1.

MÉTODOS INDIRECTOS

Estas son las técnicas serológicas tradicionales para descubrir anticuerpos contra
determinado agente viral, teniendo en cuenta que la exposición al agente produce una
respuesta por parte del sistema inmune que genera la producción de anticuerpos
específicos.
 
Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del
huésped. Entre las técnicas tenemos las siguientes:
  EIA, IFI, Test de aglutinación, WB, Producción de anticuerpos in vitrio, etc. (13)
En el curso de una infección varían las poblaciones de anticuerpos frente al agente
infectante. En una primera fase la clase predominante suele ser IgM, mientras que con
el transcurso del tiempo las IgM disminuyen hasta desaparecer o quedar a baja
concentración residual y, en cambio, aumentan las IgG. La búsqueda de anticuerpos
clase IgM es de utilidad para hacer diagnóstico de infección reciente en una sola
muestra de suero extraída en el período agudo de la enfermedad. Este método se
emplea para el diagnóstico de enfermedades como: Rubéola, Citomegalovirus,
Hepatitis a virus A, etc.
 
La búsqueda de anticuerpos clase IgG en una sola muestra se utiliza como técnica de
tamizaje, por ejemplo, para el diagnóstico de la infección por el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH). Posteriormente los hallazgos positivos son
confirmados en la misma muestra de suero por otra metodología.
La seroconversión es el aumento del título de anticuerpos cuatro veces o más
observado en dos muestras pareadas de suero.
La primera muestra se obtendrá en el período agudo de la enfermedad y la segunda, 15
a 21 días después de la primera, en el período de convalesencia.
 
La seroconversión es útil para establecer el diagnóstico retrospectivo, pero no para el
diagnóstico temprano de una infección, puesto que debemos esperar al período de
convalecencia para obtener la segunda muestra del suero. Este tipo de diagnóstico es
útil para estudios epidemiológicos.
Las diferencias de títulos deben ser mayores de cuatro veces para tener valor
estadístico y se debería estudiar ambas muestras simultáneamente.
 
Las determinaciones serológicas también nos pueden informar sobre el estado inmune
del paciente frente a muchas infecciones virales, como paperas, sarampión y rubéola,
donde la presencia de anticuerpos específicos indica que el individuo ha estado
expuesto previamente al virus y que es inmune para una nueva infección.
 
A veces el diagnóstico serológico tiene dificultades, por ejemplo: cuando se realiza en
recién nacidos para identificar la causa de una infección congénita. La evaluación de
los resultados en este caso es difícil porque los ensayos serológicos detectan ante todo
IgG, y mucha de la IgG presente en el suero del niño provino de la madre por vía
transplacentaria y no es posible diferenciar la IgG del niño de la IgG de la madre.
 
 Tradicionalmente, el diagnóstico de las enfermedades virales congénitas se realiza
mediante determinaciones seriadas de IgG en el suero. El descenso del titulo de
anticuerpos indica que los anticuerpos eran maternos y que el niño no está infectado.
 El aumento en el título de anticuerpos indica que el niño esta produciendo anticuerpos
y por lo tanto esta infectado. Sin embargo, hoy en día el diagnóstico serológico viral
se ha simplificado con las nuevas técnicas que detectan IgM, ya que la detección de
IgM específica en el suero del niño confirma que el niño está infectado, porque la IgM
no atraviesa la placenta y por tanto no puede ser de origen materno.

A continuación, se describirán los métodos serológicos más comúnmente usados en el

diagnóstico viral.(14)

MÉTODOS TRADICIONALES

Son utilizados para el diagnóstico serológico de las infecciones virales incluyen:

Fijación del Complemento, la neutralización, la inhibición de la hemaglutinación (IHA)
y la hemaglutinación indirecta (HAI). La confirmación serológica de una infección
aguda por cualquiera de estas técnicas tradicionales está dada por un aumento de cuatro
veces o mayor en el título de anticuerpos cuando se emplean diluciones al doble
seriadas. En los últimos años se han desarrollado nuevos métodos para la detección de
anticuerpos virales, y en muchos casos han demostrado ser mejores que las pruebas
tradicionales en términos de economía, sensibilidad, especificidad y rapidez.

FIJACIÓN DEL COMPLEMENTO:

La FC es un proceso de dos pasos, esta técnica emplea el complemento para lisar los
eritrocitos que, a su vez, funcionan como indicadores. Durante el primer paso, el
antígeno reacciona con el anticuerpo que se encuentra en la muestra de suero del
paciente, en presencia de complemento (casi siempre de suero de conejo) titulado
previamente. Si el antígeno y el anticuerpo reaccionan, se activa la vía clásica del
complemento, luego se añade el indicador constituido por eritrocitos cubiertos con
anticuerpos y de esta forma, si el complemento se fija y se activa por el complejo
antígeno viral-anticuerpos del paciente, los eritrocitos no se lisarán. Si durante la
primera fase no hay unión antígeno-anticuerpo el complemento permanece libre y se
une al complejo indicador y produce la lisis de eritrocitos. Este es un sistema
semicuantitativo y es una de las pruebas serológicas tradicionales utilizada como
estándar de comparación («gold standard») para las nuevas pruebas comerciales. Una de
sus aplicaciones es determinar anticuerpos contra agentes de baja prevalencia como los
virus Coxsackie. Los anticuerpos que fijan el complemento aparecen tardíamente
comparados con los descubiertos por otras pruebas y tienen una vida corta, lo que puede
ser útil para determinar la actividad de ciertas infecciones, como por ejemplo la rubéola.
(15)
 

HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA

Los eritrocitos se pueden sensibilizar con diversos antígenos y se pueden utilizar como
sistema indicador. Así, si se descubren los anticuerpos, la reacción se revelará como una
hemoaglutinación que se puede advertir fácilmente a simple vista. Existe una amplia
variedad de antígenos que se pueden unir a los glóbulos rojos, entre ellos los
carbohidratos que se adhieren con rapidez, en el caso de las proteínas se requiere un
proceso de pretratamiento con ácido tánico o con cloruro de cromo. Este sistema se usa
para demostrar anticuerpos contra toxinas como la de la difteria o del tétanos. También
para descubrir anticuerpos contra el virus de fiebre amarilla, VZV, influenza,
parainfluenza y dengue. (16)

AGLUTINACIÓN DE LÁTEX.

Es similar a la técnica de látex ya descrita sólo que en este caso el antígeno se encuentra
fijo a la partícula de látex y, por tanto, se espera descubrir los anticuerpos que se
encuentran en la muestra. Estos ensayos generalmente son pruebas de filtro (tamizaje)
pues sólo determinan la presencia o no de anticuerpos. Los resultados se pueden
interpretar como «inmune» (si es positivo) o «susceptible» (si es negativo), como en el
caso de determinar el estado inmune para el virus de la rubéola. La información que
suministra corresponde a exposición al agente o infección pasada y aunque, como se ha
afirmado, la IgM es una aglutinina muy buena, generalmente las pruebas de látex no son
específicas para ésta. En virología se utiliza con más frecuencia la técnica de
aglutinación de látex directa. (17)

 NEUTRALIZACIÓN VIRAL.

Demuestra anticuerpos por su efecto inhibitorio en la infectividad viral. Este ensayo

mide funciones virales específicas, por lo que es bastante selectivo, de esta forma la
neutralización viral sólo mide anticuerpos para antígenos específicos sobre la superficie
viral. Si los anticuerpos se encuentran en el suero del paciente que se pone a incubar con
una suspensión del virus, los anticuerpos reaccionarán con los antígenos virales, y
cuando la suspensión se ponga en presencia de las células permisivas al virus (en cultivo
celular) el resultado será la neutralización de la invasión celular y la no evidencia del
EC. En caso de no existir anticuerpos en el suero de paciente, se producirá la invasión
celular y como consecuencia se hará evidente el EC característico. Para realizar esta
prueba se debe disponer de líneas celulares adecuadas y por lo general se hace en
laboratorios donde se tiene toda la infraestructura para los cultivos celulares. Esta
técnica se ha utilizado para el diagnóstico de las infecciones por dengue. (18)
Resultado positivo (Figura 5A). Resultado negativo (Figura 5B)

INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN (IH).

Algunos antígenos virales tienen capacidad para aglutinar eritrocitos de diversas

especies, sinembargo la presencia de anticuerpos específicos en el suero del paciente
evitan la aglutinación de los eritrocitos por tales antígenos; cuando esto ocurre se
evidencia la presencia de anticuerpos. Para cuantificarlos se hacen diversas diluciones
del suero con el fin de hacer una titulación y determinar el nivel de anticuerpos del
paciente. Esta prueba al principio se utilizó para demostrar anticuerpos contra rubéola y
dengue, pero se ha reemplazado por ELISA, pues la IH no puede diferenciar entre
anticuerpos tipo IgM (infección aguda) o IgG (infección antigua), sin embargo aún se
utiliza para influenza y para otros virus menos abundantes que poseen actividad
hemaglutinante como los arbovirus (p.e., virus de la fiebre amarilla), reovirus y algunos
enterovirus (Figura 6).(6)
 

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

 La IFI, es un método rápido y confiable para la determinación de anticuerpos

antivirales en el suero del paciente. El principio de la técnica se ilustra en la figura......

  Se basa en la unión de anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente a los
antígenos virales expresados en la superficie y citoplasma de células infectadas, que han
sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de especificidad se usan células no
infectadas. El procedimiento es el que sigue: Se incuba el suero del paciente con las
células infectadas y no infectadas.

 Luego se realiza un lavado con PBS y se agrega posteriormente anticuerpo anti IgG
humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína. El isotiocianato de fluoresceína es
una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposición de la luz ultravioleta y emite
una luz verde característica.

El conjugado se unirá a los anticuerpos del paciente si la reacción es positiva, leyéndose

la prueba en un microscopio de fluorescencia. La presencia de Ac se evidencia por la
aparición de fluorescencia en el citoplasma y superficie de las células infectadas,
mientras que las células control no fluorescen. 
ENZIMOINMUNOANALISIS INDIRECTO (EIA)

 Los EIA indirectos se han aplicado de forma amplia en los últimos años al diagnóstico
de anticuerpos virales. Tiene las ventajas de ser un método versátil, relativamente
económico, sensible y de lectura objetiva (instrumental). La metodología es la siguiente:
Los antígenos virales se inmovilizan sobre una fase sólida (esferita, policubetas para
microtitulación u otros elementos de plástico) y se agregan los sueros en estudio; se
incuban, se lavan y se revela la reacción Ag-Ac por el agregado de una
inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato
apropiado para esta. Los resultados se pueden leer con un espectrofotómetro y en
algunos casos de forma visual.(13)