INFORME DE VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE

DETERMINACIÓN DE HISTAMINA EN PRODUCTOS DE

LA PESCA MEDIANTE KIT ENZIMÁTICO
DESARROLLADO POR BioSystems S.A.

ENERO 2017
 INTRODUCCIÓN

La validación de un método de ensayo consiste en un estudio sistemático que permite conocer si

las características técnicas del mismo cumplen las especificaciones relativas al uso previsto.

La validación de un método será poco exhaustiva, limitándola a la comprobación del

cumplimiento de las características especificadas en aquellos métodos que se consideran de
referencia, y mucho más completa y exhaustiva en las nuevas metodologías analíticas, en cuyo
caso, si es posible la validación debe basarse en normas reconocidas.

Existen algunas normas ISO para la validación de métodos microbiológicos, como es el caso de la
ISO 16140:2003 “Microbiología de los alimentos para consumo humano y animal. Protocolo de
validación de métodos alternativos”, sin embargo no hay normas disponibles para la validación
de ensayos físico-químicos alternativos, aunque sí guías ampliamente reconocidas con
protocolos para la validación de métodos de ensayo, y que sirven de referencia a las entidades
que acreditan el cumplimiento de la UNE-EN ISO/IEC 17025:2005 como son por ejemplo la guía
Eurachem (“The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics”), o el documento del CODEX “Guidelines on Establishing methods
criteria for the identification of relevant analytical methods”.

Además, la DECISIÓN DE LA COMISIÓN 2002/657 de 12 de agosto de 2002, por la que se aplica la

Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos y la
interpretación de los resultados, establece normas relativas a los métodos analíticos de
muestras oficiales, y fija criterios comunes de interpretación de los resultados analíticos por
parte de los laboratorios oficiales de control. Concretamente, en su artículo 3, especifica que los
Estados miembros garantizarán que los métodos analíticos hayan sido validados de acuerdo con
los procedimientos que se especifican en dicha Decisión.

ANFACO-CECOPESCA ha recopilado estas y otras referencias bibliográficas en el Procedimiento

PG/0/06 para la validación de métodos de ensayo, integrado en el sistema de calidad según la
norma UNE-EN ISO/IEC 17025:2005, y que tiene por objeto definir la operativa establecida por
ANFACO-CECOPESCA para la validación de métodos o procedimientos de ensayo y la definición
de los formatos aplicables, en base a los siguientes documentos:

 AOAC International (1998). AOAC Peer-verified methods program. Manual on policies

and procedures. Maryland. USA.
 DECISIÓN DE LA COMISIÓN (2002/657/CE) de 12 de agosto de 2002, por la que se aplica
la Directiva 96/23/CE del Consejo en cuanto al funcionamiento de los métodos analíticos
y la interpretación de los resultados.

 DIRECTIVA 98/53/CE, de la Comisión, de 16 de julio de 1998, por la que se fijan métodos

de toma de muestras y de análisis para el control oficial del contenido máximo de
algunos contaminantes en los productos alimenticios.

 Ellison, S L R, Rosslein, M and Williams A. (2000). Quantifying Uncertainty in Anaytical

Measurement. 2ª edición. EURACHEM/CITAC Guide.

 EURACHEM-GUIDE (1998). The fitness for purpose of analytical methods: A laboratory

guide to method validation and related topics. LGC, Teddington.

 Horwitz, W. (1998). A simple Method for Evaluating Data from an Interlaboratory Study.
Journal of AOAC International Vol. 81, No. 6.

 Hotwitz, W. (2003). Validation: An invisible component of Measurament. AOAC

International.

 Huber, L. (1998). Validation of Analytical Methods: Review and Strategy. LC-GC

International,pp. 96-105.

 J.C. Miller, J.N. Miller. (1993). Estadística para química analítica Addison-Wesley
Iberoamericana. 2ª edición.

 Statistical Subcommittee of the AMC. (2004). The amazing Horwitz function. Technical
Brief No.17 July. Royal Society of Chemistry.

 Thompson, M. (2000). Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb

concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing. Analyst,
125 385-386.

 Thompson, M, Ellison, S. L.R. and Wood, R. (2002). Harmonized guidelines for single-
laboratory validation of methods of analysis. IUPAC Technical report. Pure Appl. Chem.,
vol 74, Nº 5, pp. 835.855.
 IDENTIFICACIÓN DEL MÉTODO DE ENSAYO VALIDADO

Nombre completo del método:

Procedimiento para la determinación de histamina mediante la utilización de un kit enzimático y posterior
medida en un analizador automático.

Tipo de método:
Cuantitativo

Analito: Histamina
Unidades: mg/kg
Matriz: atún crudo, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca, sardina en aceite, semiconserva
de anchoa
Rango: de 10 a 200 mg/kg

Método de referencia utilizado:

Analito, rango y unidades: Histamina, rango de 10 a 500 mg/kg.
Acreditación: PEE/1/119, acreditado por ENAC según UNE-EN ISO/IEC 17025 (Anexo Técnico nº
96/LE230)
Matriz: Productos de la pesca, de la acuicultura y sus derivados
Método: HPLC- detector UV
 PARÁMETROS DE VALIDACIÓN

PRUEBAS REALIZADAS
Selectividad y Especificidad 
Linealidad 
Exactitud 
Precisión 
Robustez 
Límites de detección y de cuantificación 

SELECTIVIDAD Y ESPECIFICIDAD

Definición:
La selectividad y especificidad es la capacidad de un método de distinguir entre el analito
que se está midiendo y otras sustancias.

Descripción:
Se realizó la prueba de selectividad a partir de extractos de las matrices de estudio
adicionados con 1000 mg/kg de posibles interferentes. En este caso se realizó con agua,
tiramina, putrescina y agmatina. Para ello se prepararon extractos sin histamina y
extractos con 25 mg/kg de histamina con los distintos interferentes de estudio. Se
midieron las concentraciones obtenidas en el equipo.
Los resultados obtenidos han sido los siguientes:
ATUN CRUDO ATÚN AL NATURAL
COMPUESTOS
HISTAMINA COMPUESTOS REACCIÓN HISTAMINA
RESULTADOS (mg/kg) REACCIÓN CRUZADA RESULTADOS (mg/kg)
(mg/kg) CRUZADA (1000 ppm) (mg/kg)
(1000 ppm)
AGUA 3,4 AGUA 1,6
Tyramine 3,4 Tyramine 1,8
0 0
Putrescine 5,2 Putrescine 3,3
Agmatine 65,8 Agmatine 60,2
AGUA 28,2 AGUA 25,6
Tyramine 26,7 Tyramine 25,2
25 25
Putrescine 28,7 Putrescine 29,4
Agmatine 90,2 Agmatine 84,7

ATÚN EN ACEITE SARDINA FRESCA

HISTAMINA COMPUESTOS REACCIÓN HISTAMINA COMPUESTOS REACCIÓN
RESULTADOS (mg/kg) RESULTADOS (mg/kg)
(mg/kg) CRUZADA (1000 ppm) (mg/kg) CRUZADA (1000 ppm)
AGUA 4,2 AGUA 5,1
Tyramine 4,2 Tyramine 4,8
0 0
Putrescine 5,8 Putrescine 4,9
Agmatine 52,7 Agmatine 56,2
AGUA 28,9 AGUA 28,3
Tyramine 28,2 Tyramine 29,7
25 25
Putrescine 29,8 Putrescine 29,0
Agmatine 77,1 Agmatine 79,6
 SARDINA EN ACEITE SEMICONSERVA ANCHOA
COMPUESTOS
HISTAMINA HISTAMINA COMPUESTOS REACCIÓN
REACCIÓN CRUZADA RESULTADOS (mg/kg) RESULTADOS (mg/kg)
(mg/kg) (mg/kg) CRUZADA (1000 ppm)
(1000 ppm)
AGUA 4,8 AGUA 3,6
Tyramine 4,2 Tyramine 4,0
0 0
Putrescine 4,3 Putrescine 4,8
Agmatine 61,2 Agmatine 51,6
AGUA 30,1 AGUA 28,5
Tyramine 30,5 Tyramine 29,2
25 25
Putrescine 30,8 Putrescine 30,7
Agmatine 85,9 Agmatine 75,1

Los resultados obtenidos muestran que la agmatina causa interferencias con el kit y por
tanto debe indicarse en las instrucciones del mismo que si las muestras contienen
agmatina las medidas proporcionadas por el mismo no son adecuadas.

LINEALIDAD

Definición: Relación que existe entre la concentración de un determinado analito y la

respuesta proporcionada por el método.

Descripción:
Se evalúa la linealidad en el rango de 10 a 200 mg/kg, comprobando el coeficiente de
regresión r2 y el Factor Respuesta/Concentración:
 Valor obtenido Criterio de aceptabilidad

Se calcula el coeficiente de r2 ≥ 0,99

r2: 0,9999
regresión lineal (r2) y el factor
respuesta/concentración en cada Factor Respuesta / Concentración:
Factor Respuesta /
nivel de concentración entre 10 y
Concentración:
200 mg/kg. 90- 110 % (Sólo un punto podrá desviarse
Ver siguiente tabla
de este criterio, y tendrá que cumplir el
intervalo máximo de 80-115 %)

Concentración
patrón de Respuesta Respuesta FR % FR
histamina media
10,03
10,03
10 9,93 0,99 99
9,86
9,80
50,89
50,61
50 50,71 1,01 101
50,67
50,67
99,50
99,15
100 99,42 0,99 99
99,50
99,55
150,85
150,33
150 150,61 1,00 100
150,33
150,91
199,16
198,30
200 198,92 0,99 99
199,62
198,59

Conclusión:
Se observó que la recta es lineal en el intervalo de 10 a 200 mg/kg presentando un r2 de 0,9999 y
que cumple los criterios factor respuesta/concentración establecidos.
 EXACTITUD

Definición:
La exactitud es el grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de
referencia aceptado.

Descripción:
Se obtiene mediante el estudio de recuperaciones, en todo el rango de trabajo, desde 10
hasta 200 mg/kg, de modo que en cada nivel de concentración se analizaron las matrices
de estudio.

Se considera el método exacto si la recuperación media en todos los niveles de

concentración cumple los criterios establecidos por la AOAC.

RESULTADOS EXACTITUD
RECUPERACIÓN
VALOR DE
% REC.
REFERENCIA MATRIZ Nº Réplicas CRITERIO ¿se acepta?
(mg/kg)
MEDIO

10 ATÚN FRESCO 5 100 80-110 SI

50 ATÚN FRESCO 5 103 80-110 SI
100 ATÚN FRESCO 5 101 90-107 SI
150 ATÚN FRESCO 5 100 90-107 SI
200 ATÚN FRESCO 5 100 90-107 SI

10 ATÚN AL NATURAL 5 108 80-110 SI

50 ATÚN AL NATURAL 5 105 80-110 SI
100 ATÚN AL NATURAL 5 100 90-107 SI
150 ATÚN AL NATURAL 5 99 90-107 SI
200 ATÚN AL NATURAL 5 101 90-107 SI

10 ATÚN EN ACEITE 5 100 80-110 SI

50 ATÚN EN ACEITE 5 103 80-110 SI
100 ATÚN EN ACEITE 5 101 90-107 SI
150 ATÚN EN ACEITE 5 100 90-107 SI
200 ATÚN EN ACEITE 5 100 90-107 SI
 VALOR DE
% REC.
REFERENCIA MATRIZ Nº Réplicas CRITERIO ¿se acepta?
(mg/kg)
MEDIO
10 SARDINA FRESCA 5 100 80-110 SI
50 SARDINA FRESCA 5 103 80-110 SI
100 SARDINA FRESCA 5 101 90-107 SI
150 SARDINA FRESCA 5 100 90-107 SI
200 SARDINA FRESCA 5 100 90-107 SI

10 SARDINA EN ACEITE 5 98 80-110 SI

50 SARDINA EN ACEITE 5 98 80-110 SI
100 SARDINA EN ACEITE 5 94 90-107 SI
150 SARDINA EN ACEITE 5 94 90-107 SI
200 SARDINA EN ACEITE 5 98 90-107 SI

10 SEMICONSERVA DE ANCHOA 5 98 80-110 SI

50 SEMICONSERVA DE ANCHOA 5 103 80-110 SI
100 SEMICONSERVA DE ANCHOA 5 98 90-107 SI
150 SEMICONSERVA DE ANCHOA 5 96 90-107 SI
200 SEMICONSERVA DE ANCHOA 5 97 90-107 SI
MATERIALES DE REFERENCIA
VALOR RESULTADO
ORGANIZADOR MATRIZ REFERENCIA ASIGNADO BIOSYSTEMS ¿se acepta?
(mg/kg) (mg/kg)
FAPAS CANNED FISH TET040RM 16.6 ± 0.9 16.4 SI
216
FAPAS CANNED FISH 27176 204 SI
(186-247)
INTERLABORATORIO
ORGANIZADOR MATRIZ REFERENCIA Z SCORE ¿se acepta?
FOOD CHEMISTRY
FAPAS CANNED FISH 0.6 SI
PROFICIENCY TEST 27189
Conclusiones:
El método se considera exacto en el rango de trabajo desde 10 a 200 mg/kg, en todas las
matrices objeto de ensayo (atún fresco, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca,
sardina en aceite y semiconserva de anchoa), de acuerdo a los intervalos de recuperación
aceptables establecidos por la AOAC.
Asimismo, la participación en ejercicios intercomparativos y la medición de materiales de
referencia arrojan resultados satisfactorios.
 PRECISIÓN
Definición:
Grado de concordancia entre resultados de ensayos independientes obtenidos en
condiciones predeterminadas.

Descripción:
La precisión se suele expresar como imprecisión mediante el cálculo de desviaciones
estándar relativas calculadas y las desviaciones relativas estándar de Horwitz.

PRECISIÓN
PLANIFICACIÓN Y RESULTADOS
RDS
VALOR DE
Nº ¿se
REFERENCIA MATRIZ RSDCALCULADA RSDHorwitz CRITERIO
Réplicas acepta?
(mg/kg)
10 ATÚN FRESCO 5 7.81 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI
50 ATÚN FRESCO 5 3.16 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
100 ATÚN FRESCO 5 3.96 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
150 ATÚN FRESCO 5 2.83 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
200 ATÚN FRESCO 5 5.04 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI

10 ATÚN AL NATURAL 5 4.78 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI

50 ATÚN AL NATURAL 5 3.00 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
100 ATÚN AL NATURAL 5 2.04 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
150 ATÚN AL NATURAL 5 0.97 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
200 ATÚN AL NATURAL 5 1.22 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI

10 ATÚN EN ACEITE 5 0.90 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI

50 ATÚN EN ACEITE 5 1.26 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
100 ATÚN EN ACEITE 5 1.46 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
150 ATÚN EN ACEITE 5 1.07 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
200 ATÚN EN ACEITE 5 0.90 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI

10 SARDINA FRESCA 5 4.95 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI

50 SARDINA FRESCA 5 1.76 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
100 SARDINA FRESCA 5 2.59 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
150 SARDINA FRESCA 5 1.78 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
200 SARDINA FRESCA 5 0.91 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI
 VALOR DE
Nº ¿se
REFERENCIA MATRIZ RSDCALCULADA RSDHorwitz CRITERIO
Réplicas acepta?
(mg/kg)
10 SARDINA EN ACEITE 5 3.83 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI
50 SARDINA EN ACEITE 5 1.89 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
100 SARDINA EN ACEITE 5 1.00 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
150 SARDINA EN ACEITE 5 1.39 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
200 SARDINA EN ACEITE 5 1.36 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI

SEMICONSERVA DE
10 5 4.26 11.31 RSDCALC≤RSDHOR SI
ANCHOA
SEMICONSERVA DE
50 5 3.44 8.88 RSDCALC≤RSDHOR SI
ANCHOA
SEMICONSERVA DE
100 5 1.46 8.00 RSDCALC≤RSDHOR SI
ANCHOA
SEMICONSERVA DE
150 5 4.02 7.53 RSDCALC≤RSDHOR SI
ANCHOA
SEMICONSERVA DE
200 5 3.37 7.21 RSDCALC≤RSDHOR SI
ANCHOA

Conclusiones:
El método se considera preciso en todo el rango de trabajo, desde 10 a 200 mg/kg en
todas las matrices evaluadas: atún fresco, atún al natural, atún en aceite, sardina fresca,
sardina en aceite y semiconserva de anchoa.
 ROBUSTEZ

Definición: Susceptibilidad de un método analítico a los cambios de las condiciones

experimentales, como puede ser el tipo de matriz que se analice y que pueden
expresarse en forma de lista de los materiales de la muestra, los analitos, las condiciones
de almacenamiento o las condiciones ambientales o de preparación de la muestra en las
que puede aplicarse el método tal cual o con determinadas modificaciones menores.

Descripción: La idea fundamental para la prueba de la robustez es introducir

deliberadamente pequeñas variaciones en el método y observar los efectos. Si los
resultados se alteran, los usuarios deben ser advertidos de no desviarse de las
condiciones especificadas en el manual de instrucciones. Para esta determinación se
aplica el Test de Youden y Steiner para la evaluación de la robustez de un método
químico analítico.

Para ello a una muestra de conserva de atún al natural adicionada con 50 mg/kg de
histamina se le varió el volumen de extracción (20, 25 y 30 ml), el tiempo de medida tras
la extracción (10, 20 y 30 minutos) así como el tiempo de almacenamiento de la muestra
antes del análisis a temperatura ambiental (30 minutos, 1 hora y 2 horas).

CONSERVA DE ATÚN AL NATURAL CON 50 PPM DE HISTAMINA

PARÁMETROS DE LA ROBUSTEZ VALOR 1 VALOR 2 VALOR 3

A. VOLUMEN DE EXTRACCIÓN 20 ml 25 ml 30 ml
B. TIEMPO DE EXTRACCIÓN 10 min 20 min 30 min

C. TIEMPO ALMACENAMIENTO MUESTRA ANTES

30 min 1 hora 2 horas
DEL ANÁLISIS A TEMPERATURA AMBIENTAL

Combinación de las determinaciones

Valor del factor F
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A: 20 ml
a: 30 ml A A A A a a a a a´
a´: 25 ml
B: 10 min
b: 20 min B B b´ b´ B B b´ b´ b
b´: 30 min
C: 30 minutos
c: 1 hora C c´ C c´ C c´ C c´ c
c´: 2 horas
(mg/kg) 47,5 46,6 47,2 48,8 50,3 51,5 47,8 48,2 48
 SD del método en
Diferencias SD de las
Comparación de Variables 50 mg/kg para Criterio de
promedio diferencias Cumplimiento
(X-x) atún al natural aceptación
(Di) (SDi)

Δ A, a 2,1 1,1 SI
Δ A, a´ 0,9 0,5 SI
Δ a, a´ 1,6 0,8 SI
Δ B, b 1,9 1,0 SI
Δ b,b´ 0,5 0,3 1,6 SDi ≤ SD50 SI
Δ C, c 0,9 0,5 SI
Δ B, b´ 2,0 1,0 SI
Δ C, c´ 1,8 1,0 SI
Δ c, c´ 1,5 0,8 SI

Conclusión:
El método se considera robusto, pues la desviación estándar de las diferencias es, en
todas las combinaciones, menor que la desviación estándar del método a ese nivel de
concentración en la matriz de atún al natural evaluada.
LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

Definición:
Límite de detección: concentración más baja de analito que se puede detectar en la
muestra pero no necesariamente cuantificar con las condiciones experimentalmente
establecidas.

Límite de cuantificación: menor concentración del analito que puede determinarse con
precisión y exactitud aceptables en una muestra, bajo las condiciones del método
utilizado (verificado experimentalmente).

Descripción:
Límite de detección: Para el cálculo de LOD se aplica la siguiente fórmula:

LOD =

Donde: X 0 es el valor medio analítico de la matriz sin adicionar y sb es la interjección de

la recta; y m es la pendiente de la recta.

Límite de cuantificación: se estima mediante la fórmula 3xLOD. Se verifica

posteriormente el límite de cuantificación realizando 10 réplicas en cada matriz.

Los resultados obtenidos han sido los siguientes:

SARDINA SEMICONSERVA ATUN ATUN ATUN SARDINA

ACEITE ANCHOA NATURAL ACEITE CRUDO FRESCA
LOD = 5,77 2,85 4,28 4,58 0,29 7,01
LOQ =
3 x LOD 17 8,5 13 14 0,9 21

Se verificaron los límites de cuantificación en todos los casos a 10 mg/kg obteniéndose

los siguientes resultados:
 VALOR DE MUESTRA SIN
RESULTADO RESULTADO
MATRIZ REFERENCIA ADICIÓN MEDIA % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
(mg/kg) FINAL
(mg/Kg) (mg/Kg)
8,97 8,47
8,85 8,35
9,61 9,11
8,97 8,47
9,35 8,85
ATÚN FRESCO 10 0,50 8,7 87 -1 0,34 3,86
9,35 8,85
9,10 8,60
9,86 9,36
8,85 8,35
9,10 8,60
VALOR DE MUESTRA SIN
RESULTADO RESULTADO
MATRIZ REFERENCIA ADICIÓN AVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
(mg/kg) FINAL
(mg/Kg) (mg/Kg)
11,08 9,87
11,00 9,79
10,97 9,76
11,03 9,82
11,30 10,09
ATÚN AL NATURAL 10 1,21 9,8 98 0 0,16 1,65
10,78 9,57
10,94 9,73
11,19 9,98
10,82 9,61
10,89 9,68
VALOR DE MUESTRA SIN
RESULTADO RESULTADO
MATRIZ REFERENCIA ADICIÓN AVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
(mg/kg) FINAL
(mg/Kg) (mg/Kg)
12,39 9,36
13,12 10,09
12,88 9,85
12,89 9,86
12,71 9,68
ATÚN EN ACEITE 10 3,03 9,6 87 0 0,38 3,97
13,14 10,11
12,64 9,61
11,91 8,88
12,64 9,61
12,28 9,25
VALOR DE MUESTRA SIN
RESULTADO RESULTADO
MATRIZ REFERENCIA ADICIÓN AVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
(mg/kg) FINAL
(mg/Kg) (mg/Kg)
17,34 11,40
17,82 11,88
16,37 10,43
15,41 9,47
15,89 9,95
SARDINA FRESCA 10 5,94 10,3 103 0 0,82 7,97
15,41 9,47
15,65 9,71
16,62 10,68
16,13 10,19
15,65 9,71
VALOR DE MUESTRA SIN
RESULTADO RESULTADO
MATRIZ REFERENCIA ADICIÓN AVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
(mg/kg) FINAL
(mg/Kg) (mg/Kg)
14,63 9,78
14,82 9,97
14,79 9,94
14,73 9,88
14,53 9,68
SARDINA EN ACEITE 10 4,85 9,8 98 0 0,21 2,11
14,79 9,94
14,59 9,74
14,29 9,44
14,63 9,78
14,22 9,37
VALOR DE MUESTRA SIN
RESULTADO RESULTADO
MATRIZ REFERENCIA ADICIÓN AVERAGE % RECUPERACIÓN BIAS Sr RSD
(mg/kg) FINAL
(mg/Kg) (mg/Kg)
12,82 9,82
12,10 8,10
11,77 8,77
12,52 9,52
SEMICONSERVA DE 11,92 8,92
10 3,00 9,1 91 -1 0,59 6,51
ANCHOA 12,22 8,22
12,62 9,62
12,54 9,54
11,92 8,92
12,31 9,31
 Conclusión:

Los límites de detección obtenidos han sido los siguientes:

Atún crudo: 0,29 mg/kg

Atún al natural: 4,28 mg/kg
Atún en aceite: 4,58 mg/kg
Sardina fresca: 7,01 mg/kg
Sardina en aceite: 5,77 mg/kg
Semiconserva de anchoa: 2,85 mg/kg

Se verificó que los límites de cuantificación obtenidos en todas las matrices de estudio
han sido de 10 mg/kg y se observó que en todos los casos las RSD son menores del 10 %.

EVALUACIÓN VALIDACIÓN: Fecha: 25/01/17

RESUMEN Parámetro Características del método
Rango validado 10-200 mg/kg
Exactitud Aceptable en todo el rango
Precisión RSDCALC≤ RSDHOR
Confirmación de la selectividad y especificidad con la
Selectividad / Especificidad
experiencia (interferencia con agmatina)
Robustez Método robusto
Linealidad Método lineal
Límite de cuantificación 10 mg/kg

Validado por: Validación Firma y Fecha

Nombre: Vanesa Losada Iglesias Aceptada 
Cargo: Técnico especialista área de Asistencia
Técnica Rechazada 
25/01/2017
 ANEXO I
CRITERIOS DE ACEPTACIÓN
(EXACTITUD Y PRECISIÓN)
CRITERIOS DE EXACTITUD:

Tabla de intervalos de recuperación aceptables

Intervalos de recuperaciones (%)

(AOAC Peer Verified Methods)

Analito Analito Unidades Media

(%) ratio recomendada
(%)
100 1 100% 98-102
≥10 10-1 10% 98-102
-2
≥1 10 1% 97-103
-3
≥0.1 10 0.1% 95-105
-4
0.01 10 100 ppm 90-107
-5
0.001 10 10 ppm 80-110
0.0001 10-6 1 ppm 80-110
0.00001 10-7 100 ppb 80-110
0.000001 10-8 10 ppb 70-110
0.0000001 10-9 1 ppb 70-110
CRITERIOS DE PRECISIÓN:

La precisión de un método se evalúa comparando el valor obtenido de RSD con el valor de

referencia (RSD de Horwitz) que dependerá del nivel de concentración y se calcula según las
ecuaciones descritas a continuación:
 Horwitz * 100
RSD Horwitz  ; para el cálculo de la  Horwitz
c

0,22c
Para concentraciones <120 ppb;  Horwitz 
mr

0,02c 0,8495
Para concentraciones entre 120 ppb y 13.8%;  Horwitz 
mr

0,01c 0,5
Para concentraciones > 13.8%;  Horwitz 
mr
 ANEXO II
CÁLCULO DE INCERTIDUMBRE
INCERTIDUMBRE Determinación de histamina
INCERTIDUMBRE COMBINADA Y EXPANDIDA
CONTRIBUCIONES A LA INCERTIDUMBRE TOTAL
Fuentes de incertidumbre Incertidumbre estándar (U)

U (P) 0,026

U (R) 0,068

CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE

Contribución global U  UR 2  U(P)2

I  U K
(Factor de cobertura K=2)

INCERTIDUMBRE COMBINADA INCERTIDUMBRE EXPANDIDA INCERTIDUMBRE DEL VALOR

(Contribución global) (Contribución global) OBTENIDO
U I I

0,073 0,146 0,146 X C

Siendo C el valor de la concentración obtenido en el ensayo

EJEMPLOS DE APLICACIÓN
INCERTIDUMBRE
CONCENTRACIÓN INCERTIDUMBRE INCERTIDUMBRE
EXPANDIDA
(g/100 g) (contribución global) EXPANDIDA
(%)
10 0,146 1,5 15
50 0,146 7,3 15
100 0,146 14,6 15
150 0,146 21,8 15
200 0,146 29,1 15

Contribuciones a la incertidumbre

0,1
0,1
0,1
0,0
0,0
0,0
0,0
0,0

Precisión

Exactitud