas

Son pequeños péptidos, segregados por un tejido que actúan sobre receptores de la superficie de las células de una población competente.
Y que produce una cascada de activación intracelular, que median diferentes fosforilaciones.
La unión del mitógeno con su receptor que induce la vía de activación intracelular suele terminar con activación de factores de
transcripción de determinadas proteínas que van a inducir que se expresen determinados genes en el genoma. Uno de los genes que suele
ser transcripto como respuesta a la inducción de un mitógeno es un gen, que a su vez es un factor de transcripción Myc. Una vez que se
transcriba y traduzca es te gen se formará la proteína Myc, que actúa en el promotor de otros genes produciendo a su vez inducirá una
segunda oleada de transcripción y traducción.

El gen Myc puede activar 3 genes:

Ciclina D, que activa a G1-Cdk- ciclina, la ciclina G1 no está desde el comienzo, sino que, debe sintetizarse en la célula y comienza a hacerlo
cuando recibe una señal mitogénica que inició una vía de señalización intracelular que activa Myc y promueve la síntesis de esta ciclina.
Se transcribe una subunidad regulatoria que va a degradar a aquella proteína p27 que le ponía un freno a la ciclina G1. El mitógeno induce
a la síntesis de las proteínas que participan en la degradación de las señales inhibitorias. De modo tal, que libera la actividad no solo de las
ciclinas características de G1, sino también de las que participan de G1/S.
Ambas ciclinas, fosforilan muchos sustratos, entre ellos el Rb, la proteína del Retinoblastoma, tiene una función inhibitoria de la
proliferación, dado que secuestra al factor de transcripción que va a inducir la síntesis de las ciclinas características de los complejos S-Cdk
ciclina.

El control que tiene un organismo multicelular dependerá de la disponibilidad de los mitógenos, si ellos no se encuentran presenten no
podrán atravesar el punto de restricción por más nutrientes que posean.
Para entender el abordaje de los procesos patológicos que caracterizan a las células tumorales donde la proliferación ha perdido el control
regulatorio, se clasificaron a los genes del genoma según el fenotipo que se quiera analizar. Se los dividió en 2 grupos

A un grupo de genes que favorecen la proliferación celular, es decir tienen un efecto positivo, como por ejemplos los genes que codifican
para las ciclinas, las quinasas dependientes de ciclinas, los genes que codifican para lo mitógenos y sus receptores. Se los llama
Protooncogenes. Si ocurriera una mutación en estos genes promovería la progresión aun si tener la señalización de un mitógeno, y
entonces este gen mutado se pasa a llamar Oncogen.

El otro grupo será aquellos genes que detienen el ciclo celular, como, por ejemplo, p27, Rb, p53, proteínas que ponen un freno. Son los
genes denominados Genes supresores de tumores.

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Seminario nro. 3 de biología celular por el Dr. Giusti

Regulación de la expresión génica I

Conceptos básicos:

Diferenciación celular: 2 tipos celulares del mismo organismo, por ejemplo, una neurona y un hepatocito, el genoma de ambas es
exactamente el mismo. No todo el genoma está siendo expresado. Se hicieron experimentos para saber que transcriptos están siendo
expresados en los diferentes tipos celulares. Los genes se pueden agrupar en 3 grandes grupos:
 Algunos genes que son específicos en tipos neuronales
 Otros solo en hepatocitos
 En ambos tipos, genes de mantenimiento o housekeeping

Mecanismos moleculares que permiten la diferenciación celular. Pueden expresar genes a partir de estímulos que antes no se expresaban,
como por ejemplo la prolactina en las células de la glándula mamaria en respuesta a estímulos hormonales.
Existen 30.000 genes. De esos genes, no todos codifican para proteínas
 21.000 codifican para proteínas.
 9.000 codifican ARN no codificantes:
 snARNs (ARNs pequeños nucleares)
 sonARNs (ARNs pequeños nucleorales)
 microARNS

La expresión de los genes comienza a partir de la transcripción de esos genes por parte de la ADN polimerasa, con la transcripción de los
genes, algunos de los transcriptos primarios necesitan una modificación como el splicing. Y exportados del compartimiento nuclear al
compartimiento citoplasmático y puede o no ser traducido.
Todos los procesos de la célula son regulados. Aunque se concentran en si se van o no a transcribirse.

Regulaciones

 Regulación pre-transcripcional: procesos que regulan antes de la transcripción modificando el grado de compactación de la cromatina
llamado control pre-transcripcional.
 Regulación de la transcripción: procesos que regulan el inicio de la transcripción.
 Regulación pre-transcripcional o regulación epigenética

Epigenésis: “por encima de los genes” Conceptos

Una transformación química que puede afectar al ADN o a la cromatina pero que no afecta el orden de las bases.

En biología molecular: mecanismos moleculares algunos de ellos heredados que proveen información regulatoria al genoma sin alterar la
secuencia de nucleótidos del ADN.

En biología del desarrollo del desarrollo: aquel mecanismo que no es genético. Un evento epigenético que impulso a un mecanismo de
desarrollo.

El genoma está asociado a proteínas, histonas, que forma así la cromatina. En la célula se encuentra en estados más laxos. En diferentes
células habrá diferentes grados de compactación o de laxitud permitiendo que acceda la maquinaria transcripcional.
El nucleosoma es el primer grado de compactación. Obtenido de imágenes de microscopio y de datos químicos, formado por dímeros de
histonas: 2*H2A, 2*H2B, 2*H3, 2*H4. H1

Técnicas de cristalografía de moléculas por Rx pueden purificar las moléculas, una vez que atraviesan los rx en las moléculas y reconstruir la
disposición de las moléculas.

Características de las histonas:

 Son proteínas muy conservadas. Conservan su estructura en el tiempo.
 Cada aminoácido cumple una función específica. Poseen entre 103-115 aminoácidos.
 Las H2A poseen una alta concentración de aminoácidos básicos que el resto de las histonas, poseen una cadena positiva: Lisina (K),
Arginina ®.
 Le otorgan una carga neta positiva a las histonas, y esto otorga a las histonas asociarse al ADN que es un poli anión, con alta afinidad.

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Estructura de las histonas, son polipéptidos poseen ciertos dominios con alfa hélices y le permite plegarse, que se llaman Pliegues
Histónicos permite la asociación de histonas, también llamado “apretón de manos”.
Se forman dímeros de histonas de la asociación de H2A-H2B y H3-H4.
Los extremos N-terminales carecen de las estructuras de alfa hélice y protruyen hacia afuera de los dímeros, y son el asiento de
modificaciones químicas que permiten la compactación de la cromatina.

Modificaciones químicas de los extremos N-terminales de las histonas

Las acetilaciones y las metilaciones ocurren en el mimo tipo de residuos, ocurren en las lisinas ® poseen un resto de un grupo de 4
carbonos que presenta un extremo amino que le confiere la carga positiva, y las fosforilaciones ocurren en los residuos de serinas (K).

Acetilaciones: agrega un grupo de acetilo, consiste en un grupo de 2 carbonos (COHN-CH3) a la amina de la lisina, cancela la carga positiva.
Una histona acetilada tendrá una menor afinidad por el ADN, entonces a mayor grado de acetilación menor grado compactación, mayor
grado de transcripción.

Metilaciones: también ocurren en el nitrógeno de la lisina. Agrega un grupo metilo (CH3). No modifica la carga. Una lisina metilada no
puede ser simultáneamente acetilada, o sea no puede ser modificada para la descompactación de la cromatina.
Fosforilaciones: son menos frecuente. Aumentan la carga negativa, pierde la afinidad por el ADN, por lo cual a mayor grado de fosforilación
menor grado de compactación.

Son modificaciones dinámicas. Hay enzimas que pueden producir que la remoción de estos grupos. En el caso de la acetilación, las enzimas
responsables son la desacetilasas de histonas. En la metilación son las metiltransferasas, y en la fosforilación son las catalasas.
Las desacetilasas (HDAC) luego de remover el grupo acetilo, desfavorecen la expresión génica. Le quita la carga negativa, y que la histona
con carga positiva y tendrá más afinidad por el ADN entonces habrá mayor grado de compactación.

Heterocromatina facultativa: puede estar o no compactada. En distintos tipos celulares o en un mismo tipo celular en distintos tiempos
reaccionan a distintos estímulos.
Heterocromatina constitutiva: siempre está en forma heterocromatinizada. Hay regiones del genoma siempre están heterocromatinizada,
son regiones pobres en contenido génico, como los telómeros.

Los complejos remodeladores de la cromatina

Son mecanismos que regulan la compactación de la cromatina, complejos enzimáticos que utilizan la energía para generar movimiento en
los nucleosomas que se generar debido a la hidrolisis del ATP.

Efectos:
Pueden desplazar un nucleosoma de una región a una región adyacente, ese movimiento que un promotor escondido quede levemente
expuesto para que se active la transcripción.
Pueden remover, de una región determinada del genoma, un nucleosoma y dejar una región sin asociación de nucleosomas en esa región
del genoma.
Ambas favorecen la expresión génica.
Pueden sustituir los nucleosomas con las histonas clásicas por nucleosomas con histonas menos comunes. Variantes de H3, llamada H3.3
que tiene terminaciones aminoacídicas, la cual le confiere menor grado de afinidad por el ADN y por ende habrá menor grado de
compactación y la caracteriza por un alto grado de expresión génica. Hay otra variante de H3, con un mayor grado de afinidad al ADN,
llamada CENP-A, característica de regiones de heterocromatina constitutiva y centroméricas.

Metilación del ADN.

Características:
Ocurre en algunos residuos de citocinas, es una modificación epigenética.
La citocina tiene que estar yuxtapuesta con una guanina, esa guanina tiene que estar 3´con respecto con la citocina.
Se generan islas de CPG: regiones donde se encuentra la asociación de guanina-citocina, donde las citocinas están metiladas y por lo
general están asociados a promotores. De la sigla, la letra P, significa el grupo fosfato que une a la guanina con la citocina y hace referencia
de la posición de la mima.
No cambia las secuencias de bases. Pero cambia la conformación tridimensional.
La metilación deriva en el silenciamiento génica, ya que la Polimerasa II no puede ser adherirse al sitio de unión para comenzar la
transcripción.
Ese cambio que se genera se forma una afinidad de enzimas, desacetilasas de histonas, esto genera que las histonas se adhieran al ADN y
por ende se compacte, y de ese modo se silencie la expresión génica.

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Las modificaciones de las histonas, algunas de ellas pueden ser transmitidas a las células hijas, aunque no hay evidencia de todas las que lo
producen, solo se sabe que existen 2 tipos, por ejemplo, la trimetilación de la enzima 27 y la trimetilación de la enzima 9 de la histona H3,
se sabe que son transmisibles a las células hijas.

Regulación de la transcripción

Existen 3 tipos de ARN polimerasas, tipo I, II, y III. Transcriben distintos tipos clases de genomas.
 La ARN polimerasa I, transcribe ARN ribosomal.
 La ARN polimerasa II transcribe todos los ARN mensajeros cuyo producto final es una proteína.
 La ARN polimerasa II transcribe el ARNt, y ARN pequeños.
También existe una ARN polimerasa mitocondrial.

Características de la ARN polimerasa II,

Es un complejo de polipéptidos de 2 subunidades. La subunidad 1 posee la función enzimática, un extremo carboxi terminal, extremo CTD
compuesto por 7 aminoácidos.
Por si sola no es capaz de reconocer los promotores, no tiene afinidad por la secuencia del ADN.
Existe un conjunto de 5 proteínas son imprescindibles, los llamados Factores Basales de la Transcripción (TF2T), que permiten que la ARN
polimerasa reconozca a los promotores. Están presenten siempre, no son específicos. Si falta uno la transcripción no se produce

¿Cómo reconocen los factores basales de la transcripción a los promotores? Los promotores son doble cadena de ADN, entonces como es
que hace una proteína para reconocer la secuencia si está el promotor arrollado sobre sí mismo.
La doble hélice sufre diferentes modificaciones estructurales que son detectadas por proteínas. Existen diferentes familias de proteínas
que reconocen las estructuras especificas están las llamadas Dedos de Zinc existe un átomo de zinc y que favorece la configuración
tridimensional precisa.

También se encuentran las cremalleras de leucinas, son muchas de las proteínas que interactúan con el ADN y que poseen
homeodominios, son sectores polipeptídicos que pueden interaccionar con el ADN.
Se dice que cuando todos los factores basales de transcripción están posicionados y no ocurre la transcripción, se dice que ese complejo
está inactivo.

La forma activa de la ARN polimerasa II, se fosforila el extremo carboxi terminal.

Existen elementos del genoma, secuencias regulatorias: Potenciadores (enhancers) o silenciadores (silencers). Se posicionan un conjunto
de proteínas que interactúan con lo silenciadores o potenciadores, son los llamados Factores de Transcripción Específicos. Las proteínas
que participan son diferentes, es decir varían de un gen a otro a diferencia de los factores basales de la transcripción que siempre son las 5
mismas proteínas.

Se dice que un factor de transcripción es aquel que interactúa directamente con el ADN, y aquel que no se use de manera directa se llama
correguladores, se unen a otras proteínas. Aunque ambos tienes una actividad regulatoria sobre la activación de un gen.
Entonces:
Los promotores son secuencias del ADN, que se le pueden unir los factores de transcripción y que, a su vez, a estos últimos se les puede
unir los correguladores.
Secuencias Potenciadores: activan /ayudan a la transcripción mediante diferentes proteínas. Los silenciadores por su parte inhiben la
transcripción. Tienen su efecto rio abajo o rio arriba con diferencias de muchos o pocos pares de bases, y esto se debe a que la molécula de
ADN puede doblarse y así interactuar con la secuencia potenciadora

Mediador: complejo esencial en la transcripción, para la acción de un potenciador o de un silenciador, compuesto por más de 30 proteínas,
se lo puede pensar como un corregulador que está presente en la transcripción de todos los genes. Su función condensa las interacciones
proteicas de aquellos factores específicos de la transcripción que están unidos a potenciadores o silenciadores, que a su vez éstos están
unidos a los correguladores, que por este fenómeno de acercamiento físico de las secuencias de ADN que contienen los silenciadores y
potenciadores con los promotores. Los mediadores pueden mediar la interacción de los factores específicos de la transcripción con la ARN
polimerasa II. Algunas de esas interacciones van a favorecer, el inicio de la transcripción y otras interacciones no permitirán el inicio de
esta. Serán entonces los factores específicos que se unen a potenciadores los que produzcan que se inicie la transcripción y contrariamente
serán los factores que se unan a represores los que la inhiban. El mediador entonces la frecuencia con que la ARN polimerasa II inicia la
transcripción. Ciertas proteínas que tienen la capacidad de condensar la cromatina de manera local
Entonces los factores específicos de la transcripción se pueden unir o potenciadores o silenciadores. No pueden unirse a promotor, sino
que le se unen son los factores basales de la transcripción.

¿Que produce esta unión con el factor especifico de la transcripción?

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El factor especifico de la transcripción en primer lugar puede reclutar a ese sitio proteínas que participen en la remodelación de la
cromatina, o que sean modificadoras de histonas, el factor de transcripción interactúa con las proteínas y las atrae a ese punto de unos a
otros.

Pueden reclutar, por ejemplo, al complejo remodelador de la cromatina para que elimine de esa zona los nucleosomas o para que los
desplace permitiendo, ahora la unión de los factores basales de la transcripción y la ARN polimerasa II, también puede reclutar complejos
que modifican los extremos N terminales de las cromatinas, como una acetilasas de histonas, acetilando histonas y favoreciendo la
descondensación local y se posicionaran entonces los factores basales de la transcripción y la ARN polimerasa II.

Por lo cual el punto de inicio de todo este proceso es el posicionamiento de los factores específicos de la transcripción que van a dirigir la
modificación de la cromatina. También se puede pensar en el ejemplo en el que un factor especifico de la transcripción se une a un
represor, y que esas proteínas recluten complejos remodelares de la cromatina, uniendo los nucleosomas entre sí, o a proteínas
modificadores de histonas que remuevan los grupos acetilos y agreguen grupos metilos.

No hay un factor específico para cada uno de los 30 mil genes existentes en el genoma. No actúan de manera individual, sino que actúan de
manera combinatoria, actúan en conjunto, y es la combinación particular de cada conjunto lo que lo hace especifico. Una proteína
individual, un factor especifico de la transcripción puede ser común a varios conjuntos de iniciación de transcripción de un gen, pero el
conjunto se vuelve específico para cada gen.

Puede regular varios genes, pero con un número limitado de proteínas.

Existen genes que regulan a los factores específicos de la transcripción, llamados Genes Maestros. ¡¡¡¡¡Son ejemplos, en embriología los
genes HOX!!!!! Son genes que funcionan como factores de específicos de la transcripción.

Como conclusión: en la regulación de la expresión génica, los factores específicos de la transcripción tienen un rol fundamental, reclutando
la maquinaria de la transcripción por medio de mediadores, y correguladores, a su vez los factores de la transcripción pueden ser
regulados, y están activos o inactivos.

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Seminario 4 de biología celular por el Dr. Giusti

Regulación de la expresión génica II

Un fenómeno que surge de la regulación de la expresión génica es que haya diferentes tipos celulares que a pesar de compartir el mismo
genoma expresen distinto subconjuntos de genes

Otros niveles de la expresión génica

Los transcriptos que produce la ARN polimerasa II (transcriptos primarios) sufren una serie de cambios que son importantes para que el
transcripto adquiera sus características funcionales finales. Estos procesamientos son esenciales para que el ARN mensajero pueda ser
exportado del núcleo hacia el citosol y para que pueda ser correctamente traducido

Una vez en el citosol la vida media de los ARN esta finamente regulada. Eventualmente si un ARN mensajero es traducido, las proteínas
también están sujetas a una regulación respecto de su estabilidad y de su actividad

Procesamiento de ARNm eucariota

El transcripto primario producido por la ARN polimerasa va a sufrir modificaciones para permitir la funcionalidad. 3 pasos de
procesamiento:
1- Modificación en su extremo 5’ (capping). Ocurre apena 20 nucleótidos después de que la ARN polimerasa comienza a sintetizar el
transcripto. Se agrega en este extremo una 7 metilguanosina, se lo denomina cap.
Se une al ARN mensajero un conjunto de proteínas que tiene afinidad por el cap. (complejo de unión del cap.)
Función: evita que el ADN sea degradado por exonucleasas presentes en el exterior celular.
Segundo aspecto que permite la modificación cotranscripcional es el Trasporte del ADN a través de los poros nucleares
2- Modificación en su extremo 3’ (clivaje y poliadenilación). La enzima denominada poliA polimerasa, agrega 200 nucleótidos de
adenina al extremo del ARN mensajero (Cola poliA)
Función: regula fuertemente la estabilidad de los ARN mensajeros, esta estabilidad va a estar mediada por un conjunto de proteínas que
tienen una alta afinidad por la cola de poliA que se denominan poliA valid tropings.
La pérdida de la cola de poliA hace que en segundos el ADN sea degradado por nucleasas extracelulares
Estos procesamientos se dan al mismo tiempo que la ARN polimerasa está generando el transcripto primario (procesos cotranscripcionales)
3- Proceso de splicing o corte y empalme de exones.
Los genes eucariotas son discontinuos, las regiones que van a participar del fenómeno de la traducción se encuentran interrumpidas por
fragmentos de ADN que van a ser removidos por este proceso

Existen en el genoma ciertas secuencias consenso (conjunto de secuencias que tiene un alto grado de homología) que determinan los
límites de los intrones, estas van a ser reconocidas por la maquinaria enzimática que va a escindir a los intrones y va a empalmar luego a
los exones.

Hay 3 secuencias importantes que determinan que la región sea interpretada para este sistema enzimático como un intrón. Una de ellas se
encuentras en el extremo 5’ del intrón (GU). Segunda secuencia consenso, es interna al intrón y es una adenina particular. Tercera
secuencia se encuentra en el extremo 3’ del intrón.

Un error en un único par de bases haría por ejemplo que el transcripto maduro posea un corrimiento en el marco de lectura, o sea que
genere una proteína distinta probablemente no funcional respecto de la codificada originalmente.

Mecanismos del proceso de splicing

De la maquinaria participan grupos de ARN no codificantes llamados ARN pequeños nucleares (snArn). Tienen entre 100 y 200 pares de
bases. Suelen adoptar estructuras secundarias muy diversas, espontáneamente forman complementariedad de bases internas a una misma
hebra formando horquillas. En algunos casos los snARN pueden formar apareamiento de bases con otros snARN.
Estos funcionan acoplados a un conjunto de proteínas accesorias que van a generar ribonucleoproteína pequeñas nucleares.
SnaARN + proteínas accesorias = ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (snurnp)
Existen 5 snurps:
 Snurps u1
 Snurps u2
 Snurps U4

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 Snurps U5
 Snurps U6

La actividad catalítica enzimática es producida por el mismo ARN. Estos pueden reconocer por apareamiento de bases los nucleótidos de
las secuencias consenso que determinaban los límites de los intrones.

¿Cómo se produce este mecanismo?

Las snurps se unen a las secuencias consenso y forman un complejo de snurps conocido como el espliceosoma.
Las snurps pueden reconocerse entre sí debido a que los snARN pueden formar apareamiento de bases entre ellos.
Estos movimientos se van a caracterizar por dos reacciones de corte y formación de enlaces covalentes (transesterificación)
El primer corte que se produce es en el sitio 5’ que va a clivarse y va a unirse covalentemente a la adenina característica del punto de
ramificación formando una estructura en el intrón similar a un lazo.

La segunda, de las reacciones implica la ruptura de extremo 3’ y la unión covalente de los dos exones con precisión de un nucleótido.
De este modo como subproducto de la reacción del splicing queda en intrón en forma de lazo que rápidamente va a ser degradado por un
conjunto de exonucleasas específicas.

Complejo proteico denominado complejo de unión de exones:

se unen en el sitio donde fue producido el splicing. La precisión con la que se realiza el splicing no solo estará garantizada por los
apareamientos de los ARN pequeños con las secuencias consenso de los intrones, sino que otro elemento que favorece la precisión es este
fenómeno de splicing cotranscripcional, permite aumentar la capacidad codificante del genoma.

Procesamiento por splicing alternativo diferencial:

salteo de exones. Un exón va a estar presente como tal y va a estar ausente en otros tipos celulares. En esos otros tipos celulares la
maquinaria de splicing interpreto toda la secuencia como intrones y la removió.
Otra forma de splicing alternativo implica que los sitios consenso que se encontraban en el extremo 5’ y 3’ no sean utilizados, pero sean
utilizados sitios muy parecidos que se encuentren en la proximidad.

Los mecanismos que existen para explicar este proceso son un conjunto de proteínas que están presentes en distintos tipos celulares y
pueden interactuar con los sitios consenso y están diferencialmente expresadas. Hacen que los sitios consensos muy débiles que no
pueden reclutar proteínas por si mismos puedan luego de esa unión reclutarlas con mayor facilidad, en otras palabras, permitir que una
secuencia sea removida cuando en ausencia de esa proteína permanecería en el transcripto maduro. Esto puede explicar porque en un
determinado gen se produce un transcripto y en otro determinado gen un transcripto diferente.

Hay una secuencia de nucleótidos bastante larga presente entre el extremo 5’ y el codón de iniciación presente en los mensajeros, estos no
van a ser traducidos, se conoce como “extremo 5’ no traducido de los mensajeros”

Todos los nucleótidos presentes luego de codón stop, pero anteriores a la cola poliA presentes en el extremo 3’ tampoco se traducen
Ambos tienen un roll fundamental en regular la estabilidad de los mensajeros (no van a participar en la codificación de aminoácidos en las
proteínas) pero adquieren información regulatoria respecto de la vida media que van a adquirir los mensajeros.
Todos los ARN adoptan estructura secundaria y están asociados a un enorme número de proteínas que aseguran su estabilidad y su
exportación al citosol.

Traducción

Una vez en el citosol el ARN mensajero maduro va a interactuar con algunos complejos proteicos muy importantes para su destino que
son; los factores iniciadores de la traducción (EIF), que van a permitir el inicio de la traducción.
Una de estas proteínas va a interactuar directamente con el complejo de proteínas del Cap. (lo reemplazara), en tanto que el otro complejo
va a interactuar con las proteínas de unión a la cola de poliA, y además van a interactuar entre si generando una estructura cerrada sobre sí
misma.
Solo en esta configuración, donde los dos factores de inicio de la traducción se reconocen entre sí, el transcripto maduro puede comenzar a
ser reconocido por los ribosomas para iniciar la traducción.
Esto asegura que transcriptos que han sido correctamente exportados (que conserven sus 2 extremos) puedan ser correctamente
traducidos.
Esta traducción va a comenzar con el transcripto maduro cerrado sobre sí mismo siendo reconocido su extremo 5‘por la subunidad menor
de un ribosoma y va a moverse a lo largo del transcripto hasta llegar el primer codón de inicio de la traducción.

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Cada uno de los mensajeros configurados de esta manera pude ser traducido múltiples veces por los ribosomas generando en la célula
polirribosomas o polisomas. La estructura de estos puede ser evidenciada en imágenes de microscopia electrónica.
Un transcripto puede tener distintas estabilidades en distintos tipos celulares y por ende general distintas cantidades del producto.
Bajo ciertas convicciones las células pueden estabilizar ciertos mensajeros y mandar a degradación a otros. Tienen como característica
central ser muy rápidas gracias a estar reguladas por estos mecanismos de la expresión génica.
Usualmente esta regulación de la vida media está dada por secuencias que están presentes en el extremo 3’ no traducido de los
mensajeros, y esas secuencias pueden ser reconocidas por un conjunto de proteínas que pueden favorecer o desfavorecer la estabilidad de
dicho mensajero.

Otro mecanismo de la estabilidad de los mensajeros esta mediado por una familia distinta de ARN no codificantes (microARN) tienen
alrededor de 20 nucleótidos, están codificados por el genoma y son procesados para generar sus formas maduras, pero representan un
mecanismo de acción.

¿Cómo funcionan los microarn? (reguladores negativos)

Suelen unirse a un efector formado por proteínas y actúan guiando al complejo efector por complementariedad de bases a la secuencia de
un determinado mensajero, una vez que el complejo efector se posiciona sobre un transcripto en particular induce una represión de la
traducción, el desacople de los ribosomas y también induce la degradación del mensajero.
Estos microarn que pueden producir la regulación fina de estos transcriptos son transcriptos por la ARN polimerasa II. Sufren dos grandes
pasos de procesamiento hasta que adquieren su tamaño final y son ensamblados al citosol en el complejo de silenciamiento.

Mecanismo de control de calidad de los ARN: degradación del ARNm por secuencias de terminación prematuras (nnd)
Controlar que no haya habido algún error en el procesamiento que afecte la funcionalidad del producto final una mutación que genera un
codón STOP recibe el nombre de una mutación sin sentido, lo que va a verificar este mecanismo es que esté presente o no el codón stop,
aquellas proteínas que lo tengan van a ser activamente degradadas

Van a cumplir un roll importante los complejos proteicos de unión de exones, que indicaban los puntos de unión entre dos exones.
Como funciona: en la primera traducción de este complejo maduro (traducción pionera) los ribosomas van a interactuar por primera vez
con estos complejos y los van a modificar o remover. Cuando son removidos o modificados no disminuyen la estabilidad del mensajero.

¿qué pasa en la condición patológica?

Donde tenemos una mutación que hay generado además del codón de stop un codón stop prematuro.
El ribosoma una vez que llega al prematuro se va a desensamblar y va a dejar sin traducir el resto del ARNm y por lo tanto no va a remover
ni codificar los complejos de unión de exones posteriores al codón stop prematuro, estos reclutan endonucleasas que rápidamente
degradan el ARN. es decir que si luego de la traducción pionera no se modifican o remueven, eso va a ser la señal celular para determinar
que debe haber degradación.

¡¡¡NIVEL FINAL DE LA REGULACION DE LA EXPRESION GENICA!!!

El hecho de que exista producción de una proteína no es igual a que exista actividad, y la regulación de que fracción de esa proteína es
activa o no activa en un momento dado puede producirse en un rango temporal muy acotado.
La fosforilación es una modificación que puede cambiar la actividad de la célula en cuestión de segundos.

¿Cómo se produce la degradación de las proteínas?

Se produce a través de un sistema enzimático que se conoce como la vía ubiquitina proteosoma. La ubiquitina es un pequeño péptido que
se une covalentemente y conjuga a ciertos sustratos proteicos y constituirse en una marca celular de degradación. Las enzimas que
participan en el reconocimiento y el agregado de ubiquitinas al sustrato se conocen con el nombre de ubiquitín ligasas.
Esta degradación final se da en unos complejos proteicos denominados proteosomas que reconoce las proteínas poliubiquitinadas y las
degrada activamente

Transcriptos que producen la formación de los ARNt y ARNr

ARNt: están codificados en el genoma. Los transcriptos primarios son más largos en comparación con los transcriptos maduros que van a
ser funcionales. 4 pasos de procesamiento que ocurren en el nucléolo que implican:
 la remoción del clivaje por acción de ciertas enzimas en el extremo 5’.
 la escisión de una región intrónica cercana a la secuencia que luego va a funcionar como anticodón.

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 la remoción de ciertos nucleótidos en el extremo 3’.
 la modificación química de algunas bases.
Todos estos pasos están llevados a cabo por enzimas proteicas que están localizadas en el nucléolo (es una zona bioquímicamente
delimitada dentro del núcleo).

ARNr: los ribosomas están constituidos por una subunidad mayor (60s) y una menor (40s). Cada una de estas subunidades son enormes
ribonucleoproteínas.
La mayor compuesta por 3 ARNr de distinto tamaño (5s, 28s, 5.8s respectivamente) y por casi 50 proteínas
La pequeña: un único ARNr de 18s y poco más de 30 proteínas.
La actividad peptidiltransferasa esta llevada a cabo por un sector de ARNr

¿Cómo se producen los ARNr?

Son los más abundantes de todas las células por la enorme cantidad de ribosomas y son activamente transcriptos. Se transcriben a partir
de 2 precursores, el más grande 45s que en el nucléolo son modificadas químicamente alguna de sus bases, en tanto que otros fragmentos
de este precursor son clivados y degradados. Este precursor 45s se transcribe a partir de genes que son transcriptos por la ARN polimerasa
I. Esto es llevado a cabo por un conjunto de ribonucleoproteínas, que están formadas por un péptido asociado a ARN pequeños
nucleolares, y por lo tanto son ribonucleoproteínas pequeñas nucleares.

Función: modificar químicamente algunas secuencias del precursor y favorecer en algunos casos el corte de secuencias que no van a estar
representadas en las formas maduras. Se producen cambios químicos que permiten que esto adopten una forma tridimensional necesaria
para que ejerzan su función correctamente en el interior del ribosoma.

El otro precursor, mucho más pequeño codifica directamente para el ARN 5s.
Entonces de los 4 ARNr, 3 derivan del precursor 45s transcriptos por la ARN polimerasa I, y el 4to deriva de un único transcripto de la ARN
polimerasa III.

Un mecanismo que ha permitido compensar el enorme trabajo de las células se ha dado por un fenómeno de amplificación génica en
donde los genes que codifican para los ARNr se han multiplicado dentro de nuestro genoma generando múltiples copias de los mismos.
Tienen una localización particular, en los brazos pequeños de los cromosomas acrocéntricos, cuando la cromatina se encuentra
descondensada todas estas zonas que poseen las copias interactúan entre sí y se localizan en una misma región nuclear (el nucléolo).
Podemos pensar al nucléolo como una estructura que tiene una alta actividad bioquímica de procesamiento de ARN y de generación de
ribonucleoproteínas

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Seminario de biología n°5 de Giusti

Técnicas

Las técnicas permites saltos conceptuales, ya que permite a las ciencias biológicas, desarrolle metodologías nuevas y permite nuevos
métodos de medicina, y de investigación.

 Técnica de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia pensada como una única técnica por sus fundamentos,
 la técnica de fraccionamiento subcelular,
 la técnica de western-blot y
 la técnica RT-QPCR que es PCR cuantitativa con retro transcripción.

Objetivo de las técnicas:

 Cuantificar la expresión de proteínas o ARN
 Niveles de expresión en diferentes tejidos
 Determinación su localización
 Si se expresan homogéneamente o no

Para entender esta técnica vamos a hacer algunos pasos previos dado que, necesitamos comprender para entender el fundamento de
estas técnicas como se utilizan los anticuerpos como herramientas de investigación.
Estos anticuerpos también llamados, inmunoglobulinas son proteínas producidas específicamente por un subgrupo de células del sistema
inmune, que participan en un proceso inmunitario conocido como, inmunidad tumoral, inmunidad mediada por anticuerpos o respuesta
inmunitaria adaptativa.

En esta respuesta inmune un grupo de células del sistema inmune los linfocitos B, poseen en su membrana proteínas denominadas
inmunoglobulinas o anticuerpos. Que pueden unirse de manera específica a ciertas macromoléculas que, pueden estar presentes en
bacterias o toxinas, derivadas de bacterias y, este reconocimiento especifico se produce porque nuestro sistema inmune a lo largo de su
maduración ontogenética genera millones de clones diferentes de linfocitos B que, difieren los unos de los otros levemente en cuál es el
motivo que reconocen la superficie molecular de sus anticuerpos de superficie y en función a esa maduración prácticamente cualquier
macromolécula exógena que ingrese a nuestro organismo será reconocida por un subgrupo particular de linfocitos B que tenga anticuerpos
que puedan unirse específicamente a esa macromolécula extraña que ingreso.

El proceso por el cual se crea esta enorme diversidad de clones depende de un proceso genético denominado recombinación somática
Pero lo que nos interesa aquí es que una vez que un linfocito B ha reconocido a una proteína exógena por ejemplo, que forma parte de la
pared bacteriana de un patógeno, se diferencia y comienza a proliferar y a producir plasmocitos que no son otra cosa que una
diferenciación de linfocitos B especializados en secretar hacia el plasma aquellas moléculas del anticuerpo que antes solo estaban
localizadas en su membrana y estos anticuerpos ahora solubles cuando reconocen a los patógenos facilitan su eliminación por otras células
del sistema inmune.
Los anticuerpos o inmunoglobulinas, al tener esta capacidad de reconocer antígenos pueden ser utilizados como una herramienta de
investigación, de nuestro interés clínico

¿Como genero un anticuerpo para estudiar una proteína?

Los anticuerpos o inmunoglobulinas están compuestos por 4 cadenas polipeptídicas,

2 cadenas pesadas, internas
2 cadenas livianas, externas

Nota: ambas se componen de regiones C-terminales constantes y de regiones N-terminales variables.

Todos los anticuerpos producidos por un individuo son exactamente idénticos en la región inferior, donde están solo las 2 cadenas largas o
pesadas, y a esa región se la denomina fracción cristalizable o región FC de la inmunoglobulina.
La región que es variable de un clon de linfocito B a otro y que permite este reconocimiento especifico, se halla en los otros extremos de la
molécula. En aquellos extremos que están compuestos por el extremo que N-terminal de la cadena pesada y de la cadena liviana, esta
región denominada Región variable es la región que va a permitir el reconocimiento de esa proteína exógeno que, denominaremos
antígeno, algo es un antígeno cuando tiene la propiedad de antígeno cuando puede ser reconocido por un anticuerpo.

La forma de una inmunoglobulina, se la representa como una Y. Los 2 extremos entonces, es el lugar donde reconoce a los antígenos

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Volvamos a nuestra pregunta: “Como es posible generar anticuerpos que reconozcan específicamente a una proteína?”

El proceso de generación de anticuerpos involucra utilizar el sistema inmune mamíferos que produzcan anticuerpos una vez que
inyectamos a ese animal con la proteína contra la cual queremos producir ese anticuerpo, tradicionalmente se usaban conejos y ratones,
también aves y gallinas.
Se inyecta una proteína que queremos estudiar, entonces reconocerá el sistema inmune a esa proteína de modo que habrá algunos clones
de linfocitos B espontáneamente en el sistema inmune del animal que reconocerán específicamente a la proteína de interés y comenzaran
a proliferar y a generar una diversidad de anticuerpos que permitan reconocer distintos motivos estructurales que están presentes en la
proteína de interés que luego van ser purificados a partir del plasma de este animal y generar un plasma rico en esos anticuerpos que
reconocen a esas proteínas de interés.

Aspectos importantes:
No es solo un clon que reconocen a la proteína de interés
Esa proteína de interés contenga distintos sitios estructurales, cada uno de ellos pueden ser reconocidos por distintos clones de linfocitos
B.

Hemos mencionado que no hay probablemente un único clon de linfocitos B que posea anticuerpos que reconozcan a la proteína que
nosotros hemos inyectado sino que esa proteína de interés probablemente tenga distintos sitios estructurales cada uno de ellos
reconocido por distintos linfocitos B y esta particularidad de que una proteína tenga distintas superficies que puedan sr reconocidas por
distintos clones de linfocitos B y por ende generarse una diversidad de anticuerpos que reconozcan distintos sectores de esta proteína
denominamos a estos anticuerpos que hemos purificado como ANTICUERPOS POLICLONALES porque provienen originalmente de distintos
clones de linfocitos B, cada uno de ellos reconociendo una superficie diferente de la misma proteína.

A cada una de las superficies diferentes de la proteína que fue reconocida por un anticuerpo la denominamos EPITOPES. Una proteína
tendrá distintos epítopos que pueden ser reconocidos por distintos clones de linfocitos B de determinado animal y si yo utilizo este método
de producción tendré una solución de anticuerpos policlonales, todos reconocen la misma proteína, pero distintos motivos estructurales
de la misma proteína.

Sin embargo, también es posible generar anticuerpos que sean monoclonales es decir que reconozcan un único epítope de la proteína de
interés y la generación de anticuerpos policlonales.

Desde el punto de vista técnico es más costoso porque involucra en un primer paso aislar un único clon de linfocitos B de un animal que fue
inmunizado con la proteína de interés y una vez que uno aísla ese único clon debe hacer que ese clon se multiplique para generar ese único
tipo de anticuerpos producido por ese clon y esto es dificultoso desde el punto de vista técnico porque las células diferenciadas
productoras de anticuerpos, los plasmocitos, suelen tener un número limitado de divisiones celulares antes de entrar en apoptosis, es
decir, si yo aíslo un clon de linfocitos B y simplemente lo dejo en condiciones de cultivo para que produzca anticuerpos producirá, una
pequeña cantidad antes de que todas las células mueran en el cultivo y la técnica que permitió dar un salto y generar anticuerpos
monoclonales se desarrolló a fines de los años 70.

Dado que faltaban células productoras de anticuerpos, le faltaba un potencial mitótico, se diseñó un experimento para fusionar a las
células productoras de anticuerpos con células tumorales, con células que tienen una capacidad ilimitada de reproducción debido a las
mutaciones que poseen en los genes que regulan el ciclo celular y la fusión experimental de células tumorales y células formadoras de
anticuerpos genera lo que conocemos como HIBRIDOMAS. Es un hibrido celular producto de la fusión de una célula tumoral y de una célula
productora de anticuerpos.

Los hibridomas heredan de las células productoras de anticuerpos esta capacidad para generar anticuerpos específicos y heredan de las
células tumorales su amplio potencial mitótico de modo tal que uno puede conservar a los hibridomas en condiciones de cultivo por
tiempos muy extensos y, cosechar cada tanto del sobrenadante del medio de cultivo los anticuerpos que están siendo generados que serán
anticuerpos, que reconocen un único epítope de la superficie proteica. Este proceso de formación de anticuerpos monoclonales tuvo un
impacto gigantesco en la clínica y en la investigación por las enormes adscripciones que hoy le damos a los anticuerpos.
Los que desarrollaron esta técnica, y entre ellos estaba un argentino que recibió el premio Nobel, Milstein.
Hoy en día, no hace falta generar cada anticuerpo, sino que existen compañías que venden estos anticuerpos de las diferentes proteínas
que uno quiera investigar. Se consiguen anticuerpo tanto monoclonales como policlonales.

Técnica de inmunohistoquímica e inmunofluorescencia

Esta técnica utiliza anticuerpo, y toda técnica que tenga el prefijo Inmuno, utilizara anticuerpos.

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Se usa para determinar la localización de determinadas proteínas en un tejido o en una fracción subcelular. y pueden aplicarse dos
variantes:
 la inmunofluorescencia o inmunohistoquímica directa
 la inmunofluorescencia o inmunohistoquímica indirecta
La técnica más aplicada y la más frecuente la inmunofluorescencia indirecta.

El fundamento:
utilizar anticuerpos que reconozcan una proteína de interés, pero para hacer observable ese reconocimiento para poder identificar en qué
lugar del tejido o en qué lugar de esa célula, se ha unido el anticuerpo se le une a la fracción cristalizable del anticuerpo, moléculas de
fluoroforos, es decir, moléculas que al ser iluminadas con una determinada longitud de onda pueden emitir fluorescencia. De modo tal
que, si uno observa con un microscopio de fluorescencia a los cortes histológicos a las células de cultivo sobre las cuales se aplicó el
anticuerpo podrá ver puntos de señales fluorescentes en aquellos lugares en donde el anticuerpo están unido a mi proteína de interés.
Cuando utilizo fluoroforo, la técnica se llama inmunofluorescencia.

Si en la fracción cristalizable en vez de fluoroforos colocamos una enzima capaz de generar un producto coloreado cuando nosotros le
agregamos el sustrato esa variante en la técnica la denominamos Inmunohistoquímica, es decir, la detección estará dada porque unimos al
anticuerpo un fluoroforo, o porque agregamos una enzima capaz de generar un producto coloreado una vez que agregamos el sustrato
La inmunohistoquímica/ inmunofluorescencia directa

El fluoroforo estará directamente unida a la Fracción Cristalizable del anticuerpo que reconoce la proteína de interés. A ese anticuerpo lo
llamamos, Anticuerpo Primario y es aquel que reconoce a la proteína de interés.

La inmunohistoquímica/ inmunofluorescencia Cuando aplicamos la técnica indirecta utilizamos dos clases de anticuerpos:
 Un anticuerpo primario
 Un anticuerpo secundario

El anticuerpo primario, que reconoce nuestra proteína de interés, el anticuerpo primario. Pero en este caso ese anticuerpo primario no
tiene en sí mismo conjugado ni el fluoroforo ni la enzima.
Sino que, utilizaremos un segundo tipo de anticuerpo denominado, anticuerpo secundario que reconoce la fracción cristalizable del
anticuerpo primario que, como son anticuerpos producidos por la misma especie estos anticuerpos secundarios son simplemente
anticuerpos específicos de la especie que reconocen esa fracción.

Es decir, habrá anticuerpos secundarios que reconozcan la fracción cristalizable de anticuerpos primarios producidos en ratones, habrá
otros anticuerpos secundarios que reconozcan la fracción cristalizable de anticuerpos producidos en conejos, etc.
En esta configuración es el anticuerpo secundario quien tiene unidas de manera directa tanto los fluoroforos como las enzimas que
producen el producto coloreado y, la diferencia fundamentalmente es que, a un único anticuerpo primario se unen varios anticuerpos
secundarios y esto, implicara que, por cada proteína de interés, tendré asociados muchos más fluoroforos que en el caso de la
fluorescencia directa. Por cada proteína de interés hay más fluoroforos.

Los anticuerpos secundarios son policlonales, ya que se adhieren a diferentes partes de la Fc del anticuerpo primario.
Nos da mayor sensibilidad, por eso se usa con mucha más frecuencia.

Descripción de una imagen: imagen de una célula, que tiene 2 anticuerpos que reconocen 2 antígenos diferentes de interés; una era la
actina, proteína principal del citoesqueleto, y otro para el citocromo oxidasa 4, proteína que forma parte de la cadena de transporte de
electrones mitocondrial, de localización de las mitocondrias. Se pueden combinar distintos colores para detectar en simultaneo 2 antígenos
de interés. Si el anticuerpo que se une a la actina fue hecho en ratón, el anticuerpo secundario, reconocerá la Fc de ratón y tendrá unido un
fluoroforo rojo, que emita con fluorescencia color rojo. Si en cambio, al antígeno primario que se une al citocromo, fue hecho en conejo, el
anticuerpo secundario se unirá a la Fc contra conejo, unido con un fluoroforo de color verde. Podre así, distinguir la localización de la actina
que forma el citoesqueleto, y también donde están posicionadas las mitocondrias, utilizando a la enzima como un marcador. Si se quiere
visualizar al núcleo de una célula, se utiliza un producto diferente, se usa un colorante DAPI, que se intercala en la bases del ADN y emite
fluorescencia de color azul.

En biopsias de tumores se utilizan técnicas de inmunohistoquímicas, que nos hablan de la agresividad de ese tumor, caracterizado por el
potencial mitótico, es importante saber cuántas células son mitóticamente activas. Cuantas mayor sea el número de células mitóticamente
activas, mayor será la agresividad de ese tumor. Esto determina el pronóstico del paciente y así redirigir la terapia oncológica, por ejemplo.
Inmunohistoquímica
Como se usa para determina la expresión de una determinada proteína de interés en un subconjunto de células en un tejido.
La proteína de interés es, en este ejemplo, Ki-67 que es un proteína que esta expresada en la fase S del ciclo celular exclusivamente.

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Aquellas que sean visualizadas, significara que se encuentra en la fase S, y que son mitóticamente activas, o sea que van a dividirse.
Descripción de una imagen: aquí estamos viendo el tejido, cada pequeño sector es una célula y se ven miles de células en este tejido. Hay
algunas de las células con una coloración pálida, es decir un violeta claro, y otras de color marrón oscuro casi negro. Las células de
coloración marrón son las que son positivas para la proteína de interés. Los de color violeta, tienen una coloración de que tiñen sus
núcleos.

¿Cuál es la diferencia que podemos observar entre la inmunohistoquímica y la inmunofluorescencia?

Es que el anticuerpo secundario que se une al anticuerpo primario, que a su vez reconoce Ki-67 no está asociado a un fluoroforo, sino a una
enzima que, al colocar un sustrato incoloro, que produce un producto coloreado que precipita en el interior de las células. Entonces este
color marrón que tiene la célula se debe a la precipitación del producto de reacción de la enzima del anticuerpo secundario.

¿Como determinarían el índice mitótico de una biopsia de un tumor?

Por ejemplo, contando la cantidad de células de color marrón.

¿Y si tomamos una muestra más grande?

Podría por cantidad de células coloreadas/ células totales. También podría ser células coloreadas/una superficie dada.

Fraccionamiento subcelular

Esta técnica permite purificar/aislar distintos componentes celulares y tenerlos en tubos distintos para poder analizarlos.
Fueron desarrollaron entre los años ´40- ´50, y permitieron un gran avance en la biología celular.

Esta técnica se usa en el contexto de la investigación y en caso muy particulares en el contexto clínico.
Si uno toma una muestra de tejido, y realiza una ruptura mecánica, como por ejemplo con unas cuchillas que giran a altísima velocidad en
una centrifuga, una especie de minipimer en miniatura, uno puede generar una solución, una suspensión de ese tejido en un medio
isotónico. En esa suspensión, se generará una suspensión llamada Homogenato. Tendríamos componente de diferentes tamaños, núcleo,
mitocondrias, ribosomas, el sector soluble: el citosol, y un tipo de partícula, llamada microsoma, no es una organela propia de la célula,
derivan de pequeñas vesículas del retículo endoplásmico y del aparato del Golgi. Al romperse mecánicamente estas organelas se forman
pequeñas vesículas.

Esta técnica también puede utilizar otros métodos de ruptura mecánica, como por ejemplo sonidación, compresión, pero todos obtendrán
un homogenato en una solución isotónica.
La estrategia de la técnica esta, en la centrifugación ya que va a permitir que precipiten la fondo del tubo, cosa que no ocurre de manera
espontánea. Al aplicar la centrifugación, le permite por medio de la aceleración, es que aumente la fuerza gravitatoria. Cuanto mayor es la
densidad más fácil caerá al aplicar la fuerza gravitatoria.

Entonces se realizará una serie de centrifugaciones cada vez más veloces y por cada vez más tiempo, para que vaya secuencialmente
depositándose en el fondo del tubo, los distintos componentes presentes en la célula. En las primeras centrifugaciones precipitara los
elementos mayor tamaño y más densos, y en las centrifugaciones siguientes, precipitaran los que tengan menor tamaño y menor densidad.
En cada una de estas centrifugaciones, uno obtiene 2 partes del homogenato:
 Aquellos elementos que precipitaron, llamado pelet
 Y la suspensión, llamado sobrenadante.

Uno parte de centrifugaciones relativamente bajas. A mil veces por 10minutos. Y obtengo un pelet, que analizare después y con un
sobrenadante. Separo el sobrenadante con una pipeta a otro tubo y lo vuelvo a someter a una nueva centrifugación y otra vez tendré un
pelet con un sobrenadante.
Este es el orden en que voy obteniendo los diferentes elementos celulares por medio de centrifugaciones, cada vez a mayor velocidad y
por mayor tiempo.
 Núcleo
 Mitocondrias (peroxisomas y lisosomas, menos frecuentes)
 Microsomas (Retículo endoplásmico, Golgi, Membrana plasmática)
 Ribosomas
 Citosol

¿Como se evalúa la efectividad del procedimiento de enriquecimiento/pureza de las fracciones subcelulares?

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Se elige una enzima especifica que conozca y que tenga una localización subcelular particular, por ejemplo, la citocromo oxidasa 4 era
especifica de las mitocondrias. Si agrego producto de esta enzima en las diferentes fracciones solo debería actuar en la fracción
mitocondrial, dando un producto coloreado, si es que ha funcionado de manera correcta la centrifugación.

La determinación de una enzima puede ser, o bien por aparición de producto, o bien por desaparición de sustratos.
Estas determinaciones se hacen para ver si no hay contaminación y si el fraccionamiento subcelular fue realizado correctamente, por
ejemplo, si hago la prueba de la enzima citocromo oxidasa con el pelet nuclear y observo una reacción, diré que hay contaminación de
mitocondrias y por ende no fue realizado correctamente.

También pueden observarse estos pelet, en microscopia electrónica y determinar cuáles son las partículas que estaban presentes.
Descripción de una imagen: Pelet microsomal: ¿notan que hay vesículas que contienen gránulos en la membrana? Son las vesículas que
corresponden al REG, y esos gránulos serán los ribosomas que están presentes y las que no poseen esos gránulos, serán seguramente los
que provienen del REL.

Aplicación experimental: por ejemplo, si uno está estudiando una enfermedad de una disfuncionalidad mitocondrial, uno podría partir de
fracciones subcelulares y determina como esa funcionalidad.

Western blot o inmunoblot

Otra técnica que utilizara anticuerpos para determinar la presencia o los niveles de expresión de una proteína particular con un anticuerpo
especifico. Sin embargo, esta técnica tiene otros elementos.

1ra etapa: todas las proteínas van a ser separadas de acuerdo con su tamaño. Y eso se logra realizando una electroforesis en gel.
Electroforesis en gel: utiliza la presencia de un campo eléctrico para permitir la migración de ciertas moléculas, implica que las única que
podrá migrar serán aquellas que tengan una carga electica neta. Osea las que tengan cargas o bien positivas migrando hacia el polo
negativo o bien negativas migrando al polo positivo, aquellas que tengan carga neutra no podrá migrar.
Lo que primero se hace es tratar a la muestra biológica con un detergente carga eléctrica negativa, llamado SDS, pude unirse a todas las
cadenas polipeptídicas. Tratando a una muestra biológica, como un homogenato o alguna fracción subcelular, con SDS hará que todas sus
proteínas se desnaturalicen, pierdan su estructura terciaria y queden recubiertas con las moléculas de SDS, es decir que queden rodeadas
de cargas negativas. Y esto las hará apropiadas para que puedan migran hacia el polo positivo.
La migración se da en un soporte, un gel de poliacrilamida. Los geles mirados en un microscopio y están formados por una enorme
cantidad de fibras, parecido a una red de telaraña y esas redes son los componentes de ese gel. Esto implica las moléculas que van a
migran en el gel, deben atravesar pequeños poros formados por estas tramas formadas por el gel, y esto le impondrá una dificultad mayor
para migrar, por esa red porosa, a las moléculas que sean más grandes porque chocarán más veces con los filamentos del gel, en tanto que
las moléculas más pequeñas tendrán facilitada el pasaje y podrán migrar en determinado tiempo una mayor distancia en el gel. Por ende,
las moléculas más pequeñas migran más rápido, en un determinado tiempo que las de mayor tamaño.

2da etapa: no trabajar las moléculas en el gel, ya que el gel es muy frágil.
Se transfiere, en ese orden, a una membrana más resistente. Esto es lo que le da el nombre de “Blot”, que en ingles significa transferir.
Determinar la presencia o ausencia de la proteína de interés, incubando a esa membrana con anticuerpos específicos que permitan unirse
a mi proteína de interés.
Utilizando la técnica indirecta, un Anticuerpo 1rio que se una a la proteína de interés y después de lavados para remover los anticuerpos en
excesos y quedando pegado el anticuerpo a la proteína de interés. Se le agrega el anticuerpo 2rio pegado con una enzima y agregando un
sustrato, de o un producto coloreado, que es lo más frecuente, o una luz y esto se detecta con una cámara o placas fotográficas.

Ejemplos 1: cual es la localización subcelular de la enzima aromatasa?

Uno puede partir de un ovario, de un animal de experimentación, y realiza un fraccionamiento subcelular, donde uno obtiene el
homogenato y a partir de centrifugaciones diferenciales las diferentes fracciones subcelulares. Pero me reserve para de ese homogenato,
no lo use todo en las diferentes fracciones.

¿Como determinamos donde se encuentra? ¿Se puede hacer un Western blot de cada una de estas fracciones? Imaginemos que si lo
realizamos.

Resultado: las bandas que aparecen se deben a un marcador de peso molecular

1er calle: el homogenato, se encuentra marca en el homogenato, ya que es el tejido completo. Se deduce que la aromatasa está presente.
O sea, el tejido ovárico está presente la enzima, si no estuviera presente, entonces tendría que buscar otro tejido que si expresara la
aromatasa.
2da calle: la fracción citosólica, no hay señal. Significa que no está la aromatasa no es una enzima soluble del citosol.

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3er calle: la fracción microsomal, una gran señal, pero es de mayor intensidad que el homogenato. Se debe a que está más concentrado en
la fracción microsomal. Al tomar la misma cantidad de muestra. La aromatasa se encuentra en el REL.
También podemos saber su PM, alrededor de 50 kDa. Puede haber distintas aromatasas de distintos pesos moleculares.

Ejemplo 2: biopsias de 4 tumores de mama de diferentes pacientes.

Se quiere determinar si está presente una proteína de membrana la E-cadherina, es una proteína que permite la unión célula-célula y la
“E”, es porque se expresan específicamente en tejido epitelial.

¿Por qué es importante en biopsias de tumores, la presencia de marcadores de E-cadherinas? Porque es un indicio de la agresividad del
tumor. Y tienen la capacidad de hacer metástasis cuando pierden la expresión de E-cadherinas, ya que les permite perder la adhesión, las
células tumorales de las células circundantes y poder infiltrarse en los vasos sanguíneos. La pérdida de la expresión de la E-cadherina, es un
mal pronóstico, o de un mayor pronóstico de realizar metástasis.

Para cuantificar la cantidad de expresión de esa proteína, se usa esta técnica de Western Blot. Se realiza entonces un fraccionamiento
subcelular, obteniendo un homogenato y corriendo esos homogenatos.
Resultados:
Calle A:
Calle B:
Calle C:
Calle D: hay ausencia de la expresión de la proteína. Tiene mayor proporción de realizar metástasis.

Comparando la intensidad de las diferentes calles y teniendo en cuenta que, a cuanta mayor intensidad, menos probabilidad de realizar
metástasis, eso implicará que la ausencia de la expresión tendrá más probabilidades de realizar metástasis.
Entonces, en la calle D que hay ausencia seria el peor caso, le sigue el C, con una clara disminución de la intensidad de la marca.
La intensidad de la marca supone que se extrajo de una misma “cantidad” de tumor, y lo que da una mayor intensidad de marca no es en
realidad que el tumor era más grande. Sino que se parte en los 4 casos con un tumor del mismo tamaño

Se puede realizar 2 tipos de controles para saber si se parte de la misma cantidad de muestra: uno es haciendo una cuantificación de una
proteína, por un medio analítico y realizar luego el western blot. Otro es realizar un western blot de una proteína estructura, por ejemplo,
de la proteína actina, y luego realizar el western blot de la proteína de interés.

Una limitación de las técnicas vistas se debe a que no tengamos buenos anticuerpos que reconozco la proteínas de interés, no siempre
tenemos un anticuerpo que sea especifico y sensible para la proteína que estamos estudiando. Un anticuerpo puede reconocer un epítope
de la proteína de interés, pero puede ser común a otras proteínas, por lo que no será tan especifico. Pero también puede ser que un
anticuerpo que sea especifico a una proteína, pero al ser revelado de no de una marca, por lo que no será sensible a la proteína de interés.

RT-qPCR: PCR cuantitativa con retrotranscripción.

Es la única técnica que permite cuantificar moléculas de ARN. Se puede cuantificar transcriptos virales por medio esta técnica, como carga
viral del HIV, o cuantificar la cantidad de una proteína que se exprese más o menos en comparación con una célula hepática o una célula
nerviosa.
Con la técnica de PCR permitía amplificar múltiples copias de ADN. Se usa una ADN pol Taq (termoestable, solo puede polimerizar ADN)
Pero esta técnica mide la cantidad de ARN, entonces debemos realizar un paso previo.

Etapa 1: retrotranscripción.
Se realiza este paso, ya que la ADN pol no puede polimerizar ARN.
Se extrae todo el ARN total, se incuba una enzima retrotranscriptasas, que usan ARN como molde para generar ADN. Son
retrotranscriptasas a partir de virus.
El ADN que se obtiene es C-ADN; ADN complementario porque puede ser complementario al ARN original. Es una copia de ADN doble
cadena de un transcripto, como por ejemplo de un ARNm. Difieren en que en el sitio que había un Uracilo, habrá ahora una Timina.

Etapa 2: PCR cuantitativa

Solo amplifica el ADN complementario, que refleja al transcripto de interés que yo quería analizar.
De manera análoga al PCR, donde a pesar de tener todo el ADN solo amplificaba una secuencia específica, aquí analizaremos los
transcriptos primarios que sean de nuestro interés, seleccionando cuales son los primers que van a utilizarse en esta técnica. De acuerdo
con el diseño de los primers, si logro diseñar los primers de modo tal que tengan complementariedad de secuencias del transcripto que

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estoy buscando, solo amplificare de todos los transcripto, solo aquellos que sean del transcripto de interés. El diseño de los primers es lo
que le da la especificidad a la técnica.
Entonces se realiza una amplificación de estos ADN complementarios o transcriptos. Entonces las ADN polimerasas los pueden usar como
molde.
Esta reacción que ocurre en un tubo dentro de un termociclador, con las diferentes variaciones de temperaturas que permite amplificar al
transcrito de interés.
Se le agrega un colorante, suele ser Silver Green, que constituye moléculas que al unirse a ADN doble cadena va a emitir fluorescencia. Se
usa para ver el proceso de amplificación. A diferencia de la PCR que se cuantifica en el último estadio, esta técnica permite ir cuantificar la
amplificación en simultaneo que se va ocurriendo.
Se realiza con un termociclador, asociado con un detector de fluorescencia en cada tubo. Y generar diferentes tipos de lectura, que nos
muestre la fluorescencia en cada uno de los tubos.

Descripción de una imagen: ejemplo de axisas. Donde X es nro. de ciclos, es decir, en función del tiempo, y donde Y es fluorescencia de cada
tubos.
Tubo 1: línea horizontal, no hay producto de amplificación
Tubo 2: a partir de cierto momento hay un aumento de la fluorescencia, hay producto de amplificación.
Si yo parto de una cantidad mayor de producto, esperare que la ampliación se produzca en ciclos más tempranos. Del mismo modo, si parto
de una menor cantidad, la amplificación se dar en ciclo más tardíos.
Por eso esta técnica se utiliza para la detección de cargas virales, como es el caso de HIV, donde podremos ver que, si el tratamiento está
funcionando, teniendo en cuenta este tipo de cuantificaciones, si hay una disminución o aumento de la carga viral del paciente.

Técnicas destinadas a estudiar la función de las proteínas

¿Como es posible caracterizar, de forma experimental, cual es la función de una proteína?

2 estrategias complementarias:

Una estrategia es, aumentar la expresión génica de la proteína en una célula para observar cual es la consecuencia y así dilucidar cual es la
función de esa proteína. A esto se lo llama, estrategia de ganancia de función. La sobreexpresión es un ejemplo de ganancia de función.
Esto permite ver cuál es la mutación de una cierta proteínas. También se puede observar la expresión de proteínas que no eran común de
una célula, o también de proteínas que eran de otras especies. La sobreexpresión a veces conduce a un fenotipo diferente, o a una
localización que no tenía en un principio.
Por eso se deben realizar, de manera experimental, otra estrategia complementaria de disminución o anulación de la expresión de una
determinada proteína y observa que le ocurre a esa célula. Estos son experimentos de perdida de función.
Si queremos saber cuál es la función de una proteína debemos de realizar ambos experimentos en simultaneo, los de ganancia de función y
los de perdida de función. El más importante es el de perdida de función, ya que no se corre el riesgo de que genere fenotipos diferentes.

Tecnologías de ADN recombinante

Permiten de manera artificial, sintética, in vitro, combinar distintos segmentos de ADN y generar así una secuencia pseudoartificial y que
puede introducirse luego en la célula. Estas secuencias, artificiales, están hechas de un corte y pegue, de distintas secuencias conocidas
derivadas de las células. de este modo se puede, in vitro en un laboratorio, unir un segmento de ADN que contenga secuencia de un
promotor y luego introducir la secuencia de aquel gen que queremos que se exprese de un determinado tipo celular.
Hoy en día, se conocen, gracias a técnicas de secuenciación del genoma, las secuencias codificantes de un enorme número de proteínas y
se encuentran publicadas en una base de datos de manera pública y podemos acceder a las secuencias de una enorme mayoría de las
secuencias de proteínas de los seres humanos, y podríamos, conociendo esa secuencia, diseñar, sintetizar artificialmente, in vitro esa
secuencia de ADN y ponerla por debajo de una secuencia promotor, que será reconocido por la maquinaria transcripcional de las células
eucariotas.

Si pudiéramos lograr incorpora esta secuencia génica dentro de la célula, la maquinaria endógena de la célula, de transcripción y
traducción, permitirá generar transcribir esta secuencia y luego traducirla, conduciendo a la sobreexpresión de esta proteína que
introdujimos.
Hay promotores más fuertes y otros más débiles, es decir, que reclutan más fácil o menos fácil la maquinaria de transcripción basal. Si uno
parte de un promotor fuerte, como el citomegalovirus, tendrá niveles de expresión mucho mayores y se utiliza un promotor que tiene
menor capacidad de reclutar la maquinaria de transcripción. Esta capacidad de diseñar una secuencia de ADN que luego será introducida
en la célula, por ende, se podrá producir un producto génico.

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Se puede utilizar, de manera terapéutica, para los casos de ciertas enfermedades donde está ausente un producto génico, por ejemplo,
provocada por muchas enfermedades genéticas que tienen perdida de función de un terminado gen. Es el principio teórico para terapias
génicas.

El gen de interés que colocamos, de manera artificial, no es exactamente igual, tal cual se encuentra codificado en el genoma, ya que
normalmente posee secuencias exónicas, que forman parte del transcripto maduro y secuencias intrónicas, que son removidos por el
proceso de splicing.

Las técnicas que usan ADN recombinante no usan la secuencia genómica de exones e intrones, sino una secuencia de ADN
complementario, es decir, solo la función de los exones y esto aumenta la velocidad con que las células puede producir el producto final, ya
que no es necesario que esa secuencia sufre el proceso de splicing. Esto permite aumentar los niveles de expresión de una determinada
proteína cuando esa secuencia logra introducirse en las células.

¿Como será el abordaje experimental para elaborar los experimentos de perdida de función, para disminuir la expresión de una
determinada proteína?

Las secuencias que se usan por medio del ADN recombinante tienen las siguientes características.
Una técnica está basada en el mecanismo de ARN de interferencia (ARNi).

Para entender en que se basa esta estrategia, hay que pensar en el mecanismo que utilizan de los micro ARN para regular la expresión
génica. Estos son pequeños fragmentos de ARN y que son complementarios a una porción de ARNm que regulaba. Los miARN reclutan una
maquinaria endógena de proteínas endocrinas, que tienen como efecto silenciar/disminuir la frecuencia de traducción e inducir la
degradación de aquel ARNm al cual se une el miARN, que lleva, que guía el complejo efector. Los miARN actúan por complementariedad de
bases como una guía que traslada, que permite la localización de este complejo efector a una familia de ARN particular, que van a ser
reculado por este miARN.

Esa maquinaria endógena que usa el ARN pequeño es la que usa esta estrategia, dado que se puede diseñar una secuencia artificial de ADN
que, bajo un promotor determinado, coloque una secuencia de ARNi artificial, que diseñaremos para que tenga una secuencias más, para
que regule aquel ARNm que es el objetivo de nuestra investigación. Como conocemos la secuencia de los ARNm podemos diseñar cual será
la secuencia de ARN pequeño, que sea complementario al ARNm que queremos regular. Y una vez que ese ARN pequeño se ha expresado
en la célula reclutara la maquinaria endógena que utilizan los miARN para producir esta regulación.

Se basa entonces en el mecanismo que utilizan los miARN. Pero la estrategia la llamamos, Técnica de ARN de interferencia, dado que los
ARN pequeños interfieren con la expresión de aquellos ARNm a los que se unen.

Mediante estas 2 estrategias diseñar promotores que se unen a la secuencia génica, que pueden ser transcriptas y traducidas, lograremos
experimentos de ganancia de función, sobreexpresarse en la célula, pero cuando introducimos secuencias que va a producir ARNi,
lograremos la regulación negativa, la disminución de la expresión de aquellos ARNm que sean complementarios a esos ARNi. Esa
complementariedad no es completa, ya que esos ARN pequeños tienen alrededor de 20 nucleótidos, o sea que solo serán
complementarios a un segmento del ARNm y en su diseño hay que ser cuidadosos, ya que, si esa secuencia del ARNi puede ser
complementaria al ARNm de interés y a otros ARNm distintos, todos esos ARNm serán también silenciados.

¿Como hace la célula para incorporar secuencias de ARN exógenas? Dado que espontáneamente eso no ocurre.

Si tenemos células en cultivo, le agregamos una solución de estas moléculas de ARN que artificialmente diseñamos, no habrá una
incorporación espontanea de esas moléculas, y ahora veremos cuáles son esas estrategias para que la célula incorpore esas moléculas y
poder así ser expresadas. Y para eso debemos hablar de vectores de expresión.

Cuando hablamos de vectores de expresión, hablamos los vehículos que utilizaba el AND para que la célula incorpore las moléculas que
queremos introducir. Uno de los más utilizados son Plásmidos, que son secuencias de ADN circular, pequeños que surgen originalmente en
bacterias, como elementos extra cromosómicos que pueden utilizarse como herramienta en biología celular, uno puede insertar en la
secuencia del plásmido aquellas secuencias importante, por ejemplo, un promotor determinado y luego la secuencia de interés. La ventaja
del plásmido es que uno puede amplificar su número de manera artificial incorporando en bacterias, en un paso previo, antes de
introducirlo dentro de la célula.

Para introducir el plásmido a la célula, hay diferentes estrategias, por ejemplo:

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Combinarlo con lípidos (con carga positiva), esta combinación implica que los plásmidos van a quedar en pequeñas vesículas formadas por
estos lípidos. Estas vesículas si tienen una tendencia a fusionarse con la membrana plasmática de la célula y en ese proceso de fusión se
incorporan hacia el interior de la célula al plásmido contenido en esa vesícula. Entonces esta estrategia molecular de enmarcar e inducir la
formación de vesículas lipídicas con cargas neta positivas, aumenta la probabilidad de difusión de esta y de incorporación dese fragmento d
ADN.

Otro mecanismo para incorporar el ADN es la electroporación que, es inducir pequeños estímulos eléctricos, pequeños pulso eléctrico para
fomentar, en la célula, poros temporarios en la membrana, y por un breve lapso puede ingresar así el plásmido que se colocaron en la
solución acuosa, esto permitirá que pueda ser transcripto y luego traducido. Esa transcripción y traducción será llevada a cabo por la
maquinaria endógena de la célula. Pensemos que el código genético es universal, la secuencia que diseñamos será correctamente
aceptado.

Otra estrategias para introducir ADN es la utilización de virus, ya ellos espontáneamente introducen ADN en su genoma. Para utilizar virus
como técnica, se altera su genoma y se reemplaza en el ADN viral, aquellas secuencias que provocan la infectividad de los virus, que
provocan efectos negativos y se los reemplaza con aquellas secuencias que quieren incorporar en las células. De modo tal que, todo el
conjunto de macromoléculas que recubren al virus funciona como una puerta de entrada espontanea que va a hacer que incorporar
rápidamente a la célula. Entonces los virus se introducen de manera muy efectiva dentro de las células, sin el contenido en su genoma que
produce infecciones, sino que contiene las secuencias que quiero estudiar.

Con la técnica de ADN recombinante no solo podemos incorporar proteínas exógenas de una célula, sino que también podemos incorporar
proteínas de otro organismo a una determinada célula. Basándonos en el que el código universal la maquinaria endógena podrá introducir
los codones correspondientes de la secuencia de la proteína exógena. Esto permitió introducir una proteína fluorescente verde (GFP)
proveniente de una medusa e incorporarla en el organismo de mamíferos. Por la técnica de ADN recombinarte diseñarse esta proteína e
incorporarse por medio de plásmidos mediante vectores virales en células de mamíferos y, que expresarse esta proteína fluorescente
verde. Esta proteína cuando es iluminada por una luz con determinada longitud de onda de microscopios de fluorescencia emite
fluorescencia verde. Y se pueden observar su morfología.
Proteínas de fusión

Una estrategia interesante es generar proteínas de fusión de 2 proteínas, en particular una proteína fluorescente (GFP) y una proteína de
interés y podemos diseñar la secuencia de ADN para que se traduzca de manera completa la proteína fluorescente y luego mediante el
agregado de algunos codones que codifiquen para un péptido o vector, podrá añadirse una secuencia de una proteína de interés. Expresar
estas 2 proteínas unidas que son traducidas por un único péptido dentro de la célula, es la estrategia de creer proteínas de fusión.
A partir del descubrimiento de esta proteína verde, distintas mutaciones permitieron realizar proteínas que emite fluorescencia a distinta
longitud de onda. Entonces ahora contamos con proteínas fluorescente que emite distintos tipos de colores. Entonces, por medio de las
proteínas de fusión fusionas a proteínas fluorescentes de distinta fluorescencia, permite en simultaneo visualizar 2 o más proteínas en un
mismo momento.

Crispr-Cas9

Esta técnica, es una técnica novedosa.

Utiliza que utiliza proteínas derivadas de bacterias, pero las utiliza como herramientas, para editar genomas, para introducir modificaciones
especificas en el genomas. Las técnicas anteriores de modificación del genoma eran muy inefectivas. Permite esta técnica generar
modificaciones altamente eficientes. Está basado en la reparación del ADN. También utiliza la incorporación de miARN.
El primer elemento importante es la utilización de miARN que sirven de guía para regular la expresión génica de una proteína, por medio
de un complejo efector, tal cual ocurre en el mecanismo de ADN recombinante. La enzima principal de este proceso es la Cas9, es una
endonucleasa, que genera rupturas en un lugar específico de doble cadena de ADN, y esta enzima es usada para generar rupturas en lugar
específicos del ADN esta guiado por un ARN pequeño, que en el contexto de la técnica se denomina ARNi.

En el segundo elemento, debemos pensar que pasa cuando se daña la doble cadena de ADN. Existen 2 mecanismos que utiliza la célula
para reparar daños en la doble cadena de ADN. Uno de ellos mecanismo unión de extremos no homólogos, mecanismo de supervivencia,
ante los daños en la doble cadena del ADN, la enzimas de reparación unen las extremos libres sin tener ningún mecanismo para
recomponer la secuencia inicial que existía antes de la ruptura, es decir, que en el sitio quedan mutaciones, pero evita la muerte celular.
Entonces nosotros quisiéramos introducir una mutación en un gen determinado, podríamos mediante la técnica de ADN recombinante
introducir la expresión de Cas9, y de manera, simultanea de un ARN guía pequeño que, localice Cas9 en la secuencia del gen de interés.
Cas9 inducirá una ruptura doble cadena de esa secuencia génica que seguramente será reparada por el mecanismo de unión de extremos
no homólogos, induciendo una mutación en ese punto. Las mutaciones de este tipo llamamos Indels (abreviatura de inserción o deleción),
ya que puede ocurrir deleciones o inserciones en ese punto. Dado el punto de vista funcional cuando hay inserciones o deleciones, generan
corrimientos en el marco de lectura que suelen ser detrimentales para el funcionamiento de la proteínas. Esto producirá que haya ausencia

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de ese producto proteico y decimos en este caso, en esa célula un knockout de ese gen, hemos eliminado desde el punto de vista funcional
a ese gen.

Existe una variante que introduce un tercer componente, además de introducir Cas9 y del ARN guía que va a inducir la ruptura de la doble
cadena de ADN, se introduce también una secuencia de ADN corta que actué como molde para reparación, induciremos, favoreceremos el
mecanismo de reparación homologa, como mecanismo de reparación. Teniendo en cuenta la región donde se produjo el daño y que la
secuencia de ADN que introduciremos sea complementaria con esa región dañada. La ventaja es que introduce una mutación que nosotros
queramos incorporar, o sea que nos permite introducir mutaciones especificas en el AND, reemplazando la secuencia endógena por una
secuencia mutada. A esta mutación la llamamos Knockin.

Otro aspecto importante de esta técnica es que, podemos utilizar como herramienta para modificar el genoma por su alta eficiencia, aun
en contexto clínico, se puede usar como herramienta terapéutica, como, por ejemplo, en muchos tumores. Permite también corregir
mutaciones que se encuentran en el genoma.
Por medio de esta técnica se pueden modificar ovocitos y permite quitar mutaciones. Se pudieron modificar primates con esta técnica.
Aún no está regulada en todos los países, aunque en algunos se usan embriones no fecundados de clínicas de fertilización se destinan a
experimentación y se observa que se modifica el genoma. Aunque no se usan para implantarse y se detienen en unas pocas blástomeras.

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Seminario 6

Compartimentalización celular y dinámica de biomembranas. Síntesis y distribución de macromoléculas

La traducción de los transcriptos siempre comienza en el citosol, habíamos estudiado como los transcriptos maduros eran exportados al
citosol y allí podían ser reconocidos por la subunidad pequeña del ribosoma y cuando esta encontrara el codón de inicio de la traducción
podía acoplarse a la subunidad grande.

Este proceso que marca el inicio de la traducción siempre ocurre en el citosol sin embargo n todas las proteínas tienen una localización
citosólica, hay algunas proteínas que siempre las encontramos por ejemplo en la membrana plasmática, otras proteínas que son exclusivas
de las mitocondrias, hay otras proteínas que son solo nucleares, hay otras proteínas que están en el aparato de Golgi, otras que están en
los lisosomas.

¿Cómo saben las moléculas cuál es su localización intracelular y como alcanzan esa localización intracelular sobre todo cuales son los
mecanismos moleculares que permiten esta serie de procesos?

Porque entender estos mecanismos además de entender esta situación fisiológica nos permitirá comprender algunas situaciones
patológicas que se producen por la alteración, disfunción de estos mecanismos de localización proteica.
Para responder a esta pregunta tenemos que aludir a que este problema que vamos a analizar es exclusivamente eucariota porque esta
compartimentalización profusa intercelular. La existencia de compartimientos nos referimos a:
 retículo endoplásmico,
 aparato de Golgi
 compartimiento nuclear
 lisosomas (exclusivo de las células eucariotas)

Interpretaciones evolutivas respecto del surgimiento de las células eucariotas especulan que el desarrollo de las células eucariotas tal cual
las conocemos hoy en día. Surgió a partir de un precursor que carecía tanto de mitocondrias como de los compartimientos intercelulares
membranosos y que la adquisición de estos compartimientos celulares intramembranosos proviene a partir de invaginaciones de la
membrana plasmática. Profundas invaginaciones en el interior celular túbulos membranosos que provenían de la membrana celular y que
luego adquirieron independencia, se soltaron de la membrana generando un compartimiento membranoso interno que ha encerrado en el
interior de estas organelas membranosas por ejemplo el retículo, la membrana nuclear etc. un pedacito del exterior celular ahora residente
en el interior de las células.

Esto implica que cuando pensamos en los compartimientos intracelulares podemos establecer una correspondencia topografía, es decir,
podríamos pensar que el citosol es el verdadero interior de la célula sin embargo el espacio que ha quedado incorporado en el interior de
estas organelas membranosas no corresponde topológicamente, no es equivalente al citosol, sino que es equivalente al exterior celular.
Cuando uno mide por ejemplo el pH y la composición de iones del lumen de muchas de estas organelas membranosas es muy diferente a la
concentración de iones del citosol y esto corresponde con esta compartimentalización diferente.

¿Cómo se localizan las proteínas nucleares, sintetizadas en el citosol que luego serán residentes del núcleo?

Antes de responder la pregunta debemos notar que el interior del núcleo corresponde topológicamente al citosol, están conectados a
través de los poros nucleares, si bien sabemos que es un compartimento no totalmente accesible a las grandes macromoléculas y grandes
proteínas del citosol.
En términos de descomposición iónica hay libre difusión a través de los poros nucleares y del citosol, si se piensa evolutivamente, el
interior del núcleo es un pedazo del citosol que ha quedado parcialmente restringido por un estructura membranosa a su alrededor, es
importante entender esta compuerta que limita el contacto del interior del núcleo con el citosol (la membrana nuclear), es una estructura
doble: constituida por una membrana nuclear interna y una membrana nuclear externa y algo importante de resaltar, es que no forma una
estructura distinta de retículo endoplásmico, esta membrana nuclear externa se continúa con los túbulos y sacos del retículo, se puede
pensar entonces, que estas dos membranas que rodean al núcleo, son una especialización de un sector del retículo endoplásmico, la cual
no es continua, está interrumpida por perforaciones de la membrana nuclear externa e interna, permitiendo así la comunicación con el
citosol.

El primer tipo de transporte que va a ocurrir y que permite el pasaje de moléculas desde el núcleo al citosol, un pasaje bidireccional (así
como las ciertas proteínas que recién se sintetizan pueden tener una localización nuclear, a veces hay proteínas que luego de su síntesis
son exportadas bajo ciertas señales específicas al exterior celular) este es un transporte que debemos entender que representa el primer
ejemplo de mecanismos de transporte mediado por compuertas

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Transporte mediado por compuertas

Las compuertas son: un complejo de muchas proteínas, denominado Complejos Del Poro Nuclear, donde participan más de 30 tipos de
proteínas que actúan como compuertas selectivas respecto el pasaje de moléculas que superen un determinado tamaño, las grandes
macromoléculas que típicamente tienen un pasaje restringido que son reguladas por estas compuertas son las proteínas, las proteínas de
aproximadamente 50 kilodaltons de masa molecular pueden difundir libremente entre el interior del núcleo y el citosol.
Estos complejos (complejos del poro nuclear), permiten un pasaje aproximadamente libre de proteínas de hasta 50 Kilodaltons, hay
proteínas mucho más grandes que también pueden ingresar al núcleo mediante un proceso activo de localización, no lo hacen
espontáneamente por difusión, sino que serán incorporadas selectivamente a través de los poros nucleares.

Un experimento que se realizó en 1971 genero una teoría solida ya para los años 80 permitió descubrir que una de las claves del sistema
de transporte se encuentran en señales que están contenidas en las mismas proteínas, las proteínas contienen secuencias de aminoácidos,
que actúan como señales de localización que son interpretadas por la maquinaria proteica celular, para permitir la localización de una
proteína específica en un compartimiento específico, estas secuencias señales contenidas en las proteínas se conocen como señales
topogénicas, porque generan la ubicación topológica especifica de una determinada proteína. Por ejemplo, proteínas cuyo destino es ser
importadas al interior del núcleo tienen una secuencia consenso de aminoácidos ricas en lisinas y argininas (aminoácidos básicos) que, al
pH celular portan una carga eléctrica positiva neta, ese tracto de aminoácidos básicos es característico de una señal de importación
nuclear.

Las proteínas que poseen esa secuencia son activamente incorporadas al interior del núcleo, independientemente de su tamaño de modo
equivalente se puede decodificar cual es la secuencia particular de aminoácido que permite la exportación del núcleo o la localización la
incorporación de las proteínas al interior del retículo o incorporación de proteínas a las mitocondrias, es decir, se puede decodificar el
sistema de secuencia señales, que son endógenas a las proteínas.

Esto responde en parte a la pregunta de la localización de las células, porque si la información para localizar una proteína determinada está
dada por una secuencia de aminoácido de la propia proteína, también se puede decir que es el genoma quien está controlando la
localización de esas proteínas, porque esa secuencia también forma parte, es traducida a partir de una secuencia originalmente ubicada en
un gen de esa proteína, de ese modo con este intermediario de generar secuencias señales en las proteínas que se traducen a partir de un
gen, el genoma controla la distribución y localización de las proteínas, no siempre esta secuencia de aminoácido es una secuencia única
sino que pueden haber muchas secuencias dentro de una proteína separadas entre sí cuando pensamos en la proteína desplegada como
un péptido, pero que suelen acercarse entre sí espacialmente cuando la proteína adopta su estructura 3 D final, y en esos casos decimos
que la señal es un parche señal, está constituido por la superficie tridimensional de un sector de la proteína que al desplegarla esos
fragmento de la secuencia estarían alejados entre sí.

¿Cuáles son las señales?

Señal de localización nuclear (importación = NLS) y la señal que permite la exportación específica nuclear de las proteínas NES

¿Cuáles fueron las corroboraciones experimentales que permitieron determinar que realmente son estas secuencias las que son necesarias
y suficientes para permitir la incorporación de una proteína que comienza su síntesis en el citosol y que es demasiado grande para
atravesar el núcleo por difusión simple, pero que terminan siendo incorporadas efectivamente al compartimiento nuclear?

Uno de los sistemas experimentales clásicos para poner este sistema a prueba, utiliza la técnica (proteínas de fusión) proteínas que tienen
localización nuclear fusionadas con una proteína fluorescente, (imagen: se ve una proteína denominada antígeno T la cual ha sido
fusionada con una proteína fluorescente verde (que se ve blanco “color blanco corresponde al color verde” y negro) las estructuras
redondeadas son el núcleo de esa célula (GFP).

Observando la secuencia de aminoácido que se considera la secuencia señal, lo que busca el experimento es demostrar si esa secuencia
señal es la responsable de la localización, lo que se hizo, fue generar otra secuencia que posee una mutación, alterando la secuencia señal y

¿Se tansfectó esa secuencia que poseía una mutación y que afecta la potencial secuencia señal se la tansfectó en las células, que se
observa? ¿Cuál es la localización ahora de GFP fusionada con la proteína que tiene mutada la secuencia señal?

Tiene una secuencia citoplasmática excluida del compartimiento nuclear, en donde se observa el núcleo con ausencia de fluorescencia,
demostrando entonces que la secuencia señal es necesaria, dado entonces que al mutarla alterándola no es posible generar la localización

¿es suficiente solo la secuencia señal para para incorporar una proteína al núcleo?

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y si tengo una proteína que no es producida por las células, ejemplo GFP se le agrega una señal de localización nuclear sin una proteína
endógena ¿será suficiente esa secuencia señal, para localizarla en el interior del núcleo?

Ver experimento:

Localización de GFP y cuatro células y se observa que GFP ocupa todo el compartimento citosólico y el interior nuclear, mostrando una
localización muy amplia cuando se expresan en células eucariotas. Cuando se agrega a GFP una señal de localización nuclear

¿que se observa?

Cambia la distribución de la fluorescencia, parece estar localizada en el compartimiento nuclear y si se le agrega a GFP una señal de
exportación nuclear,

¿qué pasa con la fluorescencia de GFP?

esta forzosamente excluida del núcleo. Comparen GFP sin señal de exportación e importación la encontramos tanto en el núcleo como en
el citosol, pero al agregar una secuencia de localización nuclear, fuerza (veremos cuáles son los mecanismos), pero es suficiente como para
que las proteínas endógenas localicen GFP en el compartimiento nuclear y agregar una señal de exportación es suficiente para que los
sistemas endógenos la excluyan activamente del núcleo cuando su propia estructura es lo suficientemente pequeña como para poder
difundir e ingresar por sí misma al compartimiento nuclear.

¿Por qué GFP sin el agregado de ninguna señal puede ingresar al núcleo sino tiene ninguna señal de localización nuclear?

Porque es lo suficientemente pequeña para difundir en el núcleo (GFP, pesa 37 kilodaltons).

Entonces esa serie de experimentos repetidos con muchísimas proteínas han permitido generar un consenso que estas secuencias de
localización son a la vez necesarias y suficientes como para producir la localización, pero no quita que haya proteínas endógenas que
interactúen con esa señal para permitir la localización final. De hecho, analizaremos más en detalle como es el proceso de importación y
exportación nuclear de esas proteínas que tiene la señal de localización.

Esta señal es reconocida por una serie de receptores en el interior de la célula, proteínas que pueden reconocer la secuencia señal, las
proteínas que reconocen la secuencia de importación al núcleo se denominan Importinas, y las proteínas que reconocen las secuencias de
exportación del nuclear se denominan Exportinas. Estos receptores van a ser localizados activamente o bien en el interior del núcleo
permitiendo la liberación de la proteína de interés o a la inversa, para poder explicar el fenómeno de localización específica se debe tener
una distribución asimétrica de una proteína, que una proteína GTPasa y que explicará de manera mediada, cual es la inversión energética
de las células para generar este mecanismo de ordenamiento, que al pensarlo en términos energéticos, ordenar, producir un aumento del
ordenamiento intracelular, localizar una proteína, es un procedimiento desde el punto de vista termodinámico, un proceso que consume
energía, porque lo espontáneo es la entropía, es la difusión de las proteínas, los fenómenos entonces de localización como aumentan el
orden intracelular, son procesos no espontáneos que consumen energía, y la energía invertida en este proceso que permite la
direccionalidad del transporte va estar dada por la creación de un gradiente diferencial entre el interior del núcleo y el exterior, y ese
gradiente esa localización diferencial va a estar por una familia de proteínas GTPasas de la familia Ran.

Es frecuente el hecho de que haya proteínas que pueden unirse por ejemplo al GTP y que bajo ciertas condiciones pueden hidrolizar ese
GTP generando GDP, este proceso donde una proteína unida a GTP rompe el grupo fosfato para generar GDP, es un proceso que ha
liberado energía en ese punto.
La célula invierte energía en regenerar esta molécula de Ran GDP a Ran GTP, la regeneración va a estar dada porque hay una proteína que
permite el intercambio del nucleótido que ya se ha hidrolizado GDP por una nueva molécula GTP.

¿Cómo se produce entonces esta distribución asimétrica? ¿Por qué el citosol es rico en la variante GDP de la proteína Ran y por qué el
núcleo es rico en la otra variante, en la que está unido a GTP?

Se explica por la localización diferencial de los factores que interactúan con esta serie, una proteína citosólica, es la proteína activadora de
la GTPasa Ran, esta proteína induce sí Ran GTP sale del citosol, esta proteína interactúa con Ran GTP e induce la hidrólisis del nucleótido
generando Ran GDP, entonces la abundancia de esta proteína activadora de la GTPasa en el citosol provoca que todas las GTP que alcancen
compartimientos citosólicos sea rápidamente transformado inducido a ser transformado a Ran GDP, de manera complementaria en el
interior del núcleo exclusivamente recibe la proteína intercambiadora de Ran aquella que permite sustituir el GDP ya utilizado por un
nuevo GTP, y esta localización nuclear específica, hace que solo el núcleo este enriquecido de la variante GTP de Ran.

¿Cómo se relaciona este gradiente con el mecanismo de transporte, con los fenómenos de importación y exportación nuclear?

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Veamos como la distribución asimétrica de las GTPasas también tiene la direccionalidad de transporte, se observa como una proteína que
posee una señal de localización nuclear puede ser reconocida eventualmente por el receptor, que es una importina, las importinas tienen
afinidad por las proteínas que conforman el complejo del poro nuclear, de manera genérica se les denomina nucleoporinas tiene afinidad y
estas pueden formar uniones débiles con las nucleoporinas, estas uniones son débiles: se forman, se rompen, se forman, se rompen, etc.

Permitiendo una interacción del movimiento aleatorio de las importinas con las nucleoporinas que pueden introducirse y salir del complejo
del poro nuclear y esta afinidad por las proteínas del complejo del poro es independiente del hecho de que estén unidas a la proteína que
posea la señal de localización nuclear o no, pero al imaginar que una importina unida a la proteína al ser transportada interactuando con
las nucleoporinas pueda ingresar al compartimiento nuclear, allí al estar presente Ran GTP puede unirse de manera directa a la importina y
desplazar, inducir un cambio conformacional que permite la liberación de la proteína importada en el interior del núcleo, este es el
fenómeno de convergencia.

Esta competencia no ocurría en el compartimento citosólico, porque en citosol no hay Ran GTP que pueda competir por ese lugar, esto
entonces induce la liberación de la proteína en el interior celular. Luego la importina con Ran GTP eventualmente encontrará mediante
difusión se chocara con las nucleoporinas del complejo del poro nuclear, y eventualmente con estas uniones débiles que se forman y se
deforman podrá salir al compartimento citosólico, unida a este Ran GTP, pero en el compartimento citosólico estaba la proteína activadora
de GTPasa que provocará la hidrólisis de GTP generando Ran GDP que pierde su afinidad por la importina regenerando entonces una
importina libre en el citosol haciendo que pueda repetir este ciclo nuevamente. Es entonces esta distribución asimétrica en donde Ran GTP
esta únicamente en el núcleo y Ran GDP exclusivamente en el citosol, lo que permite esta direccionalidad de transporte, la exportación
funciona con el mismo mecanismo de manera inversa, en donde las exportinas solo pueden unir a las proteínas que poseen la señal de
exportación nuclear cuando están unidas a Ran GTP y cuando salen por estas interacciones débiles por las nucleoporinas al espacio
citoplasmático hacia el citosol el activador de las GTPasas induce la hidrólisis GTP, en ese momento la exportina al perder su unión a Ran
GTP pierde su unión a la proteína que estaban transportando y la libera quedando libre para un nuevo proceso.

Entonces, si bien las señales de importación y exportación son necesarias y suficientes, interactúan componentes intercelulares ejemplo
sus receptores las importinas y exportinas, los complejos del poro nuclear y la distribución asimétrica de Ran GTP y Ran GDP que es la
distribución que condensa esta interacción energética que realiza la célula para generar el transporte, porque la regeneración de Ran GTP
en el interior del núcleo implica consumir nucleótidos de GTP.

Otro compartimento intracelular que utiliza un mecanismo de transporte diferente para localizar a sus proteínas:

Retículo Endoplásmico: una organela que como todos los compartimentos intracelulares pudo ser descrito por primera vez de manera
consistente a partir de los año 40 (microscopio electrónico). Y fue el microscopio electrónico quien revelo por primera vez la estructura de
estos compartimentos celulares y fue a partir de entonces, del surgimiento de la ME, que se abrió este campo de conocimiento, recuerden
lo que dijimos la clase pasada, esa si es una técnica la que abre el campo del conocimiento, este es el caso de la microscopia electrónica y
las organelas intercelulares.

Retículo endoplásmico (RE): Consiste en una serie de sacos membranosos y de túbulos membranosos que encierran en su interior, lo que
denominamos el lumen, la luz del RE, compartimiento que como dijimos es topológicamente equivalente al exterior celular y que las
proteínas que están contenidas en el interior del RE deberán atravesar esa membrana que rodea al RE, ingresar en la luz, en el lumen. A
diferencia de lo que ocurría con el núcleo, no hay complejos de poros que permitan pasaje a través de compuertas, veremos en breve que
las proteínas deben atravesar directamente la membrana del retículo, por eso analizar este transporte va a implicar analizar una segunda
modalidad de transporte que se denomina: Transporte transmembrana.
Encontrar cual es la señal que permite el transporte transmembrana fue la primera señal con la que Blobel pudo demostrar
experimentalmente su hipótesis de la señal luego en un trabajo de 20 años, pudo generalizar esta hipótesis de la señal a la localización
hacia otros compartimientos intracelulares pero la historia experimental comienza con el análisis de la localización de proteínas al interior
del RE.

¿Qué funciones cumple esta organela? ¿Como se produce la síntesis y modificación posterior de proteínas en el retículo?

Otra de las funciones en el interior es poseer un sistema de control de calidad respecto del plegamiento de las proteínas intracelulares
funcionando entonces como un sistema de detección de errores de plegamiento, pero lógicamente solo puede actuar este sistema de
control de errores de plegamiento en proteínas que ingresan a la luz del RE, cosa que no ocurre como veremos con todas las proteínas.

El retículo cumple otras funciones, por ejemplo, en sus membranas están las enzimas que permiten la biosíntesis de la mayoría de los
lípidos, actúan como mencionamos en esta cualidad de poseer un compartimiento equivalente topológicamente al exterior celular y suele
ser un reservorio de calcio intracelular.

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Mantener bajos niveles de calcio en el compartimento citosólico es esencial porque el calcio va a cumplir el rol de una molécula
señalizadora que va a inducir profundos cambios en la actividad de muchas proteínas. Cuando aumenta su concentración en el citosol y la
regulación de las concentraciones intracelulares de calcio esta finamente regulada por las células y suele estar almacenada
intracelularmente en la luz del RE.

También muchas enzimas membranosas del retículo participan de la detoxificación de muchas sustancias, sobre todo aquel sector que
conocemos como retículo endoplásmico liso (REL).

La distinción entre el retículo endoplásmico rugoso (RER) y (REL), es una distinción que simplemente alude al hecho de que hay sectores de
este sistema totalmente interconectados de túbulos y sacos, hay sectores que carecen de la adhesión de ribosomas en su superficie
citosólica y a esos sectores los denominamos (REL) estos compartimientos suelen tener distintos grados de especialización en los distintos
tipos celulares, por ejemplo, los hepatocitos expresan su genoma, expresan ciertas proteínas que participan del fenómeno de
detoxificación y tienen asociadas una especialización de incrementar la superficie de su (REL) en función de la alta expresión de las
proteínas que participan de la detoxificación, otras células que fabrican hormonas esteroideas que derivan del colesterol también suelen
tener un alto contenido o una alta abundancia de (REL) y veremos que dentro de los distintos tipos celulares que producen proteínas de
exportación, que van a secretar proteínas son muy ricas en (RER) por que como veremos en el seminario de hoy el camino de estas
proteínas que van a tener como destino final su secreción por parte de las células comienza con su incorporación a la luz del RE
anticipamos entonces esa trayectoria.

Descripción de diapositiva: Aquí tenemos dos imágenes de microscopia electrónica mostrando cortes transversales en donde podemos ver
los sacos aplanados del RER y donde podemos ver esos gránulos en su superficie que corresponde a ribosomas ahora podemos interpretar
porque hay ribosomas cuando analicemos el mecanismo de transporte, sobre la superficie del RER, y aquí podemos ver una célula de Leydig,
una célula testicular especializada en la síntesis de testosterona (una hormona esteroidea) que tiene ampliamente desarrollados los sacos
de REL.

Desde el punto de vista experimental uno puede aislar al RE pero no aislarlo de manera completa sino que en el proceso de
fraccionamiento subcelular los fragmentos del REL y RER se rompen y se reciclan formando pequeñas vesículas que denominamos
microsomas que podemos aislar y obtener en fracciones puras a través de fraccionamiento subcelular y analizarlas experimentalmente, por
ejemplo, determinando que proteínas, que enzimas, que actividades enzimáticas están presentes en esas fracciones y están ausentes en
otras.

Los experimentos en los que se realizó el mecanismo de transporte transmembrana se hicieron utilizando preparaciones de microsomas
porque son funcionales y experimentalmente equivalen a pequeños retículos endoplásmicos en miniatura, estos microsomas algunos
derivan del RER y otros del REL y desarrollan posteriores afinamientos de fraccionamiento subcelular que utilizan centrifugaciones en
gradientes de sacarosa, permiten separar a las vesículas que provienen del RER y del REL y por ende esto permite desde el punto de vista
experimental, analizar que proteínas y que enzimas están presentes en el RER y cuales en el REL mediante estos análisis podemos
determinar, por ejemplo, que las proteínas encargadas de sintetizar las hormonas derivadas del colesterol estaban enriquecidas en los
microsomas lisos y no en los rugosos.

Transporte transmembrana:

Que permite localizar proteínas que empiezan su síntesis en el citosol a la luz, al lumen en el RER. Posee 2 tipos de diferencias:
1- Este transporte con respecto al transporte por compuertas del transporte de moléculas que se da del interior al exterior del
núcleo, que ya habíamos mencionado es que no ocurre a través de compuertas sino que el péptido tiene que atravesar
directamente la membrana y lo hará, veremos en breve de una manera cotraduccional, no será el péptido ya sintetizado el que
atraviese de manera completa la membrana que separa el exterior, el sector citosólico del interior del retículo, sino que será una
proteína que estará siendo traducida la que produzca este transporte
2- Es unidireccional a diferencia del núcleo donde se importa y exporta, aquí es fundamentalmente unidireccional del citosol hacia el
interior del RE.

¿Cómo se produce este transporte?

Las proteínas que tienen localización, que han de ser importadas al RE poseen una secuencia señal ya caracterizada, se encuentra
típicamente muy cerca del extremo amino terminal de las proteínas y se caracteriza por poseer un tracto de aminoácidos hidrofóbicos, hay
algunos aminoácidos que tienen carga positiva (básicos), hay aminoácidos que tienen cargas negativas (ácidos) pero también hay
aminoácidos que no tienen un resto polar sino uno hidrofóbico, estos son los aminoácidos hidrofóbicos y el tracto constituido por ellos
constituye la identidad de la secuencia de señal que permite la importación al retículo.

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¿Cómo es el mecanismo de manera simple?

Este transporte es postraduccional entonces tenemos que pensar, en el transcripto de una proteína que tiene como destino ser importada
en el interior del retículo que comience a ser traducida por un ribosoma.

Descripción de diapositiva: en este esquema no representamos por razones de simplicidad el ARNm pero estará en su conformación circular
que permitía el reconocimiento de las subunidades ribosomales, y aquí vemos un péptido que comienza a ser sintetizado por el ribosoma
cerca del extremo amino terminal que es el primero en producirse va a aparecer el péptido señal.

La secuencia señal que es reconocida en este ribosoma que está en el citosol, es reconocida por una ribonucleoproteína, que es la partícula
que reconoce esa señal y que de hecho recibe el nombre de “partícula de reconocimiento de la señal”, está constituida por algunos
péptidos y un ARN no codificante, que puede reconocer y unirse, a la partícula, a la secuencia de señal que está siendo producida por el
péptido por el ribosoma mediante ARN no codificante que forma parte de la partícula de reconocimiento de la señal se produce un
reconocimiento de ARN no codificante que es la partícula con la ARN ribosomal y ese contacto induce un detenimiento de la traducción, la
traducción no continua cuando la partícula de reconocimiento de la señal se une a la secuencia de señal que está protruyendo del
ribosoma y esta traducción queda detenida y ese complejo del ribosoma unido al mensajero y al péptido naciente al que esta acoplado
ahora la partícula de reconocimiento de la señal difunde en el interior de la célula hasta que choca eventualmente con la superficie del
RER.

¿Qué hay sobre la superficie membranosa?

Hay receptores que reconocen a su vez a la partícula de reconocimiento de la señal hay receptores de SRP localizados en la membrana del
retículo y cuando se produce esta unión entre receptores y la partícula de reconocimiento de la señal, se acopla mediante interacciones
una proteína que también está en la membrana del retículo pero no es una proteína transmembrana, es un transportador proteico que va
a permitir solo bajo esta configuración que continúe la traducción del péptido pero que a medida que sea traducido sea incorporado a la
luz del retículo a través de esta proteína transmembrana que será transportadora, entonces a medida que está siendo sintetizada la
proteína está siendo “inyectada” al lumen del RE.

Eventualmente esto nos permite comprender un hecho esencial, que los ribosomas que están asociados, que vemos en las ME asociados a
las superficies de retículo, están ahí no porque pertenezcan siempre al retículo sino porque en el momento en que fijamos la célula, eran
ribosomas que estaban traduciendo la proteína que estaba siendo incorporada a la luz del retículo, recuerden que los ribosomas se
encuentran desensamblados en el citosol y solo se ensamblan sobre un mensajero que va a ser traducido, si ese mensajero que va a ser
traducido contiene una secuencia de señal que sea reconocida por la partícula de reconocimiento de la señal y lo adose a la superficie del
retículo quedara como ribosoma asociado al retículo durante el tiempo que dure la traducción, cuando termina la traducción el ribosoma
se desensambla nuevamente y vuelve al citosol.

En cambio un ribosoma que empieza a traducir un mensajero que tiene una señal citosólica será un ribosoma libre no asociado a la
membrana del retículo es decir en otras palabras, no es una diferencia esencial, intrínseca, no hay dos poblaciones de ribosomas que sean
diferentes, son el mismo conjunto de ribosomas que en algún momento los encontramos adosados a la superficie del retículo porque están
traduciendo una proteína que tiene una señal de importación al retículo y en otro momento los encontraremos en el citosol traduciendo
un mensajero que codifique para una proteína que no tenga una localización del retículo.

También podemos encontrar polirribosomas asociados a la membrana cuando ese mismo transcripto es traducido simultáneamente por
ribosomas que en fila están incorporando ese péptido a la superficie de la membrana.

Luego de que la proteína es incorporada a través de ese translocador proteico en algunos casos hay una enzima especifica que produce un
corte en un lugar específico de la proteína liberando al péptido traducido en el interior del RE, esto ocurre para aquellas proteínas que van
a ser solubles es decir que no van a estar asociadas a membrana en otros casos esta peptidasa de las señales, esta enzima que cliva esta
secuencia, la proteína no tiene esta secuencia la proteína quedara ligada a la membrana entonces por este mecanismo tenemos:
 Proteínas asociadas a membrana, cuando la peptidasa de señal no corta a la proteína.
 Proteínas libres del RE.

Puede ocurrir que además de señales que permitan la incorporación de la proteína, haya señales secundarias en el interior del péptido que
funcionen como señales de detenimiento y que cuando esa secuencia que está atravesando la membrana plasmática se detenga la
introducción de la proteína y que el resto de la traducción continúe en el compartimiento citosólico de este modo, pueden obtenerse
proteínas membranosas con una localización especifica que tiene un sector, un tracto de aminoácidos particular que quedara atravesando
la membrana y ** de estas secuencias de incorporación de la membrana del retículo para pasar a través del translocador y otras secuencias

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que tienen este transporte, la superposición de las secuencias en un mismo péptido originan cuando sean traducidas variaciones que
permiten por ejemplo que una proteína tenga varios pasos a través de la membrana del retículo.

Las proteínas que conocemos como las proteínas transmembrana, todas las proteínas transmembrana de la célula se originan como
proteínas que inicialmente son introducidas en la membrana en el RE vemos que aun las proteínas transmembrana de la membrana celular
tienen ese origen y que luego serán localizadas en la membrana plasmática pero su incorporación a la membrana ocurrió en las
membranas del RER del mismo modo, las proteínas que quedan libres en el interior del retículo, por ejemplo, pueden tener como destino
ser proteínas de exportación que luego se liberen en la superficie celular como una proteína secretada.

Su origen nuevamente, comienza a estar en el exterior celular en un compartimiento equivalente al exterior esa es la luz del RE, las
proteínas que alcanzan la luz del RE sufren algunas modificaciones, una de las primeras modificaciones que sufren es la N-glicosilación, el
agregado de oligosacáridos en la superficie de muchas de estas proteínas, esta primera modificación que ocurre en el RE la denominamos
N-glicosilación ya que la unión de estos oligosacáridos ocurre en un aminoácido de asparagina y la asparagina en el código de aminoácido
de una letra se representa con la letra N, N-glicosilación entonces porque estos oligosacáridos son unidos a un aminoácido de asparagina,
que posee una secuencia consenso particular, no todas las asparaginas van a ser glicosiladas solo las que estén en un contexto
aminoacídico particular que sea reconocido por la enzima que induce la N-glicosilación, esta N-glicosilación cumple diversas funciones
aunque no todas están aun profundamente comprendidas, es un fenómeno muy frecuente la N-glicosilación y solo tenemos atisbos de
comprender la funcionalidad de estas modificaciones estructurales hay dos hipótesis fuertes, ambas con parciales datos experimentales
sustentándolas:

Muchas de las proteínas N-glicosiladas van a ser exportadas de las células, secretadas o ser proteínas de membrana cuya superficie
glicosilada luego mire hacia el exterior celular y esa glicosilación suele proteger a la proteína de la acción de proteasas extracelulares,
generando un impedimento estérico, los oligosacáridos son moléculas rígidas que van a poner una distancia entre la proteasa y el corazón
proteico de la proteína entonces una de las funciones de la N-glicosilación con el adicionamiento de los oligosacáridos es la de alejarlos,
evitar el contacto directo con las proteasas en aquellas proteínas que van a ser exportadas o bien van a tener una porción estructural
mirando hacia la cara extracelular.

Participa o permite la adición de la estructura tridimensional correcta en las proteínas es decir participa del correcto plegamiento de las
proteínas. Existe una gran cantidad de proteínas en el interior del RE muchas de ellas chaperonas, que ayudan al ensamblaje correcto de
las proteínas, el ensamblaje se está produciendo ahí porque recuerden que la incorporación de las proteínas fue cotraduccional, no tenían
una estructura tridimensional en el citosol sino que ingresan al retículo y allí deben adoptar su forma tridimensional final de hecho la
enorme mayoría de proteínas que se pliegan en el RE se pliegan mal y el mecanismo de control de calidad que está en el interior del RE a
esas proteínas mal plegadas que luego de varias ruedas de plegado y replegado ayudado por las chaperonas no logran plegarse
correctamente son exportadas nuevamente al citosol en donde son inmediatamente ubiquitinadas y degradadas. Se estiman en algunas
células que el 80% de las proteínas incorporadas al retículo son degradadas por mal plegamiento.

*Son unidireccionales por que la proteína entra por la membrana, pero no vuelve a salir y si sale es para ser degradada inmediatamente
pero no hay proteínas que se hayan plegado en el RE y luego cumplan una función en el citosol.

Destinos posibles para una proteina que ha ingresado al RE

Pueden ser secretadas o formar parte de las proteínas de membrana, entonces estas rutas posibles, luego de que las proteínas son
incorporadas a la membrana del retículo o a su núcleo. Son 3 grandes destinos posibles que van a seguir.

Una secuencia predeterminada como compartimientos intercelulares y la descripción de esta ruta que permite explicar los destinos de
estas proteínas que inicialmente se han incorporado al retículo recibe el nombre de “ruta o vía secretora” entonces la vía secretora
describe la secuencia de compartimientos que siguen las proteínas que son incorporadas al retículo pero que como destino final se van a
los compartimientos intercelulares, todas las proteínas que no sean proteínas residentes del retículo van a pasar a otro compartimento
membranoso, como el aparato de Golgi, del cual las proteínas pueden ser secretadas al exterior celular o ser incorporadas a la membrana
celular en el mismo transporte y esta secreción puede ser; por defecto, es decir ser el destino que la ausencia de otras señales el destino
espontaneo de la secreción de todas las proteínas que han sido incorporadas al retículo.

Del tipo regulado en donde se acumulen todas estas proteínas que provienen del retículo, que por bolsas se acumulen en vesículas
secretoras y ante señales extracelulares particulares se produzca la secreción.
Son dos variantes del fenómeno de exportación de proteínas al exterior celular, de ser secretado de manera constitutiva sin señales
adicionales o ser secretado ante una señal específica: secreción regulada.

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El otro destino posible es que luego del retículo ciertas proteínas pueden tener como destino otra organela: los lisosomas y para analizar
cómo se transportan estas proteínas que ahora están en el interior del retículo para ir del interior de Golgi al exterior celular o al interior de
los lisosomas tenemos que analizar el tercer y último tipo de transporte.

Transporte vesicular

Un transporte que se va a caracterizar por estar mediado por vesículas, vesículas membranosas que se desprenden de un compartimento
membranoso y se fusionan con otro compartimento membranoso de destino, en este último transporte las proteínas ya no necesitan
atravesar por si mismas esa barrera membranosa, sino que las vesículas al fusionarse unas con otras van llevando una porción de la luz de
un compartimento y la fusionan con la luz del compartimento siguiente.

¿Cuáles son las particularidades de este transporte vesicular?

Estará mediado por vesículas, que van a brotar de las membranas de los compartimentos, por ejemplo, de la membrana del RE y que van a
fusionarse con otro compartimento membranoso, por ejemplo, el aparato del Golgi.

Descripción de diapositiva: Nos muestra la simetría entre estos dos compartimentos topológicamente distintos, noten que están dibujados
en este esquema con distintos colores, los dos sectores, cada uno de los componentes de la bicapa lipídica, la monocapa que será la luminal
y la otra monocapa que mirara hacia el citosol que será la monocapa citosólica, cuando una vesícula se fusiona con el compartimiento de
destino la fusión va a respetar esta localización de modo tal que la monocapa luminal quedara fusionada con la luminal y la citosólica con la
citosólica del mismo modo el interior de la vesícula que contiene esta porción topológicamente equivalente al exterior celular también se
conectara con un compartimento topológicamente equivalente, recordemos que este último podría representar el exterior de la célula.

Tres son los problemas desde el punto de vista molecular que tenemos que comprender en el transporte vesicular:

¿Como se seleccionan aquellas proteínas que van a empaquetarse en las vesículas para ser transportadas?

Porque no todas las proteínas que están en el interior del compartimiento son transportadas por vesículas hay proteínas residentes de ese
compartimento que no suelen estar contenidas por las vesículas, no es una muestra aleatoria de todos los componentes de ese
compartimento entonces primer pregunta: como se seleccionan las proteínas que van a empaquetarse en las vesículas para ser
transportadas porque no todas las proteínas que están en el interior del compartimiento son transportadas en vesículas, hay proteínas
residentes de ese compartimiento que no suelen estar contenidas en las vesículas de exportación.
Dada la abundancia de compartimentos membranosos dentro de la célula

¿Como determina esa vesícula de transporte a que membrana debe fusionarse? ¿cómo se determina el compartimento de destino, cuáles
son las señales que permiten que una proteína salida del retículo y cuyo destino final es el aparto de Golgi, no se fusionen con la
membrana plasmática o con la mitocondria? ¿Como se resuelve el punto de vista termodinámico, energético, la producción de vesículas?
¿Por qué producir una esfera membranosa a partir de una bicapa espontáneamente plana desde el punto de vista energético es muy poco
favorable? ¿cómo se resuelve energéticamente ese problema, de una superficie plana una vesícula esférica, como se produce la formación
de la vesícula?

El fenómeno de que estas vesículas no están compuestas solo por membranas, sino que suelen estar revestidas en su cara citosólica por un
conjunto de proteínas, por ende estas vesículas son vesículas revestidas por ciertas proteínas y este revestimiento proteico comenzó a ser
evidente por las imágenes que se obtuvieron a partir de la ME que analizaba el proceso de formación de vesículas en donde se podía
observar una región de mayor electrodensidad, lo cual correspondía con la presencia de un revestimiento proteico, análisis bioquímicos
posteriores demostraron que hay tres grandes clases de recubrimientos proteicos pero que todos cumplen el mismo conjunto de
funciones.

La cubierta proteica permite la alteración de la membrana para formar la vesícula es decir ayuda a explicar que se genere esta reacción
termodinámicamente tan desfavorable, esto se produce porque este recubrimiento proteico está formado por monómeros que se unen a
un parche particular de la membrana o que reconocen ciertas proteínas transmembranas pero pueden ensamblarse espontáneamente
entre sí, si bien encuentran a ese parche membranoso como monómeros al estar lo suficientemente cerca interactúan entre sí y las
deformaciones tridimensionales que tienen al encastrarse unos con otros arrastra a la membrana subyacente y esta deformación que
induce a la interacción de las proteínas que forman la membrana proteica es lo que permite explicar la reacción tan desfavorable de la
formación de la vesícula.

En muchos casos después de que se produce la vesícula posteriormente en tiempos diferentes de acuerdo con el tipo de recubrimiento
proteico se produce un desensamblaje de este recubrimiento proteico y la vesícula queda nuevamente como una vesícula no revestida.

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Estos componentes proteicos que van a ensamblarse para formar la cubierta también participan en el fenómeno de selección de las
moléculas que están en el interior del compartimento y que van a ser incorporadas a la vesícula, este proceso de selección esta dado
porque, muchas proteínas transmembranas que interactúan con el recubrimiento proteico actúan como receptores de moléculas que
están en el compartimento luminal de modo tal que, si estos receptores interactúan con las proteínas de recubrimiento proteico y a su vez
seleccionan, se unen a un subconjunto de proteínas cuando se forme la vesícula estará enriquecida por aquellas proteínas que
interactuaron con esas proteínas que funcionaron como receptores entonces dado que cada uno de estos recubrimientos proteicos
distintos interactúan con un subconjunto particular de receptores terminara llevándose en esa vesícula un subconjunto particular de
moléculas, aquellas que eran reconocidas por esos receptores que eran captados por la vesícula.

Con esto el recubrimiento proteico puede explicar dos de las preguntas,

¿Cómo se produce la deformación de la membrana? Y ¿Cómo se produce la selección de las moléculas que son transportadas, la otra
pregunta (¿Cómo se determinaba el compartimiento de destino?)

De los tres grandes tipos de recubrimientos proteicos, el más estudiado desde el punto de vista experimental son las vesículas recubiertas
de clatrina, de monómeros de clatrina, las clatrinas tienen esta estructura formada por tres estructuras peptídicas que pueden auto
ensamblarse aun in vitro formando estas estructuras esféricas, o sea esta capacidad de interactuar, para acomodarse en forma de una
esfera es espontanea de la interacción de las moléculas no necesita ocurrir en el interior celular pero si bien in vitro puede formar estas
esferas vacías en el interior celular comienzan a ensamblarse sobre la superficie del parche membranoso y arrastran este parche
membranoso para formar una vesícula interna a este recubrimiento proteico.

Otros tipos de recubrimientos proteicos originalmente nombradas proteínas del coatómero, pero posteriormente fueron llamadas.
 proteínas de coatómero 1 (COP 1)
 proteínas de coatómero 2 (COP 2)

Todas estas tienen en común que cumplen las funciones de permitir la deformación de la membrana y participar de la selección del
contenido de la vesícula y difieren específicamente en el sector de la ruta de transporte donde participan, por ejemplo, las vesículas
recubiertas de clatrina median el transporte desde el aparato de Golgi a los lisosomas o desde la membrana plasmática hacia los
endosomas, las COP 2 van a permitir el transporte de vesículas desde el RE hasta el aparato de Golgi y el transporte reverso lo permitirán
las COP 1, si bien no es un concepto esencial que ustedes sepan en que sectores de la ruta participan cada uno de los recubrimientos
proteicos es importante que ustedes sepan que función cumple el recubrimiento proteico en el transporte vesicular.

Entonces, estos diferentes tipos de proteínas que forman parte de las cubiertas están presentes en distintas fases de la ruta de las
proteínas y habíamos dicho que la ruta espontanea de aquellas proteínas que se incorporen al RE, el próximo paso es ser transportadas por
el transporte vesicular hacia el aparato de Golgi antes de continuar con la ruta responderemos la última de nuestras cuestiones.

¿Cómo se determina el compartimiento de destino?

Hay dos familias proteicas que están en la superficie tanto de las vesículas, que están presentes en el compartimento de origen, y que
tienen proteínas complementarias de la misma familia en los compartimientos de destino y una de esas familias son otra familia de
GTPasas que se denominan Rab

Hay distintas familias de proteínas Rab que están presentes en las superficies de los compartimentos de origen y que quedan incorporados
a las membranas de las vesículas de transporte y que tiene proteínas complementarias específicas de la misma familia en un único tipo de
compartimiento destino y solo mediante la interacción de estos componentes complementarios de proteínas Rab, de proteínas efectoras
de RAB que pertenecen a la misma familia es que se produce el anclaje inicialmente de una vesícula a un compartimento destino, el paso
previo a la fusión de la vesícula.

Entonces, dado que los distintos compartimentos membranosos o sea los distintos miembros de esta familia Rab y distintas proteínas
efectoras, proteínas complementarias es que solo algunas interacciones entre proteínas Rab de la misma familia y su misma proteína
complementaria son posibles porque están localizadas de manera específica, de este modo las proteínas Rab que están presentes en las
vesículas del RE solo encontraran su efector par complementario en la membrana de Golgi y solo en esta membrana destino se podrá
producir el anclaje, una vesícula que choque por azar con otra membrana no quedara anclada a esa otra membrana porque no encontrara
en esa otra membrana la proteína efectora Rab complementaria perteneciente a esa misma familia.

Nota: Las vesículas suelen no moverse por difusión, sino que son transportadas activamente mediante componentes del citoesqueleto.

Entonces el sistema de proteínas Rab y su complementaria también permiten explicar el anclaje especifico de la membrana pero no la
fusión que se produce, el proceso final de fusión, aquí participa una segunda familia de proteínas denominadas Snare, se las bautizo así por

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la palabra en inglés “trampa” estas proteínas actúan a modo de trampa, están compuestos como las familias Rab por proteínas
complementarias las V-Snare, están presentes en las vesículas y las D-Snare están presente en el compartimiento de destino, cuando una
proteína V-Snare se encuentra con una proteína D-Snare complementaria se reconocen entre sí y se produce una interacción lo
suficientemente fuerte como para acercar las dos bicapas lipídicas, la de la vesícula y la de la membrana de destino permitiendo la función
espontanea de la vesícula con el compartimento de destino.

Es decir, son las proteínas de la familia Rab complementarias en los compartimentos de origen y destino y las proteínas de la familia SNARE
(V-SNARE vesículas y D-SNARE compartimento destino) los que permiten el reconocimiento especifico de cuál es la organela, cual es el
compartimento al que debe fusionarse la vesícula de transporte.

Características centrales del transporte vesicular vamos a retomar el hilo conductor de lo que era la ruta vesicular que siguen esas
proteínas es decir, nosotros analizamos mediante el transporte transmembrana como las proteínas que tienen señal de localización en
retículo son incorporadas, o bien a la membrana del retículo o bien a la luz del retículo y ahora las proteínas que han sido incorporadas a
las membranas o a la luz del retículo pueden salir de ese compartimiento membranoso y fusionarse mediante el transporte de tipo
vesicular.

¿Cuáles son los destinos posibles para esas proteínas que están en la membrana o en el interior de las vesículas?

El primer destino es El aparato de Golgi, sin embargo estas vesículas que surgen del RE y van a fusionarse al aparato de Golgi brotan
recubiertas del COP 2 y las proteínas solubles que van a ser reincorporadas al retículo tienen una señal particular que les permite su
relocalización en el RE es decir, lo que estamos pensando ahora es que existe un mecanismo de seguridad en donde hay algunas proteínas
que eran originalmente residentes del RE que haya quedado incorporada accidentalmente en una vesícula de secreción, tenemos un
mecanismo de seguridad que permite el retorno de estas proteínas residentes del RE para que vuelvan al compartimento de destino este
transporte retrogrado esta mediado por señales especificas tanto en las proteínas de membrana, como en las proteínas solubles que son
residentes en el retículo y que van a ser incorporadas en otras vesículas, vesículas de retorno nuevamente hacia la luz del RE, es decir
también hay señales que permiten a que ciertas proteínas residentes se mantengan como residentes del retículo y no sean ni secretadas, ni
transportadas al lisosoma.

Todas las vesículas que van del RE a Golgi están recubiertas por COP 2 y las que tienen un transporte retrogrado están recubiertas por COP
1.

¿Qué es lo que ocurre en el aparato de Golgi una vez que llegan las proteínas a ese compartimiento?

El aparato de Golgi está compuesto por una serie de sacos membranosos que suelen tener una ubicación perinuclear.

Descripción de diapositiva: Aquí vemos una imagen de microscopia con las tres fases en donde se ha coloreado artificialmente la
localización del aparato de Golgi suelen ser diferentes desde el punto de vista bioquímico, las enzimas que encierran cada uno de estos
compartimentos no son todas iguales por eso podemos distinguir a las distintas cisternas de Golgi de acuerdo con sus componentes
enzimáticos y las reacciones que ocurren en cada uno de estos compartimentos según su relación con el núcleo y con la membrana, aquellas
cisternas, aquellos sacos membranosos del aparato de Golgi que miran hacia el núcleo serán las cisternas “cis” de Golgi en tanto que las
cisternas que miran hacia el exterior celular, serán localizadas más hacia el exterior celular son las cisternas “trans” de Golgi y el transporte
vesicular siempre ocurre desde la cara “cis” pasando por las cisternas mediales hacia la cara “trans” y es desde la cara “trans” de Golgi que
las proteínas luego van a seguir su destino final.

¿Qué reacciones ocurren en el interior de las cisternas del aparato de Golgi?

En primer lugar aquellos oligosacáridos que habían sido incorporados a las asparaginas sufren una serie de modificaciones, pueden sufrir
remociones y agregados de moléculas de oligosacáridos generando dos tipos de clases de oligosacáridos, oligosacáridos complejos, por
ejemplo u oligosacáridos ricos en manosa que se distinguen entre sí por el tipo particular de monosacáridos que lo componen, ustedes
saben que muchas proteínas de la membrana van a tener decoraciones de oligosacáridos esos oligosacáridos provienen originalmente de
las N-glicosilaciones que se produjo en el RE y que sufrió posteriores modificaciones en el aparato de Golgi. un segundo tipo de N-
glicosilación que comienza en el aparato de Golgi es la O-glicosilación, que se distingue de la primera porque va a ocurrir en residuos de
serina unidos directamente al aminoácido serina que posee en su resto R un grupo hidroxilo dado que el oligosacárido va a unirse al átomo
de oxigeno de ese hidroxilo de la serina se llamara O-glicosilación.

Ahora la O-glicosilación, tiene una estructura muy diferente dado que lo que suelen agregarse son enormes cadenas sacarídicas lineales,
por ejemplo, las cadenas de glucosaminoglicanos son sintetizados en el aparato de Golgi mediante este proceso que es la O-glicosilación,
estudiaremos algunos aspectos funcionales de estos productos de la o-glicosilación en un seminario posterior.

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Pero cuales son los destinos posibles para las proteínas que han logrado dejar atrás el Golgi y que han sufrido estas modificaciones,
mediante el enriquecimiento de la N-glicosilación por un lado y por la O-glicosilación, hay 3 destinos posibles:
 La secreción constitutiva, es decir vesículas que brotan de la cara trans del Golgi y se fusionan con la membrana plasmática liberando
la proteína para su exportación, notemos que aquellas proteínas transmembrana que quedaron atrapadas en este tipo de vesículas
van a quedar incorporadas luego de esa fusión a la membrana plasmática y noten que la cara luminal de estas proteínas va a mirar
ahora al exterior celular es decir los oligosacáridos que van a ser incorporados por las proteínas en su cara luminal, serán los
oligosacáridos que encontraremos en la superficie celular.
 La secreción regular.
 Transporte hacia los lisosomas.

Conclusión: Irán al exterior celular por secreción constitutiva o regular o al interior de los lisosomas.

Lisosomas

Son organelas descubierta, no por microscopia electrónica porque no pueden ser diferenciadas de otros componentes, solo con el
desarrollo de técnicas de inmunohistoquímica que permitió revelar que estas organelas contenían proteínas especificas ausentes en otras
organelas se pudo determinar la existencia de los lisosomas como organelas distintas de otros compartimentos membranosos, las enzimas
que forman parte o están en el interior de los lisosomas, son hidrolasas acidas, un conjunto diverso de enzimas que tiene como función
enzimática degradar macromoléculas, hay enzimas que degradan proteínas, hay enzimas que degradan ácidos nucleicos, hay enzimas que
degradan lípidos. La función que suelen cumplir estas organelas, es ser una organela que degrada componentes macromoleculares que
pueden provenir del exterior celular por endocitosis o pinocitosis o por el mismo interior celular en donde por ejemplo ciertas organelas
que han cumplido con una determinada vida útil, que suelen tener daños moleculares son degradadas intercelularmente también en los
lisosomas.

Una característica de esas hidrolasas por lo cual se las denominada hidrolasas acidas es el hecho de que su actividad enzimática solo se
produce cuando el pH es acido, aproximadamente de 5, este pH acido es conseguido en el interior de los lisosomas gracias a un bombeo
activo de protones por proteínas de membrana, el aumento de protones en el interior de los lisosomas acidifica el pH y permite que las
enzimas se encuentren activas en el interior del lisosoma este mecanismo de hidrolasas acidas es un mecanismo evolutivo que protege a
las células de estas enzimas. Porque imaginemos ante la ruptura hipotética de un lisosoma: si todas esas enzimas degradativas atacaran los
componentes intracelulares podrían degradar los mismos componentes intracelulares, esto no ocurre ante la ruptura de un lisosoma
porque el pH es neutro en el citosol, impidiendo la actividad de las hidrolasas acidas.

¿Cómo se produce otra señal molecular que permite que solo algunas de las proteínas que están en la cisterna trans del Golgi sean
específicamente llevadas al lisosoma?

La particularidad de esta señal es que es una señal obtenida en un oligosacárido, hay algunas proteínas que portan una señal peptídica
codificada por el genoma en la forma de un parche señal, tal como lo analizamos al comienzo de la clase que son reconocidas ese parche
señal por una enzima en el interior del RE y esa enzima va a ejercer modificaciones en el oligosacárido que está unido a esa proteína y va a
generar un oligosacárido que tenga un monosacárido terminal de manosa unido a un grupo fosfato, la señal como está unida a un carbono
especifico, un carbono 6, se conoce como “señal de manosa 6 fosfato” solo se adiciona esa manosa con el grupo fosfato con el grupo 6 en
aquellas proteínas que tienen el parche señal que es reconocido por esta enzima en el interior del aparato de Golgi entonces solo las
proteínas cuyo destino final es el lisosoma, las hidrolasas acidas, van a ser marcadas por esta señal. Posteriormente, hay receptores que
reconocen la señal, que están presentes en la membrana de la red trans de Golgi que reconocen a la manosa 6 fosfato y que son
transportadas por transporte vesicular, por vesículas compuestas de Clatrina, estos receptores permiten como dijimos antes la selección
del contenido de la vesícula y son fusionadas en las vesículas que maduran hasta convertirse en lisosomas una vez que aumentan su
concentración de hidrolasas acidas.

Entonces la señal que permite el transporte lisosomal es la señal de manosa 6 fosfato que también esta codificada en el genoma porque
solo serán unidas a aquellas proteínas que tengan un parche señal constituidos por varios fragmentos de aminoácidos. Diversas patologías
genéticas han demostrado la importancia de estos sistemas de localización, por ejemplo, mutaciones que afecten o bien a las secuencias
señales o a las proteínas que interactúan con estas secuencias para producir la localización generan enfermedades en humanos y un caso
paradigmático de este conjunto de enfermedades son las denominadas “enfermedades de depósito lisosomal” estas enfermedades de
depósito lisosomal se caracterizan porque hay alguna enzima que posea mutación y que impide que se le agregue la señal de manosa 6
fosfato y sea localizada en los lisosomas por ende estas enfermedades, por ejemplo, la enfermedad de Tay Sachs, enfermedad de Gaucher,
enfermedad de Niemann-pick o enfermedad de Farber se caracterizan porque en los pacientes se producen en esos lisosomas una
progresiva acumulación de algún sustrato especifico que no puede ser degradado y que corresponde justamente al sustrato de esa enzima
que no puede ser localizada en el interior de los lisosomas, usualmente las células que acumulan estos enormes lisosomas eventualmente

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mueren por muerte celular programada, las neuronas son particularmente sensibles a estas acumulaciones lisosomales y es típico, por
ejemplo, que los pacientes con estas enfermedades, tengan un fenotipo, tengan síntomas que reflejen este ***

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Seminario 7

Citoesqueleto

La célula posee un citoplasma que contiene, matriz, orgánulos y citoesqueleto y un núcleo. El citoesqueleto es una red compleja de
filamentos proteicos que se extienden a través del citosol:
 Filamentos intermedios
 Filamentos de actina
 Microtúbulos

Entre estos 3 poseen una característica común que son polímeros de subunidades proteicas, protofilamentos unidos por enlaces
covalentes. Otra característica en común muy importante es que tienden a ensamblarse y desensamblarse continuamente. Por estas dos
características son estructuras dinámicas, adaptables y muy resistentes. La función del citoesqueleto es resistencia mecánica, los
filamentos son más abundantes en células que resisten a fuerzas tensoras, movimiento celular y modificación de zonas superficiales y
también funciona como una maquinaria de movimientos intercelulares.

Filamentos intermedios:

Proveen sostén y estructura general. Se llaman intermedios por que se encuentran entre los filamentos finos y gruesos, actina y miosina
respectivamente. Se autoensamblan a partir de un par de monómeros que se enroscan entre sí de modo paralelo para formar un dímero
estable. Dos dímeros superenrollados se enroscan entre sí de modo antiparalelo para generar una unidad de ensamblaje llamada
tetrámero. Este tetrámero forma la unidad no polarizada de los filamentos intermedios. Cada tetrámero actúa como unidad individual, se
alinea a lo largo del eje del filamento y se une al extremo libre de la estructura en proceso de alargamiento. Esta matriz helicoidal
escalonada se estabiliza adicionalmente por medio de interacciones ligadoras laterales entre tetrámeros contiguos.

Los filamentos intermedios son un grupo heterogéneo de elementos del citoesqueleto. Estos grupos son 6:
 Clases 1 y 2: Pertenece a los filamentos citoqueratinas, moléculas de queratina. La queratina acida corresponde a la clase uno y la
queratina básica y neutral a la clase número dos. Una molécula de citoqueratina acida con una básica forman un heterodímero. Son
hetero poliméricos. Los filamentos de queratina son característicos de los epitelios, aunque también se encuentran otras clases de
filamentos intermedios. Las queratinas estructurales también se encuentran en algunas conexiones entre células vecinas como
veremos más adelante en este resumen.
 Clase 3: Son homopoliméricos (que contienen un solo tipo de proteína intermedia). Este grupo contiene 4 proteínas:
o Vimentina (células de origen mesenquimática).
o Desmina (células del musculo).
o Otras proteínas del musculo: paranemina y sinemina.
o GFAP (proteína acida fibrilar glial) presente en las células gliales, específicamente en los astrocitos.
o Periferina (en las neuronas del SNP).
 Clase 4: Son los neurofilamentos (en axones de las neuronas principalmente, aunque también en dendritas).
 Clase 5: forman la lámina nuclear (parte de la envoltura nuclear). Está formada por dos tipos de proteínas:
o lamina A y
o lamina B.
Las mismas, se encuentran localizadas dentro del nucleoplasma, es decir, por dentro de la envoltura nuclear. Le otorgan sostén al núcleo
para mantener su morfología y además juegan un papel en la regulación génica y la duplicación del ADN.
 Clase 6: Incluye los “filamentos perlados” que se encuentran en el ojo. Poseen dos tipos de proteínas:
o faquinina
o filensina.
Las proteínas asociadas a filamentos intermedios son esenciales para la integridad de las uniones célula-célula y célula-matriz. Funcionan
como parte de la arquitectura molecular de la célula. Estas proteínas, además, forman la placa de adhesión de los desmosomas y
hemidesmosomas.

Filamentos de actina:

Estos filamentos están presentes en casi todos los tipos de célula, especialmente en las células musculares que juntos a la miosina forman
el sarcómero que es la unidad funcional del musculo estriado. Pueden constituir hasta un 20% de las proteínas totales de una célula no
muscular, es decir que son muy abundantes.
Los filamentos de actina se arman de forma espontánea por polimerización en una estructura lineal helicoidal (enrollada) para formar
filamentos de 6 a 8 nm de diámetro. Esta actina se denomina actina F (filamentosa) formada por actina G (globular). La actina globular se
encuentra libre en citoplasma. Los filamentos de actina son estructuras polarizadas. Su extremo de crecimiento rápido se denomina

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extremo plus (+) o barbado y el extremo de crecimiento lento se denomina ente minus (-) o puntiagudo. Las proteínas ABP son las
responsables de la organización de los filamentos.
Cuando la actina G se incorpora al filamento, el ATP se hidroliza a ADP. Sin embargo, la liberación del fosfato (de la hidrolisis del ATP) no es
inmediato y la forma temporal de la actina queda con el ADP+Pi que luego se desprende quedando solo ADP.

Las proteínas cortadoras de filamentos de actina cortan los largos filamentos de actina en fragmentos cortos.
Proteínas formadoras de casquete en la actina bloquean la adición de más moléculas de actina en el extremo libre de un filamento como
por ejemplo la tropomodulina. Esta regulación es necesaria para la regulación de la longitud.
Las proteínas formadoras de enlaces cruzados en la actina son las encargadas de establecer los enlaces cruzados de los filamentos de
actina entre sí como por ejemplo la espectrina.
Proteínas motoras de la actina perteneces a la familia de la miosina, otorga el desplazamiento a lo largo de los filamentos de actina desde
el extremo minus hacia el plus.
Funciones de los filamentos de actina:
Anclaje y movimiento de proteínas de la membrana (son redes 3D extendidos por toda la célula y se utilizan como estructuras de anclaje y
soporte).
Formación del núcleo estructural de las microvellosidades en las células epiteliales absortivas (especialización de membrana).
Locomoción celular: se alcanza mediante la fuerza ejercida por los filamentos de actina (en su borde de avance de las células se extienden
evaginaciones de membrana plasmática llamadas lamelipodios o filopodios).
Los fascículos de actina se forman mediante las proteínas formadoras de fascículos fascina y fimbrina. Estos enlaces cruzados proporcionan
sostén y rigidez a las microvellosidades.

Microtubulos

Son tubos largos, huecos, rígidos y no ramificados que pueden ensamblándose y desensamblarse continuamente con rapidez por eso se las
llama estructuras dinámicas. Por lo general se encuentran en el citoplasma donde se originan a partir de centrosoma o centro organizador
de microtúbulos (MTOC). Los MTOC están en el núcleo y se extienden hacia la periferia.

Funciones:
Están presentes en cilios y flagelos (encargados del movimiento de estos), en centriolos, huso mitótico (unen los cromosomas al huso y sus
movimientos durante la mitosis y meiosis), procesos de elongación de la célula y axones en crecimiento.
Transporte vesicular: crean un sistema de conexión como las vías de un ferrocarril que se originan en la estación central a lo largo de las
cuales ocurren el desplazamiento de estas vesículas.

Estrucutura:
Son estructuras poliméricas alargadas compuestas por partes iguales de tubulina alfa y beta.
Tienen un dímero de entre 20 y 25 nm, su pared de 5nm y consiste en 13 moléculas globulares dímericas de la proteína tubulina dispuestos
de forma circular.
Los dímeros se polimerizan cabeza con cola a partir de moléculas de tubulina alfa y beta los contactos longitudinales se entre los dímeros
se ligan en una estructura lineal llamada formando protofilamentos.
La polimerización de los dímeros requiere de la presencia de GTP y Mg2+. Cada molécula de tubulina fija GTP antes de incorporarse en el
microtúbulo en crecimiento. Luego el GTP se hidroliza quedando GDP. Esta estructura es polimerizada ya que todos los dímeros de
protofilamentos tienen la misma orientación.

Cada microtúbulo posee un extremo en crecimiento positivo + perteneciente a la tubulina beta que se alarga hacia la periferia y un
extremo creciente negativo – que corresponde a la tubulina alfa incluidos a los MTOC.
Las tubulina se asocian y disocian permanentemente lo que hace que haya tubulina sueltas en el citoplasma. Existen proteínas asociadas a
microtúbulos (MAP) que regula el armado de estos microtúbulos y lo fijan a orgánulos específicos. Las MAP también son responsables de
las poblaciones de microtúbulos estables (que no se despolimerizan) de la célula como por ejemplo los cilios y flagelos.
Como antes mencionado, los dímeros de tubulina poseen una inestabilidad dinámica cambiando de longitud de los microtúbulos. Los
dímeros de tubulina únicos a un GTP en el extremo en crecimiento están protegidos de su desarmado. En cambio, los unidos a un GDP son
propensos a despolimerizarse que conduce a un desarmado del microtúbulo.

Durante el desarmado, los dímeros de tubulina pierden su interacción lateral y los protofilamentos se enrollan cayendo hacia los costados
produciendo lo que se denomina extremos partidos.
El MTOC puede comparase con un camaleón cuando estira su lengua para captar un insecto.
La misma estrategia utiliza este con los microtúbulos “disparándolos hacia la periferia” para investigar el citoplasma. Cuando el
microtúbulo encuentra factores de estabilización como las MAP es capturado y cambia su comportamiento dinámico. Este proceso se

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denomina estabilización selectiva. Esto permite que la célula posea un sistema organizado de microtúbulos que vinculan orgánulos y
establezcan vas de comunicación.

El movimiento de los orgánulos intercelulares

Es generado por proteínas motoras asociadas a microtúbulos: las proteínas motoras se adhieren a estos orgánulos, o vesículas y los
arrastran por las guías de microtúbulos (hay gasto de ATP).
 Dineinas: son proteínas motoras que arrastran hacia el extremo minus (sin o poco crecimiento) es decir, desde la periferia hacia el
MTOC.
 Cinesinas: Se desplazan sobre los microtúbulos hacia el extremo plus + (con crecimiento) es decir, desde el MTOC hacia la periferia.
En la mitosis, los microtúbulos se superponen y gracias a las proteínas motoras se alejan cada un hacia un polo aliviando la superposición.

Estos microtúbulos están organizados formando centriolos:

Los centriolos, visibles al microscopio óptico, son cilindros citoplasmáticos cortos en pares que forman una vara, formados por 9 tripletes
de Microtúbulos. Presentan una orientación ortogonal, es decir, que se disponen en ángulo recto uno respecto del otro.
Se encuentran rodeados de aparato de Golgi cerca del núcleo.
El MTOC contiene estructuras que forman anillos que inician la formación del microtúbulo.
Sirve como lugar de inicio del ensamblaje de este que luego crece a partir del centrosoma hacia la periferia de la célula.
Cada anillo posee tubulina “Y” como “sitio de nucleación” para el crecimiento de estos, donde el extremo minus queda adherido al MTOC
mientras que el extremo en crecimiento es el extremo plus.
Los centriolos proporcionan cuerpos basales para los cilios y los flagelos. Los cuerpos basales inmaduros se denominan pro-centríolos. La
formación puede ser de dos maneras: acentriolar o centriolar.
 Formación acentriolar: sin contacto con los centriolos preexistentes, es decir, de novo.
 Formación centriolar: duplicación de centriolos existentes.

Cilios y Flagelos

Son prolongaciones de la membrana plasmática constituidas por Microtúbulos, responsables del movimiento de varios tipos de células
eucariotas.

Cilios: Miden alrededor de 10 um. Baten en un movimiento coordinado de atrás hacia adelante, de tal manera que la célula se desplaza a
través de un fluido o bien el fluido se desplaza sobre la superficie, una función importante en los animales es el movimiento de los fluidos y
del mucus sobre la superficie de las capas de células epiteliales. Un buen ejemplo
viene dado por las células ciliadas que recubren el tracto respiratorio, que lo limpian de mucus
y polvo.

Flagelos: Se diferencian de los cilios en su longitud (pueden llegar a medir 200 um) y en su tipo de batido que es ondulatorio. Las células
tienen generalmente uno o dos flagelos, que son responsables de la locomoción de varios tipos de protozoos y de los espermatozoides. La
estructura fundamental tanto de los cilios como de los flagelos es el AXONEMA฀ constituido x microtúbulos y sus proteínas asociadas. Los
microtúbulos se disponen en un patrón característico de “9+2” en el que un par central de microtúbulos se encuentra rodeado por nueve
dobletes de microtúbulos exteriores. Los
dobletes exteriores de microtúbulos se conectan al par central mediante espinales radiales y entre sí mediante puentes formados por una
proteína denominada nexina.

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Seminario nro. 8 Giusti

Fenómenos de producción de energía asociados a las mitocondrias

Comenzamos a analizar esta biología celular y molecular de las mitocondrias:

¿Desde cuándo comenzó a construirse el conocimiento experimental, celular y molecular de las mitocondrias?

Si bien, estas estructuras y el nombre mismo de mitocondrias provienen de siglo 19, cuando se observaba bajo microscopio óptica unos
pequeños orgánulos citoplasmáticos. El conocimiento más profundo de las mitocondrias, el que podemos considerar teórico, es el
conocimiento que forma parte de las teorías validadas sobre estas organelas comienza a surgir a mediados de los años 40 del siglo 20. Y
esta temporalidad está dada por el surgimiento de la microscopia electrónica que permitió, por primera vez a mediados de los 40, observar
a células bajo el microscopio electrónico y permitir analizar la ultraestructura de las organelas que sé que se encontraban dentro de la
célula. Fue entonces en los años 40 que comenzaron a evidenciarse la estructura de las mitocondrias; la estructura de la organela: una
membrana interna muy replegada sobre sí misma, estos repliegues de la membrana interna de denominan, crestas mitocondriales y una
membrana externa que limita con el espacio citosólico que es la membrana mitocondrial externa, no replegada sobre si misma, por ende,
con una superficie relativa mucho menor que la de la membrana mitocondrial interna.

Estas dos membranas concéntricas, por ende, definen dos clases de espacios dentro de las mitocondrias; el espacio contenido en el interior
de la membrana mitocondrial interna “la matriz mitocondrial” y el espacio contenido entre la membrana mitocondria interna y la externa,
que es el espacio intermembranoso; es decir, estos espacios y membranas de las mitocondrias que ustedes ya han analizado. Pero que se
definieron originalmente a partir del análisis de la microscopia electrónica.

Otra técnica que comenzó a desarrollarse también a los mediados de los 40 y con mayor fuerza en los años 50, fue la técnica que
estudiamos del fraccionamiento subcelular que permitió entonces de manera simultánea del análisis ultraestructural de las mitocondrias,
obtener preparaciones enriquecidas de mitocondrias a partir de un tejido determinado. La obtención de las tensiones mitocondriales.
Entonces permitió en estos años el análisis bioquímico, caracterizar cuales son los componentes lipídicos y proteicos que están contenidas
en las fracciones mitocondriales. En los años 50 se perfeccionaron las técnicas de fraccionamiento subcelular y a partir de esta fracción
mitocondrial, podrían realizarse pasos de purificación posterior, obteniendo un procedimiento que se denomina “fraccionamiento
submitocondrial” y que permite tener en tubos separados, los distintos componentes mitocondriales. Entonces el fraccionamiento
submitocondrial parte de la fracción mitocondrial, obtenido de un fraccionamiento subcelular y mediante centrifugaciones y
procedimientos, por ejemplo, la introducción de frox osmóticos en el medio del proceso, purificar las membranas mitocondriales internas
en un tubo; el contenido de la matriz mitocondrial en uno y el contenido de la membrana externa en otro, y así sucesivamente.

Este tipo de análisis permitió determinar que la composición de lipídica y proteica por ejemplo de la membrana mitocondrial interna es
muy diferente respecto al contenido de lípidos y proteínas de la membrana mitocondrial externa. Son dos membranas muy distintas entre
sí, en particular puede observarse que la membrana mitocondrial interna tiene un contenido proteico inusualmente alto pero las
membranas biológicas; las membranas biológicas en general por ejemplo la membrana plasmática o la membrana de las organelas como el
Retículo Endoplasmático y Aparto de Golgi tiene en general un promedio de 40% de proteínas en su composición total. En contra posición
con este valor de 40%, las membranas mitocondriales internas llegan a un contenido proteico del 75%, son inusualmente ricas en
proteínas.

Sin embargo, esta caracterización ultraestructural respecto de la disposición de las membranas y el análisis bioquímico que permitió esta
purificación mitocondrial dio durante mucho tiempo una imagen, un modelo de las mitocondrias de organelas estáticas de pequeños
bastones compuestos de doble membrana en el interior de la célula.

Pero las técnicas parte de las cuales hemos estudiado en los seminarios correspondientes a técnicas, permite hoy en día y han permitido
desde los años 50 observar las mitocondrias de células vivas y observar la dinámica temporal que tienen estas organelas en el interior de la
célula.

Descripción de video: En la que sus mitocondrias están marcadas con la proteína fluorescente verde, es decir la proteína fluorescente verde
se localizó en las membranas mitocondriales y se filmó a una mitocondria durante un lapso. Así es cómo se comportan las mitocondrias en
una célula viva.

¿Qué cosas notamos en este video respecto de la imagen que tradicionalmente había sido ilustrada por los libros?

Una de las características es que no vemos a la mitocondria como bastones, sino solemos ver toda una red de túbulos mitocondriales
unidos entre sí. Si siguen con detalle a uno de esos túbulos van a observarse que algunos de ellos se fisionan, se desprenden de otros

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túbulos generando pequeñas unidades mitocondriales. En estos casos esas subunidades se fusionan entre sí para formar un túbulo. Y
quizás el aspecto más sorprendente, es el hecho de que observamos movimientos en las mitocondrias. Lo que hoy sabemos entonces es
que las mitocondrias son organelas dinámicas. Es un movimiento producido a partir del movimiento de las mitocondrias sobre los
microtúbulos del citoesqueleto.

Es decir, las mitocondrias suelen poseer, tanto como en otras organelas, en su membrana mitocondrial externa vienen incluidas proteínas
motoras (Kinesina y dineínas) que se unen a los microtúbulos, por ejemplo, los que están en la célula y pueden moverse a lo largo de esos
microtúbulos; también poseen variantes de proteínas miosinas que les permiten desplazarse a través de los microfilamentos de actina.
Los fenómenos de fusión y fisión de mitocondrias están siendo activamente estudiados hoy en día, se encuentran alterados por ejemplo en
el contexto de ciertas enfermedades de neurodegenerativas, el párkinson, la segunda enfermedad neurodegenerativa en término de
frecuencia de aparición. Al analizar las neuronas que terminan muriendo, uno puede observar el modelo experimental que la dinámica de
fusión y fisión de las mitocondrias de esa célula se encuentra alterada, lo que aún desconocemos es qué relación existe entre los
fenómenos de fusión y fisión, y la muerte posterior de la célula.

¿Cuál es el origen de las mitocondrias?

En los años 60 en partículas en 1967, se desarrolló y se publicó una teoría evolutiva respecto del origen de las mitocondrias en la célula
eucariota. Una teoría que quizás ustedes ya han oído nombrar, que es la teoría endosimbiótica que interpreta la existencia de la
mitocondria en el interior de la célula eucariota como el reflejo de un fenómeno evolutivo, en el cual ciertas bacterias aeróbicas, que
podían utilizar el oxígeno molecular para producir, acoplando a procesos fisicoquímicos energía. Ingreso en el interior de las células
eucariotas primitivas que carecían originalmente de estas organelas y que las mitocondrias actuales entonces reflejan ese procedo de
endosimbiosis, que ocurrió de manera temprana en la célula eucariota.

Esta idea en términos de argumentación evolutiva que plantea Lynn Margulis fue la científica que desarrollo y encontró algunas evidencias
experimentales para esta teoría. La argumentación sigue la siguiente lógica, en el momento en el que surgen evolutivamente las primeras
células eucariotas, la atmosfera de la tierra carecía de oxígeno, las primeras células eucariotas evolucionaron en un ambiente anaeróbico.
Sin embargo y surgimiento posterior del proceso de fotosíntesis en las bacterias (ciertas bacterias fotosintéticas), permitió posteriormente
la acumulación progresiva del oxígeno molecular en la atmosfera. Y este cambio en el medio ambiente y la aparición de una atmosfera rica
en oxigeno condiciono la evolución posterior de las células eucariotas primitivas y aquellas células en donde que incorporaron bacterias
aeróbicas para utilizar el oxígeno moléculas como parte del proceso de producción de energía, tuvieron ventaja evolutiva respecto de
aquellas otras células que no lo hicieron, que terminaron desapareciendo.

La ventaja para la bacteria primitiva que ingreso a estas células procariotas es la disponibilidad de nutrientes en el citosol de la célula
predadora.

¿Qué evidencias presento Lynn Margulis? Y se generaron de manera posterior en apoyo a esta teoría endosimbiótica.

En primer lugar, ya se presentaba características simples no muy convincentes como por ejemplo la correspondencia del tamaño de las
bacterias y el tamaño de las mitocondrias, sin embargo, las evidencias más fuertes son otras por ejemplo el hecho de que cuando se le
analizan las proteínas especificas están expresadas en la membrana mitocondrial interna. Notemos que según el esquema la membrana
mitocondrial interna correspondería a la membrana proveniente a la bacteria en tanto que la membrana mitocondrial externa según esta
interpretación correspondería a la invaginación a la membrana plasmática, y hecho cuando uno analiza bioquímicamente los componentes
de la membrana interna, uno observa la presencia de proteínas que tiene mucha simbología con proteínas bacteriales. En tanto que la
composición de la membrana mitocondrial externa es muy similar a la membrana plasmática. Sin embargo, las evidencias más fuertes a
favor de la teoría endosimbiótica surgen del análisis de la replicación y el mantenimiento de las mitocondrias por ejemplo las mitocondrias
se dividen en el citoplasma a partes de mitocondrias preexistentes, esto refleja de alguna manera está capacidad típica de identidades
vivas que es la capacidad de autorreplicarse.

Y un hecho fundamental en apoyar en esta teoría fue el descubrimiento en la matriz mitocondrial, en la mitocondria propio genoma (ADN
mitocondrial). Que en el caso de genoma mitocondrial de células humanas. Si como el de muchas otras especies eucariotas el genoma
mitocondrial, es un genoma compuesta por ADN doble cadena, circular que refleja la estructura típica de los cromosomas bacterianos.

¿Cuál es contenido genético que posee este genoma mitocondrial humano?

Que tiene aproximadamente 16500 pares de bases de longitud, un genoma muy, muy pequeño, es un genoma que posee en total 37
genes, 13 de ellos son genes que codifican para proteínas, todas esas proteínas. 13 péptidos son péptidos que van a estas incluidas, luego
de su traducción en la membrana mitocondria interna, (si su destino celular final). Sin embargo, los otros genes contenidos en las
mitocondrias codifican pose ARN (ARNt y ARNr) dado que, dentro de las mitocondrias, acontecen los fenómenos de transcripción del

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genoma mitocondrial y de traducción de esos 13 polipéptidos mitocondriales que no utilizan las ARN de transferencia citosólicas, sino que
utiliza ARNt codificados por el propio genoma mitocondrial. Y los ribosomas que también están en la matriz mitocondrial contiene ARNr
codificados por estos genomas. La existencia de este sistema genómico en las mitocondrias es un apoyo muy fuerte a la teoría
endosimbiótica. Dado que refleja este genoma muchas características del genoma procariontes, no solo en esta estructura circular, sino
que al analizar la secuencia de los genes codificados en esté genoma, uno puede observar por ejemplo que los genes de estos polipéptidos
carecen de intrones, otra característica típica de los procariotas. Y durante la transcripción de esos genes suele generar transcriptos
policistrónicos, transcripto que contiene varios genes yuxtapuestos, otras de las características típicas de la transcripción procarionte.

Las mutaciones en el genoma mitocondrial también son origen de un conjunto de enfermedades genéticas, enfermedades de transmisión
mitocondrial que analizaremos específicamente durante la cursada de genética.
Esta noción de la existencia de un genoma mitocondrial a partir de la cual puede producirse 13 proteínas que van a estar incluidas en la
membrana mitocondrial interna, nos sugiere entonces que desde el punto de vista de su composición proteica las mitocondrias son un
sistema mixto.

Razonemos no son solo 13 polipéptidos los que alcanzan para completar la estructura y la función mitocondrial. La mitocondria tiene más
de mil proteínas diferentes que componen sus membranas mitocondriales interna y externa, como el contenido de la matriz y el espacio
intermembrana. Esa cantidad superior a mil proteínas como hemos visto no están codificados por el genoma mitocondrial, solo están
codificados 13 polipéptidos cuya localización es la membrana mitocondrial interna. El resto de esos péptidos esta codificado por el genoma
nuclear, y va a ser un proceso activo de traducción citoplasmática y posterior en relación con las mitocondrias, lo que permite a las
mitocondrias poseer el conjunto complejo de proteínas que las forman.

Este fenómeno, uno puede pensar ¿Cómo es posible? ¿Cómo es esto compatible con la teoría endosimbiótica?

El hecho que haya genes nucleares en el genoma nuclear que forma parte en la estructura de la mitocondria.
En el contexto de la teoría se supone que en un momento evolutivo ya pasado hubo una transferencia génica de parte del genoma
mitocondrial al genoma nuclear, permitiéndole a las células en donde había ocurrió esta transferencia de material genético mitocondrial a
nuclear, que le núcleo posee el control de la fisiología celular. Hubo una pérdida de independencia total de esa bacteria y quedo regulada
bajo la actividad del núcleo.

¿Cómo se localizan las proteínas mitocondriales, que son codificadas por el núcleo y traducidas en el citosol?, ¿Cómo se localizan en los
diferentes compartimientos mitocondriales?

Y de hecho vamos a utilizar uno de los conceptos que ya hemos analizado en seminarios anteriores y es el hecho que la localización de
proteínas en compartimientos específicos depende de la secuencia señal que están contenidas en la propia estructura primaria de las
proteínas. Dicho de otro modo, son secuencia de aminoácidos que forman parte de la cadena polipeptídica, las que suelen actuar como
señal para que los sistemas celulares localicen, ese polipéptido en un compartimiento determinado. Habíamos analizado en aquel
seminario que existían señales por ejemplo de localización nuclear, señales de exportación nuclear o péptido señales que inducían en la
incorporación de proteínas hacia la luz del retículo endoplásmico.

De manera análoga existen señales de localización mitocondrial, desde el punto de vista experimental, sabemos mucho más de aquellas
señales de incorporación mitocondrial que dirige a componentes proteicos a la matriz mitocondrial específicamente. Estas secuencias
señales van a dirigir la incorporación del polipéptido a la matriz mitocondrial está caracterizado por ser una secuencia de aminoácido que
está en el extremo N-terminal de la proteína. Y suele caracterizarse porque esa secuencia adopta rápidamente una estructura secundaria
de alfa hélice y esa alfa hélice tiene características bioquímicas muy particulares, es una alfa hélice anfipática, esto quiere decir, sus
costados tienen características fisicoquímicas distintas. Sobre uno de los costados de esta hélice se acomoda cierto residuo aminoacídico
básico, es decir que tienen carga electrónica positiva al pH celular, ósea uno de los costados de esa hélice está cargado positivamente. El
otro costado (opuesto), se acomoda en esa estructura aminoácido que tiene residuos hidrofóbicos, por ende, llamamos a esta alfa hélice
anfipática, de un lado posee cargas positivas y del lado opuesto posee residuos hidrofóbicos. Y es esa configuración, polarizada anfipática
que será reconocida por ciertos componentes de las membranas mitocondriales que van a actuar como un receptor de esta señal de
importación mitocondrial.

Los principales componentes de este sistema de importación de proteínas sintetizadas originalmente en el citosol. Los transportadores
principales, las proteínas transmembrana que actúa tanto como receptor de la secuencia señal y que participan del proceso de importación
de proteína. Hay 2 grandes complejos de transportadores: uno localizado en la membrana mitocondrial externa se denomina “complejo
TOM” (transportador de la membrana externa). El complejo TOM posee un receptor para la secuencia señal, la alfa hélice anfipática de
estas proteínas y permite la incorporación (la inyección) de esa proteína hacia el espacio intermembrana, En el espacio intermembrana
podrá interactuar con los complejos principales de la membrana mitocondrial interna que se denomina de manera análoga “complejo TIM”
(transportadores de la membrana interna).

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Entonces es la acción secuencial de los complejos TOM y el complejo TIM lo que permite la incorporación de estas proteínas mitocondriales
por ejemplo en el caso de que la localización final de estas proteínas sea la matriz mitocondrial.

Otro complejo adicional, por ejemplo, el complejo SAM en la membrana mitocondrial externa, permite la incorporación de aquellas
proteínas que tiene como localización especifica la membrana mitocondrial externa. Por ejemplo, una de las familias de proteínas que
están enriquecida en la membrana mitocondrial externa son un conjunto de proteínas denominadas porinas. Y se denomina de ese modo
porque son proteínas que tienen muchos pasos transmembrana y generan poros proteicos en la membrana mitocondrial externa, lo que le
confiere a la membrana una de sus características centrales e instintivas respecto de la membrana mitocondrial interna que es su alto
grado de porosidad. Por ejemplo, si analizamos el contenido iónico y de moléculas pequeñas que están presentes en el espacio
intermembrana respecto del espacio citosólico, veremos una enorme correspondencia en alta similitud, esto está dado por la distribución
permitida a través de la enorme cantidad de proteínas que presentan en la membrana mitocondrial externa. Todas las proteínas están
codificadas por el genoma nuclear y son incorporados a la membrana mitocondrial externa a partir de estos complejos SAM.

Otro complejo OXA, permite la incorporación a la membrana mitocondrial interna de aquellos péptidos que son producidos, traducidos en
la matriz mitocondrial y que surgen de la traducción del genoma mitocondrial. Esas proteínas entonces originalmente sintetizadas en la
matriz, solo esos 13 polipéptidos codificados del genoma mitocondrial serán incorporados a la membrana mitocondrial interna a través del
complejo OXA.

Recordemos que los 13 polipéptidos tienen una localización en la membrana mitocondrial interna. Esto implica por ejemplo todas las
proteínas solubles de la matriz mitocondrial están también codificadas por el genoma nuclear.
Si analizamos este proceso de incorporación especifica de proteínas hacia las mitocondrias. Debemos mencionar 2 aspectos, en primer
lugar, el hecho de la incorporación de proteínas hacia las mitocondrias implica una incorporación que es postraduccional, las proteínas son
completamente traducidas en el citosol y solo posteriormente son incorporadas a la matriz mitocondrial, esto contrasta con la
incorporación cotraduccional, por ejemplo, que ocurrirá a nivel de la luz en el retículo endoplasmático. Y esta incorporación cotraduccional
esta facilitada y permitida por el hecho que las proteínas suelen no plegarse completamente, antes de la incorporación de las mitocondrias.
Y este mantenimiento de un estado de no completamente plegado se debe a la acción de un conjunto de proteínas chaperonas
citoplasmáticas y mitocondriales.

En otras palabras, aquellas proteínas que tienen como destino la mitocondria, que son traducidas en el citosol, suele interactuar de manera
muy fuerte con un conjunto de proteínas chaperonas citosólicas que pertenecen a la familia hcp70. Como saben las chaperonas, una de las
funciones generales que tiene es permitir el correcto plegamiento de las proteínas. Y de hecho chaperonas de esta familia pueden
interactuar con un conjunto muy diverso de proteínas, porque reconocen la señal de reconocimiento de las chaperonas, no es otra cosa los
parches hidrofóbicos de los residuos de aminoácidos que forman parte del polipéptido. Intentemos comprender la lógica por el cual esta es
una señal para las chaperonas, una proteína que se pliega en el citosol, de manera espontánea dado que el citosol es un ambiente acuoso.

Aquellos residuos polares que tengan carga electrónica van a interactuar de manera facilitada con el ambiente acuoso y polar del citosol.
En tanto que los residuos no polares hidrofóbico de proteína, suele unirse entre sí y ser repelidos por el ambiente acuoso del citosol.
Suelen quedar en el interior de esa estructura globular que adopta la proteína. Un mal plegamiento entonces podría ser señalizado porque
un parche hidrofóbico, no pudo ser incorporado en el interior del péptido y queda expuesto al ambiente acuoso. Y justamente las
chaperonas reconocen (identifican) estos parches hidrofóbicos en la superficie de la proteína. En el caso de las proteínas mitocondriales a
medida que esta proteína está siendo sintetizada los parches hidrofóbicos, son reconocidos de manera secuencial por estas chaperonas,
permitiendo la interacción con el conjunto TOM de manera parcialmente desplegado. Estas chaperonas también se encuentran en su
variante mitocondrial, chaperonas mitocondriales de la misma familia, se encuentran en la matriz mitocondrial ayudando al proceso de
incorporación. De hecho, la existencia de estas chaperonas nos permite entender a esté proceso de transporte desde el punto de vista
termodinámico; es decir desde el punto de vista de la utilización de la energía. Porque sí pensamos que la localización de una proteína
implica un ordenamiento de la célula; desde el punto de vista termodinámico este ordenamiento, esa reducción de la entropía celular, es
un proceso no espontaneó que requerirá la utilización de energía para poder producirse.

¿Dónde está la energía invertida desde el punto de vista celular en este transporte?

Parte de esa inversión de energía está dada en la actividad de las chaperonas. Porque las chaperonas no suelen unirse de manera
irreversible, sino que, suelen unirse y despegarse de manera sucesiva de los péptidos a los que están asociados. Y cada una de estas
uniones y despegues esta catalizada por ruptura de ATP, entonces la unión de las chaperonas es un proceso que utiliza la energía
almacenada en el ATP.

Otro fenómeno es el hecho de que de manera indirecta este proceso esta favorecido por la existencia en la membrana mitocondrial
interna, de una diferencia de voltaje (de una diferencia de cargas eléctricas) leve entre las dos caras de la membrana mitocondrial interna.
Esa diferencia de cargas está dada por la propia actividad de las mitocondrias, por el funcionamiento de la cadena de transporte de

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electrones, como parte del proceso de generación de energía. Y pensemos que esta distribución asimétrica de cargas a lo largo de la
membrana mitocondria interna es tal, que la matriz suele ser negativa con respecto del espacio intermembrana. Entonces dado que los
péptidos que ingresan a la matriz mitocondrial tienen como péptido señal alfa hélice cargado positivamente, son las cargas electrónicas
negativas del interior de la matriz mitocondrial, lo que favorece el desplazamiento de ese péptido hacia el interior de la matriz. Podemos
pensar como un fenómeno de electroforesis, el movimiento de una partícula en función de un campo eléctrico.

Veremos que el mantenimiento de estas diferencias de cargas es un proceso energéticamente costoso para las mitocondrias.
Otros factores importantes de las mitocondrias en el interior de la célula:

Las mitocondrias participan de un fenómeno bioquímico denominado esteroideo-génesis, que se refiere a la producción de hormonas
derivadas del colesterol (ejemplo. Testosterona, los estrógenos son hormonas esteroideas). Y la fabricación de esas hormonas desde el
punto de vista celular hay algunos pasos que ocurren en las membranas mitocondriales. Si bien la mayor parte de la síntesis de las
moléculas derivadas del colesterol ocurren, tal como lo hemos visto en las membranas del retículo endoplasmático. Hay algunos pasos
bioquímicos que acurren exclusivamente en las membranas mitocondriales. De hecho, existen contactos entre la membrana del retículo
endoplasmático y las membranas mitocondriales que permiten el pasaje de sustratos de una membrana a la otra. Por ejemplo, el primer
paso de la biosíntesis desde el colesterol hacia hormona esteroidea; es el paso del colesterol a un sustrato llamado pregnelonona. Y este
paso bioquímico, la enzima que convierte al colesterol a pregnelonona, tiene localización mitocondrial. Luego de estos contactos
mitocondria- retículo la pregnelonona para, difundir hacia la membrana del retículo en donde las enzimas posteriores convierten a esta
pregnelonona de manera única en hormona esteroidea.

Reservorio de calcio. El ion Ca+2 cumple una función central en regular la actividad de un enorme conjunto de proteínas intracelulares, por
ende, en condiciones basales, el ion calcio se encuentra en concentraciones bajísimas en el citosol y altamente reguladas. Dentro de las
células el calcio se encuentra secuestrado. Ante fenómenos de señalización especifica liberado en estas organelas en la luz del Retículo
Endoplasmático, ese es el principal reservorio de calcio intracelular. Pero las mitocondrias, la matriz mitocondrial es el reservorio
secundario dentro de la célula.

Participa de los fenómenos de señalización que conduce al proceso de muerte celular programada. La liberación de ciertos componentes
mitocondriales hacia el citosol es un fenómeno de señalización que suele indicar a la célula (suele activar en serie de proceso celular) que
conducen a la muerte celular.

Síntesis de ATP celular por parte de las mitocondrias

¿Qué entendemos por reacciones químicas acopladas?

Desde el punto de vista energético las reacciones químicas desde el punto de vista termodinámico, las reacciones químicas pueden ser
espontáneas (ocurrir espontáneamente) o necesita energía para poder ocurrir. Esta distinción fundamental respecto de la espontaneidad
de una reacción de su requerimiento de energía para ocurrir distingue a estas reacciones, como reacciones espontaneas asociadas a la
liberación de energía, por ende, exergónicas y las distingue (las opone) a aquellas reacciones que solo pueden ocurrir por el consumo de
energía, las reacciones endergónicas que por ende son no espontaneas. Osea el concepto de reacción espontánea y no espontaneas esta
enteramente ligado a sí una reacción libera energía cuando se produce o si necesita absolver energía para producirse.

¿Qué reacciones dentro de la célula son reacciones que implican el consumo de energía?

En términos químicos, la necesidad de energía o liberación de energía está asociado a la ruptura o formación de enlaces químicos
covalentes. Porque un enlace químico covalente implica energía almacenada por los electrones de ese enlace.
Procesos que implican la ruptura de esos enlaces covalentes, libertan energía al medio ambiente como reacciones espontaneas y tanto
que, si queremos formar enlaces covalentes, es decir queremos almacenar energía en esos enlaces, necesitamos energía del medio
ambiente para producirlos; y por ende son reacciones importantes. Dentro de la célula reacciones no espontaneas serian, por ejemplo. La
formación de todos los enlaces que conducen a la agrupación de polímeros a partir de monómeros. La generación de largas moléculas de
ácidos nucleicos a partir de nucleótidos libres, la producción de péptidos a partir de aminoácidos, por ejemplo. Son reacciones no
espontanea que típicamente ocurren dentro de la célula.

¿Cómo es posible entonces, de donde se obtiene la energía que necesitan estas reacciones espontaneas para producirse?

El hecho es que dentro de las células las reacciones químicas pueden acoplarse, esto implica que sí 2 reacciones químicas ocurren de
manera simultánea en tiempo y en gran proximidad espacial, la energía liberada por ejemplo: una reacción espontánea puede ser utilizada
por la reacción no espontanea que está ocurriendo en ese momento y lugar para poder producirse Y en ese sentido decimos que las 2

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reacciones están acopladas, ocurren en el mismo sector espacial en el mismo tiempo y la energía liberada por una de las reacciones es
utilizada para la producción de la otra. Este es el concepto de acoplamiento de 2 reacciones químicas desde el punto de vista energético.

Dentro de las células la reacción espontánea que típicamente suele asociarse a la producción de reacciones no espontaneas es la ruptura
de un enlace covalente presente en una molécula de ATP, para liberar este grupo P (fosfato) y ADP. Esta reacción de ruptura de enlace
covalente pasando de ATP a ADP+P es una reacción espontánea y exergónica (libera energía). Y suelen ser la reacción que típicamente es la
célula con otras reacciones que requieren la incorporación de energía. Esto implica entonces que una célula que está acoplando este tipo
de reacciones, está rompiendo moléculas de ATP para generar, para fomentar reacciones que morirían de otro modo si no utilizara esta
energía liberada, esto implica que esas células con el tiempo van disminuyendo sus cantidades de ATP. Porque todo el ATP que tienen las
células en un momento dado, está siendo transformado de manera continua a ADP+P.

¿Cómo es posible que las células regeneren sus cantidades internas de ATP?, ¿Cómo se produce la reacción contraria (la generación de ATP
a partir de ADP+P)?

La respuesta a esta pregunta es la que nos va a permitir comprender la función fisiológica de las mitocondrias en la interior célula.
Otro concepto clave que nos va a permitir llegar a ese concepto son otras reacciones. Reacciones de oxido-reducción como seguramente
han estudiado en química. Recordemos conceptos centrales de las reacciones oxido-reducción: cuando hablamos de reacciones de oxido-
reducción hablamos de reacciones en donde no necesariamente participa el oxígeno molecular como molécula. Entendemos entonces por
reacciones de oxido-reducción, reacciones en donde una molécula sede electrones a otra segunda molécula. La molécula que sede
electrones diremos que se ha oxidado y la molécula que acepta los electrones cedidos por la primera sea reducido, por ende, estas
reacciones de transferencia de electrones implican siempre un par de oxido-reducción, siempre abra una molécula que se oxide, cede
electrones, y necesaria mente otras moléculas que las incorpore. Si pensamos en la combinación de esta noción de reacciones de oxido-
reducción con los criterios termodinámicos que vimos recién, también podemos decir que estas reacciones de oxido-reducción pueden ser
espontaneas y no espontaneas; es decir liberar energía o necesitar energía para producirse.

¿En qué condiciones estas reacciones de oxido-reducción son espontaneas y liberan energía?

Esto ocurre cuando, pensando en propiedades intrínsecas en las moléculas, en la capacidad que tiene cada una de las moléculas de atraer
electrones o de cederlos. Porque según sus características fisicoquímicas particulares una molécula tiene una determinada capacidad,
atracción por los electrones que puede ser diferente de la capacidad de atracción de una molécula diferente. Y podemos cuantificar a esta
magnitud que hemos denominado capacidad de atraer electrones y esa magnitud en términos cuantitativos se denomina potencial de
reducción de una molécula. Y si una molécula tiene mayor potencial de reducción que otra, es decir mayor capacidad de atraer electrones,
ese fenómeno de incorporar electrones de la primera molécula será espontánea y liberar energía. Entonces las reacciones de oxido-
reducción son espontaneas cuando los electrones pasan de una molécula de menor potencial de reducción a una que tiene mayor
potencial de reducción, una mayor capacidad de atraer electrones.

Y analizamos estas reacciones por que veremos que son centrales en los procesos de producción de ATP por parte de las mitocondrias, de
hecho estas preparaciones de reacciones de fracciones mitocondriales, que les había comentado que se inició a partir de los años 40 y 50,
fueron estas preparaciones los que le permitieron a los bioquímicos determinar cuáles son los sustratos que necesitaban las mitocondrias
para producir ATP y una de las primeras cosas que observaron es que muchas de las reacciones químicas que acontecían en estas
fracciones mitocondriales eran reaccione de oxido-reducción.

¿Y cuáles son las moléculas que van a comenzar a oxidarse progresivamente?

Son moléculas originalmente contenidas en los alimentos, hidratos de carbono y lípidos.

Tenemos que analizar una restricción bioquímica dentro de las células, estos fenómenos de oxido-reducción cuando ocurren catalizados
por enzimas en el contexto celular implican un desafío para las enzimas, porque las estructuras proteicas de las enzimas suelen no estar
preparadas para ser buenos aceptores de electrones entre una molécula que se oxida para dárselos a una molécula que se reduce. Esta
dificultad de las estructuras peptídicas para participar de este fenómeno de oxido-reducción, suele estar acompañada por una serie de
moléculas auxiliares dentro de la célula que participan como aceptores temporales de los electrones en las reacciones enzimáticas. Y de
hecho ustedes ya han visto los nombres de estas moléculas químicas que actúan como aceptores temporales de electrones pensando en la
propia dificultad de estas enzimas como aceptores. Por ejemplo, una de estas moléculas que participan como aceptores temporarios de
denominan coenzimas y suelen estar formadas por moléculas orgánicas derivadas en muchos casos de nucleótidos.

Una coenzima principal que participa de fenómenos de oxido-reducción de los hidratos de carbono y los lípidos que van a culminar con la
síntesis de ATP celular, es la molécula de discontinuidad de dinucleótido, que tal como lo hemos planteado aquí sí puede participar en
fenómenos de aceptación y ceder electrones podemos encontrarlo en la célula de dos formas: en su forma oxidada, es decir cuando aún no

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ha incorporado a los electrones sino que ya los ha cedido y en una segunda forma cuando ha incorporado los electrones que será la forma
reducida. La forma oxidada de esta molécula en NAD+ es cuando este dinucleótido de adenina y nicotinamida aún no ha incorporado
electrones y tiene una carga eléctrica neta positiva, esa es la forma oxidada de esta coenzima. Una molécula de NAD oxidad tiene la
capacidad, tiene un potencial de reducción tal que le permite incorporar 2e- a su estructura, puede participar de una reacción de oxido-
reducción donde una molécula cede 2e- y son capturados (almacenados) temporariamente esos 2e- por la molécula de NAD. Ahora

¿Cuántas cargas eléctricas tendrá la forma reducida de este aceptor temporal de electrones, si originalmente tenía una carga eléctrica
positiva?

Al incorporar 2e- tendrá una carga eléctrica negativa, sin embargo, hay presente muchos protones cargas positivas (influyen en el pH
celular), cationes de hidrogeno (H+) en el medio, ese NAD que ahora una carga negativa ahora va a incorporar simplemente del ambiente
celular un hidrogeno y va a quedar como NADH. Entonces es que la diferencia de la forma oxidad y la reducida, desde el punto de vista
funcional la importancia no está dada por ese protón (H+) sino por esos 2e- que ha incorporado. El protón que incorpora posteriormente es
simplemente un fenómeno suplementario que contra resta la carga negativa dado que hay presente en el medio celular protones.
Otra coenzima que también es frecuente en los fenómenos metabólicos y participa como aceptor temporario de electrones es la molécula
de FAD que un dinucleótido también en este casi de adenina y flavina. De manera análoga este dinucleótido FAD puede existir en 2 formas
oxidada y reducida, su forma oxidada es cuando aún no ha incorporado esos electrones y su forma reducida es cuando ya los ha
incorporado. Dado que la molécula de FAD en estado basal no tiene carga eléctrica (carga eléctrica neutra) luego de la incorporación de los
electrones, quedará con 2 cargas eléctricas positivas incorporará entonces 2 protones del medio ambiente y su forma reducida será
FADH2. Nuevamente esos protones que ha incorporado no son los que le va a dar la importancia funcional sino los 2e- que ha incorporado
en las reaccione de oxido-reducción.

¿Cuál es la diferencia fundamental ente NAD+ y NADH?

La diferencia fundamental es que NADH tiene 2e- más que NAD+, desde el punto de vista fisiológico Esto que hemos descrito hasta ahora
nos va a permitir explicar la obtención de ATP y la regeneración de ATP por parte de las mitocondrias a través de catabolismo de los
hidratos de carbono.

Concepto de catabolismo: Nos referimos a catabolismo como una parten de metabolismo, el metabolismo de forma global es todos los
conjuntos de reacciones químicas que ocurren dentro de la célula.
La ruptura de enlaces covalentes la generación de sustancias más simples a partir de sustancias más complejas son las que denominamos
catabolismo. Dicho la ruptura de enlace covalentes presentes en los hidratos de carbono y en los lípidos que consumimos como alimento,
van a formar parte de estas reacciones catabólicas que van a conducir a la liberación progresiva de energía por parte estos enlaces y que
tenemos que entender como esa liberación de energía se va a reflejar en la producción de ATP celular.

Por ejemplo, nosotros utilizamos la energía obtenida de los enlaces covalentes de los azucares, de los hidratos de carbono que los
consumimos con la dieta, a lo largo de nuestro tubo digestivo los hidratos de carbono complejo son rotos a monosacáridos que son
incorporaos a nivel intestinal en el torrente sanguíneo y luego a partir del torrente sanguíneo son incorporados en el interior de todas las
células, a través usualmente facilitado este proceso por la acción de la hormona insulina.

¿Qué ocurre entonces en el citosol de la célula una vez ingresa estos hidratos de carbonos simples? Ocurre una serie de 3 procesos que van
a culminar con la producción de ATP celular utilizando la energía covalente de esos monosacáridos.

 Proceso: La glucolisis que ocurrirá en el citoplasma

 Proceso: El ciclo de Krebs
 Ocurre en la mitocondria
 Proceso: la cadena de transporte de electrones

Glucolisis:
Es una pequeña vía metabólica compuesta por 10 reacciones que implicara la ruptura de un monosacárido de 6 carbonos en 2 moléculas
de 3 carbonos, en este proceso nosotros tenemos que comprender que la energía que contienes esos enlaces covalentes que fueron rotos
serán almacenas temporariamente en otras moléculas celulares.
Los primeros pasos de la glucolisis implican en realidad procesos endergónicos, que gastan energía, dado que hay una fosforilación doble
del sustrato original consumiendo en este paso 2 moléculas de ATP. Pero desde el punto de vista energético esas moléculas de ATP, esa
energía invertida dado que se rompieron 2 ATP para fosforilar a estos sustratos serán recuperado en momentos posteriores de esta misma
vía metabólica. Nos concentraremos en los últimos pasos finales de la glucolisis, en particular en que parte de la energía contenida en estos
enlaces covalentes, va a ser almacenada en la forma de 2 coenzimas reducidas.

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¿De dónde provienen entonces los electrones de las 2 moléculas de NADH que se han formado?

Esas 2 moléculas de NADH ¿Cuántos electrones han incorporado en total? Cada una de estas moléculas incorporo 2 electrones.

¿De dónde provenían esos electrones, donde estaban originalmente?

En los enlaces covalentes que formaban a este monosacárido, la energía de esos electrones entonces se ha desplazado, ahora está
contenida en las moléculas de NADH que han incorporado (se han reducido) de manera simultánea a la ruptura de esos enlaces. Entonces
este proceso implico la oxidación de las moléculas de monosacárido, la perdida de electrones por parte de esta molécula y la reducción (el
almacenamiento de estos electrones de alta energía en la coenzima) de las coenzimas.

Otro aspecto, es el hecho de que también en la glucolisis se produce ATP de una manera bastante directa. Hay enzimas que pueden
transferir directamente estos grupos fosfato, de estos intermediarios de 3 carbonos, a moléculas de ADP para formar de manera directa
ATP y esta forma enzimática de generación de ATP mediante la transferencia de un grupo fosfato de un sustrato orgánico al ADP para
formar ATP es un modo de producción de ATP, que se denomina fosforilación a nivel de sustrato. Veremos q este modo desde el punto de
vista bioquímico es muy ineficiente, en esa reacción hay mucha energía que se disipa en forma de calor y que no queda almacenada
finalmente en el enlace covalente entre el grupo fosfato y el ADP. Veremos entonces que desde el punto de vista bioquímico las
fosforilaciones a nivel del sustrato resultan una excepción, no son muy frecuentes dentro del metabolismo; pero vamos a utilizarla por que
veremos que durante mucho tiempo fue la única hipótesis que tenían los bioquímicos respecto a cuál era el modo de producción de ATP
dentro de las células. Durante mucho tiempo se sospechó que la generación de ATP celular se debía a todas ha fosforilaciones a nivel de
sustrato.

¿Qué ocurre una vez que se generan como consecuencia de la glucolisis estas 2 moléculas de 3 carbonos denominada ácido piruvato o
pirúvicos?

Esas moléculas que aun contienen energía en sus enlaces covalentes son incorporadas hacia la matriz mitocondrial a través de
transportadores específicos. Y ocurre dentro de la matriz mitocondrial una primera reacción que es la reacción de descarboxilación de ese
piruvato, es decir esta molécula de 3 carbonos en la matriz mitocondrial, en una reacción enzimática se va a escindir a romper un enlace
covalente liberando a ese átomo de carbono en la forma de dióxido de carbono. Parte de la energía liberada por la ruptura de este enlace
covalente va a ser almacenar 2e- nuevamente en una coenzima, en donde una molécula de NAD+ se transforma, se reduce a una molécula
de NADH y se produce la unión de esta molécula restante que ahora tiene 2 carbonos que llamamos grupo acetilo (C-C) la unión a una
molécula orgánica que está presente en la matriz mitocondrial y que denominamos Coenzima. Que también es nuevamente un derivado
complejo de un nucleótido.

¿Cuál es la lógica bioquímica de la incorporación de este grupo de 2 carbonos, esta unión covalente a un átomo de azufre que es el átomo
terminal de la Coenzima?

Una de las razones que podemos dar que sea interpretado con respecto a la evolución de esta reacción desde el punto de vista energético,
es el hecho de que la energía contenida en este enlace covalente que se ha roto es muy grande y la energía liberada por la ruptura de ese
enlace no está contenida de manera completa en la coenzima reducida, la energía restante se utiliza para formar un enlace covalente con
la molécula de la Coenzima.

Dicho de otro modo, la formación de estos enlaces con la Coenzima es una forma de no disipar la energía que aun contenía ese enlace
entre los 2 carbonos que ha sido roto, el enlace entre el carbono y el átomo de azufre es un enlace que tiene menor energía que el enlace
originalmente que se había roto la molécula y es preservado (para evitar su disipación en forma de calor) como un enlace temporario, y
luego va a ser utilizado en posteriores reacciones. Es decir, no tenemos que pensar en los enlaces en términos absolutos, hay enlaces que
tienen mayor energía que otros, entonces romper un enlace de alta energía para formar coenzimas reducidas y además formar un enlace
de menor energía, es una forma de preservar esta energía que ha quedado en este segundo enlace para evitar que se disipe en forma de
calor. Y esa es la lógica de unir este grupo acetilo a la Coenzima.

Esta primera reacción de descarboxilación para formar acido piruvato y Acetil-Coa, es una reacción que ocurre en la matriz mitocondrial
gracias a un complejo enzimático presente en la matriz mitocondrial que es el complejo del piruvato deshidrogenasa. Tiene muchas
particularidades este complejo enzimático piruvato deshidrogenasa, en primer lugar es enorme dese el punto de vista macromolecular,
está compuesto de más de 30 subunidades peptídicas que forman un complejo de 3 clase de enzimas distintas, es mucho más grande que
las enzimas monoméricas que cundo uno genera preparaciones, fraccionamientos subcelular en donde uno puede purificar los
componentes de la matriz mitocondrial y observar esos componentes de la matriz mitocondrial al microscopio electrónico, uno puede
observar las estructura de estos complejos macromoleculares, en general no es frecuente que uno no observa a las proteína de manera

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directa en el microscopio electrónico, suelen ser muchos más chicas que el poder de resolución del microscopio. Pero podemos observar
estos complejos formados por un gran número de polipéptidos.

Existen mutaciones de algunos de los componentes moleculares de este complejo que origina enfermedades metabólicas en humanos.
Imaginemos cuales serían las consecuencias de que mutaciones en proteínas en alguna de estas 3 clases de esta enzima que forma parte
de este complejo, haga que este complejo disminuya su actividad, la consecuencia de estas mutaciones es que estos individuo tiene
reducida capacidad de extraer energía a partir de los hidratos de carbono por ejemplo; la dustristasa la generación de Acetil CoA a partir
del piruvato se encuentra disminuida en términos de velocidad, y de hecho uno de los síntomas característicos de estos sujetos es la
letargia, es la dificultad del movimiento, no pueden moverse y suelen tener síntomas musculares y neurológicos, aquellos 2 tejidos que
tienen mayor consumo de ATP. Digo entonces que estas mutaciones implican en los pacientes disminución de la actividad de la piruvato
hidrogenasa, por que pensemos en que ocurriría en aquellas mutaciones que anularan la actividad de la piruvato hidrogenasa

¿Qué consecuencias esperaríamos?

Esas mutaciones son letales, no permiten la supervivencia del individuo. De hecho, comprender el funcionamiento de este complejo
enzimático central para el metabolismo permitió dilucidar la etiología de una patología que hoy sabemos que es una deficiencia nutricional,
estoy hablando de la enfermedad beriberi. Es una enfermedad se debe a una deficiencia vitamínica, de la vitamina B1(tiamina), como hoy
sabemos que la tiamina o vitamina B1 es un cofactor necesario para que el piruvato deshidrogenasas funcione de manera efectiva.

¿Qué les ocurría a los pacientes que tenían esta deficiencia nutricional?

Síndrome de aletargamiento y sin signos neurológicos y musculares. Y comprender cuál fue el mecanismo molecular por el cual los
individuos que padecían de beriberi la padecían. Reconocer que esto era una deficiencia nutricional cuando originalmente se pensaba que
era un tipo de bacteria o virus el que producía estos signo y síntomas permitió generar políticas públicas de suplementos de los alimentos,
especialmente con vitamina B1 para erradicar esta deficiencia nutricional. De hecho, beriberi en el lenguaje de los locales significa “no
puedo, no puedo” justamente reflejando este aletargamiento que tenía los individuos que tenían beriberi.

Comprender estos mecanismos moleculares nos permite diseñar estrategias de prevención primaria de la salud, saber con qué
suplementar los alimentos para evitar una epidemia des nutricional, es decir nos permite operar en ambas estrategias, estrategias de cura
y tratamiento, y también estrategias de prevención primaria de la salud. Recordemos que son justamente estas estrategias las de
prevención primaria de la salud, las que la organización mundial de la salud propone como estrategias centrales para mejorar la salud
como objetivo global. Dice la organización, no solo debemos invertir en medicina personaliza.

¿Cuál es la próxima reacción que ocurre con el Acetil CoA en el interior de la matriz mitocondrial?

La próxima reacción es una serie de reacciones denominadas ciclo de Krebs, ciclo de ácido cítrico o ciclo de los ácidos tricarboxilicos.
Nosotros esperamos la ruptura progresiva de los enlaces covalentes que están contenidos en el grupo acetilo como los pasos posteriores
para completar la liberación de energía del metabolismo. Y esta idea de ruptura progresiva de los enlaces covalentes choca con la primera
reacción que implica la unión de estos 2 carbonos a una molécula de 4 carbonos el oxalacetato para formar una molécula de 6 carbonos,
que es el ácido cítrico. Entonces lo anti intuitivo es que la primera reacción del ciclo de Krebs forma moléculas más grandes, en vez de
romper progresivamente los enlaces.

Desde el punto de vista bioquímico esto se puede explicar porque estos intermediarios del ciclo de Krebs son, a pesar de tener un mayor
número de carbonos, desde el punto de vista de reacciones enzimáticas van a ocurrir, son más factibles de sus enlaces covalentes de
romperse a través de reacciones enzimáticas. Es decir, estas moléculas que se generan tienen un mayor grado de facilidad en términos de
reacciones bioquímicas de ser sustratos de enzimas que rompan sus enlaces covalentes, desde el punto de vista bioquímico la ruptura de
los enlaces en el formato del grupo acetilo unido al acetil CoA tiene un mayor grado de dificultad enzimática. La producción de moléculas
de mayor numero de carbonos pero que finalmente van a permitir la ruptura progresiva de estos enlaces covalentes liberando a los 2
carbonos en forma de dióxido de carbono, estas moléculas de dióxido de carbono no polares pueden difundir de manera simple a través de
las membranas mitocondriales y de la membrana plasmática y serán seguramente incorporadas a una molécula de hemoglobina que pase
por un vaso sanguíneo cercano y luego se va al sistema pulmonar donde se produzca el cambio de gases.

Pero desde el punto de vista energético nuevamente la ruptura de esos enlaces covalentes implicara la liberación de electrones de alta
energía que serán capturados por las coenzimas generando NADH a partir de NAD y FADH2 a partir de FAD y que estas series de reacciones
recibe el nombre de circulo porque el último producto vuelve a ser la molécula de 4 carbonos que participo en la primera reacción. Mas
haya entonces de que las secuencias de estas reacciones permitan la ruptura de los enlaces covalentes que estaban comprimidos
originalmente en la molécula de acetato y que originalmente si seguimos el camino hacia atrás de la molécula del monosacáridos van a

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analizas, que muchos intermediarios del ciclo de Krebs pueden ser utilizados como sustratos para reacciones anabólicas. Por ejemplo, una
de estas moléculas carbonadas en vez de seguir en el ciclo de Krebs puede ser utilizadas para generar (producir) algunos aminoácidos.

Por eso el ciclo de Krebs es un núcleo del metabolismo, contiene un conjunto de moléculas que puede el origen de unas ciertas reacciones
de anabolismo o el destino de catabolismo, del mismo modo la degradación de aminoácidos puede generar componentes que ingresan al
ciclo de Krebs y que contribuyan a la producción de energía. Entonces lo que tenemos que pensar a medida que el ciclo de Krebs progresa a
medida que estas reacciones ocurren comienzan a acumularse en la matriz mitocondrial, coenzimas reducidas comienzan a acumularse
NADH y comienza a acumularse FADH2 allí está contenido la energía de electrones de alta energía que originalmente estaban en los
enlaces covalentes de los alimentos. Del mismo modo el ciclo de Krebs nos permite comprender como se genera energía a partir de los
lípidos, a partir de grasas y aceites cuando lo consumos en los alimentos.

Las grasas y aceites en general están enriquecidas de moléculas triacilgliceroles cuya ruptura metabólica genera ácidos grasos. Y los ácidos
grasos también son una fuente para obtener Acetil CoA dentro de la matriz mitocondrial, es decir el Acetil CoA no solo será producto del
piruvato que es descarboxilado en el interior de la matriz mitocondrial y que proviene de la glucólisis, sino que también puede provenir de
la ruptura de ácidos grasos en el interior de la matriz mitocondrial. Esta serie de 4 reacciones químicas que permiten obtener moléculas de
Acetil CoA a partir de las moléculas de ácidos grasos recibe el nombre de β-oxidación. Pensemos que los ácidos grasos están compuestos
por una cadena usualmente larga de carbonos, por ejemplo. 18 o 24 carbonos pueden tener las moléculas de ácidos grasos, en cada una de
estas serie de 4 reacciones él ácido graso se une a la coenzima y a lo largo de las 4 reacciones se produce una ruptura del ácido graso
generando solo la unión de solo 2 carbonos de la molécula del ácido graso a la Coenzima es decir se genera en cada serie de 4 reacciones,
una molécula de Acetil CoA; que implicara entonces el acortamiento en 2 carbonos de la molécula del ácido graso.

¿Cuántas moléculas de Acetil CoA puede generar, en una serie de reacciones de β-oxidación un ácido graso de 18 átomos de carbono?

Una molécula de ácido graso de 18 átomos de carbono puede generar, luego de diversas reacciones de β-oxidación número total de 9
moléculas de Acetil CoA. Por ende, en términos metabólicos los ácidos grasos son mucho más energéticos que los hidratos de carbono, se
pueden esperar muchas más moléculas de Acetil CoA por cada molécula de ácido graso que el número de moléculas de Acetil CoA que se
puede generar por cada mono sacárido. Y por ende las grasas suelen ser el mecanismo preferido de almacenamiento energético de la
endotérmica. No solo son más energético por unidad de moléculas, sino que desde el punto de vista del espacio que ocupa, los lípidos se
almacenan de una manera mucho más eficiente porque al ser no polares, no incorporan agua a las moléculas, los hidratos de carbono, por
ejemplo. el glucógeno se hidrata en el citosol de la célula y ocupa un menor volumen, ese volumen es mucho menor que el volumen
ocupado por las moléculas de ácidos grasos en el interior del citosol; y es una segunda razón por cual las grasas son el mecanismo preferido
del almacenamiento energético dentro de la célula a largo plazo. Entonces generar moléculas de Acetil CoA, generadas por los ácidos
grasos del mismo modo de las moléculas de Acetil CoA generadas por el piruvato que provienen de los hidratos de carbono, ambos
conjuntos van a seguir las reacciones del ciclo de Krebs y por ende van a contribuir al almacenamiento de coenzimas reducidas de NADH y
FADH2 en la matriz mitocondrial.

Llegado a este punto:

Tenemos que hacer la siguiente vinculación → ¿Qué relación existe entre la generación de las moléculas NADH y FADH2 (estos procesos de
acumulación de coenzimas reducidas) con el fenómeno de producción de ATP? ¿Qué relación hay entre esta oxidación y la fosforilación
que necesitamos para producir APT?

Recordemos la hipótesis primaria que tenían los bioquímicos en aquel momento era que las reacciones de producción de ATP eran
fosforilaciones a nivel de sustrato, es decir la obtención de un fosfato de una molécula orgánica directamente transferida a una molécula
de ADP. Pero no se encontraba para los años 60 ni cual era ese intermediario fosfatado a partir del cual se iba a obtener el fosfato ni cuál
era la enzima que iba a producir esta reacción. A demás en esta hipótesis que no cerraba, otro aspecto que no se podía explicar era

¿Por qué eran necesarias las membranas mitocondriales para producir ATP?

Algo que era observado en los experimentos solo cuando estaban las membranas mitocondriales se producía ATP en las fracciones
mitocondriales, pero no se podía explicar por qué las membranas eran necesarias. Aun cuando se extrajera todas las proteínas de las
membranas y las proteínas purificadas de las membranas se pusieran en un tubo, esas proteínas totales purificadas no lograban producir el
ATP, que se producía cuando estaban las membranas mitocondriales completas. Un científico Ingles en los años 60 elaboro una hipótesis
que permitió, luego ser corroborada experimentalmente que cambio el modo de pensar sobre estas reacciones, luego permitió explicar
esta relación existente de cómo se puede vincular en las células, la energía almacenada en las coenzimas reducidas respecto de los
fenómenos de fosforilación. Y este científico fue Peter Mitchell que en el año 1961 publica un trabajo de investigación en la revista Science,
en donde propone un método alternativo que va a denominarse la teoría quimiosmótica.

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En esta teoría quimiosmótica que es el mecanismo que ya han estudiado en el CBC, de producción de energía, implica que no hay una
relación directa entre la oxidación y la fosforilación, sino que hay un espacio intermedio fisicoquímico. La energía contenida en estos
electrones de alta energía va a utilizarse para generar un gradiente electroquímico, la acumulación de un ion en uno de los lados de la
membrana y va a ser la disipación de ese gradiente lo que libera la energía necesaria para la producción de ATP. La existencia de este
intermediario, que no hay una transferencia directa desde los electrones al ATP, sino que la energía de los electrones se utiliza para
generar un gradiente y luego la disipación del gradiente es directamente acoplada al fenómeno de fosforilación es el modelo propuesto por
Mitchell. Que fue corroborado en parte por el mismo y otros científicos años después.

Le preguntaba Mitchell ¿Conoces alguna enzima que pueda producir ATP gracias a la disipación de un gradiente electroquímico?

Sabemos que estas coenzimas reducidas que se acumulan en la matriz mitocondrial van a transferir sus electrones a una serie de complejos
proteicos que están en la membrana mitocondrial interna y que se denominan complejos respiratorios. Cada uno de los complejos
respiratorios está formado por más de 40 polipéptidos cada uno de estos complejos respiratorios.

¿Cómo se produce estos fenómenos de oxido-reducción o de cadena de transporte de electrones?

Se producen de manera espontánea porque cada uno de estos complejos respiratorios tienen progresivamente un mayor potencial de
reducción respecto del complejo anterior, de modo tal que esas reacciones de pasaje de electrones a medida que son crecientes los
potenciales de reducción de cada uno de los complejos se producen de manera espontánea liberando energía.

¿Qué ocurre con esa energía libera por esos procesos de oxido-reducción que es utilizada para hacer cambios conformacionales?

En estos complejos respiratorios que les permiten bombear protones en contra de su gradiente de concentración, es decir la energía de la
oxido-reducción es utilizada en bombear protones y generar un gradiente, que será más concentrado en el espacio intermembrana y
menos concentrado en la matiz; es decir genera una diferencia de potencial en la matriz, más negativa en la matriz y más positiva en el
espacio intermembrana. Esa polaridad que solo va a producirse cuando esté funcionando la cadena de transporte de electrones, es la que
habíamos visto la que favorecía la incorporación de proteínas en los procesos de transporte a través de la matriz mitocondrial.

¿No era que proteínas por su estructura peptídica eran malos aceptores temporarios de electrones, como es posible entonces que estos
complejos respiratorios fundamentalmente peptídicos participen de estas reacciones de oxido-reducción?

Muchas de las proteínas que están presentes, que forman parte del complejo respiratorio poseen estructuras adicionales no peptídicas que
le permiten funcionar como receptores temporarios de electrones. Por ejemplo, muchas proteínas contienen citocromos, los citocromos
no son otra cosa que un grupo hemo, una molécula orgánica que posee en su interior un átomo de hierro que puede actuar como el
aceptor temporal de electrones metidos en una estructura peptídica. Otra de las proteínas muy frecuentes también en los complejos
respiratorios es la ferro sulfuro proteínas que contiene en este caso átomos de azufre y de hierro que también suelen ser aceptores
temporales de electrones, otras moléculas adicionales orgánicas pequeñas como la ubiquinona permiten también actuar como moléculas
que transfieren temporariamente electrones en estas reacciones de oxido-reducción. Y como les decía la secuencia en las que los
electrones van a ir recorriendo desde las coenzimas reducidas a los complejos respiratorios se da en un orden que sigue el potencial de
reducción creciente, siendo que todas estas reacciones sean espontaneas y liberación de energía.

¿Cuál es último aceptor de electrones?

Es aquella molécula que posee mayor potencial de reducción de todos, el oxígeno molecular, el oxígeno actúa entonces como el ultimo
aceptor de electrones que estaban en las coenzimas reducidas y que originalmente estaban en los enlaces covalentes de los lípidos y
monosacáridos que comenzaron a oxidarse, porque es el que tiene mayor potencial de reducción. Cuando el oxígeno se reduce con 4
electrones produce 2 moléculas de agua, por ende, necesitamos para que la cadena de transporte de electrones funcione de manera
continua necesitamos un aporte continuo de oxígeno, porque el oxígeno está constantemente aceptando los electrones y transformándose
en moléculas de agua y eso explica entonces el fenómeno vital del intercambio de gases.

Necesitamos el intercambio de gases hacia el último aceptor de electrones de la cadena respiratoria y necesitamos liberar el dióxido de
carbono que surge de las reacciones de descarboxilación de las moléculas durante el mismo proceso de oxidación. Notemos entonces que
comprender la lógica de la cadena respiratoria nos permite comprender, por ejemplo, la acción de ciertos venenos respiratorios que suelen
ser tóxicos y causar la muerte de mamíferos y a los seres humanos en particular. por ejemplo, el cianuro como veneno porque inhibe de
manera irreversible al complejo respiratorio 4 y por ende también bloquea el transporte de electrones, dado que todos los complejos
respiratoria previos quedan saturados de electrones sin poder entregarle al último aceptor los electrones y esto en ultima estancia
detendrá el bombeo de protones y por ende la síntesis de ATP.

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Entonces el bombeo de protones en contra el gradiente de concentración, genera una forma de acumulación de energía potencial que
Mitchell demostró, que esta energía potencial generada por la acumulación de protones en el espacio intermembrana, pueden liberar
energía al disiparse a través de una proteína transmembrana la ATP sintetasa, que es finalmente la enzima que explica como la disipación
de ese gradiente a través de esta enzima, es utilizada cuando se disipan los protones en el gradiente de protones a través del poro
generado por la ATP sintetasa, se produce un cambio conformacional en esa enzima que permite que esa enzima haga chocar una
molécula de ADP y a una molécula de fosfato permitiendo la generación de enlaces covalentes de modo tal que la energía contenida en
este gradiente va a quedar almacenada en los enlaces covalentes de las moléculas de ATP generada por la acción de la ATP sintetasa. De
este modo la teoría quimiosmótica de Mitchell permite explicar la producción de ATP generada por la producción de gradiente temporario
de protones.

Fosforilación oxidativa es que comprender este camino fisiológico no solo nos permite entender el mecanismo de producción de ATP y
cómo funcionan los venenos respiratorios. Sino que nos permite explicar la acción de ciertas moléculas, por ejemplo, los desacoplantes de
la cadena respiratoria de transportes de electrones; por ejemplo, una de estas moléculas desacoplantes es el di nitrógeno.

Cuando uno dice que las mitocondrias están acopladas, lo que esta acoplada es la transferencia de electrones a través de los complejos
respiratorios respecto a la formación de un gradiente electroquímico que luego va a ser utilizado para formar ATP. Pero notemos que ese
gradiente solo puede formarse, gracias a una de las propiedades de su impermeabilidad. Gracias que es impermeable a lociones, los
protones que son bombeados pueden acumularse para formar un gradiente y solo pasar a través de la ATP sintetasa. Pero hay moléculas
como el dinitrofenol que produce poros temporarios, en la membrana mitocondrial interna entonces el dinitrofenol cuando es
administrado a las células y genera poros en la membrana mitocondrial interna permitirá que los electrones circulen por la cadena
respiratoria de electrones que existen reacciones de oxido-reducción pero impedirá que se forme el gradiente de protones, dado que
cuando los protones son bombeados volverán a favor del gradiente de concentración a través de los poros generados por el dinitrofenol , o
sea

¿habrá producción de ATP bajo condiciones de desacoplamiento?

No porque el ATP puede producirse por la disipación de ese gradiente a través de la ATP sintetasa, sin embargo

¿funciona la cadena de transporte de electrones?

Si, entonces el mecanismo es diferente con respecto a la cadena respiratoria. Es interesante notar que cuando las membranas están
desacopladas esa energía que no logra ser almacenada en forma de ATP se disipa en forma de calor y las mitocondrias desacopladas
aumentan su temperatura. Este mecanismo es utilizado bajo unas condiciones fisiológicas por ejemplo el tejido que conocemos como
grasa parda, el tejido adiposo parda puede producir bajo ciertas condiciones proteínas que desacoplan a las mitocondrias de ese tejido que
permeabiliza la membrana de ese tejido. En consecuencia, cuando el tejido graso parda está desacoplando a sus mitocondrias ese tejido se
vuelve tejido que produce calor, que produce termogénesis. Grasa parda por el alto contenido de las mitocondrias de los adipocitos y el
alto contenido de mitocondrias presenta un alto contenido de citocromos y los citocromos suelen estar coloreados y eso es lo que le da el
color a la grasa parda.

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Seminario 9 del Dr Giusti

Integración de células en tejidos

Mecanismo que hace a la multicelularidad:

Como las células se unen entre sí y a la matriz extracelular. Esas interacciones están bajo la regulación de las células y permiten fenómenos
de movilidad celular y formación de estructuras compactas (ejemplo.: epitelio)

Propiedades de nuestro organismo: deriva propiedades complejas que son emergentes a la interacción de las células entre sí y a un
conjunto de sustancias que secretan las células denominadas matriz extracelular, esas propiedades no se pueden encontrar en cada célula
aislada, las propiedades del hueso, de los cartílagos, de los músculos no pueden ser explicada únicamente analizando los componentes de
la célula, si no entendiendo las interacciones de las células entre sí y con la matriz extracelular que la forma

Para entender las interacciones se va a estudiar dos tipos de tejidos:

 Tejidos epiteliales: se caracteriza: Por tener una alta celularidad, las células están muy juntas entre sí, escaza proporción de matriz
extracelular entre ella (queda reducida a un sector llamado lamina basal, que es la base del epitelio). El extremo apical del epitelio da
hacia una luz y el otro extremo basal donde el epitelio está anclado a la lámina basal. Los epitelios al estar expuestos a las superficies
del cuerpo o a la luz de vasos o tubos del interior del cuerpo, están expuestos a tenciones mecánicas y las uniones entre las células van
a permitir responder ante estas tensiones. Otra de las características es que los epitelios no están irrigados, si no que el O2 y los
nutrientes necesarios para la supervivencia celular se difunden x la lámina basal (eso explica porque los epitelios suelen ser delgados
dado que la capacidad difusiva de las sustancias es limitada)
 Tejidos conectivos: ejemplo.: tejido conectivo no especializado: se encuentra en las partes subyacentes a la epidermis, la dermis tiene
tejido conectivo no especializado (TCNE) que subyace al epitelio intestinal. Hay otro TCNE que va a dar los tejidos hueso, de los
cartílagos, en estos tejidos la celularidad es más baja, los contactos de célula a célula son más bajos, pero son más frecuentes los
anclajes entre las células y el componente de la matriz extracelular. estas células tienen más facilidad de migrar atreves del medio que
confiere la matriz extracelular, tan abundante en estos tejidos

Aclaración: Cuando hablamos de unión celulares: no nos referimos únicamente a la unión de 2 células entre sí, esa es una unión célula a
célula, un tipo de unión celular, el otro tipo de unión es cuando las células se unen a componentes de la matriz extracelular

Descripción detallada de los distintos tipos de unión celular:

4 tipos de criterios que se van a aplicar a un primer tipo de unión entre células o entre células y la matriz extracelular que vamos a
denominar Uniones de Anclaje.
Uniones de anclaje: se denomina así porque ancla a componente del citoesqueleto del interior de las células con otras células o con la
matriz extracelular
Criterios:

¿Cuáles son los componentes de citoesqueleto, las dos subsistemas del citoesqueleto que participan de las uniones de anclaje?

Son los filamentos de actina, los microfilamentos o los filamentos intermedios. Aquello a lo que se va a anclar esa célula
por un lado, se puede anclar a otra célula o se puede anclar a un componente de la matriz extracelular. Existe un componente estructural
que está en la superficie de anclar. Del lado intracelular son los filamentos del citoesqueleto lo que van a permitir la unión intracelular
Moléculas de superficie que van a actuar como moléculas de adhesión entre células y la matriz extracelular, una de las moléculas que
participan son proteínas de las familias de las cadherina, que se pueden clasificar según distintos criterios, por un lados son glicoproteínas
de membrana (punto de vista estructural) y por otro lado son moléculas de adhesión (punto de vista funcional) cadherina:

Propiedades estructurales: son todas proteínas transmembrana que, en su dominio extracelular, es el domino N terminal poseen una serie
de dominios proteicos llamados dominios cadherina, porque poseen una capacidad adherente con otras moléculas de cadherina
dependiente de cationes calcio.

El tipo de uniones que se producen entre estas moléculas ocurre en las regiones extracelulares, es decir las dos moléculas de cadherina
genéticamente interactúan entre si van a estar dispuestas en membranas plasmáticas de células adyacentes y podrán contactarse ente si
formando una unión débil pero efectivas, cuando haya uniones de calcio en el medio extracelular.

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Las primeras cadherinas: son un grupo denominadas cadherinas clásicas que son: se llaman así por donde se las encontró E-cadherina, en
células epiteliales, N-cadherina, en neuronas, células musculares y p-cadherina, en la placenta.

Las uniones entre cadherinas son estrictamente homofílicas, esto significa que son solo cadherinas exactamente del mismo subtipo las que
pueden formar uniones adherentes entre sí, cadherinas con distinto tipo, por ejemplo.: una cadherina-N con un subtipo celular puede
interactuar con una cadherina-E. Esta unión homofílicas cumplen funciones esenciales durante la morfogénesis embrionaria porque
permite que un reconocimiento especifico entre distintos tipos celulares, por ejemplo.: en el proceso de neurulación primaria que ocurre
entre la 3ra y la 4ta semana de desarrollo y en este proceso se produce una evaginación del ectodermo para generar el tubo neural que
finalmente se va a desprender de la lámina epitelial que constituye este ectodermo.

Existe un proceso de la regulación de la expresión génica en donde las células del ectodermo originalmente todas expresando E-cadherina
un subgrupo de esas células, aquellas que se van a trasformar en el tubo neural, disminuyen su expresión de E-cadherina y comienzan a
expresar N-cadherina de modo tal de tener mayor afinidad de unión entre ellas que respecto a las células que conformaban originalmente
la lámina epitelial del ectodermo, esas uniones diferenciales permiten en parte explicar la separación de estos grupos celulares, por otro
lado un subgrupo de células, las que después serán llamadas células de la cresta neural expresan a su vez un tipo diferente de cadherinas
distinto de las e-cadherinas y n-cadherinas, que les permiten despegarse de la lámina epitelial, como del tubo neural primario, no son solo
los subtipos específicos de cadherina los que median esta afinidad homofílica entre los tipos celulares, sino también los niveles de
expresión los que permiten un adhesión diferencial, es decir aun dentro de las células que expresen e-cadherinas aquellas que expresen un
nivel bajos de e-cadherinas tenderán a unirse entre sí y las que expresen un nivel alto de e-cadherinas también van a unirse entre sí , es
una regulación que no solo está dado por el subtipo sino también del número de moléculas de cadherinas expresadas en la superficie de la
célula. Las moléculas de cadherina expresadas por las células de la cresta neural, la cadherina 7 suelen expresarse en niveles
suficientemente bajos como para permitir la unión y desunión entre células de la creta neural, que suelen migrar relativamente cercanas,
pero no de manera compacta. Estos niveles bajos de cadherina 7 permiten uniones transitorias entre las células que permita migrar de,
manera cercana pero no compacta.

Usualmente la cadherinas forman parte del primer tipo de unión entre células, que es la unión adherente, de uniones anclaje

Uniones adherentes:

Están mediadas por moléculas de cadherina, que permiten la unión célula a célula y que anclan desde el lado intracelular a las células
mediante los filamentos de actina, estas uniones adherentes son muy frecuentes en las células epiteliales (mucho contacto célula a célula),
en cambio son poco frecuentes y transitorias en las células mesenquimáticas, en aquellas células que están en tejido del tipo conectivo,
que tienen abundancia de matriz extracelular. Hay una zona específica usualmente en los epitelios que es rica en cadherinas, que no está
uniformemente distribuidas a lo largo de las paredes laterales de las células y se llama zona adherens. Las uniones de cadherina son débiles
pero la fortaleza de las uniones adherentes se debe a la suposición de muchas uniones entre cadherinas que se une de manera lateral y a
este principio de generar fuerzas de adhesión sumando, en simultaneidad un enorme número de uniones, cada una de ellas débiles es lo
que conocemos como principio del velcro (si uno ve como se produce la unión del velcro, la unión implica la unión de múltiples uniones de
una superficie con la otra cada una de esas uniones son débiles, pero la fuerza total de la unión se da por la sumatoria de múltiples fuerzas
débiles, algo así ocurre con la unión de cas cadherinas)

¿Cómo ocurre el anclaje de las fibras del citoesqueleto actina a las moléculas de cadherina?

En un sector de la membrana plasmática de una célula epitelial con una molécula de cadherina clásica con sus dominios cadherina por el
lado extracelular y su dominio citoplasmático que está anclado a un filamento de actina mediante proteínas asesorías, pertenecientes a la
familia cateninas por ejemplo.: alfa catenina y beta catenina son moléculas proteicas que permiten vincular, al sector intracelular
cadherinas con los filamentos de actina, usualmente estos filamentos de actina pueden responder de manera dinámica a las tensiones a las
que está expuesta el epitelio por ejemplo.: se demostrado experimentalmente si se aumenta la fuerza de tensión entre 2 células epiteliales
unidas por cadherina, esta fuerza de tensión es trasmitida intracelularmente a las moléculas de catenina que pueden desplegarse como
respuesta a esa tensión y exponer ciertos dominios proteicos que impliquen el reclutamiento de proteínas adicionales, que permiten
finalmente aumentar el número de filamentos de actina que están anclando en cada una de esas uniones, de modo tal que incrementar la
tensión intracelular que resista a la atracción originalmente provocada, es decir que estas uniones desde el punto de vista conceptual,
pueden cesar los niveles de tensión a los que está sometido un epitelio y generar una respuesta intracelular para contrarrestar esos niveles
de tensión, estos filamentos de actina que se ancla intracelularmente a las moléculas de catenina se encuentran organizados de modo tal
de deformar haces contráctiles, estos haces contráctiles se formaban por filamentos de actina dispuestos de modo anti paralelo, es decir
con los extremos + y – en disposición opuesta unos con otros y entre los cuales podían unirse moléculas de miosina2 no muscular, las
moléculas de miosina intercaladas entre 2 filamentos anti paralelos de actina pueden generar el desplazamiento de un filamento entre
otro y generar contracción local. Es decir que este anillo intracelular de filamentos de actina que están anclados a las cadherinas es un
anillo con capacidad contráctil y la contracción localizada de este anillo intracelular, permite al estar las células de un epitelio ancladas

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entre si mediante sus esqueletos de actinas, fomentar cambios morfológicos en las láminas epitelio, que también son utilizados en lo
proceso morfogénesis embrionaria por ejemplo el corazón, la glándulas y el túbulo neural se forman mediante la formación de túbulos
epiteliales a partir de láminas epiteliales, este cambio morfológico esta producido gracias a la acción conjunta, a coordinación de los
citoesqueletos de actina de las células que forman parte de la lámina epitelial.

La producción de la evaginación, esa provocada porque algunas células de este epitelio contraen su anillo contráctil induciendo el cambio
morfológico del reto de la lámina, si el citoesqueleto de actina no estuviera conectado entre sí, cada célula podría contraerse o no pero no
alteraría la morfología de la lámina epitelial en su conjunto (las células que son bisagras en el caso de la evaginación son aquellas donde se
producen esta contracción inicial). Este fenómeno se superpone con otros procesos moleculares como la regulación diferencial del tipo de
cadherinas que van a expresar cada uno de los epitelios, para lograr, por ejemplo.: el desprendimiento del tubo neural

Los desmosomas

Son uniones intercelulares que va a conectar a las células entre sí, mediante el citoesqueleto de filamentos intermedios (fibras de mayor
resistencia a la atracción mecánica). Los desmosomas son abundantes en células que están sometidas a grandes atracciones mecánicas,
como son las células epiteliales, también las células musculares como por ejemplo.: cardiomiocitos, células del musculo cardiaco, están
sometidas a tensiones, están vinculadas entre si mediante desmosomas (límites entre células musculares cardíacas son: discos
intercalares), estos se observan en ME, como puntos electro densos (en forma de discos) en los límites de adyacencia entre dos células
(epiteliales o musculares). El subtipo de proteína que conforma a los filamentos de intermedios difiere de un tipo de célula a otra, en
células epiteliales los filamentos intermedios son filamentos de la proteína queratina, en células musculares son filamentos de proteínas
desmina.

Estructuralmente son: uniones con forma de disco, no se encuentran formando un anillo alrededor de las células, sino que se encuentran
localizadas en forma de botones, en la superficie que media las dos células, se asemejan a la familia de cadherinas, en este caso son
cadherinas no clásicas, que son las moléculas de adhesión de los desmosomas, que mediante proteínas accesorias anclan
intracelularmente con los filamentos intermedios

Adhesión mediante como los componentes del citoesqueleto se anclan a componentes de la matriz extracelular:
Las familias que actúan como receptores del componente de la matriz extracelular son las moléculas de integrinas.

Integrinas: son diversas, en humanos tenemos más de 24 clases de integrinas, cada una está formada por un heterodímeros por dos
subunidades diferente de glicoproteínas transmembrana, que tiene una región pequeña en su extremo carboxilo-terminal, y sus dominios
de unión con la matriz extracelular miran a hacia la cara extracelular y concentran los dominios globulares, estas 24 integrinas distintas
surge de combinaciones entre 18 cadenas integrinas alfa y 8 clases de cadenas betas ambas codificadas en el genoma, no todas las
combinaciones entre estas dos cadenas existen en nuestros tejidos, la subunidad de integrinas difieren en cuál es el componente especifico
de la matriz extracelular a la que se van a unir y cuál es el tipo celular que lo expresa, ejemplo.: el subtipo alfa5-beta1 se une a una
glicoproteína de la matriz extracelular que es la fibronectina, que puede ser expresado por múltiples tipos celulares, pero hay otro tipo
celulares como alfa7-beta1 que tienen una distribución tisular más restringida, son las expresadas por células musculares, permiten el
anclaje de esas células musculares a un componente de la matriz extracelular llamada proteína laminina. Las uniones de las integrinas con
componentes de la matriz extracelular son dependientes de calcio o de magnesio, es decir no tienen propiedades de adhesiones constante,
sino que van a depender de la concentración de la concentración iónica en el medio extracelular.

Adhesiones focales:

Los filamentos del citoesqueleto que se usa son los filamentos de actina. También existes proteínas accesorias en este caso proteínas de la
familia linas que unen a los sectores citoplasmático de las integrinas en particular de la cadena beta con las fibras del citoesqueleto de
actina. Estas adhesiones focales, no son frecuentes en células epiteliales, sino en células mesenquimáticas rodeadas por abundante matriz
extracelular, por ejemplo.: fibroblasto que son prototipos de células del tejido conectivo que migran dentro de la matriz extracelular,
suelen utilizar en el proceso de migración las uniones focales. Para que una célula pueda migrar tiene que existir un reordenamiento de su
sistema de citoesqueleto y habrá polimerización de filamentos de actina en forme avance, que le permita a la célula generar lamelipodios
que le da la protección hacia el frente de avance, una célula no puede migrar sino tiene un punto de anclaje sobre el cual se produzca la
protección hacia adelante, ya que sin el anclaje la célula rueda en su mismo sitio, ese anclaje lo constituye las uniones focales que están
formadas por moléculas de integrina unidas a componentes de la matriz extracelular como la fibronectina. Desde el punto de vista
intracelular estos filamentos de actinas suele ser filamentos contráctiles y al producirse la contracción, ese filamento contráctil que está
anclado en el exterior permite la retracción del polo posterior de la célula, permitiendo: la producción del frente anterior, el anclaje al
sustrato y la retracción del frente del polo posterior (estos tres procesos son los que permiten la liberación celular). Las moléculas de
integrina pueden mediar la interacción del anclaje con filamentos intermedios, ese tipo de unión se produce de manera exclusiva en las

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células basales del epitelio, porque van a permitir el anclaje de las células epiteliales a la membrana basal, integrinas como alfa6-beta4
permite a los filamentos intermedio, en este caso queratina anclar con un componente de la membrana basal que es la laminina, esta
unión se llama m-desmosomas (ancla a una célula epitelial basal con un componente de la matriz extracelular, membrana basal).En
personas que tienen los filamentos de actina frágil por tensiones en el epitelio desgarran a la célula epitelial de la membrana basal, las
células por encima y que se despegaron de la membrana basal, por ausencia de O2 y nutrientes entran en necrosis o muerte celular
programada, por tracciones en el epitelio en esos sitios se desgarra la membrana basal y ese tejido muere se forman ampollas, que
terminan necrosando al tejido epitelial que esta encima de la ruptura de los hemidesmosomas.

Uniones estrechas (uniones oclusivas):

Están restringidas a células epiteliales, le otorgan al epitelio la propiedad de formar barreras de permeabilidad, ejemplo.: en células del
epitelio simple que tapizan el interior de intestino delgado, en la luz de este intestino hay moléculas en proceso de digestión que no entran
directamente al interior del cuerpo, sino que solo ingresa por las células absortivas, lo que evita que se filtren las moléculas es un tipo de
unión flechas que están mediadas por un conjuntos de proteínas que se dispone formando hebras en el interior de las membranas de cada
una de las células adyacentes, estas proteínas que van a restringir esta difusión son proteínas de las familias de claudinas y ocludinas, que
tienen muchos proteínas transmembranas y tiene afinidad entre ellas cuando se yuxtaponen un conjunto de moléculas claudinas y
ocludinas en una de las membranas con proteínas dispuestas del mismo modo en la membrana adyacente, esta secuencia de ubicaciones
yuxtapuestas de una proteína al lado de otra, es lo que forma las hebras formada de puntos donde cada punto es la ubicación de una
proteína transmembrana de la familia de las claudinas u ocludinas. En los epitelios estas uniones oclusivas no ocupan la totalidad de las
membranas laterales de las células epiteliales, sino que se restrinja a una porción muy apical de la zona lateral de la células y esa zona
donde están concentradas las uniones oclusivas es lo que se denomina zona occludens (por debajo esta la zona adherens), los dominios
intracelulares de esta proteína interactúan con una serie de proteínas (ZO) de unión a la zona occludens; las Z01, ZO2 y ZO3 son proteínas
transferentes que se unen a los dominios intracelulares de las claudinas u ocludinas y que tienen múltiples dominios que permiten la unión
de otros componentes intracelulares, que son organizados sobre la superficie bidimensional de la membrana donde estén presentes las
claudinas u ocludinas, es decir las claudinas y ocludinas no solo forman parte de las uniones oclusivas sino generan un ordenamiento de
ciertos componentes proteicos.-

Uniones comunicantes o de tipo gap:

Forman canales acuosos en las membranas de las que les permite comunicarse por otro canal acuso a las células adyacente generando un
puente acuoso entre dos células yuxtapuestas entre sí, por medio del puente acuoso formados por proteínas entre dos células va a poder
difundir moléculas de un determinado tamaño, pero no pueden pasar proteínas porque son muy grandes de un 1 kilobyte. El hecho (punto
de vista fisiológico) que a partir de estas uniones puedan atravesar moléculas iónicas permite que dos células puedan estar acopladas
desde el punto de vista eléctrico, la transmisión de información entre ciertos tipos celulares se da mediante perturbaciones eléctrico que
van a ser transportadas por un flujo de iones entre las células, se determinó que una combinación eléctrica de una neurona con otra puede
estar mediada por una sinapsis de tipo eléctrica, que está caracterizada por uniones de tipo gap, en donde los iones que transportan el
impulso nervioso directamente van a travesar la neurona post sináptica sin el retardo temporal que implica la sinapsis de tipo químico, otro
ejemplo es el acoplamiento sincrónico de la contracción de las células musculares cardiacas, esa simultaneidad se produce por las
comunicaciones de tipo gap entre células musculares, en donde la ola de calcio que permite la contracción este sincronizada entre los
distintos tipos células, permitiendo una de las características de la multicelularidad que es este funcionamiento sincrónico de la célula y no
el funcionamiento de aislado. Punto de vista estructural: estas uniones están formado en cada membrana de las células que se comunican
por 2 hemicanales, cada uno de esos hemicanal se comunica con el hemicanal correspondiente en la membrana plasmática de la célula
adyacente para formar el canal acuoso, y para formar este hemicanal las proteínas(péptidos) involucradas se denominan conexinas.
Muchas células tienen uniones gap, como células epiteliales, musculares, nerviosa y etc., no hay expresión especifica muy marcada dentro
de las conectivas. Cada uno de estos hemicanales está compuesto por 6 péptidos de conexinas que están dispuestos en forma de proteínas
transmembrana en cada una de las membranas plasmáticas y estos péptidos no necesariamente tienen que ser codificados por el mismo
gen, si no que pueden ser codificadas por genes diferente.

Los roles que cumple la matriz extracelular se encontraron poco, porque se le da más importancia a la fisiología celular (mirando a la célula
desde su interior). Pero propiedades en su totalidad depende de las propiedades de la matriz extracelular, más que de las propiedades
intrínsecas de cada una de las células, por ejemplo: las propiedades del hueso se deben principalmente a esa particular especialización de
la matriz extracelular que se calcifico, que se mineralizo y no tanto a las propiedades intrínsecas de los osteocitos y osteoblasto. las células
musculares están rodeadas de matriz extracelular que reciben el nombre de láminas externas o laminas basales de cada una de las células
musculares, es decir que aun en casos de alta celularidad tenemos matriz extracelular.

¿Cuáles son los componentes típicos de todas las matrices extracelulares y que van a especializarse en cada uno del tejido?

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Glucosaminoglicanos (gags), otros componentes asociados a los gags son los proteoglicanos, todos los componentes de la matriz
extracelular son producidos por la misma célula y luego son secretados al exterior celular, estos componentes son oligosacáridos no
ramificados, son macromoléculas enormes. Los gagas son formados por disacáridos que se repiten uno detrás de otro, desde el punto de
vista estructural los polisacáridos se características porque son muy rígidos, no suelen por el tipo de uniones ser flexibles, debido a que
cada uno de los monosacáridos que lo componen tienen carga eléctrica, son muy ricos en grupo carboxilo y mucho de ellos son sulfatados
les confieren carga negativa, estas cargas atraen moléculas de agua, atraen de sodio al medio extracelular y estos cationes sodio
osmóticamente activos arrastran agua, de modo que esto oligosacáridos en los tejidos se encuentran formando genes altamente
hidratados, las estructuras similares a los genes están formados por enormes filamentos que atraen moléculas de agua, estas sustancias
altamente hidratadas componen la sustancia fundamental o amorfa en los tejidos. Ejemplo: Ácido hialurónico forma un gags especial por
su enorme tamaño y porque a diferencia de otros gags no se encuentran sulfatados. Existen diversas moléculas gags sulfatados, el

Dermatán sulfato, queratán sulfato, difieren entre sí por el tamaño especifico y localización. Todos los aminoglicanos son producidos por la
célula, en el aparato de Golgi luego por las vesículas son secretados de las células, con excepción del ácido hialurónico, que es sintetizado
directamente en la matriz extracelular. La mayoría de glucosaminoglicanos no se encuentran de manera libre sino unido a un componente
proteico, a esa unión se le llama unión proteoglicano con excepción del ácido hialurónico que no se encuentra unido a una proteína, sino
que existe independientemente; en algunos casos el proteoglicano de corina costa de 1 polipéptido unido 1 gags, pero la mayoría de
proteoglicano esta constituidos a múltiples moléculas de glucosaminoglicanos unidos a un mismo filamento proteico por ejemplo, el
agrecano (mole. Enorme), fuertemente hidratada y es muy abundante en el tejido cartilaginoso, la resistencia a la compresión de este
tejido se debe a su gran riqueza de agrecano.

Diferencia de glicoproteína y proteoglicano: en ambos casos nos referimos a la unión de algo de origen peptídico y algo de origen
sacarímico, pero la diferencia fundamental es cuál de las dos aporta mayor masa, en los proteoglicanos es el componente de polisacáridos
lo que le da la mayor proporción de masa de la molécula total, en cambio en las glicoproteínas que son proteínas con una pequeña
proporción de oligosacáridos la masa mayor es el componente proteico; otra diferencia es que el oligosacárido ramificado que se une a las
glicoproteínas es producto de una N-glicosilación que ocurre inicialmente en la luz del retículo endoplásmico, en cambio la unión de los
glucosaminoglicano es producto de una glicosilación que ocurre en el aparato de Golgi. Cuando hablamos de proteoglicano el componente
principal en términos de más es el polisacárido y el péptido es una porción menor. Los proteoglicanos pueden unirse entre sí y formar
complejos macromoleculares enormes, tan grandes que pueden observas en el M.O, su estructura es compleja dado que el ejemplo central
está formado por el ácido hialurónico (polisacárido que existe de manera independiente), sale de manera radial desde este ejemplo
distintas moléculas de agrecano (proteoglicanos formados por un ejemplo proteico y por muchas moléculas de aminoglicanos), este
complejo es común en tejido cartilaginoso y le permite a este tejido ser sometido a grandes fuerzas de.

Otros componentes de la matriz extracelular son las glicoproteínas adhesivas, son moléculas que tienen como componentes de masa su
parte peptídica y que se encuentran decoradas por oligosacáridos, estas glicoproteínas de adhesión se denominan así porque poseen
dominios proteicos en su estructura, que tienen afinidad por otros componentes de la matriz extracelular o componentes que están
presentes a la superficie de la célula, ambos les permiten a estas glicoproteínas adhesivas organizar la distribución de componentes y
células dentro de la matriz extracelular. Dos ejemplos de glicoproteínas adhesivas son la fibronectina, componente de la matriz extracelular
al que se unía las integrinas, está formada por un dímero y cada dímero consta de una serie lineal de dominios proteicos.

Dominio proteico: me refiero a una zona de la proteína que tiene una morfología tridimensional que adopta por sí sola, si cortas los
dominios entre si adoptan esa misma forma tridimensional por más que no esté unida al resto de la molécula, esta zona de la proteína que
tienen una morfología propia independientemente del reto de la proteína es lo que llamamos el dominio de una proteína, los dominios
están relacionados a funciones específicas, cada uno de estos largos polipéptidos esta subdividido en dominios morfológicos cada uno de
ellos con capacidad de unirse, por ejemplo la fibronectina tiene muchos dominios que pueden unirse a fibras de colágeno, hay otros
dominios que pueden unirse a las integrinas y también a las heparinas, las fibronectinas son muy abundantes en todos los tejidos.
Conectivos es un ejemplo. De regulación de la expresión génica porque cuando se analiza los tipos de fibronectinas que hay en los distintos
tejidos se encontraron más de 20 clases, difieren entre sí en el número de dominios que se une a cada clase de componentes que poseen
péptidos ejemplo: hay algunas fibronectinas que poseen muchas uniones a colágeno y son pobres a dominios de unión a integrinas, en
cambio hay otras fibronectinas que se unen más a integrinas que a colágenos, sin embargo, todas las fibronectinas están conectadas al
mismo gen, hay un único gen de fibronectina en el genoma (este gen tiene 50 exones)

¿Cómo se genera esa enorme esa enorme diversidad de fibronectina a partir del mismo gen?

La forma alternativa de splicing permite alternar esos exones de modo tal de generar las distintas variantes de fibronectina, cada uno de
los exones codifica un en dominio independiente de cada proteína.

Otro ejemplo de glicoproteína es la laminina, se llama así porque forma parte de las láminas basales o membrana basales de los epitelios
de esa especialización de matriz extracelular donde se anclan las células basales del epitelio, las lamininas son hetero trímeros, están

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formadas cada molécula por tres cadenas polipeptídicas de una cadena alfa, una beta y una cadena gama, cada una de esas cadenas esta
codificada por un gen independiente. Estos hetero trímeros tienen la capacidad de unirse entre sí, para formarse redes bidimensionales y
esta capacidad es propia de las moléculas de laminina, pueden formar estas redes in vitro en un medio, no es necesario estar en un
contexto celular para formar estas redes bidimensionales, sobre estas redes se organizan los distintos componentes que forman parte de
las membranas basales de los epitelios.

Otros componentes principales de la matriz extracelular son los componentes fibrilares, proteínas fibrosas, que se encuentran dentro de la
matriz extracelular, estos componentes fibrilares en tres grandes tipos de fibras, fibras colágenas, reticulares y las elásticas
Fibras colágenas: su componente proteico bajo la técnica de rutina le da un color acidófilo, con el microscopio electrónico en un corte
longitudinal se ven excreciones, cada fibra de colágeno es el empaquetamiento de fibrillas de menor diámetro y cada fibrilla está
compuesta de una serie de hélices triples de cadenas polipeptídicas, cada una de estas cadenas están codificadas por un gen de alfa
colágeno (cada una de estas es una cadena alfa). Caracteriza a la estructura primaria de las cadenas alfa de colágeno el hecho de que están
compuestas por aminoácidos de prolina, seguidos aminoácidos de glicina, seguido por un aminoácido diferente pero estos tripletes de
prolina, glicina y otro aminoácido es una estructura característica de las cadenas alfas y esta asociación de prolinas y glicinas es lo que le
confiere a la cadena polipeptídica la torsión espontanea para formar hélices. En algunos casos los aminoácidos de prolina son hidroxilados
es decir se le agrega un grupo hidroxilo durante su procesamiento intracelular. Las triple hélices pueden acomodarse en el espacio
formando estructuras de fibrillas, esta disposición en el espacio adopta una separación regular entre cada molécula hace que intervalos
regulares queden en secciones transversales solo 3 molécula y no 4 y esta separación regular es lo que le va a conferir a la fibra como un
todo, estas extracciones observadas en el microscopio electrónico y se debe a la disposición ordenada y regular de estas triples alfas
hélices de colágeno

¿Cómo producen las células inicialmente las fibras de colágeno?

Inicialmente los genes de la alfa comienzan a ser traducidos en el citosol, tiene péptida señal y son incorporados en la luz del retículo
endoplásmico, acá espontáneamente las molécula de alfa colágeno se unen entre sí para formar triple hélices alfas que luego por trasporte
vesicular se llevan al aparato de Golgi, en donde los residuos de prolina son modificados e hidroxilados y por las vesículas son secretados al
medio extracelular y espontáneamente estas alfa hélices de colágeno ya modificadas se ensamblan formando fibras colágeno. Poseemos
más de 21 genes que codifican cadena alfa, sin embargo, los tipos de colágenos existente no son clasificados por el gen original por el cual
se transcribe las cadenas alfa, sino por la morfología final que tienen las fibras que componen esa molécula de colágeno, estas fibras
gruesas que están presentes, por ejemplo: en la dermis, son fibras que denominamos colágeno de tipo I (más abundante en el cuerpo);
pero el colágeno puede adoptar otras morfologías. El colágeno tipo 3 forma un segundo tipo de fibras reticulares; los colágenos tipo 9, 10 y
11 están presentes en fibras del cartílago y las láminas basales de los epitelios tenemos una alta concentración de colágeno tipo 4 que no
forma fibras gruesas sino filamentos. Mutaciones que afectan a la producción de colágeno I, por su alta prevalencia en el tejido oseo las
mutaciones que afectan a la producción de colágeno tipo 1 suelen tener un correlato genotipo en el desarrollo embrionario, según cuales
es el gen de alfa colágeno que posea la mutación y el tipo de mutación los genotipos de los pacientes son diversos y se agrupan en distintas
categorías, en distintos tipos pero estos típicos fenotipos tipo I, no corresponde a mutaciones de colágeno tipo I todos estos ontogénesis
imperfectas son parte de colágeno I, esta caracterización genotipo se debe a los grados de severidad que posea o no la patología. En casos
débiles la ontogénesis imperfecta suele implicar una mayor probabilidad a fracturas de los huesos, en casos más graves produce a una
mortalidad perinatal y en otros casos suele haber deformación e inclusos ausencia de formación de algunos miembros

Fibras reticulares: Formadas por colágeno tipo 3, estas fibras son más delgadas, forman redes y mallas que envuelven y que están en el
parénquima de muchos tejidos. Ejemplos: ganglios linfáticos, medula ósea; cuando se realizan tinciones específicas para revelar colágeno
tipo 3, las fibras reticulares mediante las técnicas de impregnación argéntica se pueden observar en su parénquima una delegada red de
fibras que ayuda a organizar la distribución de las células en ese tejido; también en el hígado son frecuentes las fibras elásticas.

Fibras elásticas: suelen estar presentes en las paredes de los vasos arteriales, permiten al tejido distenderse y volver a su forma original.
Desde el punto de vista estructural esta fibras se encuentran compuestas por 2 componentes: la elastina, que es una proteína con baja
estructuración, pueden adoptar una multiplicidad de formas, no tiene una estructura globular rígida como muchas proteínas, sino la
abundancia de aminoácidos hidrofóbicos les permite tener una estructura poco globular y con alto grado de flexibilidad, pero la flexibilidad
del tejido, la propiedad de ser elástico está determinado por las uniones que entre si forman los distintos péptidos de elastina, se produce
una vinculación en estas fibras electicas de muchas subunidades de elastina que las une de manera covalente, en este caso estos
componentes proteicos que forman parte de esta unión transversal de molécula esta dado por la proteína desmosina, debido al alto nivel
de plegamiento y desestructuración que tienen las molécula de elastina uno puede expandir y someter atracciones laterales a esta malla
de filamentos de actina, generando el desenrollamiento de cada uno de las subunidades y permitiendo que la longitud total de este arreglo
multiproteíco aumente su longitud, usualmente las fibras de elastinas no solo están compuestas de elastina y desmosinas sino que suelen
estar rodeadas por una segunda clase de fibrillas que les confiere una mayor estabilidad y son las molécula de fibrilina, el conjunto de
molécula de elastina unidas entre sí para formar esta red extensible con los elementos de fibrilina los que forman parte de la estructura de
las fibras elásticas. Mutaciones en los genes de fibrilina ocasionan una enfermedad muy frecuente que impacta negativamente en la

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función de las fibras elásticas, los individuos que sufren el síndrome de Marfan, su síndrome más grave es que tienen una pronunciada
debilidad de la Orta, es decir la arteria Orta suele romperse con facilidad ya que cumplen un rol sobre la morfogénesis de los miembros,
otra morfología es extremidades largas que son hiperlaxas

Las células también producen productos proteicos que pueden romper la matriz extracelular y generar un espacio apto para la migración,
estos componente que favorecen los fenómenos de desadhesión, son un conjunto de proteasas conocidas como metaloproteasas de la
matriz (llamadas así por que necesita como cofactores iones metálicos , son un conjunto de enzimas que existen en forma secretada por las
células o como proteínas de membrana y son secretadas o expuestas en la membrana en modo inactiva, que por señales extracelulares
especificas pueden activarse y degradan distintos componentes de la matiz extracelular por ejemplo: fibronectina o fibras de colágeno. Hay
un repertorio de genes que codifican diferentes metaloproteasas de la matriz que permiten degradar distintos componentes de la matriz
extracelular. La matriz extracelular la identificamos como un espacian que está en continua remodelación por parte de la célula, está
fabricando constantemente y remodelando de forma simultánea, no es un escenario pasivo constante de la célula; hay otros genes que
actúan balanceando la actividad de las metaloproteasas de la matriz que son proteínas de la familia actina y que son inhibidores de estas
metaloproteasas, distintos tipos celulares se encuentran secretando de manera complementaria algunos células que en un tejido secretan
proteasas de la matriz y otras secretan sus antagonistas las molécula stim y el balance de esos productos proteicos determinan el grado de
estabilidad o no de una matriz extracelular en un momento dado, dado que estos componentes a su vez están regulados en el tiempo, eso
permite explicar cómo en determinados momentos del desarrollo un sector de la matriz extracelular de un tejido se vuelve dinámico y
permite la migración de ciertas células y en otros momentos se vuelve más estable y permite la estabilización de ciertas células.

¿Cuáles son los productos proteicos, los genes que se activarán en las células que favorecerán por un lado un genotipo epitelial y por otro
lado favorecerán un genotipo mesenquimático característico de una célula en migración?

Esta transición epitelio-mesenquimático (de un genotipo epitelial a uno mesenquimático) se caracteriza por la pérdida de cadherinas
epiteliales, dado que las cadherinas epiteliales forman parte de molécula de adhesión, que eran los componentes esenciales entre células
epiteliales. Las células epiteliales que expresan filamentos de queratina cuando se transforman en células migratorias mesenquimáticas
expresan filamentos de vimentina más típicas de fibras fibroblástica. La polaridad apical y basal que caracteriza a células epiteliales y que es
mantenida por las uniones estrechas que evita la difusión simple de moléculas apicales y basales, al perder la expresión de claudinas y
ocludinas que formaban parte de uniones estrechas esta polaridad estable de células epiteliales se pierde, las células que adquieren un
genotipo migratorio comienzan a secretas metaloproteasas de la matriz y se comienza a expresar integrinas que les permite interactuar
con los componentes de la matriz

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Seminario de integración 10 –S. Giusti

Señalización Celular

Habíamos comentado en seminarios pasados, que estos seminarios se enmarcan en comprender algunos aspectos de la multicelularidad
de los seres humanos. Como la biología de las células en los sistemas multicelulares desarrolla procesos y mecanismos biológicos que le
permiten la existencia en la multicelularidad y uno de los aspectos que analizamos en el seminario pasado era el aspecto quizás más fácil,
cuáles son los mecanismos, las macromoléculas, que permiten a las células estar unidas entre sí y analizamos entonces las distintas uniones
entre las células y la matriz extracelular y las moléculas involucradas en esas uniones.

Hoy vamos a abordar un segundo aspecto característico de la multicelularidad y es el hecho de que distintos grupos celulares de nuestro
cuerpo pueden comunicarse entre sí mediante señales químicas, y eso permite que el organismo se comporte de manera unitaria y que
ciertos procesos que están ocurriendo en un determinado grupo de células de nuestro cuerpo puedan ser transmitidos, puedan comunicar
un cierto mensaje a otro grupo de células que está localizado de manera lejana a ese primer grupo. Veremos que de hecho el discurso que
utilizaremos para referirnos a estos procesos biológicos es un discurso de la teoría de la información, nos vamos a referir al modo en que
estas células se comunican, vamos a interpretar estos intercambios físicos y químicos con un fenómeno de comunicación y por ende
hablaremos de señales de receptores y tendremos que tener muy en cuenta esta analogía y reflexionar sobre ella, porque a veces cuando
utilizamos analogías para explicar procesos biológicos quedamos pegados con la analogía, seguimos pensando en función de una teoría de
la información y perdemos de vista los aspectos específicamente biológicos, intentaremos hacer algunas distinciones entre la analogía de
pensar en estos procesos como procesos de información y cual es mecanismo puntual que ocurre en las células.

En los organismos multicelulares si una célula no recibe señales la matriz extracelular circundante, de las células vecinas usualmente esa
célula entra en muerte celular programada, la ausencia de señal implica de hecho una señal pro apoptótica, de hecho, la mera
supervivencia de las células en el contexto multicelular implica la activa y constante recepción de ciertas señales químicas por parte de la
matriz extracelular y de otros grupos celulares. Otras señales adicionales a las señales de supervivencia van a permitir que un determinado
grupo de células salga de la fase G0 del ciclo celular e induzca la proliferación, señales distintas van a permitir una modificación de la
expresión génica de esa célula y que va a conducir por ejemplo a diferenciación. Ahora cuando hablamos de estas señales, desde el punto
de vista químico,

¿Qué clase de moléculas son?

Las que pueden funcionar como señales entre las células, hay distintos grupos de moléculas que pueden funcionar como señales,
clásicamente las hormonas son de estos tipos de moléculas que pueden funcionar como señales, desde el punto de vista químico las
hormonas pueden tener diferente naturaleza, muchas de ellas tienen naturaleza peptídica, son pequeños péptidos, por ejemplo la
insulina, la hormona del crecimiento, la somatostatina, etc., son hormonas peptídicas, pero también hay algunas lipídicas que derivan por
ejemplo del colesterol, la testosterona, el estradiol de progesterona, son hormonas de tipo lipídico, es decir el termino hormona no
designa una entidad bioquímica sino está referida a la funcionalidad de ese tipo de molécula por más que tengan naturaleza química
distintas. Los factores de crecimiento son otro tipo de señales, los hemos llamado de otras maneras a lo largo de los seminarios, por
ejemplo, los factores de crecimiento también se conocen como mitógenos, usualmente son moléculas que al unirse a receptores en otras
células van a favorecer su proliferación, por ejemplo

¿alguien conoce algún factor de crecimiento para dar como ejemplo?

El FPM que sería el factor promotor de la mitosis mencionan, sin embargo esa molécula que está implicada en fenómenos de proliferación
es una molécula intracelular que permite los cambios intracelulares que favorecen el avance a lo largo de la mitosis, era una quinasa
dependiente de ciclina unida a ciclina mitótica, no funciona como una señal que comunica distintas poblaciones celulares, o sea el FPM que
es una quinasa dependiente de ciclina unida a su ciclina no es una señal química entre distintas poblaciones celulares, pero muchos de Uds.
de aquí están cursando embriología, y ahí seguramente han nombrado muchas moléculas que funcionan como factores de crecimiento,
como por ejemplo el Factor de Crecimiento Epidérmico, como el Factor de Crecimiento Fibroblástico, el Factor de Crecimiento derivado de
Plaquetas, todas esas son nombres de moléculas que funcionan como factores de crecimiento, que pueden inducir la mitosis de otras
poblaciones celulares, suelen ser de naturaleza peptídica, son pequeños péptidos. Los neurotransmisores también son otro grupo de
moléculas de diversa naturaleza química que usualmente son producidos por las neuronas para señalizar aquellas células con las cuales
hace contacto que llamaremos de tipo sinóptico.

¿Alguien conoce el nombre de algún neurotransmisor?

Acetilcolina es un ejemplo, noradrenalina, muy bien, GABA, glutamato, etc., la naturaleza química de esas moléculas es muy diversa los
morfógenos, quienes están estudiando embriología seguramente han hablado de moléculas que pueden inducir variaciones en el

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comportamiento celular, por ejemplo el ácido retinoico, y otras moléculas, las citoquinas podríamos pensarlas que son las análogas a las
hormonas en el sistema inmune, inducen por ejemplo la proliferación y diferenciación de células del sistema inmune, la interleuquina-2 por
ejemplo es un ejemplo de una citoquina.

Las moléculas de adhesión celular también pueden actuar como fenómenos de señalización, es decir las integrinas, en donde allí la
señalización como veremos va a depender de un contacto cercano entre las células que van a transmitirse mensajes pero también me
gustaría subrayar que no son solo moléculas sintetizadas endógenamente las que tienen la capacidad de señalizar procesos biológicos,
moléculas artificiales o bien provenientes de otros organismos o sintetizadas químicamente de manera artificial pueden actuar sobre los
sistema biológicos y generar respuestas celulares, la base de la farmacología es en efecto esa: actuar sobre procesos biológicos e inducir
respuestas, veremos algunos ejemplos de mecanismos acción de fármacos basados en su acción en fenómenos de señalización, actuando
como señales químicas.

Podemos comenzar a delinear algunas modalidades de señalización celular, tomando como criterio la localización de las poblaciones
celulares que emiten la señal química en relación con aquellas otras que van a ser las receptoras de esa señal. Cuando la población de
células que emite la señal se encuentra lejana a la población de células que recibe la señal y la señal viaja por el a través del torrente
sanguíneo, ese tipo de señalización es una señalización de tipo endocrina, por ejemplo la acción de la hormona insulina, producida por las
células beta del páncreas que impacta en celulares musculares, por ejemplo lejanas al páncreas, es un ejemplo de señalización de tipo
endocrina, en cambio cuando la población de células que produce esa señal química, se encuentra cercana en las cercanías de la población
celular que va a recibir esa señal podemos clasificarla como Paracrinas o Autocrinas,

¿Cuál es la diferencia entre estos dos términos?

Una señalización de tipo paracrina implica que un grupo de células que produce la señal
impacta en un grupo de células diferente que se encuentra en las cercanías, también puede ocurrir que el mismo tipo celular que esté
produciendo la señal sea quien responda a esa señal producida por ese tipo celular y en ese caso hablaremos de señal Autocrinas.
Notemos que estamos hablando de un tipo celular que responde a las señales emitidas por el mismo tipo celular, no tenemos que pensar
que hay una única célula que emite la señal y que la recibe de manera individual, por más que la señal sea producida por una célula y
recibida por otra, pero si pertenece al mismo tipo celular que están localizadas en el mismo lugar también esa señal es de tipo autocrina.

Otros tipos más especializados de modo de señalización, tomando como criterio nuevamente esta relación espacial que existe entre las
células que producen la señal y las que la reciban, son por ejemplo la señalización de tipo sináptica, en la sinapsis que clásicamente se
ejerce por neuronas y células efectoras que pueden ser otras neuronas, células musculas o células glandulares, en este tipo de señalización
las sinapsis implica una cercanía entre un célula que produce la señal y la célula que recibe la señal y se libera la señal en un pequeño
espacio entre las dos células que se denomina Hendidura Sináptica, este tipo de señalización es característico de neuronas con otros tipos
celulares.

Por último las señalizaciones que llamaremos dependientes de contacto o yuxtacrinas son aquellas señalizaciones en donde la señal se
encuentra ligada, directamente vinculada a la superficie de una célula o a la superficie del sector de la matriz extracelular y la recepción
entonces de esa señal por la célula blanco, que es la que recibe la señal, implicará un contacto directo de esa célula o bien con la célula que
está produciendo la señal, como en este caso, o con aquel sector de la matriz extracelular en donde este unida esa molécula que actúa
como señal. Otro criterio de clasificación general para entender los fenómenos de señalización es que la naturaleza química de la señal va a
determinar el tipo del receptor, la localización del receptor en las que esas células actúen, en aquellas células que van a ser las células
blanco, todas aquellas moléculas que actúen como señales químicas y que por sus características fisicoquímicas sean moléculas hidrofílicas
tendrán receptores en las células blanco que estén localizados en la superficie celular, por ejemplo todas las señales que son peptídicas
tendrán receptores de membrana en la superficie de las células blanco, podemos entonces inferir que los receptores de insulina, siguiendo
el ejemplo que habíamos dado en las células musculares, serán receptores de membrana, por el contrario si las señales por sus
características fisicoquímicas son moléculas hidrofóbicas los receptores se encuentran en el interior celular, ya sea citoplasmáticos o
nucleares, un ejemplo paradigmático son los receptores de las hormonas derivadas del colesterol, los receptores de estrógenos, receptores
de progesterona son receptores intracelulares.

Dentro de los receptores de membrana, a lo largo del seminario, vamos a distinguir 3 grandes familias: hay receptores de membrana que
por el tipo de señalización al que están vinculados lo vamos a subdividir en 3 grupos, hay receptores que están acoplados a canales iónicos,
que la unión de la molécula señal abre un canal de membrana que permite la permeabilidad o unión que antes de esa unión estaba
vedada. Hay un segundo tipo de receptores de membrana, los más abundantes, que son aquellos acoplados a proteínas G, las analizaremos
con cierto detalle a lo largo del seminario, y por último hay receptores de membrana que están acoplados a enzimas o que tienen actividad
enzimática intrínseca, que ellos mismos tienen actividad enzimática, que se activan justamente mediante la unión de la señal a ese
receptor. Usualmente llamamos a la señal, para despegarnos un poco de esta analogía de la teoría de la información y pasar a un lenguaje

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más bioquímico, usualmente llamamos a esta señal como LIGANDO, llamarla ligando implica interpretarla como una molécula que va a
unirse a un determinado receptor e intentaremos comprender algunas particularidades entre el ligando y sus receptores.

Usualmente la señalización no culmina con la unión del ligando a su receptor en la célula blanco, sino que la unión de este ligando con este
receptor desencadena una serie de modificaciones bioquímicas en el interior de las células, una cascada de señalización celular que va a
implicar modificaciones en proteínas efectoras, un ejemplo clásico de estos cambios inducidos por las vías de señalización son cambios que
implican la fosforilación de proteínas. Fosforilar algunas proteínas intracelulares modifica, como hemos visto en muchos ejemplos, la
actividad de esas proteínas, en estas cadenas de fosforilaciones, por ejemplo, que caracterizan a las señales intracelulares algunas de las
moléculas que se fosforilan pueden ser enzimas metabólicas, factores de transcripción o proteínas que participan de la arquitectura del
citoesqueleto y es en la fosforilación la modificación postraduccional de esas proteínas van a implicar cambios, respuestas celulares, por
ejemplo la fosforilación de ciertos factores de transcripción pueden hacer que un factor de transcripción inactivo se vuelva activo y pueda
unirse a un potenciador en cáncer y modificar el patrón de expresión génica de esa célula, y esa célula entonces modificará su patrón de
expresión génica como respuesta a la unión de una molécula que actuó como señal.

Si volvemos ahora a esta analogía de la teoría de la información, diremos que esta es la respuesta de la célula a esa señal. Como ustedes
están observando estamos delineando algunos principios básicos de todos estos fenómenos de señalización, pero no es así la estrategia
pedagógica que vamos a seguir a lo largo de este seminario. Este seminario está pensado, desde el punto de vista didáctico, de describir los
fenómenos de señalización celular a través de tres ejemplos de integración, vamos a analizar ejemplos de relevancia fisiológica y en el
análisis de esos ejemplos vamos a ilustrar en acción muchos de los conceptos propios de la señalización celular y será un desafío para
nosotros poder distinguir en lo que es un ejemplo puntual respecto de una característica general de los fenómenos de señalización,
probablemente esta diferencia
“qué es un ejemplo particular” y “qué es una concepto general” lo terminen de resolver cuando ustedes vayan a la bibliografía y lean los
fenómenos de señalización celular y puedan decir “esto que vimos en el ejemplo es un fenómeno general de tal tipo de señalización”.

Esto nos va a permitir, no solo dar la relevancia fisiológica y clínica de muchos ejemplos, sino que nos va a permitir integrar otros conceptos
importantes que hemos visto en otros seminarios y ver como condicionan los fenómenos de señalización celular. De hecho, el primer
ejemplo que vamos a utilizar para ilustrar los fenómenos de señalización es la que ocurre en la unión neuromuscular, para pensar en este
fenómeno de señalización tenemos que ubicarnos en el tejido en el que esta acción ocurre. Si hablamos de unión neuromuscular, lo que
tenemos que comprender es cómo se contraen los músculos voluntarios. Ustedes saben, sobre todo los que están haciendo Histología, que
las células de musculo estriado las llamamos fibras porque no son en realidad una célula única, durante el desarrollo, durante la formación
de las células musculares, las células precursoras se fusionan entre si formando un sincicio, un complejo multicelular que va a diferenciarse
como una entidad única.

Por esta razón este complejo que ha sido multicelular y se ha fusionado contiene múltiples núcleos, y su forma alargada nos permite
llamarlo fibras, cada una de estas fibras musculares en una microfotografía óptica vemos que posee una serie de estriaciones, y estas
estriaciones, que le dan el nombre al musculo esquelético, reflejan una de las especializaciones fantásticas de estas células que es el alto
grado de especialización de sus de fibras del citoesqueleto, que son las que permiten efectivamente su contracción, en el interior de cada
una de estas fibras musculares hay sectores especializados del citoesqueleto que se denominan MIOFIBRILLAS que no son otra cosa que un
arreglo muy ordenado de determinadas fibras del citoesqueleto, compuestas por filamentos de actina dispuestos de manera regular y
paralela entre los que se intercala una molécula de miosina muscular, si recordamos el seminario de citoesqueleto las miosinas eran
proteínas motoras que podían moverse sobre la superficie de los filamentos de actina.

Dado que dentro de las miofibrillas los filamentos de actina se encuentran anclados a una serie de proteínas denominados Discos z, cuando
la miosina ejerce su actividad motora deslizándose sobre los filamentos de actina, por la disposición opuesta de estas cabezas de proteínas
motoras, el efecto del movimiento de las proteínas miosinas es el de producir un deslizamiento de las fibras de actina hacia el centro
reduciendo el ancho de esta estructura que denominaremos sarcómero, y es entonces el movimiento de las cabezas de miosina sobre los
filamentos de actina que va a producir un acortamiento de los sarcómeros, si esto ocurre a lo largo de todos los sarcómeros de cada
miofibrilla lo que va a conducir a una disminución de la longitud total de las fibras musculares, y a ese fenómeno lo denominamos
contracción muscular.

Notemos que muchas de las especializaciones que encontremos en las fibras musculares han incurrido en el prefijo SARCO, que vemos en
sarcómero y en muchos otros componentes de las fibras musculares, ustedes saben que sarco, proviene el latín y significa CARNE, es el
prefijo que usualmente utilizamos para referirnos a los músculos y de allí viene también el prefijo de SARCOFAGO, un poco tétrico
pensando el ataúd como algo que come carne tiene el mismo prefijo.
¿Cómo se contraen los músculos? ¿Cuál es la señal que permite que los músculos voluntarios se contraigan?
El fenómeno de señalización celular que aquí está en juego es un fenómeno entre dos poblaciones celulares. Los músculos se encuentran
inervados, hay neuronas que están en contacto estrecho con las fibras musculares y que es la señalización de esas neuronas lo que va a
permitir la contracción en cada una de esa las fibras. Intentaremos comprender las particularidades de ese fenómeno de señalización. Si lo

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pensamos bajo el criterio de cuál es la relación que existe entre la célula que proviene la señal, las neuronas, y las células que van a recibir
la señal, las fibras musculares, en este caso en esta el tipo de señalización es de tipo sináptica, y la sinapsis que ocurren entre las neuronas
y las fibras musculares reciben el nombre de uniones neuromusculares.

Unión neuromuscular es el nombre particular que le damos a aquellas sinapsis que hay entre a las neuronas y las fibras musculares. Las
neuronas que usualmente inervan los músculos, por ejemplo, las neuronas que inervan las extremidades tienen sus somas, sus cuerpos
celulares en la médula espinal y viajan a través de los nervios, a veces distancias muy grandes, para inervar los músculos de las
extremidades. Aquello que contacta específicamente a las fibras nerviosas no es otra cosa que el axón de las neuronas, los terminales
nerviosos son los puntos terminales de esas prolongaciones axonales de neuronas que se encuentran en este caso, son somas en la médula
espinal, entonces en esta unión de tipo sináptica siempre tenemos que distinguir al componente presináptico, la molécula de donde
proviene la señal, la neurona, del componente postsináptico, en este caso, la fibra muscular. Esta sinapsis de unión neuromuscular tiene
una historia fantástica, de hecho, las investigaciones de la unión neuromuscular fueron las investigaciones que permitieron comprender la
naturaleza de la comunicación sináptica.

¿Cómo se comunican las neuronas entre sí?

Comprender eso fue un fenómeno posterior a partir de investigaciones que originalmente intentaban determinar cómo es el fenómeno de
señalización de las neuronas con otros efectores, por ejemplo, las fibras musculares. De hecho, si nos retrotraemos a los años ’50, Eduardo
de Robertis en el año 1954 descubrió por primera vez la existencia de las vesículas sinápticas mediante microscopia electrónica.
Analizando los terminales de los axones unas pequeñas vesículas membranosas, (Se empieza a describir una microfotografía electrónica de
hendidura sináptica y su descripción) aquí estamos viendo un corte transversal de un botón pre sináptico de una terminal nerviosa, por
debajo lo que observamos es el corte transversal de una miofibrilla, y esta separación es la Hendidura Sináptica, entre el terminal nervioso
y la miofibrilla, se ven algunas mitocondrias en el terminal del axón pero vemos además pequeñas vesículas membranosas, esas vesículas
fueron observadas inicialmente por De Robertis, las llamó vesículas sinápticas y era un momento en donde él hace este descubrimiento en
donde se desconocía el mecanismo de comunicación entre las neuronas, y el hipotetizó al observar estas estructuras que podrían ser
organelas que contuvieran las sustancias químicas que permitan la comunicación de las neuronas entre sí o de las neuronas con las células
efectoras, años después en el año 1962 el logro purificar, desarrollar por seguimientos de fraccionamiento celular de tejido nervioso para
purificar las vesículas sinápticas que estaban contenidas en los terminales de los axones y demostró efectivamente la presencia en su
interior de esas sustancias químicas.

Él logró explicar y dar sustento estructural a investigaciones que se estaban realizando, como les decía, sobre las uniones neuromotoras
que permitieron comprender la naturaleza de la comunicación sináptica. Por estos descubrimientos, de cómo se comunican las neuronas
entre sí, por descubrir cómo funcionan las sinapsis recibieron en el año 1970 el premio Nobel 3 investigadores y muchos de los colegas de
De Robertis sentían que De Robertis también tendría que haber sido ternado en este descubrimiento porque sus descubrimientos de las
vesículas sinápticas también fueron esenciales para comprender este mecanismo de transmisión sináptica. Ahora volvamos a nuestro
ejemplo,

¿Qué sustancias hay dentro de las vesículas sinápticas en la unión neuromuscular?

La sustancia química que encontramos aquí, el neurotransmisor que encontramos aquí es la acetilcolina, un molécula orgánica pequeña,
(descripción de una diapositiva) que como ustedes pueden observar posee un sector que es aquel derivado de la molécula orgánica
acetilcolina, que posee un átomo de nitrógeno que tiene un carga eléctrica positiva al pH celular, es decir, si bien es una molécula pequeña
es una molécula cargada positivamente, sus receptores, pensando en el ejemplo que habíamos dado anteriormente, dado que esta es una
molécula polar, cargada eléctricamente de hecho, ¿tendrá receptores en la membrana o intracelulares? Posee receptores membranosos,
las moléculas cargadas usualmente poseen receptores de membrana.

¿Cuáles son los receptores que se han aislado de la acetilcolina?

En distintos tejidos se han encontrado distintas clases de receptores de membrana para la acetilcolina, algunos de ellos son los llamados
receptores muscarínicos de la acetilcolina que pertenecen a una de las clases de receptores de membrana que son aquellos que son
acoplados a proteína G, en cambio los receptores nicotínicos, como otra clase de receptores a los cuales puede unirse la acetilcolina,
pertenecen a otro grupo de receptores que son receptores asociados a canales iónicos.

Notemos algo, la acetilcolina además de ser el neurotransmisor que participa de la unión neuromuscular, participa dentro del sistema
nervioso en otros fenómenos de señalización, por ejemplo dentro del sistema nervioso autónomo la vía parasimpática, que regula por
ejemplo los movimientos peristálticos del intestino, el ritmo cardiaco, el grado de contracción las pupilas, la sudoración, etc., esa
señalización de las neuronas que forman parte de la rama parasimpática y que contactan con esos efectores usualmente tienen una
comunicación sináptica que está mediada por la acetilcolina, por ejemplo las células los cardiomiocitos modificados, que forman parte del

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marcapasos del corazón responden al acetilcolina porque tienen receptores de tipo muscarínicos en su membrana, receptores acoplados a
proteína G, y la respuesta celular a la unión de la acetilcolina es la disminución del ritmo cardiaco, las células glandulares de las glándulas
salivales, que también poseen el mismo tipo de receptores, responden secretando saliva, en cambio la unión de la acetilcolina a los
receptores, que llamamos nicotínicos, en este caso tipos de receptores que son receptores iónicos, tienen un efecto sobre las células
musculares que es el efecto de la contracción.

Este ejemplo, me gustaría utilizarlo para reflexionar sobre lo siguiente, muchas veces pegados a esta analogía de la teoría de la información
suponemos que el mensaje está en la molécula señal, es decir, que la respuesta que debe ser decodificada por la célula está encriptada
químicamente en la molécula señal, otros dicen que está encriptada en el receptor, pero bioquímicamente podemos ver que una misma
molécula que actúa como señal puede ejercer efectos muy diversos en distintos tipos celulares, incluso tipos celulares que tienen la misma
clase de receptores responden de manera diversa, es decir que la respuesta no depende únicamente ni del tipo de señal ni del tipo de
receptor, dependerá también de todo el repertorio de proteínas que ya posee esa célula y que le permitirán desarrollar fenómenos de
señalización intercelular que les permitirán dar una respuesta determinada.

Propiedades de la unión del ligando, en este caso el acetilcolina con su receptor, y son conceptos de Especificidad y Afinidad,

¿Qué entendemos por especificidad?

La especificidad nos va a referir a qué relación existe entre un determinado ligando y un receptor, es decir, un determinado ligando a
cuantos tipos de receptores puede unirse y en forma complementaria un determinado receptor a cuantos ligandos puede aceptar. Los que
podemos ver, la acetilcolina, en este caso, puede unirse a distintas clases de receptores, y de hecho si pensamos en los nombres que les
hemos dado a esos receptores, muscarínicos y nicotínicos, esos nombres especiales que se les ha dado en el contexto de la investigación a
esos receptores surgen porque existen ligandos no endógenos que pueden unirse a esos receptores con mayor especificidad que la propia
acetilcolina. Los receptores muscarínicos se llaman así porque pueden unir al ligando denominado muscarina, un ligando que es producido
por cierto familia de hongos, el ligando de muscarina puede unirse a estos receptores muscarínicos a los que se une la acetilcolina, pero no
puede unirse a estos otros ligandos nicotínicos.

De manera inversa, la nicotina, todos sabemos derivada de la planta de tabaco, puede unirse de manera específica, por más que sea un
ligando exógeno no producido por nuestro cuerpo, puede unirse a los receptores que hoy denominamos nicotínicos, es decir incluso
ligandos exógenos pueden ser más afines y más específicos a los receptores que ligandos endógenos. De hecho la Afinidad hace referencia
a las fuerzas intermoleculares, cuan fuerte es la unión de un ligando y un receptor, en los casos de la muscarina y de la nicotina, estos dos
ligandos exógenos se unen con mayor fuerza a la acetilcolina, y la unión de esos ligandos suele también producir efecto sobre esas células,
de hecho la capacidad adictiva de la nicotina está determinada por la unión de la nicotina a los receptores nicotínicos que están presentes
en las neuronas del sistema nervioso central.

En este caso tanto la nicotina como la muscarina son ligandos de estos receptores que ejercen un efecto agonista, que producen el mismo
tipo de respuesta celular que produce el ligando endógeno, en el caso particular, ahora volviendo a la unión neuromuscular aquí vemos
una preparación histológica en donde vemos fibras musculares en donde vemos la conexión de los terminales nerviosos sobre cada una de
estas fibras, para determinar qué tipos de receptores de acetilcolina hay en las uniones neuromusculares uno puedo aplicar una de las
técnica que nosotros ya hemos utilizado, si hacemos una inmunofluorescencia utilizando anticuerpos que pueden reconocer de manera
diferencial a los receptores nicotínicos y a los receptores muscarínicos podríamos determinar cuál es el tipo de receptores que tenemos
allí.

Una inmunofluorescencia contra un receptor nicotínico y contra un receptor muscarínico típicamente nos va a dar esta imagen

Descripción de diapositiva: en una preparación en donde contengamos uniones neuromusculares y lo que podemos observar es que
tenemos señal, cuando usamos un anticuerpo que detecta receptores nicotínicos notamos ausencia de señal cuando usamos anticuerpos
que detecten receptores muscarínicos, de hecho, los receptores de acetilcolina en musculo estriado son receptores de membrana de tipo
nicotínicos que hoy sabemos son receptores que están acoplados a un canal iónico.

De hecho, es la unión del ligando-receptor en el contexto nicotínico nos permite comprender los efectos de ciertos venenos. Por ejemplo,
la bucarotoxina es un veneno que contiene ciertas familias de serpientes, la picadura de estas serpientes, la introducción de este veneno
provoca parálisis muscular.

¿Cómo explicamos fisiológicamente la parálisis muscular provocada por la inyección de veneno de estas serpientes?

La bucarotoxina es un ligando que se une a los receptores nicotínicos, pero se comporta como un antagonista, esto implica que el ligando
se une a los receptores, pero no provoca la respuesta de contracción muscular, sino que actúa como un bloqueador de ese receptor,

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impide, se une al receptor con altísima afinidad e impide que ese receptor se una a la acetilcolina, entonces bloquear los receptores
nicotínicos de los músculos provoca la incapacidad de contraer esos músculos.

En la unión neuromuscular, en la neurona el mensaje, la señal química que va a estar contenida en la vesícula de la acetilcolina es liberada
cuando llega un potencial de acción, una señal eléctrica que despolariza el axón de las neuronas, este potencial de acción, esta
perturbación eléctrica, implica una movilización de iones a lo largo de las membranas de las neuronas, implica la apertura de canales de
sodio dependientes de voltaje a lo largo de toda la membrana de la neurona, la apertura de estos canales iónicos cuando el potencial de
acción llega al terminal nervioso, implicará la apertura de canales que permitirá el ingreso de calcio en el terminal nervioso en ese botón
presináptico, que es el otro nombre que se le da a la terminal nerviosa, que es la punta del axón donde están alojadas las vesículas
sinápticas que describió De Robertis.

El ingreso de calcio induce modificación en las vesículas sinápticas y van a permitir su exocitosis, este fenómeno entonces: la liberación de
los neurotransmisores de las vesículas sinápticas, podemos pensarlo como un fenómeno de secreción regulada.

Este fenómeno de liberación de acetilcolina a la hendidura sináptica, notemos que los receptores nicotínicos, que van a estar en la
membrana de la célula muscular, van a estar en la postsinapsis. Habíamos dicho entonces que la liberación de las vesículas simpáticas
podemos pensarlas como un fenómeno de secreción regulada, estas vesículas que incorporan en el terminal sináptico incorporan
acetilcolina que es sintetizada en el citosol gracias a que poseen en su membrana un transportador de membrana que específicamente
importa acetilcolina del citosol.

¿cómo llegan estas vesículas al terminal sináptico y cómo esas proteínas que forman parte del transportador de acetilcolina? ¿cómo llega a
la membrana de la vesícula? ¿cómo se generan esas vesículas y llegan al terminal sináptico? ¿cómo surge esa vesícula?

Si esta proteína de membrana no representada que es la importadora de la acetilcolina en el citosol, esa proteína comenzó a sintetizarse
en el citosol con todas las proteínas, es una proteína que en el soma celular , en el cuerpo celular de esa neurona que está localizada en la
medula espinal fue introducida, poseía un péptido señal y pudo ser introducida por el transporte transmembrana a la membrana del
retículo endoplásmico, luego con transporte vesicular pasó del retículo endoplásmico al aparato de Golgi y en la red trans de Golgi había 3
destinos posibles, o bien esas vesículas iban al lisosoma o bien iban ser una secreción de tipo regulada, como en este caso, o una secreción
constitutiva.

Estas vesículas que salen de la red trans de Golgi, por las particularidades de la especialización anatómica de las neuronas, están muy
distantes en el compartimiento somático respecto del terminal axónico, y a lo largo de todo el axón hay fibras del citoesqueleto, en este
caso microtúbulos, que están orientados de modo tal de poseer sus extremos (+) en el terminal nervioso y sus extremos (-) del lado
somático. Estas vesículas, entonces, contienen en sus membranas proteínas motoras, quinesinas, que les permiten desplazarse a lo largo
de los microtúbulos, desde el soma hasta a llegar al terminal sináptico. Piensen las distancias que algunas de estas vesículas tienen que
viajar, algunos axones que llegan a los miembros inferiores tienen más de un metro de largo, es una distancia enorme para estructuras tan
pequeñas, y lo hacen por un transporte a lo largo de proteínas de citoesqueleto, a lo largo de microtúbulos.

Una vez en el terminal sináptico ese ingreso de calcio lo que permite es que estas vesículas se fusionen con la membrana que permite su
liberación, y podemos ver aquí otras proteínas que están presentes en la superficie de la vesícula y la superficie de la membrana que van a
determinar, tal como lo habíamos visto en el seminario de transporte vesicular, la especificidad de esas fusiones, recordemos que durante
el transporte vesicular hay proteínas, en las membranas tanto de la vesícula como de la membrana que esa vesícula va a fusionarse, que
permiten un reconocimiento especifico, que permiten determinar esa vesícula va a fusionarse con esa membrana y no con otra, y las
proteínas pertenecientes a esa familia se llamaban Snare. Los nombres específicos de esa proteína de la familia Snare, en el caso de las
vesículas sinápticas son estos nombres, Sinaptobrevina que es la proteína Snare que está en la vesícula sináptica y SIntaxina-Snap25, son
los miembros que están en la membrana de destino.

Hay un reconocimiento mutuo entre estas proteínas que es la que va a permitir que una vez que ingrese calcio al terminal sináptico se
produzca efectivamente la fusión. Comprender la fisiología de esas proteínas que determinan la especificidad de la hormona nos permitió
comprender una condición clínica que surge a partir de una infección bacteriana, hay bacterias que pertenecen al género Clostridium que
producen una toxina denominada toxina botulínica, específicamente la especie de la bacteria es Clostridium Botulinum, en algunos
alimentos por ejemplo están en las esporas de las especies, entonces por el consumo de alimentos contaminados y también a veces por
heridas en la piel si estas bacterias infectan el cuerpo producen una proteína que se denomina toxina botulínica y la toxina botulínica
ingresa en el interior de las células y se une específicamente a las proteínas de la familia Snare en los terminales presinápticos,
específicamente de acetilcolina, los terminales colinérgicos, y evita entonces la fusión de las vesículas con las membranas.

¿Qué signos y síntomas tienen los individuos que están infectados con la clostridium botulinum?

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Los primeros signos implican la parálisis, la imposibilidad de movilizar los músculo, se debe a la toxina botulínica.
Comprender el mecanismo de funcionamiento no solo permite comprender los signos y síntomas a surgir de la infección con esta proteína
sino que el bótox, la toxina botulínica purificada, hoy se utiliza con diversas aplicaciones médicas, en la aplicación cosmética por ejemplo,
bajas dosis de toxina botulínica inyectadas típicamente en los músculos faciales impiden la contracción de los músculos fáciles porque
evitan la fusión de las vesículas de acetilcolina que harán contraer los músculos y esto retrasa la formación de arrugas.

Sin embargo no es la única aplicación de la toxina botulínica, habíamos dicho por ejemplo, que la inervación de las glándulas sudoríparas en
particular también es una inervación de tipo colinérgica, es decir las neuronas que inervan las glándulas sudoríparas señalizan a las
glándulas sudoríparas mediante acetilcolina y hay una condición de ciertos individuos que se denomina hiperhidrosis, que es una condición
de sudoración excesiva que puede estar localizada a nivel axilar pero muchos casos es en la palma de los manos y en la palma de los pies,
esos pacientes tienen mucha incomodidad, están escribiendo y se mojan las hojas, socialmente le resulta muy molesto y uno de los
tratamientos de la hiperhidrosis es inyectar toxina botulínica en distintos puntos de las palmas de las manos, dado que eso inhibirá la
secreción de acetilcolina por ende las glándulas sudoríparas no tendrán más la señal nerviosa de emitir su secreción,

Las dosis que se utilizan son y los puntos de localización son lo suficientemente precisos son muy superficiales, es decir la inyección no llega
al musculo sino que se inyecta de manera más superficial de modo tal que solo impactan en las glándulas sudoríparas, del mismo modo
que el bótox inyectado en el rostro también sino no permitirá el cerrado de los parpados, todo es un tema del punto de la localización de la
inyección y de cuál es la dosis, en ambos casos el sistema inmune degrada progresivamente la toxina botulínica y el movimiento muscular
se recupera, por ende tanto el caso del tratamiento de la hiperhidrosis como el caso del tratamiento estético las inyecciones deben
repetirse periódicamente.

Sigamos con el proceso de señalización.

¿Qué ocurre una vez que la acetilcolina se une a los receptores nicotínicos en las membrana plasmática de la célula muscular?

El nombre especifico que se le da a la membrana plasmática de la fibra muscular es la de sarcolema, nuevamente utilizamos el prefijo
SARCO, sarcolema no hace otra cosa que referirse a la membrana de la fibra muscular, los receptores nicotínicos entonces están en la
superficie de la sarcolema, la unión de la acetilcolina abre esos canales iónicos y permite que a través de esos canales ingresen iones en
particular iones de sodio que van a ingresar a favor del gradiente de concentración ya que se encuentran más concentrados en el medio
extracelular que el medio intracelular y el ingreso de sodio a través de los canales nicotínicos hace que sé que genere en la membrana
celular un potencial de acción, una variación eléctrica que va a propagarse a lo largo de la membrana de la célula muscular, de manera
análoga a la transmisión del impulso nervioso que ocurría a lo largo del axón de la neurona.

Otra de las especializaciones de la célula muscular es que el sarcolema, la membrana plasmática, se invagina formando túbulos muy
delgados que ingresan al interior de la célula y esos túbulos delgados que no son otra cosa que invaginaciones de la membrana plasmática
reciben del nombre de Túbulos T, es decir que el potencial de acción puede viajar a lo largo, ingresa en el interior de la células a lo largo de
los túbulos T y adyacente por el lado intracelular a los túbulos T se encuentran los compartimentos de retículo endoplasmático liso, que en
el caso de las células musculares reciben el nombre de retículo sarcoplásmico, pero ese retículo es el endoplasmático liso, si ustedes
recuerdan una de las funciones del retículo endoplasmático liso era la de ser un reservorio de iones calcio, sobre las membranas del
retículo endoplásmico liso cuando ingresa potencial de acción se abren canales de calcio voltaje dependientes en la superficie del retículo
sarcoplásmico y esto permite la liberación de calcio desde el interior del retículo hacia el citosol.

Los cationes de calcio son una molécula que normalmente están en bajísimas concentraciones en el interior celular y que este aumento
momentáneo le permite unirse a otras proteínas y le permite modificar de manera aguda la actividad de muchos componentes proteicos
en el interior celular, veremos en breve que la elevación transitoria de las concentraciones de calcio intracelulares las que le van a permitir
a los sarcómeros a las fibras especializadas del citoesqueleto la contracción.

¿Qué relación existe entonces entre esta liberación intracelular de calcio y la efectiva contracción de los sarcómeros?

Si volvemos a la estructura del sarcómero habíamos dicho que los filamentos de actina se encontraban ordenados de manera paralela,
fijados sobre los discos z, proteínas de soporte, y por entre medio de estos filamentos estaban las moléculas de miosina muscular
orientadas de manera opuesta que pueden moverse en sentidos opuestos sobre las fibras de actina de las cuales están cercanas, sin
embargo en condiciones basales el contacto entre las cabezas de miosina y las fibras de actina está impedido, en condiciones basales no
hay contacto directo entre esas cabezas de miosina y estos filamentos de actina por ende al no haber contacto directo no puede haber un
movimiento de esa proteína motora sobre el citoesqueleto de actina.

Este contacto esta por un complejo proteico denominado troponina-tropomiosina, la tropomiosina es un filamento muy delgado que
recubre todo el filamento de actina, y sobre el cual se deposita una proteína denominada troponina, este delgado filamento de

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tropomiosina que envuelve al filamento de actina y la proteína troponina impide, repito, el contacto directo de la miosina motora, sin
embargo cuando aumentan las concentración intracelulares de calcio, el calcio puede unirse a la troponina y generar un cambio
conformacional que permite bajo esas condiciones, cuando el calcio está unido a la troponina, permite contactar a las cabezas de miosina
con los filamentos de actina y cuando se produce ese contacto las proteínas motoras pueden moverse y pueden producir el fenómeno de
la contracción, de ese modo el aumento de las concentraciones intracelulares de calcio tienen como consecuencia el desplazamiento de las
miosinas sobre las actinas y por ende la contracción muscular.

Si analizamos a modo de resumen cuáles son estas precisas especializaciones de la fibra muscular para poder ejercer esta función de
contracción veremos que la especialización más sobresaliente es la especialización de su citoesqueleto que está representado en la
presencia de las miofibrillas, estos reordenamientos precisos de los filamentos de actina y filamentos de miosina, notemos que otra
especialización de la que hablamos era la membrana plasmática, el sarcolema, que posee invaginaciones, denominados túbulos T, que
rodean a cada una de las miofibrillas esa especialización permite que el potencial de acción que viaja sobre la membrana plasmática llegue
a cada una de las miofibrillas en el interior de la fibra muscular permitiendo entonces la contracción.

Descripción de diapositiva: ¿Notan acá este dibujo celeste sobre cada una de las miofibrillas? Ese es el amplio desarrollo que tiene el retículo
sarcoplásmico.

El retículo sarcoplásmico, este compartimento que es el reservorio de calcio está extendido sobre toda la superficie de las miofibrillas de
modo tal que la liberación de calcio provoca simultáneamente la contracción de todas las miofibrillas en su conjunto, permitiendo esta
coordinación de la contracción muscular, por supuesto el tejido muscular es altamente rico en mitocondrias porque el movimiento de las
miosinas sobre la actina es dependiente de ATP, de modo tal que la contracción consume grandes cantidades de ATP, siendo junto con el
tejido nervioso los dos tejidos que mayor consumo energético poseen.

¿Cómo se finaliza esta señalización de la acetilcolina que permite la contracción muscular? ¿En qué momento finaliza?

Hay 2 instancias de finalización de esta señal que permiten explicar el detenimiento de la contracción. En primer lugar hay una degradación
de la molécula que actúa como señal, hay una degradación de la acetilcolina en el espacio sináptico, la vida media de esa molécula es muy
breve porque hay una, también en el espacio sináptico, una enzima denominada acetilcolinesterasa que degrada rápidamente a la
acetilcolina de modo tal de que cuando se degrada la acetilcolina se cierran los canales iónicos nicotínicos se detiene el potencial de acción
y por ende no va a haber más liberación de calcio intracelular.

El descubrimiento de la acetilcolinesterasa, que es una enzima que degrada acetilcolina y que está en la hendidura sináptica nos permitió
comprender la fisiopatología de una enfermedad muy grave denominada miastenia gravis, es una enfermedad autoinmune en donde los
individuos que la padecen generan anticuerpos contra los receptores nicotínicos de las uniones neuromusculares, esos anticuerpos se unen
a los anticuerpos nicotínicos y los bloquean, y el síntoma entonces nuevamente de estos individuos es la imposibilidad de la contracción
muscular.

Un medicamento que se desarrolló para palear al menos durante un tiempo los síntomas de la miastenia gravis fue intentar aumentar las
concentraciones de acetilcolina en las uniones neuromusculares para darle la posibilidad a los pocos receptores nicotínicos aun presentes
de señalizar la contracción y farmacológicamente la estrategia que se desarrolló fue bloquear la acción de la enzima que degrada la
acetilcolina, el tratamiento entonces para la miastenia gravis es utilizar inhibidores de la acetilcolina, es decir aumentan las
concentraciones en las hendiduras sinápticas y permite que los pocos receptores que aún quedan puedan responder a la contracción
muscular.

Esta enfermedad que lamentablemente hoy aún no tenemos cura culmina usualmente con la muerte de los pacientes por insuficiencia
respiratoria porque los músculos de la ventilación también dejan de funcionar justamente porque los receptores nicotínicos de esos
músculos también están afectados por esta patología clínica.

Un segundo mecanismo entonces que permite la terminación de la señal es que existe un bombeo activo intracelular de los cationes de
calcio hacia el interior del retículo sarcoplásmico, es decir esta liberación de calcio que se había producido por el potencial de acción es
transitoria ya que activamente son re-captados por bombas en la membrana del retículo sarcoplásmico, en ausencia entonces de un nuevo
potencial de acción bajan repentinamente las concentraciones de calcio intracelulares y se reestablecen este impedimento de contacto
entre las miosinas y los filamentos de actina y el musculo queda en estado de no contracción.

¿cómo es posible que ciertos músculos sean efectivamente inervados por ciertas neuronas cuyos somas están en la medula espinal?

Esa inervación no es idiosincrática, no es diferente en cada individuo, no es que hay algunos individuos en donde los miembros inferiores
son inervados por nervios del cuello y que hay otros individuos que son por nervios lumbares, hay un patrón característico de la especie en

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la inervación, durante al desarrollo embrionario del sistema nervioso se está produciendo la inervación de los miembros, por ejemplo en el
caso de los humanos durante la semana quinta del desarrollo los axones de las neuronas que están en la medula en desarrollo comienzan
a inervar las extremidades superiores.

¿cuáles son las señales moleculares que permiten a los axones encontrar aquellas células a las cuales van a unirse para establecer el
contacto sináptico? ¿Molecularmente cómo podemos comprender esas señales?

Esas señales lo que van a guiar en este caso es lo que llamamos cono de crecimiento axonal, que no es otra cosa que la protrusión del axón
por parte de neuronas cuyo somas están en la medula espinal y una de las vías de señalización que permiten realizar este camino de los
conos de crecimiento axonal para inervar finalmente las fibras musculares que están en las extremidades en desarrollo es una familia de
moléculas que se denominan Efrinas, no sé si han hablado de las efrinas y sus receptores en embriología, estas moléculas las efrinas y sus
receptores denominados EPH son una familia de ligandos y receptores que típicamente funcionan señalizando vías de migración entre
otras señalizaciones, lo característico de esta vía de señalizaciones es que el ligando la molécula señal las efrinas no son ligandos solubles,
sino que están ligados directamente a la membrana de otras células, de modo tal que el contacto entre la efrina y su receptor se da cuando
dos células están en proximidad,

¿cómo llamamos a este tipo de señalización cuando el ligando estaba unido a la superficie de otra célula?

Es una señalización de tipo yuxtacrina, una señalización dependiente de contacto. Otra de las características de la unión de las efrinas y sus
receptor es que la unión de las efrinas con su receptor van a provocar una autofosforilación del receptor, el receptor tiene una actividad
enzimática endócrina, pertenece a la tercer clase de receptores de membrana, su unión con su ligando con una efrina que está en la
superficie de una célula cercana con la cual se establece contacto induce una fosforilación intercelular del receptor que se va a trasmitir
luego en una cascada de señalización intracelular, pero una de las características les decía de esta vía de señalización es que puede ser en
algunos casos puede ser bidireccional, dado que las efrinas es decir lo que actúa domo ligando también puede transmitir una señal
intracelular a la célula que es portadora de ese ligando, normalmente en los otros tipos de señalización la señalización es unidireccional, la
célula que responde es la célula que recibe la señal, en este caso tanto la célula que posee el receptor va a sufrir una modificación
intracelular como la célula que poseería el ligando a eso nos referimos con que el flujo de la información puede en algunos casos ser
bidireccional cuando involucra efrinas, por ejemplo una de las proteínas que mediante esta vía de señalización pueden modificar su
actividad son proteínas que modifican al citoesqueleto y que van a permitir por ejemplo que en el polo opuesto a donde se produce la
señalización comience a polimerizarse el citoesqueleto de actina para formar un lamelipodio.

¿Por qué subrayo que es el polo opuesto?

Porque usualmente las efrinas cuando se contactan con sus receptores van a señalizar una respuesta de repulsión entre los dos tipos
celulares, la unión de efrinas con su receptor implicará que una de las células, usualmente la que posee el receptor, comience a migrar en
el sentido opuesto al contacto de las efrinas mediante señales repulsivas. Hay dos clases de efrinas de tipo A y de tipo B y hay 2 clase de
receptores, receptores EPH de tipo A y de Tipo B que tienen preferencias por cada uno de los ligandos, pero esta diferencia, quizás un
tanto tétrica, no forma parte del centro de explicación. Pensemos entonces cómo se comportan las efrinas y sus receptores de pH para
permitir esta localización esta guía de los axones a lo largo del desarrollo.

Descripción de diapositiva: Este esquema intenta representar de manera muy esquemático un corte transversal de un embrión al nivel de
sus extremidades, acá observamos la médula espinal en desarrollo y esta sería los primordios de los miembros superiores. Lo que estamos
observando aquí es que hay neuronas,

Cuyos somas están en la médula espinal, que emiten axones de manera conjunta pero que en un momento determinado uno de estos
axones inerva el sector dorsal del miembro superior pero hay otros axones que inervan el sector ventral, y esta inervación característica
que este grupo de neuronas siempre inerva la parte dorsal y este siempre inerva la parte ventral no es diferente en cada individuo sino que
como les decía es algo característico de la especie, y pudimos comprender que esto ocurre de este modo por la señalización a través de las
efrinas y sus receptores, por ejemplo sabemos que en el miembro en desarrollo hay un gradiente inverso de expresión de moléculas de
efrinas, por ejemplo en el sector dorsal del miembro hay un mayor expresión de efrinas de tipo B y menor concentración de tipo A y ese
gradiente es inverso en el sector ventral.

Estos axones, que provienen de poblaciones neuronales cercanas pero diferentes de la medula espinal, poseen una expresión de
receptores complementaria, es decir, aquellos receptores que poseen las neuronas que van a invernar la parte ventral poseen receptor de
efrina de tipo B EPH de tipo B y justamente es la repulsión producida por los ligandos de las células de parte dorsal lo que determina que
este axón quede restringido a la parte ventral, y lo mismo ocurre pero de manera inversa con el otro axón, es la repulsión de los ligandos
de la efrina A lo que hace este axón que expresa el receptor EPH tipo A sea repelido y sea restringido al sector dorsal, entonces esta guía
axonal esta explicada en muchos casos por una señalización dependiente de contacto de las vías efrinas ephs.

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Las efrinas y la vía efrina-EPH también participa del fenómeno de migración de células de la cresta neural y es entonces muchas células
migran de un determinado sector porque son repelidas por el contacto de efrinas en un determinado sector del embrión cuando esas
células de la cresta neural tienen receptores que pueden unirse a esas efrinas que les causa repulsión, y este movimiento repulsivo está
determinado porque la señalización activada por ese receptor remodelará el citoesqueleto de modo tal que permitirá la migración en un
sentido contrario.

Segundo ejemplo de señalización.

Relacionado al de remodelación ósea y de cómo responde nuestro cuerpo a las variaciones en la concentración plasmática de calcio. Para
entender el fenómeno de remodelación ósea pensemos brevemente en la estructura del hueso, ustedes saben que los huesos tienen
funciones tanto estructurales como metabólicas porque además de permitir el soporte y movimiento del cuerpo los huesos también
funcionan como un sitio de almacenaje de calcio y fosfato y esto está dado por las particularidades de la matriz extracelular de los huesos.

La matriz extracelular del hueso tiene una composición tal que en su enorme mayoría, en un 67% aproximadamente, está formada por
cristales de hidroxiapatita que en términos minerales es fosfato de calcio, esos minerales se encuentran depositados fundamentalmente
sobre el resto de los componentes de la matriz extracelular, que son fibras de colágeno de tipo 1 y también hay un grupo de proteínas no
colágenas como la osteonectina, la osteopectina, la cianoproteínas óseas, todos esos componentes orgánicos, de los cuales repito el
fundamental es el colágeno de tipo 1, sobre esos componentes se depositan los minerales de hidroxiapatita.

Hay 2 tipos celulares fundamentales que permiten explicar el fenómeno de remodelación ósea, y cuando digo remodelación ósea digo
procesos de producción de generación de nueva matriz extracelular que va a formar parte del hueso y fenómenos de relación o de
resorción de esa matriz ósea y los dos tipos celulares que van a permitir formar o remover esa matriz extracelular son los osteoblastos y
osteoclastos respectivamente.

Descripción de diapositiva: Aquí en esta representación, la matriz extracelular mineralizada está representada en este esquema naranja en
tanto que los osteoblastos suelen estar localizados en los bordes de esa matriz calcificada y van a producir la matriz orgánica sobre la cual
se va a producir la calcificación, y los osteoclastos, en cambio, se encuentran localizados también en los sectores limítrofes de la producción
de la matriz calcificada y van a permitir la degradación local del hueso liberando al exterior por ejemplo iones al plasma.

Descripción de diapositiva: Aquí tenemos una representación más esquemática de la estructura de la matriz extracelular del hueso y de
estos componentes celulares, aquí en negro estamos representamos a la matriz extracelular mineralizada del hueso, sobre los bordes de
cada uno de estos sectores mineralizados en el hueso.

Si lo vemos al microscopio vamos a ver que esos sectores de matriz mineralizada se encuentran formando trabéculas pequeños sectores
sobre la superficie lateral de cada una de estas trabéculas están ubicados los osteoblastos que son células que están encargadas de
producir la matriz extracelular orgánica que luego va a mineralizarse y esa matriz extracelular orgánica, que llamamos osteoide, está
formada, repito, fundamentalmente por colágeno de tipo 1 y otras proteínas accesorias típicas del hueso.

A medida que los osteoblastos producen matriz extracelular y se van mineralizando quedan retenidos en el interior de este material
mineralizado, y en este estado de diferenciación final a estos osteoblastos los llamamos osteocitos, y en ese estado ya encriptado en la
matriz mineralizada su producción de osteoide es mucho menor ya no tienen un grado activo de producción de matriz que tenían en su
estado de osteoblastos, estos osteoblastos provienen mitóticamente de la proliferación de células más indiferenciadas que son las
osteoprogenitoras, que también están en el hueso. El otro grupo celular que contrasta con el de los osteoblastos es el de los osteoclastos,
los osteoclastos tienen origen muy diverso, provienen en realidad de diferenciación de células del sistema inmune, de diferenciación de
monocitos y macrófagos que pueden extravasarse de vasos sanguíneos y mediante un proceso de señalización especifico pueden
fusionarse entre sí para formar células grandes multinucleares que van a tener una actividad enzimática degradadora de hueso y alas que
llamamos osteoclastos.

Descripción de diapositiva: Aquí tenemos otra una imagen histológica, un corte histológica de un hueso que fue desmineralizado para poder
ser cortado y que teñido bajo la técnica de rutina, si bien sé que la interpretación del corte para los que están cursando histología
observemos lo siguiente, este material que observamos rosado es la matriz extracelular del hueso, en los bordes de la matriz extracelular
del hueso observamos un grupo de células que son los osteoblastos, no si pueden observar que estas células muy unidas entre sí que están
en los bordes de la trabécula del hueso son los osteoblastos.

¿Notan algunas células en el interior de la matriz?

Esos son los osteocitos que han quedado incluidos en esa matriz ósea y aquí

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¿pueden observar grandes células que tienen muchos núcleos?
Esos son los osteoclastos, ahora que tenemos en mente la estructura del hueso y cuáles son los tipos celulares que producen la matriz ósea
y cuáles la renuevan vamos a ver un fenómeno de señalización que nos va a permitir comprender la regulación de la calcemia, que no es
otra cosa que la concentración del calcio. Usualmente cuando las concentraciones plasmáticas de calcio son muy bajas una glándula de
nuestro cuerpo, la glándula paratiroides, ubicada en la cercanía de la glándula tiroides, comienza a secretar una hormona proteica que es la
hormona paratiroidea, y esa hormona paratiroidea que es proteína, es secretada al torrente sanguíneo e impacta sobre receptores de
membrana en otros tipos celulares, un tipo celular que responde a la señal de la hormona paratiroides son los osteoblastos, los
osteoblastos poseen receptores a los que se une la hormona paratiroidea.

¿Qué clase de receptores?

Receptores acoplados a proteína G, de los cuales hablaremos en breve. Si volvemos a ese criterio respecto que mencionamos inicialmente
respecto de la localización de las células que emiten la señal y aquellas que la reciben,

¿qué clase de señalización es la que se produce entre las células de la glándula paratiroidea y los osteoblastos?

Es una señalización endócrina a distancia, dado que la hormona viaja a través del torrente sanguíneo y llega finalmente a poblaciones
celulares muy distantes. Estos receptores de membrana, que denominados receptores acoplados a proteína G, son los receptores de
membrana más abundantes de todos, y tienen ese nombre debido a que intracelularmente están unidos a un hetero trímero, la proteína G
es un hetero trímero formado por 3 péptidos diferentes que están unidos desde el lado intracelular de la membrana y que pueden
contactar, pueden chocar, pueden interactuar con estos receptores acoplados a proteína G, que se denomina así porque justamente
pueden interactuar con este hetero trímero.

Los receptores acoplados a proteína G tienen una morfología típica, están formados por un único péptido que atraviesa la membrana siete
veces, tiene siete pasos transmembrana y esa estructura es igual para todos los receptores acoplados a proteína G y no solo son los
receptores más abundantes de membrana sino que de todos los fármacos que existen hoy en la farmacología el 50% de todos los fármacos
ejerce su efecto, o bien uniéndose a receptores acoplados a proteína G o afectando a la señalización producida por esos receptores, su
importancia no puede ser mayor, desde el punto de vista farmacológico.

Estas proteínas G que interactúan con estos receptores se denominan alfa beta y gama, y lo que nosotros vamos a ver en este ejemplo
particular es un tipo de señalización a través de proteína G que no es el único es muy frecuente, pero lean en la bibliografía que hay
variantes de la proteína G que desencadenan distintos tipos de señalizaciones. La variante que nosotros vamos a ver en el contexto de la
parathormona y su receptor se denomina unión de una proteína G con una subunidad alfa estimulatoria, pero verán no es la única que hay
distintas proteínas G que desencadenan reacciones intracelulares diversas.

Cuando un ligando se une a un receptor acoplado a la proteína g esto permite que el receptor se una efectivamente a la proteína G y le
permita a la subunidad alfa cambiar una subunidad de GTP que tiene unida por una subunidad de GTP, entonces este componente alfa de
la proteína G en estado inactivo basal está unido a un GTP y cuando es activado gracias a su interacción con receptor unido a un ligando se
activa uniéndose a un GTP. Esa unión al GTP es transitoria, porque la subunidad alfa luego de cierto tiempo característico desfosforila al
GTP y lo transforma en GTP nuevamente quedando en un estado inactivo, pero durante ese corto tiempo de activación de la subunidad
alfa, mientras está unida al GTP, puede interactuar con otras proteínas de membrana, en particular estimula a una enzima denominada
adelinato ciclasa, que va a catalizar la producción de una molécula un segundo mensajero que es el amp-cíclico,
Este segundo mensajero, esta molécula, es entonces producida por una enzima la adelinato ciclasa como consecuencia de su activación por
esta subunidad alfa. El amp-cíclico es sintetizado a partir del ATP y el adelinato ciclasa desfosforila, quita estos últimos 2 fosfatos del ATP, y
produce un enlace covalente con el anillo con la pentosa del nucleótido generando esta estructura cíclica, que por ende se llama amp-
cíclico. El amp cíclico actúa como una subunidad regulatoria de muchas proteínas intracelulares, es decir muchas proteínas intracelulares
pueden unirse al amp-cíclico y cambiar su patrón de actividad, en ese sentido es análogo a una fosforilación a una modificación post-
traducción que cambia transitoriamente la actividad de esas proteínas.

Entonces la unión del ligando del receptor va a aumentar transitoriamente las concentraciones de amp-cíclico y una de las moléculas de las
enzimas que responde al amp-cíclico es una proteína quinasa denominada proteína-quinasa-A, que en estado basal se encuentra en el
citosol unida a subunidades regulatorias que impiden su actividad pero la unión del amp-cíclico a estas subunidades regulatorias implica la
liberación de la proteína-quinasa-A de forma activa que empieza a fosforilar ahora más activada a diversos sustratos intracelulares.

Entre los muchos sustratos que puede fosforilar la proteína-quinasa-A, fosforila a un factor de transcripción específico, ese factor de
transcripción específico se llama KREB y una vez que esta fosforilado puede unirse a elementos en el ADN, por ejemplo, potenciadores, y
puede inducir la expresión de ciertos genes en aquella célula que recibió la señal del amp-cíclico. Esta vía de señalización implica que
describimos que implica que a través de un receptor acoplado a proteínas G el aumento de concentraciones intracelulares de amp-cíclico

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que conducen a la activación de la proteína-quinasa-A y que activa el factor de transcripción KREB es una vía de señalización muy
conservada, muchos tipos celulares responden a señales a través de sus receptores acoplados a proteína G aumentado sus
concentraciones intracelulares de amp-cíclico, activando la proteína-quinasa-A y entre los efectores que van a activarse a través de esta
enzima son el factor de transcripción KREB.

¿Qué genes específicamente van a comenzar a transcribirse en estos osteoblastos que recibieron esta señal?

El gen inducido que vamos a utilizar para continuar este ejemplo es el gen Rank-L (Rank ligando) es una proteína que va a ser producida por
los osteoblastos. Pero antes de continuar el ejemplo me gustaría hacer una reflexión sobre este fenómeno de señalización, en el concepto
de que la aparición de este segundo mensajero amp-cíclico nos está revelando un patrón molecular característico de muchos fenómenos
de señalización y me refiero específicamente al fenómeno de la amplificación de la señal.

¿A qué nos referimos con el fenómeno de amplificación de la señal?

Notemos que nosotros habíamos comenzado diciendo que una hormona de la parathormona se une a un receptor acoplado a proteína G
en la membrana plasmática, esto puede inducir no sólo la activación de una única subunidad alfa de proteína G sino que en la membrana
plasmática hay muchas proteínas G que pueden chocar con el receptor activado por su ligando y que pueden activarse de manera
simultánea, cada de estas subunidades alfa de proteína G activadas puede activar a muchos adelinato ciclasas que a su vez producen
grandes cantidades de amp-cíclico y esas grandes cantidades de amp-cíclico pueden estimular muchas proteínas-quinasa-A que a su vez
pueden fosforilar a múltiples sustratos, es decir si antes la información estaba contenida en una única molécula de ligando en términos
intracelulares esa señal original estará representada por un gran número de moléculas, este fenómeno de amplificación, el hecho de que
sean muchas moléculas simultáneamente la que han transmitido esta información y la rapidez y robustez a la respuesta.

¿Por qué decimos que es robusta la respuesta?

Porque si por un accidente molecular, imaginemos, una de las subunidades alfa de la proteína G se degrada, si la señal se transmitiera de
una única molécula sobre una única molécula efectora la señalización se detendría en ese momento, el fenómeno de amplificación se
asegura que por más que haya algún accidente molecular en alguna de estas moléculas, que sufra degradación, por ejemplo, la señal va a
continuar y la respuesta celular va a producirse. Si ahora nos retrotraemos al ejemplo anterior al fenómeno de señalización de unión
neuromuscular,

¿Hubo allí un fenómeno de amplificación de la señal? ¿Hubo en algún momento muchas moléculas que permitieran o solo dependía de la
unión de una única molécula acetilcolina a receptor nicotínico?

¿Qué molécula es la amplificación?

El calcio, en el caso del ejemplo pasado, el calcio operó como un segundo mensajero en donde se produjo una amplificación de la señal, en
este caso el segundo mensajero fue amp-cíclico. Volvamos ahora a nuestro ejemplo particular, habíamos dicho que en respuesta a las bajas
concentraciones citoplasmáticas de calcio la hormona paratiroidea sintetizaba parathormona y la parathormona se unía a receptores en la
superficie de los osteoblastos generando un fenómeno de señalización que culminó con la producción de una proteína denomina Rank-
ligando, esa proteína Rank-ligando es secretada, es una proteína que se secreta, aquí representada en verde, por este grupo de
osteoblastos, representados en azul, y estas moléculas de Rank- ligando se unen a receptores que están presentes en los osteoclastos en
diferenciación de sus precursores e inducen uniéndose a los receptores en los osteoclastos y sus precursores, inducen la activación y la
diferenciación de los osteoclastos. Esa activación, este fenómeno de señalización que se ha producido por Rank-ligando uniéndose a sus
receptores en la superficie de los osteoclastos

¿cómo la clasificaríamos Respecto de la cercanía de las moléculas que emiten la señal de aquellas que la reciben? ¿Será una señalización,
como dicen aquí, de tipo paracrina verdad?

Están en proximidad y son dos tipos celulares distintos. Esta diferenciación del osteoclasto una vez que recibe la señal del Rank-ligando
implica una modificación en la expresión génica del osteoclasto que va a inducir por ejemplo la expresión de proteínas de un grupo especial
de integrinas que le va a permitir unirse con altísima afinidad a ciertos componentes de la matriz extracelular del hueso y va a formar una
unión sellada, gracias a estas integrinas, con la superficie del hueso uniéndose a proteínas de esa matriz extracelular.

Otro de los cambios en la expresión génica van a indicar la secreción de muchas proteínas que van a degradar la matriz extracelular, de
modo tal que el osteoclasto empieza a liberar, en esta superficie ha sellado una superficie en la superficie del hueso y libera al exterior
celular un conjunto de proteasas que van a degradar los componentes orgánicos de la matriz extracelular, también libera iones que van a
significar ese medio favoreciendo la actividad enzimática de esas proteasas, como consecuencia de esa actividad proteolítica el hueso, los

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componentes minerales del hueso comienzan a degradarse y al liberarse los iones que estaban originalmente contenidos en los cristales de
hidroxiapatita comienzan a ser liberados hacia el plasma y esto elevará entonces las concentraciones plasmáticas de calcio restableciendo
la lógica del circuito de señalización.

Pensemos, las concentraciones bajas de calcio indujeron la secreción de parathormona, la parathormona indujo la expresión de Rank-
ligando por parte de los osteoblastos y esto indujo la actividad de los osteoclastos que remueven el hueso que lo degradan permitiendo
liberar el calcio, contenido en los huesos nuevamente, al torrente sanguíneo.

Otro de los componentes de esta señalización que está regulando la densidad del hueso, su calidad y matriz extracelular y por otro lado los
niveles plasmáticos de calcio, hay otro actor proteico que debemos describir que va a actuar de manera contraria a Rank-ligando y que es
otro factor proteico que va a puede ser sintetizado por los osteoblastos y que denominamos OPG.

También sintetizada bajo ciertas condiciones por los osteoblastos, esta proteína opg se une a Rank-ligando y bloquea su unión con sus
receptores en los osteoclastos, actúa como un inhibidor, secuestra a las moléculas de Rank ligando, tiene un efecto contrario, estas
moléculas de opg, sintetizadas por los osteoblastos y que actúan antagonizando el efecto de Rank-ligando, suelen ser producidas por los
osteoblastos en respuesta a estrógenos. Los estrógenos pueden inducir la producción de opg por parte de los osteoblastos y esto nos va a
permitir comprender cómo las moléculas esteroideas típicamente ejercen sus efectos celulares.

Entonces decíamos que los estrógenos inducen la producción de opg por parte de los osteoblastos, los estrógenos son hormonas
esteroideas, lipídicas sintetizadas a partir del colesterol y los receptores de estrógenos típicamente son receptores intracelulares, los
estrógenos atraviesas por su característica no polar por difusión simple la membrana plasmática, se unen a receptores citosólicos e
inducen un cambio conformacional de estos receptores citosólicos, que se despegan por ejemplo de proteínas chaperonas que estaban
unidas a ellos, se dimerizan y pueden exponer señales de localización nuclear que permiten su importación al núcleo.

Un ejemplo de importación al núcleo de un receptor citosólico seguramente lo han estudiado en el taller número 4, estos receptores una
vez en el núcleo funcionan directamente como factores específicos de transcripciones, pueden unirse a potenciadores o a silenciadores en
la secuencia del genoma y pueden inducir la expresión génica, en este caso en la unión hay secuencias específicas que se denominan
elementos de respuesta estrógeno que son secuencias conservadas a las que se unen estos receptores de estrógenos que en nuestro
genoma tenemos dos genes que codifican para estos receptores, receptores alfa y beta que pueden actuar como homodímeros o
heterodímeros. En este caso, en este fenómeno de señalización,

¿hubo amplificación de la señal?

El estradiol entró activó un receptor dimérico, se necesitan de dos moléculas de estrógeno, y ese factor de transcripción activó una…
¿hasta ahí tenemos un fenómeno de amplificación?

No, el único fenómeno de amplificación que existe es que la unión de este factor de transcripción específico ahora activo al genoma
probablemente logrará transcribir varias copias de la proteína inducida, en este caso la proteína inducida es opg.

¿Qué tipo de señalización se produjo?

Si pensamos en las células que produjeron la señal y las células que recibieron la señal, para responder esta pregunta tenemos que pensar
que producen los estrógenos, que son recibidos por los osteoblastos,

¿dónde se producen los estrógenos?

Tenemos que pensar en las distintas fuentes de los estrógenos que son diferentes en distintos individuos dependiendo del sexo y del
momento del ciclo vital, en el caso de las mujeres pre- menopaúsicas la producción ovárica de estrógenos es una fuente muy fuerte de
estrógenos, sin embargo en niñas, hombres, en mujeres post-menopaúsicas, básicamente en todos los individuos que no tienen ovarios u
ovarios no funcionales, el estradiol suele producirse a partir de otros precursores, de precursores que son andrógenos, andrógenos
producidos en el caso de los hombres por los testículos pero en el caso de las mujeres por las glándulas suprarrenales, entonces por
ejemplo en el caso de mujeres post-menopaúsicas son los andrógenos producidos por las glándulas suprarrenales que serán convertidos
enzimáticamente por una enzima denominada aromatasa a estradiol. Los osteoblastos producen aromatasa, es decir que en las mujeres
post-menopaúsicas los andrógenos producidos por glándulas suprarrenales llegan a los osteoblastos en los osteoblastos son convertidos a
estradiol y el estradiol en esas células permiten el fenómeno de señalización que recién vimos generando la síntesis de opg. En ese caso
entonces

¿qué tipo de señalización se produjo? ¿Dónde se produjo el estradiol?

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Autocrina, porque el estradiol es en ese caso es producido por las mismas células que van a responder a él, y ¿en el caso de una mujer con
producción ovárica de estradiol?

Allí seria endocrina, y ¿en el caso de los hombres, con testículos y glándulas suprarrenales que producen testosterona y andrógenos? ¿El
estradiol dónde se produce?

El estradiol se producirá en el interior de los osteoblastos, en ese caso sería como en las mujeres postmenopáusicas de manera autocrina,

Es decir, la señalización será endócrina cuando las células que produzcan el estrógeno estén en un lugar lejano en el cuerpo, por ejemplo,
una fuente ovárica, pero en el caso de que el precursor sea el que migre a los osteoblastos y dentro del osteoblasto se produzca la
conversión diremos que es una señalización de tipo autocrina. Entonces, dijimos que el efecto de la parathormona final es inducir la
expresión de Rank-ligando por parte de los osteoblastos esto inducirá la acción de los osteoclastos y el efecto final que tiene sobre el hueso
es la resorción ósea, el osteoclasto degrada el hueso liberando sus componentes al plasma y disminuyendo la masa ósea, por el contrario
los estrógenos inducen la expresión de opg que antagoniza la función de Rank-ligando por ende esto favorece la producción ósea, dado
que la producción por los osteoclastos lo hace degrada por los osteoclastos.

Este fenómeno opuesto de fenómenos de resorción y de producción de matriz ósea va a estar determinada entonces por las proporciones
relativas de Rank-ligando y opg que se produzcan. Durante el crecimiento nuestros huesos crecen porque los fenómenos de producción
ósea son superiores a los fenómenos de remoción ósea, durante la adultez por ejemplo nuestros huesos no crecen porque hay un
equilibrio entre los fenómenos de remoción ósea y de producción ósea, y durante la vejez usualmente predominan los fenómenos de
resorción ósea que disminuyen la masa de los huesos, de hecho estudios cuantitativos que miden la densidad ósea permiten revelar que a
lo largo el ciclo vital hay inicialmente un aumento de la masa ósea en relación al crecimiento corporal, una fase de mantenimiento pero
luego hay una disminución progresiva de la masa ósea y me gustaría que notarán en este gráfico una diferencia importante en la
disminución de la masa ósea de los hombres respecto de la disminución de la masa ósea de las mujeres.

¿Por qué podemos explicar esta gran diferencia, esta caída tan pronunciada en la masa ósea de las mujeres?

La menopausia dice, pero ¿la menopausia a qué se relaciona? Disminuye la producción de estrógenos, si disminuye la producción de
estrógenos disminuirá entonces la producción de opg por parte de los osteoblastos y por ende ese opg disminuido no podrá antagonizar al
Rank-ligando.

¿Por qué los hombres, si no tienen ovarios, por qué no tienen este efecto? ¿De dónde sacan el estradiol los hombres?

De la glándula suprarrenal y de los testículos, de la testosterona de los testículos, entonces es la gran cantidad de andrógeno que tienen los
hombres, superior a la cantidad de las mujeres lo que permite esta conversión dentro de los osteoblastos de andrógenos a estrógenos vía
aromatasa lo que permite sostener la producción de opg. Aquí la compañera dice que la menopausia es posterior, pero exactamente esos
niveles hormonales en el caso de los andrógenos permiten que sean convertidos a estrógenos dentro de los osteoblastos sostener evitar la
caída de la densidad del hueso, por ende, las mujeres sobre todo las mujeres posmenopáusicas tienen una mayor susceptibilidad a estos
fenómenos de remoción del hueso que una condición que conocemos como osteoporosis. En nuestras sociedades, en donde la expectativa
de vida se ha aumentado afortunadamente tanto, la prevalencia de la osteoporosis es muy grande.

¿Qué tratamientos podemos pensar para evitar el desarrollo de la osteoporosis?

¿Qué podríamos hacer conociendo el sistema de señalización que vimos? ¿Inyectar parathormona? ¿Qué haría la parathormona?
Induciría la expresión de Rank-ligando y favorecería la remoción de hueso, la parathormona sería un tratamiento contrario a lo que
buscamos.

¿Inyectar estradiol? Y si inyectamos estradiol, ¿sería un tratamiento adecuado?

Seria temporal dicen aquí, de hecho la administración de estrógenos fue y sigue siendo uno de los tratamientos contra la osteoporosis
dado que estimula la producción de opg y por ende bloquea los fenómenos de remoción del hueso, sin embrago muchas pacientes tienen
efectos adversos por la administración con estrógenos, por ejemplo aumenta el riesgo de accidentes cardiovasculares, y aumenta en
muchos casos el riesgo de cáncer endometrial, por ende dado los efectos adversos que en esta administración de estradiol se ha
investigado mucho respecto de tratamientos alternativos para palear la osteoporosis y uno de los tratamientos de última generación es
muy interesante para que lo pensemos desde el punto de vista mecanístico, es la generación de anticuerpos monoclonales anti Rank-
ligando que pueden unirse y bloquear a Rank-ligando, es algo similar a lo que hace endógenamente opg, que funciona como una proteína
que se une a Rank-ligando, que era una proteína que inducía la activación de los osteoclastos, y lo hace de manera homóloga este
anticuerpo monoclonal que en este caso se usa como un fármaco, como un medicamento, se acuerdan que cuando en el seminario de

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técnicas hablamos de los usos de los anticuerpos como herramientas de investigación, por ejemplo para detectar proteínas específicas.
Aquí hay otro uso muy interesante de los anticuerpos, se unen específicamente a una proteína, a Rank-ligando y en este caso esa unión
bloquea su efecto, entonces si inyectamos este anticuerpo de Rank-ligando en los pacientes, el anticuerpo se une a Rank-ligando y evita
que active a los osteoclastos y este es hoy uno de los tratamientos de última generación contra la osteoporosis que permite evitar los
efectos adversos de la administración directa de estrógenos.
.

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Seminario 11

Diferenciación celular en organismos multicelulares

Para explicar el proceso de diferenciación celular, nos vamos a basar en el desarrollo embrionario porque durante el desarrollo
embrionario se produce esta transición de un cigoto, de un organismo unicelular a un individuo multicelular. Muchos de los procesos que
se requiere para que se forme un organismo multicelular se produce durante el desarrollo embrionario. Este proceso es altamente
complejo. Sin que exista un organizador externo genere la formación de un individuo completo, coordinando los fenómenos de:
 Proliferación
 Migración
 Otros fenómenos de otro orden de complejidad, como morfogénesis
¿Como es posible que este proceso ocurra sin que exista un organizador externo? ¿Cómo es posible que cada una de las células y las
interacciones entre las células, permita que cada una de las células que van a participar de este fenómeno de desarrollo “conozcan” su
comportamiento y su ubicación para generar un organismo completo?
Un estudio en 2013 que publico Human Biology, estima que existe un rango de 37. 1013 células en el cuerpo humano y más de 200 tipos
celulares.
Distintos procesos que permite que se genere, a partir de una única célula un organismo completo. Como los fenómenos de proliferación,
cuáles son los mecanismos que utiliza la célula para regular su tasa de proliferación celular. Entre ellos, la unión de ciertos factores de
crecimiento o mitógenos a receptores de ciertas células le permitía producir una cascada de transducción de señas internas que le permitía
a la célula comience a producir las ciclinas necesarias, para las quinasas dependientes de ciclinas que regulan la progresión del ciclo celular
acontezca.
También estudiamos, las uniones entre células y la matriz extracelular, algunas de las interacciones intercelulares que ocurren entre las
células, como fenómeno de señalización. No solo son interacciones directas, sino que pueden estar mediadas por moléculas químicas.
Las células pueden migran, debido a su reestructuración de su citoesqueleto y muchas veces la iniciación de ese fenómeno de migración
implicaba que la célula debía adquirir un fenotipo mesenquimático, despegarse de las células lindantes, despegarse también de la
membrana basal si originalmente era una célula epitelial y luego reorganizar su citoesqueleto para poder migrar.

Diferenciación celular
Entendemos este proceso, como la especialización que sufren las células para adquirir un fenotipo particular. Estas especializaciones
pueden ser:
 Morfológicas
 Bioquímicas
 Funcionales

Teniendo en cuenta la regulación génica, en un individuo las diferentes células pueden expresar diferentes subconjuntos de genes de su
genoma.

Hay un grupo de genes que van a ser expresados por los diferentes tipos celulares de un individuo, a ese grupo se los llama Genes
Constitutivos o housekeeping. Que son genes que se encuentran involucrados en el mantenimiento básico de la célula. Por ejemplo, el
mantenimiento del citoesqueleto, que están en todos los tipos celulares. Del mismo modo, el gen que codifica para las histonas también se
expresa en todos los tipos celulares, dado la organización de la cromatina, o sea la adhesión del ADN con las histonas es independiente del
tipo celular.
Además de estos hay un conjunto de genes que va a ser especifico de cada uno de los tipos de células especializadas, que le van a conferir
a la célula ese fenotipo particular.

Durante mucho tiempo, las observaciones embriológicas que los fenómenos de diferenciación celular son usualmente irreversibles en los
embriones, es decir, una vez que la célula adquiere un fenotipo diferenciado no vuelve a tener en un momento posterior del desarrollo un
fenotipo indiferenciado. Esta idea, de que una vez que se alcanza el fenotipo diferenciado es irreversible, implico diversas teorías. Entre
ellas, que la diferenciación implicaba una pérdida progresiva de genes y que eso explicaba el fenómeno irreversible.

Un biólogo, August Weisman en el año 1892, creo la teoría del Plasma Germinal. Postulo que la diferenciación celular conllevaba la pérdida
progresiva del plasma germinal, de la información genética. Teoría que se creía válida hasta el año 1950, cuando se pudo poner a prueba
experimentalmente si esto ocurría o no.

Expresión génica diferencial

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En los años ´60, se llevó a cabo una serie de experimentos por John Gurdon. Trabaja, como método experimental, con embriones de
anfibios, las cigotas son muy grandes y es mucho más fácil de estudiar. Pensemos que se pueden observar bajo la lupa y esto, permite la
fácil manipulación. Se pueden inyectar, quitar el núcleo ya que su diámetro es mucho mayor a otras especies, como la humana que son
minúsculas.
Hizo el siguiente experimento, usando embriones de anfibios, inyectando micropipetas de vidrio y ayudándose con un lupa, le extrajo el
núcleo a esa cigota, y le inyecto un núcleo de un individuo ya desarrollado. Usando una célula del epitelio intestinal de un renacuajo. Lo
que observo fue, que esa cigota con el núcleo reconstituido, se desarrolló normalmente, formo un renacuajo completo.
Entonces, sacando conclusiones: observo que no se perdía información de las células diferenciadas, ya que, sino esa cigota no hubiera
generado un renacuajo, por lo que llego a la conclusión de que la diferenciación no conlleva una pérdida de información genética. Y
también esto condujo a romper el paradigma de que la diferenciación es irreversible.
En el proceso biológico, fisiológico nos parece que es irreversible, pero bajo condiciones de experimentación, por ejemplo, poniendo el
núcleo de una célula diferenciada en el citosol de un cigoto, hay una reprogramación y vuelve al estado indiferenciado que permite el
desarrollo normal.
Gurdon intento repetir este experimento con otras células diferenciado y en algunos casos no puedo lograr el desarrollo normal. Como, por
ejemplo, usando el núcleo de neuronas, donde había algo, en ciertos tipos celulares, que impedía esta progresión.
Estos experimentos de Gurdon, fueron los primeros indicios de la clonación, como hoy se la conoce.

En el año ´97, esto se logró reproducir esto en mamífero, clonando por primera vez a una oveja, que la llamaron Dolly. Se logro reproducir
los experimentos de Gurdon, pero en mamíferos, teniendo en cuenta la gran dificultad que conlleva, dado del pequeño tamaño de la cigota
y también para poder implantarlo luego, a diferencia de reptiles, las cigotas de mamíferos necesita de un ambiente materno para
desarrollarse.
En el caso de la oveja Dolly se utilizó una célula del epitelio de la glándula mamaria de una oveja se la fusiono con una cigota enucleada de
otra oveja, como avanzo el desarrollo luego fue implantada.
Esto permitió para poder clonar mamíferos para diferentes especies, como caballos, ganado y esto permitió que ciertas compañías
compraran las patentes y ofrecer este servicio de clonación, como también a las mascotas.

También se pudieron clonar primates, a partir de fibroblastos fetales se generaron 2 primates, que son clones entre sí, y clones del que
aporto de la información genética. Esto nos habla de que se podría clonar también humanos, desde un punto de vista técnico.

La diferenciación celular implica no la perdida de expresión de genes, sino la expresión de un subconjunto de genes.
Para hablar de diferenciación celular, debemos de hablar de un concepto, del compromiso celular. Hablamos de diferenciación celular,
cuando una célula se ha especializado morfológica, fisiológica y bioquímicamente. Pero embriológicamente antes de que se diferencia, ya
suponían que tenía una restricción evolutiva. Entendemos como restricción evolutiva, a aquellos tipos celulares que surgen de un tipo
celular.

Para pensar el concepto de restricción evolutiva, analizaremos el fenómeno de gastrulación:

Durante los primeros procesos durante el desarrollo embrionario, implica una proliferación en un grupo de células, totipotenciales,
llamadas blástomeras. Luego de ese fenómeno inicial, siguen las mitosis, pero en un momento comienza la primera diferenciación, y se
forma una masa de células, llamada Macizo Celular Interno o Epiblasto, que van a formar las células que formaran todos elementos del
embrión propiamente dicho, surgen entonces todos los tipos celulares de este MCI. Otra parte, llamado Macizo Celular Externo o
trofoblasto, formara todos los elementos extraembrionarios, como, por ejemplo, la placenta. Aquí ya tenemos una restricción del
potencial evolutivo. Diremos entonces que una célula, por ejemplo, del MCI no podrá dar células para la placenta, ya que perdió potencial
evolutivo con respecto a la cigota que tenía toda la potencial, es decir, era totipotencial.
Alrededor de la 3era semana de desarrollo, las células del MCI comienzan un fenómeno de diferenciación, y fenómenos que involucran,
migración y transición epitelio-mesenquimática, se genera un embrión de 3 capas, de 3 hojas germinativas: ectodermo, endodermo y
mesodermo. Tendremos que los tipos celulares que derivan de cada una de las hojas serán diferentes entre sí. Por ejemplo, las neuronas,
surgen de la hoja ectodérmica. Las células del aparato respiratorio y del aparato digestivo, surgen de la hoja que formaban parte del
endodermo.
Antes de la diferenciación hay cambios moleculares de las células, que restringe el potencial evolutivo de la célula, restringe el tipo de
célula que puede dar. A este fenómeno que no se puede ver, se lo denomina compromiso celular.

En compromiso celular, en el campo de la biología del desarrollo en 2 fases: en fenómenos de especificación y de determinación. Ambos
son parte del mismo fenómeno de compromiso.
Embriólogos y biólogos del desarrollo, en este compromiso a la restricción del potencial evolutivo, antes de la diferenciación, a la
especificación que luego es seguida por un fenómeno de determinación.

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 1- Especificación:

Estos conceptos surgen de experimentos embriológicos.

Surgen a partir de experimentos, que el compromiso tiene 2 fases. La primera fase, de especificación, es lábil o reversible, dado que uno
puede modificar, cuando modifica esas interacciones de tipos celulares o señalizaciones que recibe.
Se basaron en experimentos clásicos de la embriología, que analizan el desarrollo embrionario de anfibios, en estadios muy tempranos,
llamado blástula, donde se divide mitóticamente y genera una masa de células, esta blástula tiene 2 polos, se los dividió así por el tamaño
de las células, en el polo animal donde las células con mucho más pequeñas y el polo vegetal que además esta enriquecido por material
materno. Se observo, clásicamente, que las células que forman parte del polo animal iban, a formar la parte dorsal del embrión, y las
células que se encontraban en el polo vegetal iba a formar parte de las células que se encontraba en la región ventral del embrión.

Entonces, ¿se preguntaron si las tenías un destino fijo de lo que iban a formar? ¿O podrían formar algo distinto del embrión, si yo saco esa
célula y la coloco en una región diferente?

Y se demostró que si era cierto esto. Si se tomaban células de la región ventral y se las colocaba en la región dorsal. No generaban una
nueva región ventral injertada en la región dorsal. Entonces estas células, tienen un compromiso lábil, si uno las coloca ante otras señales
positivas del embrión, podemos revertir ese compromiso inicial. La fase, en donde las células pueden revertir el compromiso celular, lo
llamamos Especificación.

Esto se complementa, con experimentos donde se toman células del polo animal del embrión, y se las coloca en un ambiente neutral, en
una placa de cultivo, esa célula se va a desarrollar con las características del polo animal, o sea se formarán las células que corresponden a
la región dorsal del embrión. Es decir, había algún tipo de determinación que se expresaba en un ambiente neutro, pero cuando uno las
colocaba con otro tipo de interacciones específicas del embrión, podía ser reversible. Entonces los embriólogos, a esta fase, en que una
célula en un ambiente neutro no modificaba su expresión, pero si lo hacía mediante señales positivas del embrión, la denominaron fase de
Especificación.

2- Determinación:
A medida que avanza el desarrollo embrionario, este compromiso se hace más grande. Y aun moviendo de una región a otra, no podemos
revertir la determinación de esas células. Esta fase no reversible, donde el compromiso no es reversible, la llamamos Determinación. La
célula está determinada cunado no podemos modificar, la orientación de su compromiso aun sometiéndolas a otras señales del embrión.

¿Cuáles son los mecanismos moleculares, que está pasando en el interior de la célula para explicar tanto los fenómenos tanto de
compromiso como de diferenciación celular?

¿Como se regula la expresión genética de la célula para explicar los procesos de diferenciación celular?

Mecanismo de la expresión génica:

Los eucariotas y en mamíferos en general, tienen distintos puntos de regulación de la expresión génica. El punto que concentra mayor
cantidad de mecanismos regulatorios es justamente el comienzo de la regulación génica, el inicio de la transcripción de los genes es el
punto que está más regulado en las células. Si un gen se va a expresar o no. Si un gen comienza a transcribirse, probablemente se exprese.
Dado que los otros mecanismos, si bien existen tienen una menor intensidad en las células. Como, por ejemplo, mecanismos que regulen a
las histonas, mediante acetilación o metilación, y menos medida fosforilación de las histonas. Otro tipo de mecanismo a nivel del ADN será,
por ejemplo, metilación del ADN.

También un factor importante son los Factores Específicos de la Transcripción. Son proteínas que pueden unirse en forma directa a ciertas
secuencias del ADN, elementos reguladores, potenciadores si tienen un efecto positivo, en cambio los silenciadores tendrán un efecto
negativo. Lo que determina la expresión génica, es que los factores específicos de la transcripción reclutan a ese sitio complejos
remodeladores de la cromatina. Por ejemplo, complejos que remueven a los nucleosomas, desplazarlo si ese factor especifico esta unido a
un potenciador, el efecto será la descondensación de la cromatina en ese sitio. Y también estos factores específicos puede reclutar
complejos modificadores de las histonas.
Tienen un segundo rol, estos factores específicos de la transcripción, van a interactuar con la ARN polimerasa II posicionada sobre el
promotor de los genes. Secuencia de su actividad:
a. Se une a un elemento del ADN
b. Recluta complejos remodeladores de la cromatina o enzima que modifican a las histonas
c. Se abre localmente la cromatina
d. Permite el ARN polimerasa II y los factores basales de la transcripción se unan al promotor del gen que está siendo regulado.

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 e. Se necesitan señales positivas para que comience la transcripción, mediante un complejo llamado Mediador, este complejo va a
regular la frecuencia con la que ARN polimerasa II transcriba esos genes.

El control combinatorio, se produce mediante un subconjunto particular factores de la transcripción que regulen la probabilidad de inicio
de un gen dado. A este subconjunto de factores específicos de la transcripción se denominó Control combinatorio, dado que un solo factor
no era suficiente para regular la expresión génica, y es la combinación particular para cada gen lo que lo hace especifico.

¿Como podemos explicar que a lo largo del desarrollo embrionario las distintas células que surgen mitóticamente de unas de otras vayan
adquiriendo un subconjunto de factores específicos de la transcripción?

Un caso particular, si en una cigota que luego de la primera división, una de las células hijas tiene un factor especifico de la transcripción
diferente de la otra célula hija; siendo que ambas partes de la misma célula huevo.
Como las interacciones de las células, fenómenos de unión y desunión, y fenómenos de señalización, pueden modificar el patrón de la
expresión génica. Por ejemplo, uno podría pensar en ciertos ARNm en la célula original podría no estar de manera equitativa en todo el
citosol, sino que ciertos ARNm pueden localizarse en ciertas regiones de la célula. Entonces, cuando esa célula se divida solo, una de las
células hijas tendrá el material de esta región concentrada y eso podría explicar, porque solo una de las células hijas exprese esa proteína.
Si esa proteína, es un factor especifico de la transcripción, ya comenzamos a tener diferencias.
Otro fenómeno de interacciones diferenciales se va dando, interactúan con diferentes células vecinas a lo largo de la proliferación. Las más
importantes, son aquellas interacciones, llamadas Interacciones Dependiente de Contacto o Yuxtacrinas. Por ejemplo, ciertas estructuras
durante el desarrollo embrionarios se producen, gracias a un grupo de señalización entre un grupo de células epitelial en contacto con otro
conjunto de células con fenotipo mesenquimático, y estas inducciones epitelio-mesenquimáticas, estos fenómenos de señalización entre
grupos celulares que están cercanos entre sí suelen explicar algunos fenómenos de diferenciación posterior.
Osea, las células más basales del grupo de células epiteliales estarán en contacto con el grupo de células mesenquimáticas, y podrá recibir
señalizaciones dependientes de contacto, y va n a poder en función de esa señalización específica, modificar su patrón de expresión génica,
y gracias a esa señalización, puede proliferar un subconjunto de células y transformarse en un epitelio secretor, convirtiéndose en una
glándula.

¿Cuáles son, en el desarrollo embrionario, las señales moleculares que dependen de contacto y que pueden afectar a un subconjunto de
células epiteliales en contacto con célula mesenquimáticas?

Vía Wnt

Una vía de señalización muy frecuente en el desarrollo embrionario es la vía Wnt (ligando, señal química que participa de esa señalización).
Esta vía, usualmente el recepto es el receptor Frizzled.

(el nombre de Wnt, viene de estudios que se realizaron en Drosophila, y se llamó a este gen Winless, ya que la mosca utilizada no tenía alas.
Y el mismo gen, pero descubierto en ratón, se lo llamo Integred. Entonces ambos nombres se fusionaron para dar Wnt. W=winless, y
nt=integred)

Este ligando, Wnt, no es soluble, se encuentra en la membrana de ciertos tipos celulares y que contacta con los receptores de células
yuxtapuestas, que se encuentran en contacto directo con esas primeras células que están expresando el ligando, en nuestro caso, las
células mesenquimáticas están expresando el ligando Wnt y las células epiteliales están expresando el receptor Frizzled. Esto unión
provoca una cascada de eventos de señalización celular, que conduce a la estabilización de una proteína, beta catenina, que va a funcionar
como un factor especifico de la transcripción. La beta catenina, es una proteína que participa de las uniones de anclaje, que permitía el
anclaje de los filamentos de actina y los filamentos intracelulares; pero esta proteína, libre tiene otra función que es actuar como un factor
especifico de la transcripción. Aunque en condiciones basales está siendo producida y degradada, así que su concentración es casi nula.
Solo cuando una célula recibe una señal de Wnt, se estabiliza esta proteína, es decir, se detiene su degradación. Entonces, solas las células
que estuvieron en contacto con el ligando Wnt expresar este factor especifico de la transcripción. Y esto explicara porque estas células
expresaran ciertos genes que conducirán a que se diferencien en células del tipo epitelial secretoras.

Vía Delta- Noch

No todas las interacciones celulares serán del tipo positivas, sino que también existirán las del tipo inhibitorio entre las células en el
desarrollo embrionario, que tienen que ser entendidas como un fenómeno de señalización.

Dentro del oído interno, existe una membrana que va a percibir los sonidos, en ella hay una capa de células epiteliales, que van a ser
ciliadas. Las células que rodean a las células ciliadas, que no son ciliadas, pero van a tener la función de soporte a esas células ciliadas. Lo
que explica esto es una señalización mediado por contacto directo, aquí el ligando que va a ser expresado será, denominado Delta, y el

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receptor, Noch, y a esta vía se la conoce como vía Delta-Noch. Es una vía que usualmente media interacciones inhibitorias dado que, la
señal de Delta-Noch, cuando se produce en la célula que recibe esa señal, va a regular negativamente la expresión del ligando Delta.

Inicialmente todas las capas de células epiteliales tienen una expresión relativamente débil y aproximadamente equivalentes, todas están
expresando simultáneamente el ligando Delta y el receptor Noch. En un momento dado, fluctuaciones aleatorias en los niveles de
expresión de estos ligandos, hacen que una de esas células, en un momento determinado exprese un poquito más del ligando Delta.
Cuando esta célula exprese un poco más este ligando, las células vecinas van a regular negativamente su propia expresión del ligando
Delta, dado que esta vía de señalización conduce a la represión del ligando Delta.

Estas células que no expresan Delta van a permitir que células un poco más alejadas expresen nuevamente Delta, generando este patrón
regular, en donde cuando una célula expresa Delta, permitiendo que otras no lo expresen, y que a su vez otras si lo expresen.

Vía de señalización a través de morfógenos

Otro conjunto de señalizaciones entre las células, que ocurre durante el desarrollo embrionario, ya no va a estar mediada por interacciones
yuxtacrinas y dependientes de contacto, sino por señales químicas solubles que pueden ser emitidas por una población de células y afectar
a otra población de célula que están a cierta distancia. Una vía de señalización en el desarrollo embrionario se debe a moléculas,
denominadas morfógenos.

Los morfógenos son señales químicas producidas por un cierto grupo de células y que van a actuar mediante fenómenos de señalización
paracrina, incluso autocrina en células vecinas. Todo el grupo de células que puede responder a esa señal química, o morfógeno, se lo
denomina Campo Morfogenético; y las células que emiten esa señal química se las denominara Células Polarizantes.

Una de las características de los morfógenos, es que la respuesta a esa señal química no es una respuesta de todo o nada, sino que el tipo
de modificación de la expresión génica que van a sufrir las células que responde a la señal, van a depender de la concentración de la señal a
la que estuvieron expuestas. Las células que estuvieron más cerca de la fuente de la señal, es decir, que van a estar expuestas a una mayor
concentración del morfógeno, tendrán una tipo particular de expresión de sus genes y van a ser diferentes de aquellas células que
estuvieron a una concentración menor, por estar, por ejemplo, más lejanas a la fuente de origen. Y esto se debe, en termino moleculares,
dependiendo del número de receptores que son activados en la superficie de las células que responden, la intensidad de las vías de
señalización intracelular cambiara, y esto conducirá a que ciertos factores específicos de la transcripción puedan activarse o no, en cierto
tipos celulares, dependiendo de la intensidad de la señalización.

También tenemos que pensar que, en muchos casos, los factores específicos de la transcripción ya están dentro de la célula, pero de
manera inactiva, y un fenómeno de señalización, como que conduzca a una fosforilación intracelular podría activa a un factor especifico de
transcripción, que estaba en la célula, pero de manera inactiva.

Alguno de los morfógenos es, por ejemplo, Sonic Hedgehog, ácido retinoico, muchas proteínas de la familia Bmp (proteínas morfogenéticas
de hueso), Fgf (factor de crecimiento de fibroblastos).

Tomando como ejemplo al Sonic Hedgehog se realizaron experimentos clásicos de morfógenos, que su patrón de diferenciación va a
depender de la concentración de la molécula. Estudiaron como se formaban los ejemplos de diferenciación anteriores de los miembros de
los mamíferos. Los experimentos se realizaron en estudios de desarrollo embrionario de las aves, en embriones de pollo. A diferencia de
los humanos, las aves tienen 3 dígitos a modo de dedo. Tomaron un conjunto de células originalmente indiferenciadas respecto de su
genotipo, respecto de otras y las colocaron en otro embrión en la región anterior. Y los que observaron, que, al realizar estos injertos, el
patrón de desarrollo de los dígitos del ave, cambiaron, se duplico el ejemplo anteroposterior. Pensaron que seguramente existía una
molécula polarizante que estaba actuando, y fue ahí que descubrieron a Sonic Hedgehog. Y el receptor que responden a esa señal, que se
llama Pach.

Regulación mediante microARN

Los microARN son una familia de ARN pequeños no codificantes endógenos, codificados por el genoma por un gen que codifica para los
micro ARN, que luego de ser transcriptos por la ARN polimerasa II so modificados por una enzima, de modo que en su estado maduro
tienen una longitud muy pequeña. Y se unen ene le citosol a un complejo proteico, denominado Risc que, es el complejo de silenciamiento
inducido por ARN. Estas enzimas a las que se une el miARN, tienen la capacidad de aumentar la tasa de degradación de los ARNm o de
inhibir la traducción de estos. La función de los miARN es de guiar a este complejo enzimático a cuáles son los ARNm blanco o diana que
van a ser regulados a ese complejo, y esa capacidad de guiar al complejo, depende de la complementariedad de bases que tiene un miARN
particular con el ARNm que va a ser regulado. Un miARN regulara negativamente a todos aquellos ARNm que se encuentren en una célula y
que tengan complementariedad de bases.

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Un factor especifico de la transcripción, importantísimo en el desarrollo del sistema nervioso, es el denominado Rest. Actúa en un sentido
represivo, es decir, puede unir a cierto elementos en el genoma del célula que se expresan, esos elementos se encuentran en regiones
regulatorias de los genes y una vez que se une Rest a estos elementos de manera directa, recluta un conjunto de proteínas regulatorias o
correpresores. Entonces puede reclutar, un conjunto de enzimas que pueden metilar el ADN, desacetilar y metilar las histonas, que van a
ejercer sobre esas regiones, marcas epigenéticas represivas del ADN. A consecuencia es, que toda la región donde se unió Rest va a cerrar,
heterocromatinizarse y no va a expresarse. Rest reprime específicamente genes de las neuronas y que les dan la identidad a las neuronas.

Durante el desarrollo embrionario temprano, todas las células del embrión expresan altos niveles de Rest, es decir, todas las células del
embrión, en etapas muy tempranas, tienen reprimido la expresión de los genes de neuronas. Alrededor de la 15 SD, comienza a disminuir
los niveles de Rest, esa disminución específica del tubo neural, lo que le permite comenzar a expresar genes específicamente neuronales. O
sea que para que se formen las neuronas, los niveles de Rest tienen que ser bajos.

En este proceso de disminución de Rest, participan los miARN, en particularmente el miARN-9, que tiene una secuencia tal que es
complementaria del ARNm de Rest. Y lo que se observo es que, a medida que avanza el desarrollo neuronal, las células expresan niveles
cada vez más altos de este miARN-9, entonces los niveles del ARNm de Rest irán disminuyendo progresivamente.

Memoria celular

Si ponemos, por ejemplo, a 2 tipos celulares distintos a una misma señal, la respuesta será distinta, para la misma necesitará un
mecanismo de transducción de señal y si, en caso de que no tuviera el receptor especifico no podrá dar una repuesta ante esa señal. O si le
falta uno de esos componentes, tampoco podrá tampoco responder del mismo modo.

Nos referimos a memoria celular, dependerá de las proteínas que ya haya expresado hasta ese momento y las proteínas que haya
expresado hasta ese momento dependerá de la historia de fenómenos de señalización de la misma célula. La respuesta de una célula
dependerá de su estado interno, y ese estado interno es resultado de una historia evolutiva de fenómenos de señalización, en términos
ontogenéticos.

Mecanismos moleculares (biológicos) que explican la memoria celular

Si una célula es expuesta, por ejemplo, a una señal Wnt y activo un cierto tipo de factores específicos de la transcripción, si esa célula se
divide, esos factores de transcripción que han sido expresado se repartirán en las células hijas, y no en las células hijas, de una célula que
no estuvo expuesta a la señalización de Wnt. Entonces, un mecanismo que tienen es que tienen las células, es la transmisión de factores de
transcripción a las células hijas, en particular los factores específicos de la transcripción que ya había formado esa célula antes de dividirse.

Otro mecanismo, es el hecho muchas modificaciones de la cromatina pueden ser transmitidas mitóticamente a las células hijas. Y hay
evidencias de 2 de ellas, la metilación de ciertas regiones del genoma, esta marca silenciadora que heterocromitiniza ciertas células y que
puede transmitirse luego de la replicación celular a las células hijas.

Linaje celular

Árbol genealógico que describe todos los tipos celulares que surgen por fenómenos de diferenciación progresiva, los unos de los otros y lo
que normalmente veremos es una restricción del potencial evolutivo.

Por ejemplo, vamos la evolución de una célula madre hematopoyética, ubicada en la medula ósea de los huesos largo, que por
proliferación y diferenciación sucesivas prácticamente todos los tipos celulares sanguíneos. Surgen de esta célula madre, un progenitor
mieloide que dará los glóbulos blancos, el precursor de los eritrocitos y del megacariocitos, que dará luego a las plaquetas. En cambio,
surge de este mismo precursor, un precursor linfoide, que dará origen a los linfocitos T y B. Lo que se observa es la restricción evolutiva. Se
observa de este árbol, que los linajes que están en las raíces pueden dar un mayor potencial evolutivo que las ramas siguientes, pueden dar
origen a un mayor número de tipos celulares.

Concepto de una célula madre: es aquella que célula que son indiferenciadas con capacidad de autorrenovación, y lo que las caracteriza es
que, al dividirse pueden generar una célula hija idéntica, en cuanto a las características, a la célula progenitora, es decir, tiene una división
celular, conservando un pool de células madre. Las células que no son células madres, cuando se dividieron ya disminuyeron su potencial
evolutivo. Este proceso, es el llamado autorrenovación.

En el caso de las células madres, esta diferenciación de 2 células hijas, una de ellas con las características de célula madre puede explicarse
por 2 casos de asimetría.

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En un caso, ciertos factores ciertos ARNm que le confieren el fenotipo de célula madre, se ubicaran de manera diferencial en el citosol de la
célula madre, y solo una de las células hijas heredara ese patrimonio de ARNm que le confererirán la característica de célula madre.
Entonces la que heredo ese conjunto de ARNm que seguirá como célula madre y la otra habrá reducido su potencial evolutivo.

Otra asimetría que explica, las características de las células vecinas o de la matriz extracelular que entran en contacto directo con esas
célula madres. Un medio ambiente diferencial o especifico que pueden inducir señalizaciones específicas para hacer que una célula madre
conserve sus características, se denominó Nichos de células madres. Si una célula madre se divide, y solo una célula hija queda en contacto
con ese medio ambiente, seguramente será esa célula la que conserve las características de célula madre. Lo que significa que mediante
señalización mediante interacciones yuxtacrinas, mantengan el fenotipo de célula madre. Y la célula que se despegue de las células
adyacentes o de la matriz extracelular, perderá así, las características de célula madre, restringiendo su potencial evolutivo.

Clases de células madres:

Dependen del potencial evolutivo, lo que le confieren esas diferencias

 Totipotentes: son las células madres que pueden dar todos los tipos celulares de un individuo. Son las primeras 8 blástomeras que
pueden dar todos los tipos celulares embrionarios y también extraembrionarios.
 Pluripotentes: son aquellas células que poseen una enorme capacidad evolutiva, pero que ya restringieron parte de ese potencial
evolutivo. Son ejemplo, las células del macizo célula interno, que darán origen a la mayoría de las células embrionarias.
 Multipotentes: las células que quedan en los diferentes tejidos, aun en un individuo adulto. Como, por ejemplo, una célula madre
hematopoyética.

Las células madres no solo tiene importancia embriológica, sino que también tienen implicancia de terapias génicas. Por ejemplo, en
terapias de reemplazo para regeneración de tejido como el tejido muscular cardiaco, en el caso de un infarto de miocardio.

Shamanaka hizo una investigación acerca de los factores específicos de la transcripción de las células madres. Realizo experimentos en
embriones de ratones, utilizando el MCI y los hizo crecer en condiciones de cultivo. E hizo contabilizar los factores específicos de la
transcripción de esas células, y encontró un conjunto de 24 de factores de transcripción. Y luego tomando células diferenciadas, como los
fibroblastos, le transfectó, hizo que expresaran este conjunto de 24 factores de la transcripción y observo, que esos fibroblastos se
indiferenciaban y tomaban las características de las células madres pluripotentes. Luego fue quitando, uno a uno, estos factores para ver
cuál era un mínimo número de factores que necesitaba para seguir como una célula madre pluripotente, y observo que solo 4 factores de
transcripción eran necesarios. Estas células madres obtenidas mediante este estudio, se las llamo Células Madres Pluripotente Inducidas
(IPS cells).

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Seminario 12 de Falzone

Cáncer

 Un tumor se desarrolla a partir de una única célula que prolifera de manera anormal. A partir de una célula mutada se producen
células descontroladas ya crecidas. Un tumor puede ser benigno o maligno.
 Un tumor benigno permanece confinado en su localización original, sin invadir el tejido sano adyacente ni propagarse a lugares
distantes del cuerpo.

Un tumor maligno es capaz de invadir el tejido normal y propagarse por el cuerpo mediante sistemas circulatorios o linfáticos. Solo a estos
se los denomina canceres, y es su capacidad para invadir y dar lugar a la metástasis (distribución de tumores en todo el organismo) lo que
lo convierte al cáncer en algo tan peligroso.

 También se clasifican de acuerdo al tipo de célula del que proceden:

Los carcinomas: son alteraciones epiteliales.
 Sarcomas: son tumores sólidos de tejidos conectivos como el musculo, el hueso, el cartílago y tejido fibroso.
 Las leucemias y los linfomas: surgen a partir de células hematopoyéticas y de células del sistema inmune.

Causas del Cáncer

La primera alteración es la proliferación continua e incontrolada de las células cancerosas. Estas crecen y se dividen de manera
incontrolada, invadiendo órganos y tejidos sanos, diseminándose por todo el cuerpo. La pérdida del control del crecimiento que muestran
las células cancerosas es el resultado de la acumulación de alteraciones en múltiples sistemas reguladores de la célula y se refleja en varios
aspectos del comportamiento celular.

Desarrollo

Los tumores se desarrollan a partir de una única célula que prolifera de manera anormal. Es un proceso multietapa, en el que las células se
convierten en malignas progresivamente a través de una serie de alteraciones. Se considera un proceso multietapa constituido por la
mutación y selección de aquellas células con capacidad cada vez mayor de proliferación, supervivencia, invasión y metástasis.
La iniciación del tumor se debe a una alteración genética que provoca la proliferación anormal de una única célula. La proliferación celular
da lugar a una población clonal de células tumorales.

La progresión del tumor ocurre a medida que se acumulan mutaciones adicionales en las células de la población del tumor que les
confieren ventajas selectivas, por lo que los tumores crecen y aumentan su carácter maligno e invasivo. Este proceso se denomina
selección clonal, ya que un nuevo clon de células tumorales evoluciona en función de su ritmo de crecimiento más rápido o de otras
propiedades, que les confiera una ventaja selectiva.

Progresión tumoral

Ocurre la remodelación de la matriz extracelular que está dada por las metaloproteasas. Estas proteínas degradan la MEC, lo que permite a
las células cancerosas invadir los tejidos normales adyacentes. La acción de las metaloproteasas sobre la MEC es muy importante porque es
capaz de alterar las uniones célula-MEC y célula-célula, mediar la liberación, activación o desactivación de moléculas señalizadores
autocrinas o paracrinas (activadores de angiogénesis, por ejemplo) y activar o inactivar los receptores de la superficie celular.

Y también suceda la generación de nuevos vasos sanguíneos. Esto se denomina angiogénesis. La angiogénesis es necesaria para mantener
el crecimiento de un tumor por encima de un tamaño de un millón de células, en el que se requieren nuevos vasos sanguíneos para
proporcionar oxígeno y nutrientes a las células tumorales en proliferación. Estos vasos se forman en respuesta a los factores de
crecimiento secretados por células tumorales. También es importante la formación de nuevos capilares para el establecimiento de
metástasis.

Propiedades de las células cancerosas

Manifiestan alteraciones en los mecanismos que regulan la proliferación, diferenciación y supervivencia celular hormonal
Siguen creciendo hasta alcanzar una densidad elevada de células en cultivo, de la misma manera que ocurre con la proliferación
incontrolada
Continúan moviéndose tras contactar con otras, migrando sobre células adyacentes y creciendo en patrones multicapa desordenados

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Son capaces de crecer en ausencia de factores de crecimiento
Producen factores de crecimiento que estimulan su propia proliferación (estimulaciones autocrinas de crecimiento)
Tienen menor capacidad de adhesión que las células normales
Genes reguladores de la proliferación celular
Genes supresores de tumores: es un tipo de gen que elabora una proteína que se llama proteína supresora de tumores, la cual ayuda a
controlar el crecimiento celular o lo frena. Las mutaciones en genes supresores de tumores pueden conducir al cáncer. Como, por ejemplo,
p53, el retinoblastoma y el microARN (que puede ser también un oncogén).

La función del P53 en estado normal es la de regulación del ciclo celular ante un daño del DNA. Cuando el ADN se daña, el P53 se acumula
en el núcleo, y es capaz de detener el ciclo celular en G1 antes que se duplique el ADN e iniciar su reparación. P53 va a inducir la síntesis de
proteínas inhibidoras de los complejos ciclina-CDKs, bloqueando el ciclo celular. Si se repara la lesión el ciclo continúa, pero si no se repara
se induce la apoptosis de la célula. La alteración de la proteína P53 produce inestabilidad genómica, siendo las células incapaces de evitar la
proliferación o activar la apoptosis, cuando está comprometida la integridad del ADN, de manera que son capaces de acumular las
mutaciones para completar la carcinogénesis y continúan dividiéndose.

El retinoblastoma (Rb) inhibe el paso a través del punto de restricción en G1 reprimiendo la transcripción de determinados genes
relacionados con la progresión del ciclo celular y la síntesis de ADN. El paso a través de estos puntos se regula por los complejos Cdk4,
6/ciclina D, que fosforilan e inactivan a Rb. Por lo tanto, la inactivación de Rb en los tumores supone la pérdida de un regulador negativo de
la progresión del ciclo celular.

Protooncogenes: es un que participa en el crecimiento normal de las células. Las mutaciones en un protooncogén pueden hacer que este
se convierta en un oncogén, que puede hacer que se formen células cancerosas.
El microARN puede funcionar como gen supresor de tumores o como oncogenes.
A estos se los considera reguladores de la expresión génica en las células eucariotas. Participan en la regulación de una tercera parte de los
genes que codifican proteínas, por eso es muy posible que estén implicados en el desarrollo tumoral.
Hay ARNmi que se amplifican en varios tipos tumorales y actúan sobre ARNm que codifican proteínas que inhiben la progresión del ciclo
celular (inhibidor de Cdk p21) o favorecen la apoptosis (Bcl-2 Bim)

Vías por las que un proto-oncogén puede convertirse en un oncogén:

Mutaciones puntuales: una sustitución de un par de bases por otro par en una secuencia de ADN
Reordenamiento cromosómico: una parte de un cromosoma se liga al otro cromosoma, el resultado es un cromosoma híbrido detectable
en el cariotipo. Esto da lugar a una alteración en la transcripción del ADN.
Por amplificación de genes: las células eucariotas están formadas por un genoma diploide. En determinadas circunstancias una de las
copias puede multiplicarse miles de veces aumentando su tasa de expresión, dando lugar a la amplificación del gen. Es uno de los
mecanismos más implicados en la carcinogénesis.
Los principales sospechosos de mutaciones relacionadas con el cáncer son los oncogenes, genes supresores de tumores mutados, y los
genes de reparación del ADN defectuoso, las mutaciones que figuran a continuación también hacen daño:
Activar y desactivar carcinógenos
Control de suicidio celular (apoptosis)
Control de la señalización celular
Control de la diferenciación celular

Necrosis y Apoptosis

A nivel celular existen dos formas de morir: por necrosis o por apoptosis. Por necrosis mueren las células accidentalmente cuando son
lesionadas por agresión mecánica o tóxica. Por apoptosis mueren las células cuando son inducidas a suicidarse.
En la muerte por necrosis se detectan una serie de cambios característicos:
Las células y sus orgánulos se hinchan porque se altera la capacidad de la membrana plasmática para controlar el paso de los iones y el
agua
Las células se rompen y su contenido se vierte al espacio intercelular
Se origina inflamación de los tejidos adyacentes
Las membranas se rompen
Las células que son inducidas a sufrir apoptosis o suicidio celular presentan las características siguientes:
Reducen su tamaño
Sus mitocondrias se abren y dejan salir el citocromo c
Las membranas no se rompen, la célula se va fragmentando en cuerpos apoptóticos
Los aspectos morfológicos de la apoptosis:

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Disminución del volumen celular
Se generan ampollas en la membrana plasmática
Los núcleos se rompen
La célula se fragmenta en núcleos picnóticos

La apoptosis tiene dos vías, una extrínseca y una intrínseca. La vía extrínseca es la que necesita una señal externa, de afuera de la célula
que la induzca.

Extrínseca: existen receptores fas con dominios externo e interno en la membrana celular. Se adaptan a él, el ligando fas y proteínas FADD.
Este complejo de tres partes envía señales para que la procaspasa 8 llegue y se adjunte a ellos, liberando la caspasa 8 ya activa, en forma
de tetrámeros. Estos tetrámeros activan la caspasa 3, la 6 y la 7. La caspasa 7 empieza a deshidratar el citoplasma, la 3 induce la
fragmentación del ADN y la formación de cuerpos apoptóticos, y la 6 se encarga de los procesos apoptóticos.

Intrínseca: se da en la mitocondria y no necesita ninguna señal. Involucra tres tipos de proteínas, las anti apoptóticas (BCL-2 y BCL-XL), las
proapoptóticas (BAX y BAK) y las proapoptóticas (BID, PUMA y BAD). Las proteínas PUMA y BAX se juntan y comienzan un proceso de
ruptura de la membrana externa mitocondrial. Cuando esta abertura surge, el citocromo C de la mitocondria se libera hacia el citosol.
Luego, el citocromo C se une a una proteína Apaf-1 y al ATP. Este último complejo forma un apoptosoma. Para que este comience a
funcionar, cuando se forman varios apoptosomas se une a este la caspasa 9 que forma un anillo, al que se va a unir la caspasa 3 para que
comience el proceso de apoptosis intrínseca. Proteínas mitocondriales como la SMAC/Diablo entran al citoplasma donde se unen a las
proteínas citoplasmáticas que actúan como inhibidores de la apoptosis llamada IAP y las inactivan. Estas IAP, bloquean la activación de las
caspasas, incluidas las caspasas efectoras como la 3, para mantener viva a la célula.

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