ABSTRACT: In this practice is study the behavior of an acid phosphatase extracted from a small amount of wheat

germ. Study was conducted on enzyme activity and the effect of the concentration of the enzyme substrate
concentration as equal, the effect of the substrate concentration, effect of temperature, pH effect and effect as
phosphate. Was observed that the behavior of functional enzyme activity in the concentration was still the Michaelis -
Menten model to which the linearization is realize according Lineweaver - Burk and calculated their corresponding
Vmax and Km. was obtained on the effect of temperature on the enzyme activity that the optimal temperature was 50 °
C and the effect of pH in the optimum pH was pH = 5.

Keywords: Effectors, Enzymatic Activity, Substrate, Catalytic Activity, Kinetic Characterization, Inhibition, Michaelis-
Menten, Lineweaver – Burk.

1. INTRODUCCIÓN Esquema 1. Equilibrio quimico de una reacción enzimática

Las enzimas son proteínas que catalizan reacciones ;

químicas en los seres vivos, están compuestas por
secuencias de aminoácidos, algunas poseen pequeñas Esquema 2. Relación de la constante catalítica, velocidad
moléculas orgánicas conocidas como cofactores que máxima de reacción y constante de Michaelis- Menten
contribuyen en la función catalítica, la unión entre un
2. MATERIALES Y MÉTODOS
sustrato y una enzima forma un complejo conocido
como enzima-sustrato el cual acelera reacciones pero Los materiales, reactivos y metodología usada para la
no hace factibles reacciones que se consideran caracterización cinética de una enzima fue realizada
imposibles, la acción catalítica depende de condiciones con base a la guía práctica de Enzimología: fosfatasa
fisiológicas especiales como: pH, temperatura, acida.
concentración y afinidad de la enzima por el sustrato,
las fuerzas implicadas en la unión enzima –sustrato
son de carácter iónico, puentes de hidrogeno, y en
general enlaces polares. Una característica relevante
de las enzimas es su especificidad en las reacciones 3. RESULTADOS Y ANÁLISIS
que catalizan. Las enzimas se clasifican de acuerdo al
tipo de reacción que catalizan entre ellas se 3.1 Efecto de la concentración de la enzima usando
encuentran las transferasas, liasas ligasas, la dilución y los tiempos óptimos.
isomerasas, hidrolasas, y las oxidorreductasas [10].
Se determinó la velocidad de reacción a una cantidad
La cinética química de las enzimas se puede analizar igual de sustrato con diferentes volúmenes de enzima
mediante la ecuación de Michaelis-Menten (Esquema diluida con el fin de identificar el comportamiento de la
1) y las características catalíticas se pueden actividad catalítica cuando la concentración de enzima
determinar mediante la Linealización de Lineawearver- aumenta.
Burk (esquema 2), esta metodología matemática
La fosfatasa ácida puede ser cuantificada por
relaciona el inverso de la velocidad y la concentración
colorimetría mediante la transformación del sustrato p-
de sustrato donde la pendiente es el valor de k m y el
nitrofenilfosfato (p-NFP) en p-nitrofenol (p-NF) que en
intercepto el valor de Kcat, el análisis cinético por estos
solución ácida absorbe a 405 nm.
métodos evidencia la presencia de factores que
afecten la actividad catalítica como lo son los
inhibidores, activadores y efectores, también permite
encontrar las regiones de mayor actividad catalítica en
función de variables controlables [1].

K1 Kcat
E+S E-S E+P
K-1
 NO2 NO2 0.08
pH ácido
F.A OH

V (Δabs/min )
O P O
O 0.06
H2O
O O
O P O
O
0.04
p-NFP p-NF 0 0.5 1 1.5 2
Figura 1. Reacción catalizada enzimáticamente sobre Volumen enzima (ml)
el sustrato p-NFP para la liberación del producto p-NF.

Gráfica 1. Actividad enzimática en función del volumen

El KOH adicionado a cada tubo de ensayo con el fin de
detener la reacción enzimática se debe a que se extrae
un protón del grupo hidroxilo del p-NF y por resonancia
se produce la quinona (ver figura 2.), la cual no
reacciona con la enzima y es la que absorbe a 405 nm.
La actividad enzimática puede darse en unidades de
Abs/min.
O
NO2
Figura 2. Estructura de la quinona.
Con base en lo anterior se obtuvieron los resultados de
la tabla 1 y la gráfica 1.
de enzima a concentración fija de sustrato.
La velocidad de una reacción catalizada
enzimáticamente para la formación del producto (P)
dependerá de la [ES] y esta a su vez de la [E] y [S] en
solución. Esta suposición solo sirve a concentraciones
bajas de sustrato porque a medida que aumente la
velocidad esto no variara incluso aunque se aumente
la concentración de sustrato. [1]
A bajas concentraciones de sustrato la velocidad es
proporcional a [S] que es constante para este sistema,
si se aumenta [E] se incrementa la velocidad máxima
por tener mayor número de sitios activos pero el valor
del Km no cambia. [1] En estas condiciones se puede
observar saturación del sustrato, donde la [S] es mayor
que el Km, se espera una cinética de orden cero
respecto al sustrato y de primer orden para la enzima,
obteniéndose una relación lineal.

3.2 Efecto de la concentración del sustrato sobre la

actividad enzimática

Cuando la concentración de sustrato aumenta la

Tabla 1. Resultados obtenidos para la actividad actividad enzimática dependerá de la velocidad de
enzimática a una concentración fija de sustrato. reacción catalizada en función del volumen del sustrato
que se adicionó. En la tabla 2 se observan los
Resultados resultados obtenidos para este ítem, la gráfica 2
Volumen representa el efecto de [S] a medida que aumenta la
V
Enzima
(Δ abs/min ) concentración de este para una concentración fija de
(mL)
enzima, cuando se satura con sustrato la actividad
0,3 0,172
0,5 0,216 catalítica se mantendrá constante [1].
1 0,29 Los valores de Km y Vmax se pueden determinar
1,5 0,354
teniendo en cuenta el Esquema 3.
2 0,411

Esquema 3. Linealización de Lineweaver-Burk.

Tabla 2. Resultados obtenidos para la actividad encuentra la concentración del sustrato y de enzima,
enzimática a una concentración fija de sustrato. el aumento o disminución pueden afectar los
parámetros dependientes de dicha reacción como lo
Volumen Enzima (mL) V(Δ abs/min ) son la velocidad máxima, la media y la Km, factores
0,7 0,261 especiales que dan idea de la actividad enzimática o la
0,9 0,311 cantidad de enzima que realiza la conversión de 1 mol
de sustrato por segundo [4].
1,2 0,359
Para poder observar a fondo la relación que guarda la
1,6 0,434
actividad enzimática con la cantidad de sustrato o
2,4 0,559 enzima es necesario entender las interacciones
presentes en las reacciones catalizadas por enzimas,
Km 0,149 así la forma más eficaz en la interacción de llave
Vmax 0,326 cerradura, la cual compara a la enzima como una
combinación espacial casi única para un solo tipo de
molécula que llevará a un cambio químico más
conocida como sustrato. Este análisis conlleva a
0.1
recordar a las enzimas como grandes aglomeraciones
0.09 de proteínas que son conformadas por aminoácidos,
las cuales poseen diversas características debido a
V (Δabs/min )

0.08
cambios significativos de sus ambientes que generan
0.07 diferentes tipos de interacciones intra o inter molecular,
favorables para la formación de un bolsillo o sitio activo
0.06
para un correcto alojamiento del sustrato [5].
0.05
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2
[s] (mM)

Gráfica 2. Actividad enzimática en función de la

concentración de sustrato a una concentración fija de
enzima.

17.9
f(x) = 8.53 x + 3.06
R² = 1 Figura 3. Reacción catalítica entre la enzima y el
16.6 sustrato
1/V

15.3
Cabe resaltar que no todas las enzimas tienen un
comportamiento similar en la forma de unión de los
14 sustratos ni del tipo o cantidad de sitios activos para
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 dicha molécula; debido a que no todas las reacciones
1/[s] biológicas son idénticas y no todas poseen la misma
función dentro del metabolismo de un sistema vivo, la
selectividad especifica por el sustrato y el tiempo de
Gráfica 3. Linealización de Lineweaver-Burk para la reacción. Un ejemplo es el de las fosfatasas ácidas las
actividad enzimática en función de la concentración de cuales tienen la capacidad de agarrar un orto-ester
sustrato a una concentración fija de enzima. monofosfato en un ambiente acuoso y transformarlo en
un alcohol con liberación de ácido fosfórico, las
Análisis de los ítems 3.1 y 3.2
interacciones implicadas dentro de la fosfatasa ácida
Dentro de los factores medibles en el estudio cinético son de carácter iónico o electrónico las cuales facilitan
de las reacciones catalizadas por enzimas se el agarre con los grupos que poseen átomos con
electrones libres que servirán como anclaje o como
puntos de reacción para posteriormente dejar el sitio
activo como un producto [6].
La diferencia más notoria es la dependencia del
sustrato, este se va volviendo cada vez más minoritario
hasta llegar al punto en donde la actividad catalítica es
un máximo por la imposibilidad de un aumento en la
velocidad máxima en contraposición al cambio de la
cantidad de enzima que registrara un aumento
proporcional en la actividad [1].

3.3 Efecto de la temperatura sobre la actividad

enzimática

El aumento de temperatura aumenta la actividad

Esquema 4. Reacción entre el para-fenil fosfato
catalítica de una enzima sin embargo, debido a que
disodico y la fosfatasa en medio acuoso.
una enzima es una proteína después de cierta
Son este tipo de interacciones provocadas por factores temperatura esta corre el riesgo de desnaturalizarse
externos e internos las que realizan el trabajo catalítico debido al calor y la actividad disminuye hasta hacerse
selectivo de un sustrato pero ahora bien si la cero. Los resultados obtenidos se observan en la
selectividad y afinidad por un sustrato no cambia gráfica 4 [3].
(suponiendo aun ambiente libre de inhibidores) cuál es
la razón del cambio de los parámetros medibles dentro 0.44
de la cinética de las enzimas, la explicación lógica se
0.36
encuentra dentro de la saturación o instauración del
V (Δabs/min )
sistema en sí, dependiendo del parámetro que se 0.28
desee medir y del que queda constante [4].
0.2
Al mantener un cambio creciente significativo de 0.12
sustrato se observa un incremento en la velocidad de
toda una ruta metabólica esto según lo observado 0.04
dentro de las distribuciones normales de las gráficas 0 20 40 60 80 100
de Michaelis-Menten; sin embargo dicho aumento Temperatura ºC
posee un límite el cual corresponde a un aumento
excesivo de la cantidad molecular del sustrato y se
ocupan todos los centros activos de las enzimas, las 0.44
enzimas simplemente llegarán a un límite en donde el 0.36 Grupo 1
trabajo está al máximo de su capacidad, así la
V (Δabs/min )

velocidad de reacción se vuelve independiente de la 0.28

cantidad de sustrato y se habla de una actividad
catalítica máxima alcanzada puesto que al realizar la
reacción se consume sustrato y en concentraciones
muy elevadas el consumo de sustrato se considera
constante y por ende la actividad máxima ver gráfica
2[4].
Por otro lado se encuentra el caso en donde la
velocidad a una cantidad de sustrato constante tendrá
un aumento proporcional al aumento de la cantidad de
enzima que se tenga dentro del sistema reaccionante
de esta manera se observa un aumento lineal en la
actividad catalítica, esto es adecuadamente explicado
de forma análoga al proceso anterior puesto que al
tener una cantidad de enzima que va en aumento se
encontrara más espacios o centros activos libres por el
cual la saturación de sustrato no se dará la cantidad
moles de sustrato por segundo aumenta y por ende la
actividad aumentar ver gráfico 1[1].
0.2
0.12
0.04
0 20 40 60 80 100
Temperatura ºC
Gráfica 4. Actividad enzimática a igual volumen de
enzima y sustrato a diferentes temperaturas.
El control de la actividad catalítica de una enzima
depende en gran medida del adecuado ajuste de
variables como la temperatura en la reacción química,
para cada tipo de enzima existe una temperatura
optima máxima de reacción aunque en general el
aumento gradual de la temperatura conlleva a un
aumento en la actividad catalítica como se observa en
la gráfica 4, para la fosfatasa ácida la temperatura
oprima de reacción esta alrededor de 50°C, superior a 3.5000
esta temperatura gráficamente se observa que la 3.0000
actividad catalítica disminuye debido a que la proteína 2.5000 Grupo 4

Vo (µM/min)
se empieza a desnaturalizar [12].
2.0000
3.4 Efecto del pH sobre la actividad enzimática 1.5000
1.0000
Las enzimas son muy sensibles a las variaciones de
0.5000
pH, un cambio drástico de este afectará en gran
medida la actividad de la enzima en una reacción 0.0000
química [3]. 00 00 00 00 .00 .00 .00 .00
0. 2. 4. 6. 8 10 12 14
pH
Con base a lo anterior experimentalmente se
obtuvieron los resultados de la tabla 3 y la gráfica 5.
Gráfica 5. Actividad enzimática en función del pH

Tabla 3. Resultados obtenidos efectos del pH sobre la Los protones además de alterar la estructura, alteran la
actividad enzimática forma del sitio activo, rompiendo los enlaces que se
encuentran en esta interacción ver figura 7.
V(Δ abs/min ) V(Δ abs/min )
pH
Grupo 3 Grupo 4
2 0,004 0,010

3 0,03 0,015

4 0,067 0,014

5 0,09 0,015 Gráfica 6. Efecto de pH en actividad enzimática

7 0,026 0,003 En las proteínas al igual como ocurre con la

9 0,022 0,005 temperatura el pH debe ser ajustado para evitar la
hidrolisis de la proteína ya que la carga neta sobre la
12 0,017 0,006 proteína está directamente relacionado con el pH,
debido a este hecho la acción catalítica se ve afectada
0
ya que se ven involucrados residuos de aminoácidos
0 que están muy cerca del sitio activo donde la reacción
se llevara a cabo si las cargas se ven estabilizadas
Vo (mM/min)

0 Grupo 3
sobre el sustrato al igual que para la temperatura
0 existe un pH optimo el cual como se observa en la
0 gráfica 5 se encuentra a pH=5, la estructura terciaria
de un proteína se ve afecta a pH o muy básicos o muy
0
ácidos con respecto al pH optimo modificando el
0 rendimiento de la acción catalítica de la enzima; debido
0 2 4 6 8 10 12 14
a las particularidades de las cargas netas de la enzima
pH en el sitio activo generalmente estas son óptimas en
estrechos rangos de pH y dependen de factores como
la ionización del sustrato, el estado de ionización de
los residuos y el modo de fijación del sustrato sobre la
enzima entre otros [11].

3.5 Efecto de la concentración de efectores

En algunos casos una enzima necesita la presencia de

un cofactor para aumentar la actividad catalítica, estos
pueden ser iones inorgánicos, en este caso los
efectores fueron: NaF, VO43-, MoO42- y PO43- [3].
Los resultados obtenidos por los diferentes grupos se que agarrar las curvas de velocidades de reacción del
encuentran consignados en la tabla 4 y se observan en sustrato y a su vez son explicados debido a la
la gráfica 5. presencia de moléculas que también son capaces de
interaccionar con la enzima a estas se le conoce como
Tabla 4. Resultados obtenidos efectos del pH sobre la efectores y realizan actividades de unión no covalentes
actividad enzimática. con sitios diferenciales a los sitios activos para el
Resultados
sustrato, realizando así un corrimiento en la
Efector Km Vmax conformación espacial de la enzima permitiendo así el
171,1 4,37 correcto enlace con el sustrato [8].
PO43- Grupo 1
-0,1305 -0,0001 Estos efectores muestran varias relaciones y pueden
VO43 Grupo 3
ser desde moléculas similares al sustrato o efectores
MoO42- Grupo 5 135,93 -0,0383 homotrópicos hasta pequeñas moléculas o átomos
4,34 1,41 ionizables que realicen una acción de tensor o anclaje
MoO42- Grupo 4
de diversas zonas espaciales de las enzimas
PO43- Grupo 2 4,769 0, 227 conocidas como efectores heterotrópicos, de los
últimos dependen las regulaciones alostéricas y la
razón de su presencia puede ser visualizada
0.7 experimentalmente debido a comportamientos no
mentelianos en las velocidades ya mencionadas de
0.6
reacción [8].
0.5
La fosfatasa ácida es de la familia de las
Abs/min

0.4 metalohidrolasas binucleares lo cual indica la

0.3
0.2
0.1
0 como es el comportamiento de los diferentes
0.09 0.19 0.37 0.69
[S] (mM)
Gráfica 7. Actividad enzimática en relación al efecto de
la presencia de efectores.
Debe resaltarse que los resultados obtenidos no se
relacionan especialmente para las parejas de grupos
que utilizaron el mismo efector, debido posiblemente a
errores en la ejecución de la actividad, por lo cual se
considera que la información experimental no es lo
suficientemente concluyente.
Sin embargo debe resaltarse que de los factores
importantes de estudio se encuentran los cambios en
las velocidades de reacción que puede haber dentro
de la catálisis enzimáticas, en muchos caso este tipo
de cambios son provocados por alteraciones
espaciales dentro de la conformación normal de la
enzima ya sea para aumentar la reacción o para
disminuirla, estas son conocidas como la conformación
tensa y la conformación relajada de la enzima y su
utilidad es la de mejorar o empeorar la unión natural
que tiene la enzima hacia un sustrato [8].
Estos cambios son apreciados debido a cambios
significativos en las velocidades o incluso en la forma
presencia de un núcleo metálico de Fe(lll) y un cofactor
metálico (ll), dentro de los estudios realizados se
observó el efecto de la acción de varios metales dentro
de la reacción catalítica. En la gráfica 4 se observa
1.39 cofactores en función de la concentración de sustrato y
la absorbancia, cada uno de ellos presenta
comportamientos diferentes pero los K m no se
correlacionan (Tabla 4).
3.6 Preguntas
1) ¿Qué dato necesitaría para expresar la actividad
específica en UI de p-nitrofenil fosfato hidrolizado?
La sigla UI hace referencia a Unidad Internacional,
este parámetro corresponde a la cantidad de enzima
pura que transforma, en condiciones óptimas, 1 µmol
del sustrato en un minuto [13]. Los datos en función del
cambio en µmol del p-nitrofenil fosfato pueden ser
expresados en unidades UI al conocer la
concentración de enzima en el volumen empleado.
Este valor fue determinado mediante el ensayo del
ácido bicinconínico, obteniendo una concentración de
enzima de 340.09 ± 23.34 mg/mL. Con relación al
valor reportado en la literatura para las Unidades
Internacionales, este corresponde a que una unidad
hidroliza 1,0 mmol de p-nitrofenil fosfato por minuto a
un pH de 4,8 en una temperatura de 37 °C [14].
4) Sabiendo que el valor de kcat para esta enzima con
su sustrato en condiciones experimentales similares es
de 38.4 s-1, calcule la concentración de enzima en el
ensayo de Vo vs [S]o y comente si esa concentración
comparada con las manejadas para el sustrato permite [4] MELO, V., CUAMATZI, O. Bioquímica de los
suponer un ajuste del sistema al modelo de Michaelis- procesos metabólicos. 2ed. Mexico: Editorial Reverté,
Menten 2007. p. 98

Sea → [5] Wan, N. Enzyme purification by salt (ammonium

Con respecto al resultado anterior se puede decir, que
al obtener un valor tan bajo de concentración inicial de
enzima en comparación al sustrato, se puede suponer
que los datos experimentales se ajustan al modelo de
Michaelis-Menten, ya que se cumple que la
concentración de sustrato sea mucho mayor que la de
la enzima. Además, esto demuestra, que la acción
catalítica de las enzimas se da en concentraciones
traza.
CONCLUSIONES
Se evidenció que la enzima fosfatasa ácida presentó
actividad catalítica ya que resultó la transformación del
sustrato p-nitrofenilfosfato a producto p-nitrofenol. Esta
fue notable debido a la aparición del color amarillo en
solución luego de interrumpir la actividad enzimática.
El comportamiento del efecto sustrato sobre la
actividad enzimática no fue el esperado, pues se
esperaba una curva tipo Michael-Menten; este
comportamiento puede estar sujeto a la disolución de
la enzima o a las absorbancias bajas del p-nitrofenol.
La enzima fosfatasa ácida presenta una temperatura
alrededor de 50˚C y un pH cercano a 5 en las cuales
conlleva una adecuada actividad catalítica,
disminuyendo la obtención de producto fuera de estos
rangos.
sulfate) precipitation. [Online]
http://www.eng.umd.edu/~nsw/ench485/lab6a.htm
Ultimo acceso 12-julio-2019
[6]VOET, D., VOET, J. Bioquímica. 3ed. Buenos aires:
Editorial Medica Panamericana, 2006. p. 140
[7] MELO, Op. Cit. p. 98
[8]FREIFELDE. David,.Técnicas de bioquímica y
biología molecular. Reverté, S.A. 2003. Pág 244
[9]GARRIDO. Amando, TEIJON. José,. Fundamentos
de bioquímica estructural. Segunda Edición. TÉBAR.
2006. P.p 117, 165-167.
[10] De Arriaga D., Soler J., Busto F., Cadenas E.;
Cinética Enzimática; Universidad de Oviedo,
departamento de bioquímica, facultad de biología y
veterinaria; pp. 12
[11] Devin T.; Bioquímica: Libro de texto con
aplicaciones clínicas, 5ta ed.; Editorial Reverte;
España, 2004; pp. 436-437.
[12] GUIJA, E.: et. al. Mecanismo de acción de las
fosfatasas acidas de bajo peso molecular. An. Fac.
Med. Lima, 2007; 68(4). 356.
[13] Lira Silva, Elizabeth ; Jasso Chávez, R.
Comparación De Los Diferentes Métodos De Análisis
Cinéticos Para Determinar El Tipo De Inhibición De
Dos Compuestos. Reb, 32 (1), 2013 19–32.

[14] Devlin T.A. Bioquímica. Libro de Texto con

SUGERENCIAS
Aplicaciones Clínicas. Editorial Reverte S.A. 2003. 451
El estudio de la actividad enzimática la fosfatasa acida
se lleva a cabo siguiendo la metodología de la guía. No
se presentaron inconvenientes a nivel experimenta a
excepción de los resultados de los efectores.

REFERENCIAS

[1] Neet KE (1995). «Cooperativity in enzyme function:

equilibrium and kinetic aspects». Meth. Enzymol. pp
249: 519–67.
[2] [3] Peña, A. Bioquímica. 2ed. México: Limusa,
1988. p. 201-202

[3] Efectos de pH, Temperatura y efectores en una

enzima. Disponible en:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm.
Visto el 3 de julio de 2019.