Proteinas Hemostaticas - En.es

12
Hemoderivados recombinantes y enzimas

terapéuticas
12.1 Introducción
La sangre y los productos sanguíneos constituyen un grupo importante de productos biológicos tradicionales. Los principales
componentes de la sangre son los glóbulos rojos y blancos, junto con las plaquetas y el plasma en el que están suspendidos
estos elementos celulares. La sangre entera permanece en uso terapéutico rutinario, al igual que los concentrados de
glóbulos rojos y plaquetas. También se sigue purificando a partir del plasma una variedad de proteínas sanguíneas de
importancia terapéutica. Estos incluyen varios factores de coagulación e inmunoglobulinas. Sin embargo, de acuerdo con el
alcance de este libro, nos enfocaremos en este capítulo en las proteínas sanguíneas / proteínas relacionadas con la sangre
producidas por ingeniería genética. Estos incluyen factores de coagulación recombinantes, anticoagulantes (como hirudina) y
trombolíticos (como tPA).
12.2 Hemostasia
La sangre desempeña varias funciones vitales dentro del cuerpo y no es sorprendente que se hayan desarrollado varios procesos capaces de
mantener eficazmente la hemostasia (la rápida detención de la pérdida de sangre por daño vascular, para mantener un volumen sanguíneo
relativamente constante). En los seres humanos, tres mecanismos principales subrayan el proceso hemostático:
• La congregación y aglutinación de plaquetas sanguíneas en el sitio de la lesión vascular, taponando así eficazmente el sitio de la
pérdida de sangre.
• Constricción localizada de los vasos sanguíneos, que minimiza el flujo sanguíneo adicional a través del área.
• Inducción de la cascada de coagulación sanguínea. Esto culmina en la conversión de una proteína sérica soluble, el fibrinógeno,
en fibrina insoluble. Los monómeros de fibrina luego se agregan en el sitio de
Biotecnología farmacéutica: conceptos y aplicaciones Gary Walsh

© 2007 John Wiley & Sons, Ltd ISBN 978 0 470 01244 4 (HB) 978 0 470 01245 1 (PB)
330 PRODUCTOS SANGUÍNEOS RECOMBINANTES CH12 Y ENZIMAS TERAPÉUTICAS
daño, formando así un coágulo (trombo) para sellarlo. Estos mecanismos son eficaces para tratar lesiones de vasos pequeños
(por ejemplo, capilares y arteriolas), aunque son ineficaces cuando el daño se relaciona con venas / arterias grandes.
12.2.1 La vía de la coagulación
El proceso de coagulación sanguínea depende de una gran cantidad de factores de coagulación sanguínea, que actúan de forma
secuencial. Al menos 12 factores distintos participan en la cascada de la coagulación, junto con varios cofactores macromoleculares.
Todos los factores de la coagulación se designan con números romanos (tabla 12.1) y, con la excepción del factor IV, todos son
proteínas. La mayoría de los factores son zimógenos proteolíticos, que se activan secuencialmente. Un factor activado se indica
mediante la inclusión de un subíndice "a" (por ejemplo, el factor XIIa es el factor XII activado).
Aunque los pasos finales de la cascada de la coagulación sanguínea son idénticos, los pasos iniciales pueden ocurrir a través de dos vías
distintas: extrínseca e intrínseca. Ambas vías se inician cuando proteínas de coagulación específicas entran en contacto con moléculas de
superficie específicas que se exponen sólo al dañarse un vaso sanguíneo. La coagulación ocurre mucho más rápidamente cuando se inicia a
través de la vía extrínseca.
Dos factores de coagulación funcionan de forma única en la vía extrínseca: el factor III (factor tisular) y el factor VII. El factor tisular es una
proteína de membrana integral presente en una amplia variedad de tipos de tejidos (particularmente pulmón y cerebro). Esta proteína está
expuesta a los componentes sanguíneos solo tras la ruptura de
Cuadro 12.1 Los factores de coagulación que promueven el proceso de coagulación de la sangre. Tenga en cuenta que el factor originalmente designado como VI se
demostró más tarde que era el factor Va
Factor Camino en el que

número Nombre común Funciona Función
yo Fibrinógeno Ambos Forma la base estructural del coágulo después de su conversión en fibrina
II Protrombina Ambos Precursor de la trombina, que activa los factores I, V, VII, VIII y XIII
III Factor tisular Extrínseco Proteína tisular accesoria que inicia la vía extrínseca
(tromboplastina)
IV Iones de calcio Ambos Requerido para la activación del factor XIII y estabiliza algunos factores
V Proacelerina Ambos Proteína accesoria, mejora la tasa de activación de X Precursor de

VII Proconvertin Extrínseco convertina (VIIa) que activa X (extrínseca
sistema)
VIII Antihemofílico Intrínseco Proteína accesoria, mejora la activación de X (sistema intrínseco)
factor
IX Factor navideño Intrínseco IX activado activa directamente X (sistema intrínseco) La forma activada
X Factor estuardo Ambos (Xa) convierte la protrombina en trombina La forma activada (XIa) sirve
XI Plasma Intrínseco para activar IX
tromboplastina
antecedente
XII Factor de Hageman Intrínseco Activado por contacto superficial o el sistema kallikrenin.
XIIa ayuda a iniciar el sistema intrínseco
XIII Estabilizador de fibrina Ambos Forma activada entrecruza la fibra, formando un coágulo duro
factor
HEMOSTASIS 331
un vaso sanguíneo, e inicia la cascada de coagulación extrínseca en el sitio del daño como se describe a continuación.
El factor VII contiene una serie de γ- Residuos de carboxiglutamato (al igual que los factores II, IX y X), que juegan un papel
esencial en facilitar su unión de Ca 2 iones. Los eventos iniciales que inician la vía extrínseca implican la interacción del factor VII
con Ca 2 y factor tisular. En esta forma asociada, el factor VII se vuelve proteolíticamente activo. Muestra tanto afinidad de unión
por el factor X como actividad catalítica contra el factor X. Por lo tanto, activa el factor X mediante el procesamiento proteolítico, y
el factor Xa, que inicia las etapas terminales de la formación del coágulo, permanece unido al factor tisular-Ca 2 complejo en el sitio
del daño. Esto asegura que la formación de coágulos solo ocurra en el punto donde se necesita (Figura 12.1).
Los pasos iniciales de la vía intrínseca son algo más complicados. Este sistema requiere la presencia de factores de
coagulación VIII, IX, XI y XII, todos los cuales, excepto el factor VIII, son proteasas de acción endo. Como en el caso de la vía
extrínseca, la vía intrínseca se activa tras la exposición de los factores de coagulación a proteínas presentes en la superficie del
tejido corporal expuesto por lesión vascular. Estos sitios de activación / unión a proteínas probablemente incluyen colágeno.
Los constituyentes proteicos adicionales de la cascada intrínseca incluyen precalicreína, un zimógeno proteico de 88 kDa de la
proteasa calicreína, y cininógeno de alta masa molecular, una glicoproteína plasmática de 150 kDa que sirve como factor accesorio.
La ruta intrínseca parece iniciarse cuando el factor XII se activa por contacto con proteínas de superficie expuestas en el
sitio del daño. El cininógeno de alta masa molecular también parece formar parte de este complejo activador inicial (Figura
12.2).
El factor XIIa puede escindir proteolíticamente y, por tanto, activar dos sustratos:
Figura 12.1 Diagrama esquemático de los pasos iniciales de la vía extrínseca de coagulación sanguínea. Ver texto para más detalles (TF: factor tisular)
Activar la glicoproteína de superficie
Calicreína
XIIa HMK
XII
XIa
XI
IXa VIIIa
IX
Xa
X
Figura 12.2 Los pasos exclusivos de la vía de coagulación intrínseca. El factor XIIa también puede convertir precalicreína en calicreína mediante
proteólisis, pero esto se omite en aras de la claridad. Los detalles completos se dan en el texto principal. Los pasos finales de la cascada de la
coagulación, que son compartidos por vías extrínsecas e intrínsecas, se describen en la figura 12.3.
• precalicreína, produciendo calicreína (que, a su vez, puede activar directamente más XII a XIIa).
• factor XI, formando XIa.
El factor XIa, a su vez, activa el factor IX. Entonces, el factor IXa promueve la activación del factor X, pero solo cuando (es
decir, IXa) está asociado con el factor VIIIa. El factor VIIIa se forma por la acción directa de la trombina sobre el factor VIII. La
trombina estará presente en esta etapa debido a la activación previa de la vía intrínseca.
12.2.2 Pasos terminales de la vía de la coagulación
Tanto la ruta intrínseca como la extrínseca generan el factor X activado. Esta proteasa, a su vez, cataliza la conversión proteolítica
de protrombina (factor II) en trombina (IIa). La trombina, a su vez, cataliza la conversión proteolítica del fibrinógeno (I) en fibrina (Ia).
Las moléculas individuales de fibrina se agregan para formar un coágulo blando. El factor XIIIa cataliza la formación de enlaces
cruzados covalentes entre moléculas de fibrina individuales, formando un coágulo duro (Figuras 12.3 y 12.4).
La protrombina (factor II) es una glicoproteína de 582 aminoácidos, 72,5 kDa, que representa el zimógeno circulante de la
trombina (IIa). Contiene hasta seis γ- residuos de carboxiglutamato hacia su extremo N-terminal, a través del cual se une a
varios Ca 2 iones. Unión de Ca 2 facilita la protrombina
unión al factor Xa en el sitio de la lesión vascular. El complejo de factor Xa luego proteolíticamente
HEMOSTASIS 333
Extrínseco Intrínseco
ruta ruta
Xa
Protrombina Trombina
(II) (IIa)
Fibrina
Fibrinógeno (I a)
(YO)
Agregación
XIIIa
Covalente
reticulación
Difícil Suave
coágulo coágulo
Figura 12.3 Descripción general de la cascada de coagulación sanguínea, con énfasis en el detalle molecular de sus etapas terminales. Consulte el texto para
obtener detalles específicos.
Sangre herida
buque
sangre roja
Agregado, célula
Vasoconstricción
reticulado del buque
fibrina Plaqueta
Figura 12.4 Pasos terminales de un coágulo de sangre (tapón hemostático): las moléculas de fibrina reticuladas unen las plaquetas y los
glóbulos rojos congregados en el lugar del daño, evitando así la pérdida de sangre.
Xa
Protrombina
S S
NH2
Trombina
S S
NH2
Figura 12.5 Escisión proteolítica de la protrombina por el factor Xa, produciendo trombina activa. Aunque la protrombina es una glicoproteína
monocatenaria, la trombina consta de dos polipéptidos unidos por lo que originalmente era el enlace disulfuro intracadena de protrombina. El
fragmento de polipéptido de trombina más pequeño consta de 49 residuos de aminoácidos y la cadena polipeptídica grande contiene 259
aminoácidos. El fragmento N-terminal liberado de la protrombina contiene 274 residuos de aminoácidos. La activación de la protrombina por Xa
no ocurre en solución libre, sino en el sitio del daño vascular.
escinde la protrombina en dos sitios (arg 274 –Thr 275 y arg 323 –Ile 324), produciendo trombina activa y un fragmento de polipéptido inactivo,
como se muestra en la Figura 12.5.
El fibrinógeno (factor I) es una glicoproteína grande (340 kDa) que consta de dos tri-polipéptidos idénticos
unidades, α, β y γ. Por tanto, su composición estructural global se puede representar como ( α β γ) 2.
Las regiones N-terminales del α y β Las cadenas de fibrinógeno son ricas en aminoácidos cargados que, a través de
repulsión de carga, juegan un papel importante en la prevención de la agregación de moléculas de fibrinógeno individuales. La trombina, que
cataliza la activación proteolítica del fibrinógeno, hidroliza estos péptidos N-terminales. Esto hace que las moléculas individuales de fibrina sean
más propicias para la agregación, lo que promueve la formación de coágulos blandos. El coágulo blando se estabiliza mediante la posterior
introducción de enlaces cruzados covalentes entre las moléculas de fibrina participantes individuales. Esta reacción está catalizada por el factor
XIIIa.
12.2.3 Trastornos de la coagulación
Los defectos genéticos caracterizados por (a) falta de expresión o (b) una secuencia de aminoácidos alterada de cualquier factor de
coagulación pueden tener consecuencias clínicas graves. Para promover una coagulación eficaz, las vías de coagulación tanto intrínseca
como extrínseca deben ser funcionales, y la inhibición de incluso una de estas vías dará como resultado una capacidad de coagulación
severamente retardada. El resultado suele ser la aparición de hematomas espontáneos y hemorragias prolongadas, que pueden ser
mortales. Con la excepción del factor tisular y Ca 2, Se han caracterizado defectos en todos los demás factores de coagulación. Sin embargo,
hasta el 90 por ciento de estos se relacionan con una deficiencia de factor VIII, y gran parte del resto se debe a una deficiencia de factor IX.
HEMOSTASIS 335
Cuadro 12.2 Factores de coagulación sanguínea recombinantes que han sido aprobados para el tratamiento de los trastornos de la coagulación.
Producto (nombre comercial) Empresa Indicación
Advate (rhFactor VIII) Baxter Hemofilia A

Bioclato (rhFactor VIII) Aventis Hemofilia A
Beneficio (rhFactor IX) Instituto de Genética Hemofilia B
Kogenate (rhFactor VIII) Bayer Hemofilia A
Helixate NexGen (rhFactor VIII) Bayer Hemofilia A
NovoSeven (rhFactor VIIa) Novo-Nordisk Algunas formas de hemofilia
Recombinar (rhFactor VIII) Baxter Healthcare / Genetics Institute Hemofilia A
ReFacto (dominio B eliminado Instituto de Genética Hemofilia A
rhFactor VIII)
Dichos trastornos de la coagulación se tratan generalmente mediante la administración continua de sangre completa o, más habitualmente,
concentrados del factor de coagulación relevante purificado de sangre completa. Esto conlleva un riesgo significativo de transmisión accidental
de enfermedades de transmisión sanguínea, en particular hepatitis y SIDA. A su vez, esto ha acelerado el desarrollo de factores de coagulación
sanguínea producidos por ingeniería genética, varios de los cuales están ahora aprobados para uso médico general (cuadro 12.2).
12.2.4 Factor VIII y hemofilia
La hemofilia A (hemofilia clásica, a menudo denominada simplemente hemofilia) es un trastorno recesivo ligado al cromosoma X causado por una
deficiencia del factor VIII. La enfermedad de Von Willebrand es un trastorno relacionado, también causado por un defecto en el complejo de factor VIII,
como se analiza a continuación.
El factor VIII intacto, como suele purificarse de la sangre, consta de dos productos genéticos distintos: factor VIII y (múltiples
copias del) factor de von Willebrand (vWF; figura 12.6). Este complejo presenta una masa molecular que varía de 1 a 2 MDa, de
los cuales hasta un 15 por ciento son carbohidratos. Se requiere el complejo de factor VIII completamente intacto para mejorar la
tasa de activación del factor IX del sistema intrínseco.
La porción del polipéptido del factor VIII del complejo del factor VIII está codificada por un gen inusualmente largo (289 kb).
La transcripción y procesamiento del ARNm genera un ARNm maduro más corto que codifica una proteína de 300 kDa. Tras su
síntesis, este precursor polipeptídico se procesa posteriormente proteolíticamente, con la eliminación de una parte significativa
de su región media. Esto produce dos fragmentos: un polipéptido amino terminal de 90 kDa y un polipéptido carboxilo terminal
de 80 kDa. Estos se asocian de forma no covalente (un proceso que requiere Ca 2 iones) para producir factor VIII maduro (a
veces llamado factor VIII: C). Este factor VIII maduro se libera luego en el plasma donde se asocia con múltiples copias de vWF
formando el complejo de factor VIII biológicamente activo. vWF estabiliza el factor VIII en plasma (particularmente contra la
degradación proteolítica). También puede asociarse con plaquetas en el sitio del daño vascular y, por lo tanto, presumiblemente
juega un papel en el acoplamiento del complejo de factor VIII en una posición apropiada donde puede participar en la cascada
de coagulación.
Las personas que padecen hemofilia A muestran niveles marcadamente reducidos (o la ausencia total) del complejo de
factor VIII en la sangre. Esto se debe a la falta de producción de factor VIII: C.
Celulas del higado Células endoteliales

Celulas del higado Células endoteliales Celulas del higado Células endoteliales
vWF
Plasma
Factor VIII C Factor VIII C
vWF Rápida degradación

de VIII C
Factor VIII
complejo
(VIII C: vWF)
(un) (segundo) (C)
Figura 12.6 ( a) Síntesis del complejo de factor VIII como ocurre en individuos sanos. b) En el caso de personas que padecen hemofilia A, se bloquea la
síntesis de factor VIII: C, lo que impide la constitución de un complejo de factor VIII activo en el plasma. (c) Las personas que padecen la enfermedad de
von Willebrand no pueden sintetizar el vWF. Aunque pueden sintetizar VIII: C, este se degrada rápidamente al entrar en la sangre debido a la falta de su
factor estabilizador de vWF.
Las personas que padecen (la más rara) la enfermedad de von Willebrand carecen de ambos componentes del complejo de factor VIII maduro
(Figura 12.6). La gravedad de la enfermedad resultante depende en cierta medida del nivel de complejo de factor VIII intacto producido. Las
personas que carecen completamente de él (o que expresan niveles por debajo del 1 por ciento de los valores normales) experimentarán episodios
de hemorragia frecuentes, graves y, a menudo, espontáneos.
Las personas que expresan el 5 por ciento o más de los niveles del complejo normal experimentan síntomas clínicos menos graves. El
tratamiento normalmente implica la administración de un complejo de factor VIII purificado de sangre donada. Más recientemente, también
están disponibles formas recombinantes del producto. Los regímenes terapéuticos pueden requerir la administración del producto
semanalmente, de por vida. Aproximadamente 1 de cada 10 000 varones nacen con un defecto en el complejo del factor VIII y hay
aproximadamente 25 000 hemofílicos que residen actualmente en los Estados Unidos.
12.2.5 Producción de factor VIII
El factor VIII nativo se purifica tradicionalmente a partir de donaciones de sangre que primero se analizan para detectar la presencia de
virus como la hepatitis B y el VIH. Se han utilizado diversos procedimientos de fraccionamiento (inicialmente principalmente
procedimientos de precipitación) para producir un producto de factor VIII. El producto final se esteriliza por filtración y se llena en sus
envases de producto terminado. A continuación, el producto se liofiliza y los envases se sellan posteriormente al vacío o se lavan con
un gas inerte.
(por ejemplo, N 2) antes de sellar. No se agrega conservante. A continuación, el producto liofilizado se almacena por debajo de 8 C hasta poco antes de su
uso.
HEMOSTASIS 337
Aunque las preparaciones de factor VIII anteriores eran relativamente crudas (es decir, contenían niveles más bajos de varias otras
proteínas plasmáticas), muchas de las preparaciones modernas se purifican cromatográficamente en un alto grado. El uso de la
cromatografía de inmunoafinidad se ha generalizado a este respecto desde 1988 (Figura 12.7). La extrema bioselectividad de este
método puede producir un factor de purificación de varios miles de veces en un solo paso.
Aunque el fraccionamiento puede reducir de manera muy significativa la probabilidad de transmisión de patógenos, no puede eliminar por
completo esta posibilidad. Los productos de factor VIII derivados de la sangre, incluidos los preparados por cromatografía de inmunoafinidad,
generalmente se someten a más pasos de procesamiento diseñados para eliminar / inactivar cualquier virus presente. La materia prima a
menudo se calienta hasta 10 horas a 60 ° C o se trata con solvente o detergente diluido antes de la cromatografía. El factor VIII recombinante
también se trata a menudo con detergente diluido en un esfuerzo por inactivar cualquier partícula viral potencialmente presente.
La producción de factor VIII recombinante (cuadro 12.2) ha terminado con la dependencia de la sangre como única fuente de este producto
y ha eliminado la posibilidad de transmitir enfermedades transmitidas por sangre derivadas específicamente de la sangre infectada. En el
pasado, era probable que más del 60% de los hemofílicos se infectaran accidentalmente a través de productos contaminados en alguna etapa
de su vida.
Varias empresas han expresado el ADNc que codifica el factor VIII: C humano en una variedad de sistemas de producción eucariotas
(el VIII: C humano contiene 25 sitios potenciales de glicosilación). Las células CHO y las líneas celulares BHK se han utilizado con mayor
frecuencia, además de otras líneas celulares, como varias líneas celulares de carcinoma de ratón. El producto de factor VIII recombinante
generalmente contiene sólo VIII: C (es decir, carece de vWF). Sin embargo, tanto los estudios clínicos como los preclínicos han
demostrado que la administración de este producto a pacientes que padecen hemofilia A es tan eficaz como la administración del complejo
de factor VIII derivado de la sangre. El producto VIII: C recombinante parece unirse al plasma.
Complejo de factor VIII

Brazo espaciador
Epítopo contra
cual anticuerpo
se elevó
Anti-factor VIII
anticuerpo
Soporte de cuentas
Factores sanguíneos adicionales

u otras proteínas plasmáticas
que no se unen al anticuerpo
Figura 12.7 Purificación del complejo de factor VIII mediante cromatografía de inmunoafinidad. El anticuerpo anti-factor VIII inmovilizado es de
origen de ratón. Se han utilizado con éxito anticuerpos producidos contra epítopos específicos en los componentes VIII: C y vWF. Las
columnas a escala industrial a menudo exhiben un volumen de lecho de varios litros. Tenga en cuenta que los diferentes elementos de este
diagrama no están dibujados a la escala correcta entre sí
vWF con igual afinidad al VIII: C nativo tras su inyección en el sistema circulatorio del paciente. Los datos farmacocinéticos en
animales y humanos no revelan diferencias significativas entre las propiedades de los productos recombinantes y nativos.
Algunos pacientes, en particular los que padecen hemofilia A grave (es decir, los que producen de forma natural poco o nada de VIII:
C), desarrollarán una respuesta inmunitaria contra el factor VIII: C inyectado, sea cual sea su origen.
La producción de anticuerpos anti-factor VIII: C hace necesaria la administración de dosis terapéuticas más altas
del producto. En casos graves, el producto puede incluso volverse ineficaz. Pueden adoptarse varios enfoques para
evitar este problema. Éstos incluyen:
• Exanguinotransfusión de sangre total. Esto disminuirá transitoriamente los anticuerpos anti-factor VIII: C circulantes.
• Administración directa de factor Xa, evitando así el paso no funcional en la cascada de la coagulación (Figuras 12.2
y 12.3).
• Administración de niveles elevados de una mezcla de factores de coagulación II, VII, IX y X, que actúa eficazmente en el 50 por ciento de
los pacientes tratados.
• Administración de factor VIIa, como se comenta a continuación.
• Administración de factor VIII porcino, que puede o no tener reacciones cruzadas con los anticuerpos producidos contra el factor VIIIa
humano. (Sin embargo, el sistema inmunológico pronto comenzará a producir anticuerpos contra el factor de coagulación porcino).
• Administración de factor VIII, con administración concurrente de agentes inmunosupresores.
Debido a la frecuencia de administración del producto, el procedimiento de purificación del factor VIII: C recombinante debe ser
particularmente riguroso. A diferencia de lo que ocurre cuando el producto se purifica a partir de sangre humana, cualquier
contaminante presente en el producto final será no humano y, por lo tanto, inmunogénico. Las fuentes de dichos contaminantes
incluirían:
• proteínas de la célula huésped;
• medio de cultivo de células animales;
• Anticuerpo filtrado de la columna de inmunoafinidad.
Se hace hincapié no solo en garantizar la ausencia de proteínas contaminantes, sino también en otros contaminantes potenciales, en
particular el ADN. (El ADN derivado de la línea celular del huésped podría albergar oncogenes; Capítulo 7.)
El factor VIII recombinante está ganando una cuota de mercado cada vez mayor del mercado del factor VIII. Los investigadores
también están intentando desarrollar formas modificadas de VIII: C (por mutagénesis dirigida al sitio) que muestren características
deseables adicionales. Particularmente atractivo a este respecto sería el desarrollo de un producto que exhibiera una vida media
circulatoria prolongada. Esto podría reducir
HEMOSTASIS 339
la frecuencia de las inyecciones que necesitan los pacientes con hemofilia A. Sin embargo, cualquier alteración de la secuencia
primaria de la molécula conlleva la gran posibilidad de convertir al mutante resultante en inmunogénico.
12.2.6 Factores IX, IIVa y XIII
Las personas que presentan una deficiencia de factor IX desarrollan hemofilia B, también conocida como enfermedad de Christmas. Aunque
sus consecuencias clínicas son muy similares a las de una deficiencia de factor VIII, su incidencia general en la población es mucho menor.
Las personas que padecen hemofilia B se tratan mediante la administración intravenosa de un concentrado de factor IX. Esto se obtenía
tradicionalmente mediante el fraccionamiento de sangre humana. El factor IX recombinante ahora también se produce en células CHO
modificadas genéticamente (cuadro 12.2 y recuadro 12.1).
El factor IX obtenido de donaciones de sangre normalmente es solo parcialmente puro. Además de factor
IX, el producto contiene niveles más bajos de factores II, VII y X y también se ha utilizado para tratar trastornos hemorrágicos causados por
la falta de estos factores.
El factor IX también puede purificarse mediante cromatografía de inmunoafinidad, utilizando monoclonales murinos antiIX inmovilizados.
La purificación hasta la homogeneidad es particularmente importante en el caso de
Recuadro 12.1
Estudio de caso de producto: BeneFix
BeneFix (nombre comercial, también conocido como nonacog alfa) es un factor IX de sangre humana recombinante aprobado
para uso médico general en los EE. UU. Y la UE desde 1997. Está indicado para el control y la prevención de episodios
hemorrágicos en pacientes con hemofilia B (enfermedad de Christmas) , incluido el uso en un entorno quirúrgico. La proteína
monocatenaria de 55 kDa y 415 aminoácidos muestra una secuencia de aminoácidos idéntica y un perfil de modificación
postraduccional relativamente similar al del factor IX nativo derivado del suero. Las modificaciones postraduccionales presentes
incluyen glicosilación ligada a N y O, γ- carboxilación, β- hidroxilación, sulfatación y fosforilación. El factor IX sanguíneo
recombinante se produce en una línea celular CHO modificada, y el procesamiento posterior implica múltiples pasos
cromatográficos, ultrafiltración y diafiltración. El producto final se presenta liofilizado en viales de un solo uso y contiene histidina,
sacarosa, glicina y polisorbato 80 como excipientes. Los viales contienen 250, 500 o 1000 UI de factor IX (según lo determinado
por un ensayo de coagulación de una etapa frente a un estándar internacional de la Organización Mundial de la Salud). El
producto está destinado a la administración intravenosa y los regímenes de dosificación / administración exactos dependen de la
gravedad de la deficiencia de factor IX, la ubicación y extensión del sangrado y el estado clínico del paciente.
El producto muestra una semivida sérica media de 18,8 h en humanos. Se ha evaluado en cuatro ensayos clínicos en los que
participaron un total de 128 sujetos y en el contexto tanto de hemorragia espontánea como de cirugía. Aproximadamente el 88 por ciento
del total de infusiones administradas para el sangrado se calificó como de respuesta "buena" o "excelente". Los efectos secundarios
notificados, aunque poco frecuentes, incluyeron hipersensibilidad, así como dolor de cabeza, fiebre y náuseas. BeneFix es comercializado
por Wyeth.
productos recombinantes. Se ha generado al menos un anticuerpo monoclonal que se une específicamente solo al factor IX que
contiene Ca previamente unido 2 ( es decir, el Ca 2 - conformación dependiente del factor
IX). La inmovilización de este anticuerpo permitió el desarrollo de un sistema de inmunoafinidad en el que el factor IX se une a la columna
en presencia de un Ca 2 - que contiene tampón. La elución posterior se promueve simplemente mediante la inclusión de un agente quelante
(por ejemplo, EDTA) en el tampón de elución.
Entre el 5% y el 25% de las personas que padecen hemofilia A desarrollan anticuerpos anti-factor VIII y entre el 3% y el 6%
de los que padecen hemofilia B desarrollan anticuerpos anti-factor IX. Esto complica el tratamiento de estas afecciones y, como
se mencionó anteriormente, un enfoque para su tratamiento es la administración directa de factor VIIa. El fundamento
terapéutico es que el factor VIIa podría activar directamente los pasos finales comunes de la cascada de la coagulación,
independientemente del factor VIII o IX (figura 12.1). El factor VIIa forma un complejo con el factor tisular que, en presencia de
fosfolípidos y Ca 2, activa el factor X.
Novo-Nordisk comercializa una forma recombinante de factor VIIa (denominada 'NovoSeven' o 'eptacog alfa activado')
(tabla 12.2). La molécula recombinante se produce en una línea celular BHK y el producto final difiere sólo ligeramente (sólo
en su patrón de glicosilación) de la molécula nativa.
La purificación implica el uso de una columna de inmunoafinidad que contiene anticuerpo antifactor VII murino inmovilizado.
Inicialmente se produce como un polipéptido de 406 aminoácidos monocatenario inactivado, que posteriormente se convierte
proteolíticamente en el complejo de factor VIIa activo de dos cadenas. Después de la esterilización por filtración, el producto final se
llena asépticamente en sus envases de producto final y se liofiliza.
Una deficiencia genética (muy rara) en la producción del factor XIII también da como resultado una eficacia de coagulación alterada en las
personas afectadas. En este caso, no se forman los enlaces covalentes que normalmente caracterizan la transformación de un coágulo blando en un
coágulo duro. Las preparaciones de factor XIII, parcialmente purificadas de sangre humana, se utilizan para tratar a personas con esta afección;
hasta la fecha, no se ha comercializado ninguna versión recombinante del producto.
12.3 Anticoagulantes
Aunque la formación de coágulos de sangre es esencial para mantener la hemostasia, una coagulación inadecuada puede dar lugar a
afecciones médicas graves, a veces fatales. La formación de un coágulo de sangre (un trombo) a menudo ocurre de manera inapropiada dentro
de los vasos sanguíneos enfermos. Esto obstruye parcial o completamente el flujo de sangre (y por lo tanto de oxígeno) a los tejidos que
normalmente abastece ese vaso sanguíneo.
La formación de trombos en una arteria coronaria (las arterias que suministran oxígeno y nutrientes al músculo cardíaco) se denomina
trombosis coronaria. Esto resulta en un ataque cardíaco, caracterizado por la muerte (infarto) del músculo cardíaco privado de oxígeno; de
ahí el término infarto de miocardio. El desarrollo de un trombo en un vaso que suministra sangre al cerebro puede provocar el desarrollo de
un accidente cerebrovascular. Además, un trombo (o parte del mismo) que se ha formado en un sitio particular del sistema vascular puede
desprenderse. Después de viajar a través de la sangre, esta puede alojarse en otro vaso sanguíneo, obstruyendo el flujo sanguíneo en ese
punto. Este proceso, que también puede dar lugar a ataques cardíacos o accidentes cerebrovasculares, se denomina embolia.
Los anticoagulantes son sustancias que pueden evitar la coagulación de la sangre y, por tanto, tienen un uso terapéutico en
los casos en los que se diagnostica un alto riesgo de coagulación. A menudo se administran a pacientes con enfermedad
coronaria y a pacientes que han sufrido un ataque cardíaco o
ANTICOAGULANTES 341
Cuadro 12.3 Anticoagulantes que se utilizan terapéuticamente o muestran potencial terapéutico.
Anticoagulante un Estructura Fuente Masa molecular (Da)
Heparina Glicosaminoglicano Pulmón de res, mucosa gástrica de cerdo 3000–40 000

Dicumarol A base de cumarina Fabricación de productos químicos 336,3
Warfarina A base de cumarina Fabricación química 308,4
Hirudin Polipéptido Saliva sanguijuela, genética 7 000
Ingenieria
Ancrod Polipéptido Veneno de serpiente, genético 35 000
Ingenieria
Proteína C Glicoproteína Plasma humano 62 000
un El dicumarol y las moléculas relacionadas se usan generalmente durante períodos prolongados, mientras que la heparina se usa durante períodos más cortos. La hirudina ha sido aprobada
recientemente para uso médico general, mientras que ancrod permanece bajo investigación clínica.
accidente cerebrovascular (en un esfuerzo por prevenir episodios recurrentes). Los principales anticoagulantes utilizados con fines terapéuticos se
enumeran en la tabla 12.3.
La heparina es un anticoagulante a base de carbohidratos (glicosaminoglicano) asociado con muchos tejidos, pero se
encuentra principalmente almacenado intracelularmente como gránulos en los mastocitos que recubren el endotelio de los
vasos sanguíneos. Una vez liberada en el torrente sanguíneo, la heparina se une a una proteína plasmática adicional, la
antitrombina, que la activa. El complejo heparina-antitrombina luego se une a varios factores de coagulación activados
(incluidos IIa, IXa, Xa, XIa y XIIa), inactivándolos así. La heparina ahora se disocia del complejo y se combina con otra
molécula de antitrombina, iniciando así otro giro de este ciclo inhibitorio.
La heparina se extraía originalmente del hígado (de ahí su nombre), pero las preparaciones comerciales ahora se obtienen mediante
extracción de pulmón de res o mucosa gástrica porcina.
Aunque el producto ha demostrado ser un anticoagulante eficaz (y relativamente económico), adolece de una serie de
desventajas clínicas, incluida la necesidad de un cofactor (antitrombina III) y respuestas de dosis poco predecibles. Sin
embargo, a pesar de tales desventajas, la heparina todavía disfruta de un uso clínico generalizado.
Los antimetabolitos de vitamina K dicumarol y warfarina son anticoagulantes relacionados a base de cumarina que, a diferencia
de la heparina, pueden administrarse por vía oral. Estos compuestos inducen su efecto anticoagulante previniendo la vitamina K
dependiente γ- carboxilación de ciertos factores sanguíneos, específicamente los factores II, VII, IX y X. Tras la síntesis hepática
inicial de estos factores de coagulación, una carboxilasa específica cataliza la γ- carboxilación de varios de sus residuos de
glutamato (por ejemplo, 10 de los primeros 33 residuos presentes en la protrombina son γ- carboxiglutamato). Esta modificación
postraduccional es necesaria para permitir que estos factores se unan a Ca 2 iones, que es un requisito previo para su
funcionamiento eficaz. La vitamina K es un cofactor esencial para la enzima carboxilasa, y su reemplazo con el antimetabolito
dicumarol inactiva esta enzima. Como consecuencia, se producen factores sanguíneos defectuosos que dificultan el
funcionamiento eficaz de la cascada de coagulación. El único efecto secundario importante de estos anticoagulantes orales es el
sangrado prolongado; por tanto, los niveles de dosificación se eligen con cuidado. El dicumarol se aisló por primera vez del heno
de trébol dulce en mal estado, como agente que promovía la enfermedad hemorrágica en el ganado. Tanto el dicumarol como la
warfarina también se han utilizado (en dosis altas) como venenos para ratas.
12.3.1 Hirudin
La hirudina es un anticoagulante derivado de la sanguijuela que actúa inhibiendo directamente la trombina. Una variedad de animales chupadores
de sangre contienen sustancias en su saliva que inhiben específicamente algún elemento del sistema de coagulación de la sangre (tabla 12.4).
La picadura de cualquiera de estos parásitos se caracteriza por una hemorragia prolongada del huésped. Esta propiedad llevó al uso
documentado de sanguijuelas como ayuda para la sangría desde varios cientos de años antes de Cristo. El método estaba particularmente de
moda en Europa a principios del siglo XIX. Muchos médicos en ese momento todavía creían que la mayoría de las enfermedades estaban
relacionadas de alguna manera con la composición de la sangre, y el sangrado era una terapia común, aunque ineficaz. Los cirujanos del Ejército
Napoleónico, por ejemplo, utilizaron sanguijuelas para extraer sangre de los soldados que padecían condiciones tan diversas como infecciones y
enfermedades mentales.
Con el advenimiento de los principios médicos modernos, el uso médico de sanguijuelas disminuyó un poco. En años más recientes,
sin embargo, realizaron un regreso limitado. Ocasionalmente se utilizaron para drenar la sangre de los tejidos inflamados y en
procedimientos asociados con la cirugía plástica.
La presencia de un anticoagulante en la saliva de la sanguijuela, Hirudo medicinalis, se describió por primera vez en 1884.
Sin embargo, no fue hasta 1957 que la principal actividad anticoagulante presente se purificó y se denominó hirudina. La
hirudina es un polipéptido corto (65 aminoácidos), de masa molecular 7000 Da. El residuo de tirosina en la posición 63 es
inusual porque contiene un grupo sulfato. La molécula parece tener dos dominios. El dominio N-terminal globular está
estabilizado por tres enlaces disulfuro, mientras que el dominio C-terminal es más alargado y exhibe un alto contenido de
aminoácidos ácidos.
La hirudina exhibe su efecto anticoagulante al unirse fuertemente a la trombina, inactivándola así. Además de su papel
fundamental en la producción de un coágulo de fibrina, la trombina muestra varias otras actividades biológicas (no enzimáticas)
importantes para mantener la hemostasia. Éstos incluyen:
• es un potente inductor de la activación y agregación plaquetarias;
• funciona como quimioatrayente para monocitos y neutrófilos;
• estimula el transporte endotelial.
Cuadro 12.4 Algunas sustancias aisladas de parásitos hematófagos que inhiben los mecanismos hemostáticos de su huésped. Todos son
polipéptidos de masa molecular relativamente baja.
Polipéptido Masa molecular (Da) Productor Efecto hemostático interrumpido
Hirudin 7 000 Hirudo medicinalis Se une e inhibe la trombina Se une a

Rhodniin 11 100 Rhodnius prolixus la trombina e inhibe Inhibe el factor
Antistatina 15 000 Haementeria of fi cinalis Xa
Anticoagulante para garrapatas 6800 Ornithodoros moubata Inhibe el factor Xa
péptido (TAP)
Calin 55 000 Hirudo medicinalis Inhibe la adhesión plaquetaria
Decorsin 4 400 Macrobdella decora Inhibe la adhesión plaquetaria

ANTICOAGULANTES 343
Una molécula de hirudina se une a una sola molécula de trombina con una afinidad muy alta ( K re ≈
10 12 mol l 1). La unión y la inactivación ocurren como un mecanismo de dos pasos. La región C-terminal de
La hirudina se une primero a lo largo de un surco en la superficie de la trombina, lo que da como resultado un pequeño cambio
conformacional de la enzima. Esto luego facilita la unión de la región N-terminal al área del sitio activo (Figura 12.8). La unión de hirudina
inhibe todas las funciones principales de la trombina. Los fragmentos de hirudina también pueden unirse a la trombina, pero generalmente
solo inhibirán algunas de las actividades de la trombina. Por ejemplo, la unión de un fragmento de hirudina N-terminal a la trombina inhibe
solo la actividad catalítica de la trombina.
La hirudina muestra varias ventajas terapéuticas potenciales como anticoagulante. Éstos incluyen:
• actúa directamente sobre la trombina;
• no requiere cofactor;
• es menos probable que muchos otros anticoagulantes inducir hemorragia involuntaria;
• es un inmunógeno débil.
Aunque durante muchos años se apreció el potencial terapéutico de la hirudina, no se pudo purificar el material de la fuente nativa
para respaldar los ensayos clínicos, sin importar su amplia aplicación médica. El gen de la hirudina se clonó en la década de 1980 y
posteriormente se ha expresado en varios sistemas recombinantes, incluidos E. coli, Bacillis subtilis y Saccharomyces cerevisiae. Una
hirudina recombinante (nombre comercial Re fl udan) fue aprobada por primera vez para uso médico general en 1997. El sistema de
producción recombinante se construyó mediante la inserción (a través de un plásmido) de un gen de hirudina sintética en una cepa de S.
cerevisiae. Las células de levadura secretan el producto, que luego se purifica mediante diversas técnicas de fraccionamiento (Figura
12.9). La molécula recombinante muestra una secuencia de aminoácidos ligeramente alterada en comparación con el producto nativo.
Sus dos primeros aminoácidos, leucina y treonina, reemplazan dos valinas de la hirudina nativa. También está desprovisto de sulfato.
Hirudin
Región N terminal
Sitio activo
región
Hirudina-trombina inactiva
complejo
Trombina
Figura 12.8 Unión de hirudina a trombina, inactivando así este factor de coagulación activado.
Cromatográfico inicial
Fermentación de
fraccionamiento del filtrado
Saccharmomyces Cosecha de
por, por ejemplo, ion-
cerevisiae células (filtración)
cromatografía de intercambio
Concentración y sal
Ultrafiltración Alta resolución
eliminación (ultrafiltración
(concentración) cromatografia
y diafiltración)
Adición de excipientes Liofilización de

Filtración y
(manitol) y pH producto final
llenado aséptico
ajustamiento
Figura 12.9 Visión general de la producción de Re fl udan (hirudina recombinante). Los detalles exactos de muchos pasos siguen siendo confidenciales por
razones comerciales obvias. Se llevan a cabo una serie de controles de CC en el producto final para con fi rmar la estructura del producto. Estos incluyen
composición de aminoácidos, análisis de HPLC y mapeo de péptidos.
grupo normalmente presente en tirosina 63. Sin embargo, los ensayos clínicos han demostrado que este producto ligeramente alterado es
seguro y eficaz. El producto final se presenta en forma liofilizada con el azúcar manitol que representa el principal excipiente añadido. El
producto, que muestra una vida útil útil de 2 años cuando se almacena a temperatura ambiente, se reconstituye con solución salina o
WFI inmediatamente antes de su administración iv. Un segundo producto recombinante (nombre comercial revasc, también producido
en
S. cerevisiae) también ha sido aprobado.
12.3.2 Antitrombina
La antitrombina, ya mencionada en el contexto de la heparina, es el inhibidor natural de la coagulación más abundante. Es una
glicoproteína monocatenaria de 432 aminoácidos que presenta cuatro cadenas laterales de oligosacáridos y una masa molecular
aproximada de 58 kDa. Está presente en el plasma a concentraciones de 150 µ g ml 1 y es un potente inhibidor de la trombina
(factor IIa), así como de los factores IXa y Xa. Inhibe la trombina uniéndose directamente a ella en un complejo estequiométrico 1:
1.
Los concentrados de antitrombina derivados de plasma se han utilizado con fines médicos desde la década de 1980 para el tratamiento de la
deficiencia de antitrombina hereditaria y adquirida. La deficiencia hereditaria (genética) se caracteriza por la presencia de poca o ninguna
actividad antitrombina nativa en el plasma y da como resultado un mayor riesgo de formación inadecuada de coágulos de sangre / émbolos. La
deficiencia de antitrombina adquirida puede ser inducida por fármacos (p. Ej., Heparina y estrógenos), enfermedad hepática (disminución de la
antitrombina
AGENTES TROMBOLÍTICOS 345
Clarificación de la leche
Rebaño de cabras transgénicas Ordeño (filtración usando ≈ 500 kDa

filtrar)
Interacción hidrofóbica Intercambio de aniones Afinidad de la heparina
cromatografia cromatografia cromatografia
Figura 12.10 Esquema de la producción y purificación de antitrombina a partir de la leche de cabras transgénicas. La purificación logra un
rendimiento general del producto superior al 50 por ciento, con una pureza superior al 99 por ciento.
síntesis) o varias otras condiciones médicas. La antitrombina recombinante se ha expresado en la leche de cabras
transgénicas (Capítulo 5), y este producto (nombre comercial Atryn) fue aprobado para uso médico general en Europa en
2006 (Figura 12.10). El producto recombinante muestra una secuencia de aminoácidos idéntica a la de la antitrombina
humana nativa, aunque su composición de oligosacáridos varía algo de la proteína nativa.
También se ha aprobado para uso médico un producto relacionado (nombre comercial Xigiris, también conocido como drotrecogina alfa).
Xigiris es una proteína C activada humana recombinante, una molécula que juega un papel importante en el control de la coagulación. en vivo.
El producto recombinante se produce en una línea celular de mamíferos modificada y, como muchas otras proteínas sanguíneas, se
caracteriza por la presencia de varias γ- carboxiglutamato y β- Residuos hidroxilados (Capítulo 2). La proteína C activada está indicada para el
tratamiento de la sepsis grave, principalmente para prevenir la insuficiencia orgánica múltiple que puede desencadenarse por la formación de
coágulos sanguíneos asociados a la sepsis.
12.4 Agentes trombolíticos
El proceso natural de la trombosis funciona para taponar un vaso sanguíneo dañado, manteniendo así la hemostasia hasta que el
vaso dañado pueda repararse. Posteriormente a esta reparación, el coágulo se elimina mediante un proceso de degradación
enzimático conocido como fibrinólisis. La fibrinólisis normalmente depende de la serina proteasa plasmina, que es capaz de degradar
las hebras de fibrina presentes en el coágulo.
En situaciones en las que la formación inadecuada de un coágulo da como resultado el bloqueo de un vaso sanguíneo, el daño tisular
resultante depende, hasta cierto punto, de cuánto tiempo bloquea el coágulo el flujo sanguíneo. La eliminación rápida del coágulo a menudo
puede minimizar la gravedad del daño tisular. Por tanto, varios agentes trombolíticos (que degradan los coágulos) han encontrado aplicación
médica (cuadro 12.5). El mercado de un agente trombolítico eficaz es sustancial. Solo en EE. UU., Se estima que 1,5 millones de personas
sufren un infarto agudo de miocardio cada año, y hay otros 0,5 millones que sufren accidentes cerebrovasculares.
Cuadro 12.5 Agentes trombolíticos aprobados para uso médico general
Producto un Empresa
Activasa (rh-tPA) Genentech

Ecoquinasa (rtPA; difiere del tPA humano en que se han eliminado tres de sus cinco dominios) Galenus Mannheim
Retavase (rtPA; ver Ecokinase) Boehringer Manheim / Centocor

Rapilysin (rtPA; ver Ecokinase) Boehringer Manheim
Tenecteplasa (también comercializada como Metalyse) (TNK-tPA, rtPA modificado) TNKase Boehringer Ingelheim
(tenecteplasa; rtPA modificado; ver Tenecteplasa) Estreptoquinasa (producida por Estreptoquinasa Genentech
haemolyticus) Varios
Uroquinasa (extraída de orina humana) Estafilocinasa (extraída de Staphylococcus Varios
aureus y producido en Varios
varios sistemas recombinantes
un r: recombinante; rh: humano recombinante.
12.4.1 Activador de plasminógeno tisular
El proceso trombolítico natural se ilustra en la Figura 12.11. La plasmina es una proteasa que cataliza la degradación proteolítica
de la fibrina presente en los coágulos, disolviendo así eficazmente el coágulo. La plasmina se deriva del plasminógeno, su
zimógeno circulante. El plasminógeno se sintetiza y se libera en los riñones. Es una glicoproteína monocatenaria de 90 kDa que se
estabiliza mediante varios enlaces disulfuro.
El tPA (también conocido como fibroquinasa) representa el activador fisiológico más importante del plasminógeno. El tPA es una
serina proteasa de 527 aminoácidos. Se sintetiza predominantemente en las células endoteliales vasculares (células que recubren el
interior de los vasos sanguíneos) y muestra cinco dominios estructurales, cada uno de los cuales tiene una función específica (cuadro
12.6). El tPA muestra cuatro sitios potenciales de glicosilación, tres de los cuales normalmente están glicosilados (residuos 117, 184 y
448). Los restos de carbohidratos desempeñan un papel importante en la mediación de la captación hepática de tPA y, por tanto, su
eliminación del plasma. Normalmente se encuentra en la sangre en dos formas: un polipéptido monocatenario (tPA tipo I) y una
estructura de dos cadenas (tipo II) derivada proteolíticamente de la estructura monocatenaria. La forma de dos cadenas es la que se
asocia predominantemente con los coágulos sometidos a lisis,
Cuadro 12.6 Los cinco dominios que constituyen el tPA humano y la función biológica de cada dominio
dominio tPA Función
Dominio de dedo (dominio F) Dominio de Promueve la unión del tPA a la fi brina con alta afinidad Muestra actividad
proteasa (dominio P) proteolítica específica del plasminógeno Se une a los receptores
Dominio del factor de crecimiento epidérmico (dominio EGF) hepáticos, por lo que media la eliminación hepática del tPA de la sangre
Dominio Kringle-1 (K 1 dominio) Dominio Asociado con la unión al receptor hepático Facilita la estimulación de la
Kringle-2 (K 2 dominio) actividad proteolítica del tPA por la fibrina
Figura 12.11 ( a) El sistema fibrinolítico, en el que tPA convierte proteolíticamente el plasminógeno zimógeno en plasmina activa, que a su vez
degrada las hebras de fibrina, disolviendo así el coágulo. El tPA y el plasminógeno se unen a la superficie de las hebras de fibrina (b), lo que
garantiza una activación rápida y eficiente del proceso trombolítico.
La fibrina contiene sitios de unión tanto para el plasminógeno como para el tPA, lo que los acerca mucho. Esto facilita la
activación directa del plasminógeno en la superficie del coágulo (Figura 12.11). Este proceso de activación se ve potenciado
por el hecho de que la unión del tPA a la fibrina (a) mejora la unión posterior del plasminógeno y (b) aumenta la actividad del
tPA hacia el plasminógeno hasta 600 veces.
Por tanto, en general, la activación de la cascada trombolítica se produce exactamente donde se necesita, es decir, en la superficie del
coágulo. Esto es importante, ya que la especificidad de sustrato de la plasmina es pobre y la plasmina circulante muestra el potencial
catalítico para proteolizar el fibrinógeno, el factor V y el factor.
VIII. Aunque el tPA sérico soluble muestra una actividad muy reducida frente al plasminógeno, esta reacción produce algo de
plasmina de circulación libre. Si no se controla, esto podría aumentar el riesgo de hemorragia posterior. Este escenario
generalmente se evita porque la plasmina circulante se
ociosamente neutralizado por la proteína plasmática de anteras, α 2- antiplasmina (una glicoproteína monocatenaria de 70 kDa que se une a la plasmina
muy estrechamente en un complejo 1: 1). A diferencia de la plasmina libre, la plasmina presente en un coágulo
La superficie se inactiva muy lentamente por α 1- antiplasmina. El sistema trombolítico ha evolucionado así de manera
autorreguladora, lo que facilita la degradación eficiente del coágulo con un potencial mínimo.
interrupción de otros elementos del mecanismo hemostático.
12.4.2 Activador del plasminógeno tisular de primera generación
Aunque el tPA se estudió por primera vez a fines de la década de 1940, su caracterización extensa se vio obstaculizada por los bajos niveles a los que
normalmente se sintetiza. Se facilitaron estudios detallados en la década de 1980 después del descubrimiento de que la línea celular del melanoma de
Bowes produce y secreta grandes cantidades de esta proteína. Esto también facilitó su evaluación clínica inicial. El gen tPA se clonó a partir de la línea
celular de melanoma en 1983, y esto facilitó la producción posterior a gran escala en líneas celulares CHO mediante tecnología de ADN recombinante. El
cDNA de tPA contiene 2530 nucleótidos y codifica una proteína madura de 527 aminoácidos. El patrón de glicosilación fue similar, aunque no idéntico, a
la molécula humana nativa. Una licencia de comercialización del producto se emitió por primera vez en los EE.UU. a Genentech en 1987 (bajo el nombre
comercial Alteplase). La indicación terapéutica fue para el tratamiento del infarto agudo de miocardio. El proceso de producción implica un paso de
fermentación inicial (10000 l), durante el cual las células CHO cultivadas producen y secretan tPA en el medio de fermentación. Después de la
eliminación de las células por filtración submicrométrica y concentración inicial, el producto se purifica mediante una combinación de varias etapas
cromatográficas. Se ha demostrado que el producto final tiene una pureza superior al 99% mediante varias técnicas analíticas, incluidas HPLC,
SDS-PAGE, mapeo tríptico y secuenciación N-terminal. el producto se purifica mediante una combinación de varios pasos cromatográficos. Se ha
demostrado que el producto final tiene una pureza superior al 99 por ciento mediante varias técnicas analíticas, incluidas HPLC, SDS-PAGE, mapeo
tríptico y secuenciación N-terminal. el producto se purifica mediante una combinación de varios pasos cromatográficos. Se ha demostrado que el
producto final tiene una pureza superior al 99 por ciento mediante varias técnicas analíticas, incluidas HPLC, SDS-PAGE, mapeo tríptico y secuenciación
N-terminal.
La alteplasa ha demostrado ser eficaz en el tratamiento temprano de pacientes con infarto agudo de miocardio (es decir, aquellos tratados dentro
de las 12 h posteriores a la aparición de los primeros síntomas). Se observa un aumento significativo de las tasas de supervivencia del paciente
(medidas 1 día y 30 días después del evento inicial) cuando se administra tPA a favor de la estreptoquinasa, una terapia estándar (ver más
adelante). El tPA se ha consolidado así como una opción de primera línea en el tratamiento del infarto agudo de miocardio. Una dosis terapéutica de
90 a 100 mg (a menudo administrada por infusión durante 90 min) da como resultado una concentración de alteplasa en estado estacionario de 3 a 4
mg l 1 durante ese período. Sin embargo, el hígado elimina rápidamente el producto y presenta una semivida sérica de aproximadamente 3 min.
Como es el caso de la mayoría de los agentes trombolíticos, el riesgo más significativo asociado con la administración de tPA es la posible inducción
de una hemorragia grave.
12.4.3 Activador de plasminógeno tisular diseñado
También se han generado formas modificadas de tPA en un esfuerzo por desarrollar un producto con un perfil terapéutico
mejorado (por ejemplo, de acción más rápida o que exhibe una vida media plasmática prolongada). Reteplase es el nombre común
internacional dado a uno de esos tPA humano modificado producido en recombinantes E. coli células y se vende con los nombres
comerciales Ecokinase, Retavase y Rapilysin (Tabla 12.5). El desarrollo de este producto se basó en la generación de una
secuencia de nucleótidos sintética que codifica una molécula de tPA acortada (355 aminoácidos). Este análogo contenía sólo los
dominios tPA responsables de la selectividad de fibrina y la actividad catalítica. La secuencia de nucleótidos se integró en un
vector de expresión posteriormente introducido en E. coli ( cepa K12) por tratamiento con cloruro de calcio. La proteína se expresa
intracelularmente, donde se acumula en forma
de un cuerpo de inclusión. Debido al sistema de producción de procariotas, el producto no está glicosilado. El producto liofilizado estéril
final exhibe una vida útil de 2 años cuando se almacena a temperaturas por debajo de 25 ° C. En la figura 12.12 se presenta una
descripción general del proceso de producción.
La falta de glicosilación, así como la ausencia de EGF y K 1 dominios (tabla 12.6), confiere una vida media en
suero prolongada a la molécula diseñada. Productos a base de Reteplase
muestran una vida media en suero de hasta 20 min, lo que facilita su administración como una única inyección en bolo
en lugar de la infusión continua. Ausencia de F de la molécula 1 El dominio también reduce la afinidad de unión de fibrina del
producto. Se teoriza que esto puede mejorar aún más la degradación del coágulo,
ya que facilita una difusión más extensa del agente trombolítico en el interior del coágulo. La tenecteplasa (también
comercializada bajo el nombre comercial Metalyse) es un tPA adicional diseñado ahora en el mercado. Producida en una
línea celular CHO, esta variante glicosilada difiere en secuencia al tPA nativo en seis aminoácidos (Thr 103 convertido en
Asn; Asn 117 convertido en Gln y la secuencia Lys-His-Arg-Arg en la posición 296-299 convertida en Ala –Ala – Ala – Ala).
En conjunto, estas modificaciones dan como resultado una semivida plasmática prolongada (entre 15 y 19 min), así como un
aumento de la resistencia al PAI-1 (inhibidor del activador del plasminógeno 1, un inhibidor natural del tPA).
Disrupción celular
Fermentación
Cosecha celular y recuperación de
(Recipiente de 1000 litros)
cuerpos de inclusión
Cromatografía de afinidad Solubilización de

(Erythrina tripsina Renaturalización y
cuerpos de inclusión bajo
inhibidor - sefarosa) acidificación
condiciones reductoras
Intercambio iónico Eliminación de baja

Concentración
cromatografia peso molecular
(Ultrafiltración)
(x 2) especie (diafiltración)
Adición de excipientes
Llenado aséptico
Filtración esterilizada (arginina, fosfórico
(Viales de vidrio de 20 ml)
ácido, polisorbato 20)
Secar en frío
y sellado
Figura 12.12 Producción de Ecoquinasa, una molécula de tPA modificada que obtuvo la aprobación regulatoria en Europa en
1996. La línea celular de producción es recombinante E. coli K12, que alberga una secuencia de nucleótidos que codifica la molécula de tPA acortada.
El producto se acumula intracelularmente en forma de cuerpos de inclusión.
12.4.4 Estreptoquinasa
La estreptoquinasa es una proteína bacteriana extracelular de 48 kDa producida por varias cepas de Streptococcus haemolyticus grupo C.Su
capacidad para inducir la lisis de coágulos de sangre se demostró por primera vez en
1933. Las primeras preparaciones terapéuticas administradas a los pacientes a menudo causaban complicaciones inmunológicas y de otro
tipo, generalmente provocadas por las impurezas presentes en estos productos. La purificación cromatográfica (en particular utilizando
columnas de filtración en gel y de intercambio iónico) superó muchas de estas dificultades iniciales. Las preparaciones modernas de
estreptoquinasa cromatográficamente puras se suministran normalmente en forma liofilizada. Estas preparaciones (obtenidas todavía por
medios no recombinantes) a menudo contienen albúmina como excipiente. La albúmina evita la fl oculación del ingrediente activo tras su
reconstitución.
La estreptoquinasa es un agente trombolítico ampliamente utilizado. Se administra para tratar una variedad de trastornos
tromboembólicos, que incluyen:
• embolia pulmonar (bloqueo de la arteria pulmonar, que transporta sangre del corazón a los pulmones para la oxigenación,
por una embolia), que puede causar insuficiencia cardíaca aguda y muerte súbita;
• trombosis venosa profunda (formación de trombos en las venas profundas, generalmente en las piernas);
• oclusiones arteriales (obstrucción de una arteria);
• infarto agudo del miocardio.
La estreptoquinasa induce su efecto trombolítico al unirse específica y estrechamente al plasminógeno. Esto induce un cambio
conformacional en la molécula de plasminógeno que la vuelve proteolíticamente activa. De esta forma, el complejo
estreptoquinasa-plasminógeno cataliza la conversión proteolítica del plasminógeno en plasmina activa.
Como proteína bacteriana, el sistema inmunológico humano considera a la estreptoquinasa como una sustancia antigénica. En
algunos casos, su administración ha provocado respuestas alérgicas que van desde erupciones cutáneas leves hasta un shock
anafiláctico más grave (una respuesta alérgica extrema y generalizada caracterizada por hinchazón, constricción de los bronquiolos,
colapso circulatorio e insuficiencia cardíaca).
Otra desventaja de la administración de estreptoquinasa es el aumento asociado del riesgo de hemorragia. El plasminógeno
activado por estreptoquinasa es capaz de lisar no solo la fibrina asociada al coágulo, sino también el fibrinógeno plasmático libre. Esto
puede resultar en niveles bajos de fibrinógeno sérico y, por lo tanto, comprometer la capacidad hemostática. No debe administrarse, por
ejemplo, a pacientes que padecen trastornos de la coagulación o afecciones hemorrágicas como úlceras. A pesar de estas posibles
complicaciones clínicas, la administración cuidadosa de estreptoquinasa ha salvado incontables miles de vidas.
12.4.5 Uroquinasa
La capacidad de algún componente de la orina humana para disolver los coágulos de fibrina se observó por primera vez en 1885. Sin embargo, no
fue hasta la década de 1950 que la sustancia activa se aisló y se denominó uroquinasa.
La uroquinasa es una serina proteasa producida por el riñón y se encuentra tanto en el plasma como en la orina. Es capaz de
convertir proteolíticamente el plasminógeno en plasmina. Se han aislado dos variantes de la enzima: una especie de 54 kDa y una
variante de masa molecular inferior (33 kDa). La forma de masa molecular más baja parece derivar del resto de masa molecular
más alta mediante procesamiento proteolítico. Ambas formas exhiben actividad enzimática contra el plasminógeno.
La uroquinasa se usa clínicamente en las mismas circunstancias que la estreptoquinasa; debido a su origen humano, las respuestas
inmunológicas adversas son menos probables. Después de eventos médicos agudos como embolia pulmonar, el producto normalmente
se administra al paciente en dosis altas iniciales (por infusión) durante varios minutos. A esto le siguen inyecciones iv cada hora durante
un máximo de 12 h.
La uroquinasa utilizada médicamente generalmente se purifica directamente de la orina humana. Se une a una variedad de adsorbentes,
como el gel de sílice y, especialmente, el caolín (silicato de aluminio hidratado), que se puede utilizar inicialmente para concentrar y purificar
parcialmente el producto. También puede concentrarse y purificarse parcialmente mediante precipitación utilizando cloruro de sodio, sulfato de
amonio o etanol como precipitantes.
Pueden utilizarse diversas técnicas cromatográficas para purificar más la uroquinasa. Los métodos comúnmente empleados incluyen
cromatografía de intercambio aniónico (basada en DEAE), filtración en gel en Sephadex G-100 y cromatografía en columnas de
hidroxiapatita. La uroquinasa es una molécula relativamente estable. Permanece activo después de la incubación a 60 ° C durante varias
horas, o de una breve incubación a pH tan bajos como 1.0 o tan altos como 10.0.
Después de su purificación, filtración estéril y llenado aséptico, la uroquinasa humana normalmente se liofiliza. Debido a su estabilidad
térmica, el producto final también se puede calentar a 60 ° C durante un máximo de 10 h en un esfuerzo por inactivar cualquier partícula viral
presente no detectada. El producto utilizado clínicamente contiene ambas formas de masa molecular, predominando el resto de masa molecular
más alta. La uroquinasa también se puede producir mediante técnicas de cultivo de células animales utilizando células de riñón humano o
mediante tecnología de ADN recombinante.
12.4.6 Estafilocinasa
La estafiloquinasa es una proteína producida por varias cepas de S. aureus que también muestra potencial terapéutico como agente
trombolítico. La proteína se ha purificado de su fuente natural mediante una combinación de precipitación con sulfato de amonio y
cromatografía de intercambio catiónico en celulosa CM. También se ha utilizado la cromatografía de afinidad utilizando plasmina o
plasminógeno inmovilizado en perlas de sefarosa. El producto puro es un polipéptido de 136 aminoácidos que muestra una masa
molecular
en la región de 16,5 kDa. Derivados de masa molecular más baja que carecen de los primeros 6 o 10 NH 2- también se han caracterizado los
aminoácidos terminales. Los tres parecen mostrar una actividad trombolítica similar.
ity in vitro al menos.
El gen de estafiloquinasa se ha clonado en E. coli, así como varios otros sistemas recombinantes. La proteína se expresa
intracelularmente en E. coli en niveles altos, que representan del 10 al 15 por ciento de la proteína celular total. Puede purificarse
directamente del homogeneizado celular clarificado mediante una combinación de cromatografía de intercambio iónico e interacción
hidrófoba.
Aunque la estafiloquinasa no muestra una homología significativa con la estreptoquinasa, induce un efecto trombolítico por un
mecanismo algo similar: también forma un complejo estequiométrico 1: 1 con el plasminógeno. El mecanismo propuesto por el cual
la estafiloquinasa induce la activación del plasminógeno.
se describe en la Figura 12.13. La unión de la estafiloquinasa al plasminógeno parece inicialmente producir un complejo de
estafiloquinasa-plasminógeno inactivo. Sin embargo, la formación del complejo induce de alguna manera la posterior escisión
proteolítica del plasminógeno unido para formar plasmina, que permanece acomplejada con la estafilocinasa. Este complejo (a través
de la plasmina) parece catalizar la conversión de plasminógeno libre en plasmina, e incluso puede acelerar el proceso de conversión
de otros complejos de estafiloquinasa-plasminógeno en complejos de estafiloquinasa-plasmina. El efecto neto es la generación de
plasmina activa, que muestra un efecto trombolítico directo al degradar la fibrina basada en coágulos, como se describió
anteriormente (Figura 12.11).
La proteína del suero α 2- la antiplasmina puede inhibir el complejo plasmina-estafilocinasa activado. Parece que el α 2- la
antiplasmina puede interactuar con el resto plasmina activo del complejo,
resultando en la disociación de estafiloquinasa y la consiguiente formación de una plasmina inactiva α 2-
complejo de antiplasmina.
Estafiloquinasa
Estafilocinasa-plasminógeno
complejo (inactivo)
Plasminógeno libre
Estafilocinasa-plasmina
complejo (activo)
Plasmina libre Plasminógeno libre
Figura 12.13 Representación esquemática del mecanismo por el cual la estafiloquinasa parece activar el proceso trombolítico mediante la
generación de plasmina. Ver texto para más detalles
La capacidad trombolítica de la estafiloquinasa (recombinante) se ha evaluado en ensayos clínicos iniciales con resultados alentadores.
Alrededor del 80 por ciento de los pacientes que sufrían de infarto agudo de miocardio que recibieron estafiloquinasa respondieron
positivamente (se administraron 10 mg de estafiloquinasa por infusión durante 30 minutos). La molécula nativa muestra una semivida sérica
relativamente corta (de 6,3 min), aunque la unión covalente del PEG reduce la tasa de depuración sérica, lo que aumenta de forma eficaz la
semivida de la molécula de forma significativa. Como ocurre con la estreptoquinasa, los pacientes a los que se les administra estafiloquinasa
desarrollan anticuerpos neutralizantes. Se han generado varias variantes diseñadas por ingeniería (dominios suprimidos) que muestran una
inmunogenicidad significativamente reducida.
12.4.7 α 1- Antitripsina
El tracto respiratorio está protegido por una serie de mecanismos de defensa, que incluyen:
• eliminación de partículas en la fosa nasal / nasofaringe;
• expulsión de partículas (por ejemplo, al toser);
• eliminación ascendente de sustancias a través del transporte mucociliar;
• presencia en los pulmones de células inmunes, como macrófagos alveolares;
• producción / presencia de factores protectores solubles, incluyendo α 1- antitripsina, lisozima, lactoferrina e interferón.
La falla / funcionamiento ineficaz de uno o más de estos mecanismos puede afectar la función respiratoria normal. El enfisema, por
ejemplo, es una afección en la que se dañan los alvéolos de los pulmones. Esto compromete la capacidad del pulmón para intercambiar
gases y, a menudo, resulta en dificultad para respirar. Esta condición a menudo es promovida por el tabaquismo, infecciones respiratorias
o una deficiencia en la producción.
ción de suero α 1- antitripsina.
α 1- La antitripsina es una glicoproteína sérica de 394 aminoácidos y 52 kDa. Se sintetiza en el hígado y se secreta a la sangre,
donde normalmente está presente en concentraciones de 2 a 4 gl. 1. Constituye
más del 90 por ciento de la α 1- fracción de globulina de la sangre.
los α 1- El gen de la antitripsina se encuentra en el cromosoma 14. Varias α 1- Se han descrito variantes del gen de antitripsina.
Sus productos genéticos pueden distinguirse por su movilidad diferencial en
electroforesis en gel. La forma normal se denomina M, pero las mutaciones puntuales en el gen han generado dos formas adicionales
importantes, es decir, S y Z. Estas mutaciones dan como resultado un nivel muy reducido de
síntesis y secreción en la sangre de los adultos α 1- antitripsina. En particular, las personas heredan
ing dos copias del gen Z muestran niveles muy reducidos de suero α 1- actividad antitripsina. Esto a menudo se asocia con
el desarrollo de enfisema (particularmente en fumadores). La condición
puede tratarse mediante la administración de puri fi cados α 1- antitripsina. Esta proteína constituye el principal inhibidor de serina
proteasa presente en sangre. Es un potente inhibidor de la proteasa elastasa, que
sirve para proteger el pulmón del daño proteolítico al inhibir la elastasa de neutrófilos. El producto se administra de forma
continua a los pacientes, que reciben hasta 200 g del inhibidor cada año. Normalmente se prepara mediante un
fraccionamiento limitado de sangre humana completa, aunque la gran
cantidades requeridas por los pacientes aumentan el riesgo de transmisión accidental de patógenos sanguíneos
gens. los α 1- El gen de la antitripsina se ha expresado en varios sistemas recombinantes, incluida la leche de oveja
transgénica. Aunque el uso del producto recombinante prácticamente excluiría
transmisión de patógenos sanguíneos, parece significativamente más costosa de producir.
12.4.8 Albúmina
HSA es la proteína individual más abundante en sangre (cuadro 12.7). Su concentración normal es de aproximadamente 42 gl 1, que
representa el 60 por ciento de la proteína plasmática total. El sistema vascular de un adulto medio contiene por tanto alrededor de 150 g
de albúmina. La HSA es responsable de más del 80% de la presión osmótica coloidal de la sangre humana. Más que cualquier otro
componente del plasma, la HSA es responsable de retener suficiente líquido dentro de los vasos sanguíneos. Se ha descrito
acertadamente como la proteína que hace que la sangre sea más espesa que el agua.
Las moléculas de albúmina también abandonan temporalmente la circulación y entran en el sistema linfático, que alberga una gran cantidad de esta
proteína (hasta 230 g en un adulto). También se encuentran presentes en la piel cantidades menores de albúmina.
Además de su función osmorreguladora, HSA cumple una función de transporte. Varios metabolitos viajan por todo el sistema
vascular unidos predominantemente a HSA. Estos incluyen ácidos grasos, aminoácidos, hormonas esteroides y metales pesados
(por ejemplo, cobre y zinc), así como muchos medicamentos.
HSA es un polipéptido de 585 aminoácidos y 65,5 kDa. Es una de las pocas proteínas plasmáticas que no está glicosilada. Una
característica destacada es la presencia de 17 enlaces disulfuro, que ayudan a estabilizar la estructura tridimensional de la molécula.
La HSA se sintetiza y secreta en el hígado, y su gen está presente en el cromosoma número 4 del ser humano.
Cuadro 12.7 Las principales proteínas plasmáticas de función conocida que se encuentran en la sangre humana.
Plasma normal Molecular

Proteína concentración (gl 1) masa (kDa) Función
Albúmina 35–45 66,5 Transporte de osmorregulación
Proteína de unión al retinol 0.03–0.06 21 Transporte de retinol
Globulina transportadora de tiroxina 0.01–0.02 58 Se une / transporta tiroxina

Transcortina 0.03–0.04 52 Transporte de cortisol y corticosterona Transporte
Ceruloplasmina 0,1-0,6 151 de cobre
Haptoglobina Se une y ayuda a conservar la hemoglobina.
tipo 1–1 1.0–2.2 100
tipo 2–1 1.6–3.0 200
tipo 2–2 1.2–2.6 400
Transferrina 2.0–3.2 76,5 Transporte de hierro
Hemopexina 0,5-1,0 57 Se une al hem destinado a su eliminación
β 2-microglobulina 0,002 11,8 Asociado con el antígeno de histocompatibilidad del antígeno
leucocitario humano
γ- Globulinas 7.0-15.0 150 Anticuerpos

Transtiretina 0,1-0,4 55 Se une a la tiroxina
ENZIMAS DE VALOR TERAPÉUTICO 355
HSA se usa terapéuticamente como una solución acuosa; está disponible en forma concentrada (15-25% de proteína) o como
solución isotónica (4-5% de proteína). En ambos casos, más del 95 por ciento de la proteína presente es albúmina. Puede prepararse
mediante fraccionamiento a partir de suero o plasma normal, o purificarse a partir de placentas. El material de origen se debe analizar
primero para detectar la presencia de patógenos indicadores. Después de la purificación, se agrega un estabilizador adecuado (a
menudo caprilato de sodio), pero sin conservante. Luego, la solución se esteriliza por filtración y se llena asépticamente en recipientes
estériles finales. La relativa estabilidad térmica de HSA permite una medida de tratamiento térmico posterior, lo que reduce aún más el
riesgo de transmisión accidental de patógenos viables (particularmente virus). Este tratamiento normalmente implica calentar el
producto a 60 C durante 10 h. Luego, normalmente se incuba a 30-32 C durante 14 días más y posteriormente se examina para
detectar cualquier signo de crecimiento microbiano.
La HSA se utiliza como expansor de plasma en el tratamiento de hemorragias, shock, quemaduras y edemas, además de administrarse a
algunos pacientes después de la cirugía. Para los adultos, se usa una infusión inicial que contiene al menos 25 g de albúmina. La demanda
mundial anual de HSA supera las 300 t, lo que representa un valor de mercado del orden de mil millones de dólares.
A pesar de la selección de la materia prima y del tratamiento térmico del producto final, la HSA derivada de sangre nativa a
veces (aunque rara vez) alberga patógenos. La tecnología de ADNr proporciona una forma de superar tales preocupaciones, y
el gen y el ADNc de HSA se han expresado en una amplia variedad de sistemas microbianos, incluidos E. coli, Bacillus subtilis,
S. cerevisiae, Pichia pastoris
y Aspergillus niger. ( Su falta de glicosilación hace posible la producción de HSA nativa en sistemas procarióticos y eucarióticos). Sin
embargo, el tamaño relativamente grande de HSA, así como la presencia de tantos enlaces disulfuro, pueden complicar la producción
recombinante de altos niveles de productos correctamente plegados en algunos sistemas de producción. . Sin embargo, el principal escollo al
reemplazar la HSA nativa por una versión recombinante es económico. A diferencia de la mayoría de los biofarmacéuticos, la HSA se puede
producir en grandes cantidades y de forma económica mediante la extracción directa de su fuente nativa. La HSA nativa se vende
actualmente a entre 2 y 3 dólares el gramo. Aunque se puede garantizar que está libre de patógenos de la sangre, los productos HSA
recombinantes tendrán dificultades para competir con este precio.
12.5 Enzimas de valor terapéutico
Las enzimas se utilizan para diversos fines terapéuticos, los más importantes de los cuales se enumeran en la tabla 12.8. Ya se han
analizado en detalle varios ejemplos específicos en este capítulo, incluidos el tPA, la uroquinasa y el factor IXa. Las enzimas
terapéuticas adicionales ahora se convierten en el foco del resto del capítulo. Aunque un número limitado de enzimas que degradan
polímeros (utilizadas como ayudas digestivas) se administran por vía oral, la mayoría de las enzimas se administran por vía
intravenosa.
12.5.1 Asparaginasa
La asparaginasa es una enzima capaz de catalizar la hidrólisis de L- asparagina, produciendo ácido aspártico y amoníaco (Figura
12.14). A finales de la década de 1970, los investigadores ilustraron que el suero transferido de conejillos de indias sanos a ratones
que padecían leucemia contenía algún agente capaz de inhibir la proliferación de las células leucémicas. Una búsqueda reveló que
el agente era asparaginasa.
Cuadro 12.8 Enzimas utilizadas terapéuticamente
Enzima Solicitud
Activador de plasminógeno tisular Agente trombolítico

Uroquinasa Agente trombolítico
Ancrod Anticoagulante
Factor IXa Hemofilia B
Asparaginasa Agente contra el cáncer
Nucleasa (DNasa) Fibrosis quística

Glucocerebrosidasa La enfermedad de Gaucher
α- Galactosidasa Enfermedad de Fabry
Urato oxidasa Hiperuricemia

Laronidasa Mucopolisacaridosis
Superóxido dismutasa (SOD) Toxicidad por oxígeno
Ácido α- glucosidasa Enfermedad de Pompe
α- L- Iduronidasa Mucopolisacaridosis I (MPS I)

NORTE- Acetilgalactosamina-4-sulfactasa Mucopolisacaridosis IV
Tripsina / papaína / colagenasa Agentes desbridantes / antiinflamatorios
Lactasa / pepsina / papaína / pancrelipasa Ayudas digestivas
La mayoría de las células de mamíferos sanas (no transformadas) son capaces de sintetizar directamente asparagina a partir de
glutamina (Figura 12.14). Por lo tanto, la asparagina generalmente se clasifica como un aminoácido no esencial (es decir, no la
necesitamos como componente esencial de nuestra dieta). Sin embargo, muchas células transformadas pierden la capacidad de
sintetizar asparagina por sí mismas. Para estos, la asparagina se convierte en un aminoácido esencial. En el caso de los ratones
leucémicos, la asparaginasa de cobayas privó a las células transformadas de este aminoácido hidrolizando la asparagina plasmática.
Este enfoque se ha aplicado con éxito para tratar algunas formas de leucemia humana. Por ejemplo, el PEG– L-
La asparaginasa mencionada anteriormente fue aprobada para el tratamiento de la leucemia linfoblástica aguda infantil
refractaria.
Generalmente, la concentración plasmática de asparagina es bastante baja (~ 40 µ mol l 1). Por lo tanto, la terapia
Las asparaginasas útiles en la industria deben mostrar una alta afinidad por el sustrato (es decir, baja K metro valores). Asparaginasa
de E. coli y Erwinia, así como de Pseudomonas y Acinetobacter, ha sido
estudiado en mayor detalle. Ha demostrado ser eficaz para inhibir el crecimiento de diversas leucemias y otras líneas celulares
transformadas. A menudo se prefieren las enzimas acopladas a PEG, ya que muestran una vida media plasmática prolongada.
Aunque la terapia con asparaginasa ha demostrado ser eficaz, se han asociado varios efectos secundarios con el
inicio de la terapia. Estos han incluido náuseas, vómitos y diarrea intensos, así como función hepática y renal
comprometida. Los efectos secundarios probablemente se deban a una deficiencia transitoria de asparaginasa en varios
tejidos. En circunstancias normales, los niveles de asparagina en plasma derivados de la dieta son suficientes para
satisfacer las demandas normales de los tejidos, y la vía biosintética de la asparagina celular permanece reprimida. Los
niveles reducidos de asparagina en plasma dan como resultado la inducción de la síntesis celular de asparagina. La
administración de asparaginasa en dosis altas reducirá inmediatamente los niveles plasmáticos de asparagina. Sin
embargo, el inicio subsiguiente de la síntesis de asparagina celular puede no ocurrir durante varias horas. Así,
ENZYMES OF THERAPEUTIC VALUE 357
COO-
COO-
NH +3 C H
NH +3 C H
CH 2 Asparaginase CH 2
C
COO-
H2 O NH +4
H2 N O
Asparagine (a) Aspartic acid
COO- COO- COO- COO-
NH +3 C H NH +3 C H Glutamine NH +3 C H NH +3 C H
amidotransferase
CH 2 + (CH 2)2 CH 2 + (CH 2)2
COO- C ATP H 2 O AMP C COO-

+ PPi
H2 N O H2 N O
Aspartic acid Glutamine Asparagine Glutamic acid
(b)
Figure 12.14 ( a) Hydrolytic reaction catalysed by L- asparaginase. (b) Reaction by which asparagine is synthesized in most mammalian
cells
12.5.2 DNase
Recombinant DNase preparations have been used in the treatment of cystic fibrosis since the end of 1993. This genetic
disorder is common, particularly in ethnic groups of northern European extraction, where the frequency of occurrence
can be as high as 1 in 2500 live births. A higher than average incidence has also been recorded in southern Europe, as
well as in some Jewish and African-American populations.
Varios síntomas clínicos caracterizan a la fibrosis quística. Entre ellos, predomina la presencia de un exceso de cloruro de sodio en el
sudor del paciente con fibrosis quística. De hecho, la medición de los niveles de cloruro en el sudor sigue siendo el principal indicador de
diagnóstico de esta enfermedad. Otra característica es la producción de un moco extremadamente viscoso, parecido a una crema, en varias
glándulas / órganos del cuerpo que compromete gravemente su función. Particularmente afectados son:
• Los pulmones, en los que el moco compromete la función respiratoria.
• El páncreas, en el que la mucosidad bloquea sus conductos en el 85% de los pacientes con fibrosis quística, lo que provoca insuficiencia
pancreática. Esto se caracteriza principalmente por la secreción de niveles muy reducidos de enzimas digestivas en el intestino delgado.
• El aparato reproductor, en el que los cambios pueden hacer que los machos, en particular, sean subfértiles o infértiles.
• El hígado, en el que los conductos biliares pueden obstruirse.
• El intestino delgado, que puede obstruirse por moco mezclado con digesta.
Estas características clínicas están dominadas por las asociadas con el tracto respiratorio. Los cambios fisiológicos inducidos en
el pulmón de los que padecen fibrosis quística hacen que este tejido sea susceptible a infecciones microbianas frecuentes y
recurrentes, particularmente por Pseudomonas especies. La presencia de microorganismos en el pulmón atrae elementos inmunes,
particularmente neutrófilos fagocíticos. Estos comienzan a ingerir los microorganismos y se liberan grandes cantidades de ADN de
los microbios y neutrófilos dañados en el sitio de infección. El ADN de alta masa molecular es en sí mismo extremadamente viscoso
y aumenta sustancialmente la viscosidad del moco respiratorio.
The genetic basis of this disease was underlined by the finding of a putative cystic fibrosis gene in 1989. Specific
mutations in this gene, which resides on human chromosome 7, were linked to the development of cystic fibrosis, and the
gene is expressed largely by cells present in sweat glands, the lung, pancreas, intestine and reproductive tract.
Some 70 per cent of all cystic fibrosis patients exhibit a specific three-base-pair deletion in the gene, which results in
the loss of a single amino acid (phenylalanine 508) from its final polypeptide product. Other cystic fibrosis patients
display various other mutations in the same gene.
The gene product is termed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), and it codes for a chloride
ion channel. It may also carry out additional (as yet undetermined) functions.
Although therapeutic approaches based upon gene therapy (Chapter 14) may well one day cure cystic fibrosis,
current therapeutic intervention focuses upon alleviating cystic fibrosis symptoms, particularly those relating to
respiratory function. Improved patient care has increased life expectancy of cystic fibrosis patients to well into their 30s.
The major elements of cystic fibrosis management include:
• chest percussion (physically pounding on the chest) in order to help dislodge respiratory tract mucus, rendering the
patient better able to expel it;
• antibiotic administration, to control respiratory and other infections;
• pancreatic enzyme replacement;
• attention to nutritional status.
La innovación relativamente reciente en el tratamiento de la fibrosis quística es el uso de DNasa para reducir la viscosidad del moco respiratorio.
Los científicos sabían desde la década de 1950 que las concentraciones de ADN libre en el pulmón de los pacientes con fibrosis quística eran
extremadamente altas (3-14 mg ml 1). Se dieron cuenta de que esto podría contribuir a la viscosidad del moco. Se llevaron a cabo experimentos
pioneros, que implicaban la inhalación de extractos de páncreas bovino enriquecidos con ADNasa, pero se cuestionó tanto la seguridad como la
eficacia del producto. La toxicidad observada probablemente se debió a la tripsina u otros contaminantes que dañaban el tejido pulmonar subyacente.
El sistema inmunológico del hospedador también probablemente neutralizaba gran parte de la ADNasa bovina.
El advenimiento de la ingeniería genética y las mejoras en la metodología cromatográfica facilitaron la producción de

preparaciones de ADNasa humana recombinante (rhDNasa) altamente purificadas. Inicial
in vitro Los estudios resultaron alentadores: la incubación de la enzima con esputo derivado de un quístico
paciente con fibrosis resultó en una reducción significativa de la viscosidad del esputo. Los ensayos clínicos también demostraron que el
producto es seguro y eficaz, y Genentech recibió la autorización de comercialización del producto en diciembre de 1993, bajo el nombre
comercial Pulmozyme. El costo anual del tratamiento varía, pero a menudo se sitúa entre 10 000 y 15 000 dólares EE.UU.
Pulmozyme is produced in an engineered CHO cell line harbouring a nucleotide sequence coding for native human
DNase. Subsequent to upstream processing, the protein is purified by tangential flow filtration followed by a combination of
chromatographic steps. The purified 260 amino acid glycoprotein displays amolecular mass of 37 kDa. It is formulated as an
aqueous solution at a concentration of 1.0 mg ml 1, with the addition of calcium chloride and sodium chloride as excipients.
The solution, which contains no preservative, displays a final pH of 6.3. It is administered directly into the lungs by inhalation
of an aerosol mist generated by a compressed-air-based nebulizer system.
12.5.3 Glucocerebrosidase
Glucocerebrosidase preparations are administered to relieve the symptoms of Gaucher’s disease, which affects some
5000 people worldwide. This is a lysosomal storage disease affecting lipid metabolism, specifically the degradation of
glucocerebrosides. Glucocerebrosides are a specific class of lipid, consisting of a molecule of sphingosine, a fatty acid
and a glucose molecule (Figure 12.15). They are found in many body tissues, particularly in the brain and other neural
tissue, in which they are often associated with the myelin sheath of nerves. Glucocerebrosides, however, are not
abundant structural components of membranes, but are mostly formed as intermediates in the synthesis and degradation
of more complex glycosphingolipids. Their degradation is undertaken by specific lysosomal enzymes, particularly in cells
of the reticuloendothelial system (i.e. phagocytes, which are spread throughout the body and which function as (a) a
defence against microbial infection and (b) removal of worn-out blood cells from the plasma; these phagocytes are
particularly prevalent in the spleen, bone marrow and liver).
Gaucher’s disease is an inborn error of metabolism characterized by lack of the enzyme glucocerebrosidase, with
consequent accumulation of glucocerebrosides, particularly in tissue-based macrophages. Clinical systems include
enlargement and compromised function of these macrophage-containing tissues, particularly the liver and spleen, as
well as damage to long bones and, sometimes, mental retardation. Administration of exogenous glucocerebrosidase as
enzyme replacement therapy has been shown to reduce the main symptoms of this disease. The enzyme is normally
administered by slow i.v. infusion (over a period of 2 h) once every 2 weeks.
CH 2 OH
O
CH 3 (CH 2)12 CH CH CH CH CH 2 O
OH NH HO
OH
C
OH
O
R
Figure 12.15 Generalized structure of a glucocerebroside

360 CH12 RECOMBINANT BLOOD PRODUCTS AND THERAPEUTIC ENZYMES
Genzyme Corporation obtuvo la autorización de comercialización en 1991 para una preparación de glucocerebrosidasa que se
utilizaría para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher. Este producto Genzyme (nombre comercial Ceredase) se extrajo de
placentas (placentas) obtenidas de las salas de maternidad. La enzima muestra una masa molecular de 65 kDa y cuatro de sus cinco
sitios potenciales de glicosilación están glicosilados. Se había estimado que un suministro de enzima para un año para un paciente
promedio requería la extracción de 27 000 placentas, lo que hacía que el tratamiento fuera extremadamente costoso. Luego, Genzyme
obtuvo la aprobación regulatoria para una versión recombinante de glucocerebrosidasa producida en células CHO. Este producto
(nombre comercial Cerezyme) ha estado en el mercado desde 1994, y se estima que el mercado mundial total de glucocerebrosidasa
está en la región de 200 millones de dólares.
Cerezyme is produced in a CHO cell line harbouring the cDNA coding for human β- glucocerebrosidase. The purified
product is presented as a freeze-dried powder, which also contains mannitol, sodium citrate, citric acid and polysorbate
80 as excipients. It exhibits a shelf life of 2 years when stored at 2–8 C.
An integral part of the downstream processing process entails the modification of cerezyme’s oligosaccharide components.
The native enzyme’s sugar side-chains are complex and, for themost part, are capped with a terminal sialic acid or galactose
residue. Animal studies indicate that in excess of 95 per cent of injected glucocerebrosidase is removed from the circulation by
the liver via binding to hepatocyte surface lectins. As such, the intact enzyme is not available for uptake by the affected cell type,
i.e. the tissue macrophages. These macrophages display high levels of surface mannose receptors. Treatment of native
glucocerebrosidase with exoglycosidases, by removing terminal sugar residues, can expose mannose residues present in their
sugar side-chains, resulting in their binding to and uptake by the macrophages. In this way, the ‘mannose-engineered’ enzyme is
selectively targeted to the affected cells.
12.5.4 α- Galactosidasa, urato oxidasa y laronidasa
Recombinante α- La galactosidasa, la urato oxidasa y la laronidasa representan productos biofarmacéuticos adicionales aprobados recientemente para
uso médico general. α- La galactosidasa está aprobada para la terapia de reemplazo enzimático a largo plazo en pacientes con enfermedad de Fabry.
Como la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de Fabry es una enfermedad genética del metabolismo de los lípidos. Las víctimas muestran poco o
ningún liposomal α- actividad galactosidasa-A. Esto da como resultado la acumulación progresiva de glucoesfingolípidos en varios tipos de células
corporales. Las manifestaciones clínicas resultantes son complejas y afectan el sistema nervioso, las células endoteliales vasculares y los órganos
principales. Aunque la afección es poco común (500 a 1000 pacientes en la UE), los pacientes que no reciben tratamiento suelen morir entre los 40 y
los 50 años.
Dos recombinantes α- galactosidases are now on the market (Fabrazyme, produced by Genzyme and Replagal,
produced by TKT Europe). Fabrazyme is produced in an engineered CHO cell line, and downstream processing entails a
combination of five chromatographic purification steps followed by concentration and diafiltration. Excipients added
include mannitol and sodium phosphate buffering agents, and the final product is freeze-dried after filling into glass vials.
Replagal is produced in a continuous human cell line and is also purified by a combination of five chromatographic
purification steps, although it is marketed as a liquid solution.
Human α- galactosidase is a 100 kDa homodimeric glycoprotein. Each 398 amino acid monomer displays a
molecular mass of 45.3 kDa (excluding the glycocomponent) and is glycosylated at three positions (asparagines 108,
161 and 184). After administration (usually every second week by a 40 min infusion), the enzyme is taken up by
various body cell types and directed to the lysosomes. This cellular uptake and delivery process appear to be
mediated by mannose-
6-phosphate residues present in the oligosaccharide side-chains of the enzyme. Mannose-6-phosphate receptors are
found on the surfaces of various cell types, and also intracellularly, associated with the golgi complex, which then directs
the enzyme to the lysosomes.
La enzima urato oxidasa también ha encontrado una aplicación médica para el tratamiento de la hiperuricemia aguda (niveles
elevados de ácido úrico en plasma), asociada con varios tumores, particularmente durante su tratamiento con quimioterapia.
El ácido úrico es el producto final del metabolismo de las purinas en humanos, otros primates, aves y reptiles. Se
produce en el hígado por oxidación de xantina e hipoxantina (Figura 12.16),
Nucleótidos de purina
GMP / AMP
Ribosa
Pi
O O
norte norte
H H
norte
Xantina oxidasa norte
OH
norte norte
HO norte HO norte
H H
Ácido úrico
Xantina
(Excretado por muchos primates,

aves, reptiles e insectos)
Urate
oxidasa
O
O H
norte
NUEVA HAMPSHIRE 2
C
C
NUEVA HAMPSHIRE 2 NUEVA HAMPSHIRE 2 Alantoinasa
C O
O C
C
Urea norte H norte
H H
Alantoína
(Excretado por anfibios
y algo de pescado)
(Excretado por la mayoría de los mamíferos)
NH +4 (Excretado por marinos

invertebrados)
ion amonio
Figura 12.16 Resumen general del metabolismo de las purinas

and is excreted via the kidneys. Owing to its relatively low solubility, an increase in serum uric acid levels often triggers
the formation and precipitation of uric acid crystals, typically resulting in conditions such as gout or urate stones in the
urinary tract. Significantly elevated serum uric acid concentrations can also be associated with rapidly proliferating
cancers or, in particular, with onset of chemotherapy. In the former instance, rapid cellular turnover results in increased
rates of nucleic acid catabolism and, hence, uric acid production. In the latter case, chemotheraphy-induced cellular
lysis results in the release of intracellular contents, including free purines and purine-containing nucleic acids, into the
bloodstream. The increased associated purine metabolism then triggers hyperuricaemia. The elevated uric acid
concentrations often trigger crystal formation in the renal tubules, and hence renal failure.
Purine metabolism in some mammals is characterized by a further oxidation of uric acid to allantoin by the enzyme
urate oxidase. Allantoin is significantly more water soluble than uric acid and is also freely excreted via the renal route.
Administration of urate oxidase to humans suffering from hyperuricaemia results in the reduction of serum uric acid
levels through its conversion to allantoin. Urate oxidase purified directly
Box 12.2
Product case study: Aldurazyme
Aldurazyme (tradename, also known as laronidase) is a recombinant version of one polymorphic variant of the human
enzyme α- L- iduronidase. It was approved for general medical use in the USA in 2003 and is indicated for the treatment
of patients with certain forms of the rare inherited disease MPS I. MPS I is caused by a deficiency of a lysosomal α- L- iduronidase,
which normally catalyses the hydrolysis of terminal α- L- iduronic acid residues from the glycosaminoglycans dermatan
sulfate and heparin sulfate. The deficiency results in accumulation of the glycosaminoglycans throughout the body,
causing widespread cell and tissue dysfunction.
The 628 amino acid, 83 kDa monomeric glycosylated enzyme containing six N-linked oligosaccharide
side-chains is produced in an engineered CHO cell line. After cell culture it is purified by a combination of dye
affinity, metal chelate and hydrophobic interaction chromatography. The final product is formulated as a liquid
concentrate containing laronidase, as well as sodium phosphate buffer, sodium chloride and polysorbate 80. It is
filled in 5 ml singleuse vials and is usually administered intravenously by infusion (0.58 mg per kilogram body
weight) over 3–4 h, once weekly. Fortuitously, two of the enzyme’s oligosaccharide side-chains terminate in
mannose-6-phosphate, facilitating product cellular uptake via the mannose-6phosphate cell surface receptor.
Clinical evaluation entailed administration to 45 MPS I patients in a randomized, placebocontrolled clinical trial.
The primary efficacy outcomes assessed were forced vital capacity and distance walked in 6 min, both of which were
statistically higher relative to placebo after 26 weeks of treatment. The most serious adverse reaction noted was that
of a severe anaphylactic reaction in one patient. The most common adverse effects reported were respiratory tract
infection, rash and injection-site reactions. The product is manufactured by BioMarin Inc. and is distributed by
Genzyme Corporation.
from cultures of the fungus Aspergillus flavus has been used to treat this condition for a number of years. More recently, a
recombinant form of the fungal enzyme (tradename Fasturtec) has gained regulatory approval in the EU. Produced in an
engineered strain of S. cerevisiae, the enzyme is a tetramer composed of four identical polypeptide subunits. Each subunit
contains 301 amino acids, displays a molecular mass of 34 kDa and is N-terminal acetylated.
Laronidase is yet an additional recombinant enzyme now approved for general medical use. The product, used to treat
mucopolysaccharidosis, is overviewed in Box 12.2.
12.5.5 Superoxide dismutase
Under normal circumstances in aerobic metabolism, oxygen is reduced by four electrons, forming
H 2 O. Although this usually occurs uneventfully, incomplete reduction will result in the generation of oxygen radicals and
other reactive species. These are: the superoxide radical O 2 , hydrogen
peroxide (H 2 O 2) and the hydroxyl radical (OH ). The superoxide and hydroxyl radicals are particularly reactive and can
attack membrane components, nucleic acids and other cellular macromol-
ecules, leading to their destruction/modification. O and OH radicals,
2 for example, are believed to be amongst the most
mutagenic substances generated by ionizing radiation.
Oxygen-utilizing organisms have generally evolved specific enzyme-mediated systems that serve to protect the cell
from such reactive species. These enzymes include SOD and catalase or glutathione peroxidase (GSH-px), which
catalyse the following reactions:
O •2 O •2 2H • SOD →•• H 2 O 2 O2
• •
atala se o r GSH - px
HO
2 2 H 2 O 2• c • • •→ 2H 2 O O 2
In general, all aerobic organisms harbour these oxygen-defence systems. At least three types of SOD have been
identified: a cytosolic eukaryotic dismutase, generally a 31 kDa dimer, containing both copper and zinc; a 75 kDa
mithocondrial form and a 40 kDa bacterial form, each of which contains two manganese atoms. There is also an
iron-containing form found in some bacteria, blue–green algae and many plants. The metal ions play a direct role in the
catalytic conversion, serving as transient acceptors/donors of electrons.
In humans, increased generation of O 2 and/or reduced SOD levels have been implicated in a wide range of
pathological conditions, including ageing, asthma, accelerated tumour growth, neu-
rodegenerative diseases and inflammatory tissue necrosis. Furthermore, administration of SOD
Se ha descubierto que reduce el daño tisular debido a la irradiación u otras condiciones que generan O 2.
Mayor producción de SOD en Drosophila melanogaster conduce a una mayor tolerancia al oxígeno y,
curiosamente, mayor esperanza de vida.
La SOD aislada de hígado o eritrocitos bovinos se ha utilizado médicamente como agente antiinflamatorio. La SOD humana
también se ha expresado en varios sistemas recombinantes y actualmente se está evaluando para evaluar su capacidad para prevenir
el daño tisular inducido por la exposición a sangre excesivamente rica en oxígeno.
12.5.6 Agentes desbridantes
Debridement refers to the process of cleaning a wound by removal of foreignmaterial and dead tissue. Cleansing of the wound
facilitates rapid healing and minimizes the risk of infection due to the presence of bacteria at the wound surface. The formation
of a clot, followed by a scab, on a wound surface can trap bacteria, which then multiply (usually evidenced by the production of
pus), slowing the healing process. Although debridement may be undertaken by physical means (e.g. cutting away dead
tissue, washing/cleaning the wound), proteolytic enzymes are also often used to facilitate this process.
El valor de las proteasas en la limpieza de heridas de tejidos se ha apreciado durante varios cientos de años. En ocasiones, las
heridas se limpiaban en el pasado mediante la aplicación de saliva de gusanos que contenía proteasa. Hoy en día, esto se consigue
normalmente de forma más aceptable mediante la aplicación tópica de la enzima a la superficie de la herida. En algunos casos, la
enzima se formula en una crema de base acuosa y en otros se impregna en vendajes especiales. A este respecto, se han utilizado
tripsina, papaína, colagenasa y diversas enzimas microbianas.
Trypsin is a 24 kDa proteolytic enzyme synthesized by the mammalian pancreas in an inactive zymogen form:
trypsinogen. Upon its release into the small intestine, it is proteolytically converted into trypsin by an enteropeptidase.
Active trypsin plays a digestive role, hydrolysing peptide bonds in which the carboxyl group has been contributed by an
arginine or lysine. Trypsin used medically is generally obtained by the enzymatic activation of trypsinogen, extracted
from the pancreatic tissue of slaughterhouse animals.
Papain is a cysteine protease isolated from the latex of the immature fruit and leaves of the plant
Carica papaya. Consiste en un único polipéptido de 23,4 kDa y 212 aminoácidos, y la enzima purificada exhibe una amplia actividad
proteolítica. Aunque se puede usar como agente desbridante, también se usa para una variedad de otros procesos industriales, incluido el
ablandamiento de la carne y para la clarificación de bebidas.
La colagenasa es una proteasa que puede utilizar colágeno como sustrato. Aunque puede producirse mediante cultivo de células
animales, ciertos microorganismos también producen esta enzima, sobre todo ciertas especies de Clostridios ( la capacidad de estos
patógenos para producir colagenasa facilita su rápida diseminación por todo el cuerpo). La colagenasa utilizada terapéuticamente se
obtiene generalmente a partir de sobrenadantes de fermentación celular de Clostridium histolyticum. Tales preparaciones se aplican
tópicamente para promover el desbridamiento de heridas, úlceras cutáneas y quemaduras.
Chymotrypsin has also been utilized to promote debridement, as well as the reduction of soft tissue inflammation. It is
also used in some opthalmic procedures, particularly in facilitating cataract extraction. It is prepared by activation of its
zymogen, chymotrypsinogen, which is extracted from bovine pancreatic tissue.
Yet another proteolytic preparation used for debridement of wounds and skin ulcers consists of proteolytic enzymes
derived from B. subtilis. The preparation displays broad proteolytic activity and is usually applied several times daily to the
wound surface.
12.5.7 Digestive aids
Se pueden utilizar varias enzimas como ayudas digestivas (cuadro 12.9). En algunos casos, se utiliza una sola actividad enzimática,
mientras que otras preparaciones contienen múltiples actividades enzimáticas. Estas preparaciones de enzimas pueden usarse para
complementar la actividad digestiva normal o para conferir a un individuo una nueva capacidad digestiva.
Cuadro 12.9 Enzimas que se utilizan como ayudas digestivas.
Enzima Solicitud
α- Amilasa Ayuda en la digestión del almidón.
Celulasa Favorece la digestión parcial de la celulosa Favorece la
α- Galactosidasa degradación de los factores de flatulencia Contrarresta la
Lactasa intolerancia a la lactosa
Papaína Pepsina Bromelina Degradación mejorada de proteínas dietéticas

Pancreatina Mayor degradación de carbohidratos, grasas y proteínas de la dieta
El uso de enzimas como ayudas digestivas solo se aplica en circunstancias médicas específicas. Algunas condiciones médicas (por ejemplo,
fibrosis quística) pueden resultar en una función digestiva comprometida debido a una producción / secreción insuficiente de enzimas digestivas
endógenas. Las preparaciones de enzimas digestivas se formulan a menudo en forma de polvo (particularmente tabletas) y se recomienda
tomarlas por vía oral inmediatamente antes o durante las comidas. Como el producto nunca entra en el torrente sanguíneo, la pureza del producto
no necesita ser tan estricta como la de las enzimas (u otras proteínas) administradas por vía intravenosa. La mayoría de las enzimas digestivas
son, en el mejor de los casos, preparaciones semipuras.
In some instances there is a possibility that the efficacy of these preparations may be compromised by conditions
associated with the digestive tract. Most function at pH values approaching neutrality. They would thus display activity
possibly in saliva and particularly in the small intestine. However, the acidic conditions of the stomach (where the pH can
be below 1.5) may denature some of these enzymes. Furthermore, the ingested enzymes would also be exposed to
endogenous proteolytic activities associated with the stomach and small intestine. Some of these difficulties, however,
may be at least partially overcome by formulating the product as a tablet coated with an acid-resistant film to protect the
enzyme as it passes through the stomach.
La pancreatina es un extracto pancreático que generalmente se obtiene del páncreas de animales de matadero. Contiene una
mezcla de enzimas, principalmente amilasa, proteasa y lipasa, por lo que presenta una amplia capacidad digestiva. Se administra por
vía oral principalmente para el tratamiento de la insuficiencia pancreática causada por fibrosis quística o pancreatitis. Como es sensible
al ácido del estómago, debe administrarse en dosis elevadas o, más habitualmente, como gránulos o cápsulas con recubrimiento
entérico que pueden tomarse directamente o rociarse sobre el alimento antes de su ingestión. Actividades digestivas individuales, como
papaína, pepsina o bromelina (proteasas), o α- A veces se usa amilasa en lugar de pancreatina.
La celulasa no se produce en el sistema digestivo humano. Preparaciones de enzimas celulolíticas obtenidas de A. niger u
otras fuentes de hongos están disponibles, y se cree que su ingestión puede mejorar la digestión general, particularmente en
relación con dietas ricas en fibra.
α- Los galactósidos son oligosacáridos presentes en la materia vegetal, particularmente en los frijoles. Normalmente no se
degradan en el tracto digestivo humano debido a la ausencia de una enzima digestiva endógena apropiada (es decir, una α- galactosidasa).
Sin embargo, al entrar en el intestino grueso, estos oligosacáridos son degradados por microbios. α 1-6 galactosidasas,
estimulando así la fermentación microbiana. Los productos finales de la fermentación incluyen ácidos grasos volátiles, dióxido de
carbono, metano e hidrógeno, que conducen a la flatulencia. Esto se puede evitar minimizando la ingesta dietética de alimentos
que contengan α- galactósidos. Otro enfoque implica la ingestión simultánea de tabletas que contienen α- galactosidase activity. If
these ‘flatulence factors’ are degraded before or upon reaching the small intestine, then the monosaccharides released will be
absorbed and, hence, will be subsequently unavailable to promote undesirable microbial fermentations in the large intestine.
366 CH12 RECOMBINANT BLOOD PRODUCTS AND THERAPEUTIC ENZYMES
CH 2 OH
CH 2 OH CH 2 OH
O
O CH 2 OH
HO O
OH HO OH O
Lactase
OH
O
+ OH
OH OH
H2 O
HO OH
OH
OH OH
OH
Lactose Galactose Glucose
(O- β- D-galactopyranosyl (1 → 4) β- D-glucopyranose) ( β- D-Galactopyranose) ( β- D-glucopyranose)
Figure 12.17 Hydrolysis of lactose by lactase ( β- galactosidase)
Lactose, the major disaccharide present in milk, is composed of a molecule of glucose linked via a glycosidic bond to a
molecule of galactose. The digestive tract of young (suckling) animals generally produces significant quantities of the
enzyme β- galactosidase (lactase), which catalyses the hydrolysis of lactose, releasing the constituent monosaccharides
(Figure 12.17). This is a prerequisite to their subsequent absorption.
The digestive tracts of many adult human populations, however, produce little or no lactase, rendering these
individuals lactose intolerant. This is particularly common in Asia, Africa, Latin America and the Middle East. It
severely curtails the ability of these people to drink milk without feeling ill. In the absence of sufficient endogenous
digestive lactase activity, milk lactose is not absorbed and, thus, serves as a carbon source for intestinal
microorganisms. The resultant
production of lactic acid, CO 2 and other gases causes gastrointestinal irritation and diarrhoea. A number of approaches
have been adopted in an effort to circumvent this problem. Most involve the
application of microbial lactase enzymes. In some instances, the enzyme has been immobilized in a column format, such
that passage of milk through the column results in lactose hydrolysis. Free lactase has also been added to milk
immediately prior to its bottling, so that lactose hydrolysis can slowly occur prior to its eventual consumption (i.e. during
transport and storage).
Fungal and other microbial lactase preparations have also been formulated into tablet form, or sold in powder form.
These can be ingested immediately prior to the consumption of milk or lactose-containing milk products, or can be
sprinkled over the food before eating it. Such lactose preparations are available in supermarkets in many parts of the
world.
Further reading
Books
Becker, R. 2000. Thrombolytic and Antithrombolytic Therapy. Oxford University Press. Goodnight, S. 2001. Disorders of
Hemostasis and Thrombosis. McGraw Hill. Kirchmaier, C. 1991. New Aspects on Hirudin. Karger. Lauwers, A. and
Scharpe, S. (eds). 1997. Pharmaceutical Enzymes. Marcel Dekker. McGrath, B. and Walsh, G (eds). 2006. Directory of
Therapeutic Enzymes. Taylor and Francis. Poller, H. 1996. Oral Anticoagulants. Arnold.

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12

Hemoderivados recombinantes y enzimas

Biotecnología farmacéutica: conceptos y aplicaciones Gary Walsh

12.2.1 La vía de la coagulación

demostró más tarde que era el factor Va

Factor Camino en el que

V Proacelerina Ambos Proteína accesoria, mejora la tasa de activación de X Precursor de

Activar la glicoproteína de superficie

• factor XI, formando XIa.

12.2.2 Pasos terminales de la vía de la coagulación

12.2.3 Trastornos de la coagulación

Producto (nombre comercial) Empresa Indicación

Advate (rhFactor VIII) Baxter Hemofilia A

12.2.4 Factor VIII y hemofilia

como se analiza a continuación.

Celulas del higado Células endoteliales

vWF Rápida degradación

(un) (segundo) (C)

de hemorragia frecuentes, graves y, a menudo, espontáneos.

12.2.5 Producción de factor VIII

Complejo de factor VIII

Factores sanguíneos adicionales

• Administración de factor VIIa, como se comenta a continuación.

• Administración de factor VIII, con administración concurrente de agentes inmunosupresores.

• proteínas de la célula huésped;

• medio de cultivo de células animales;

• Anticuerpo filtrado de la columna de inmunoafinidad.

12.2.6 Factores IX, IIVa y XIII

Estudio de caso de producto: BeneFix

hasta la fecha, no se ha comercializado ninguna versión recombinante del producto.

Cuadro 12.3 Anticoagulantes que se utilizan terapéuticamente o muestran potencial terapéutico.

Anticoagulante un Estructura Fuente Masa molecular (Da)

Heparina Glicosaminoglicano Pulmón de res, mucosa gástrica de cerdo 3000–40 000

enumeran en la tabla 12.3.

• es un potente inductor de la activación y agregación plaquetarias;

• funciona como quimioatrayente para monocitos y neutrófilos;

• estimula el transporte endotelial.

Polipéptido Masa molecular (Da) Productor Efecto hemostático interrumpido

Hirudin 7 000 Hirudo medicinalis Se une e inhibe la trombina Se une a

Decorsin 4 400 Macrobdella decora Inhibe la adhesión plaquetaria

• actúa directamente sobre la trombina;

• es menos probable que muchos otros anticoagulantes inducir hemorragia involuntaria;

Adición de excipientes Liofilización de

Rebaño de cabras transgénicas Ordeño (filtración usando ≈ 500 kDa

Interacción hidrofóbica Intercambio de aniones Afinidad de la heparina

cromatografia cromatografia cromatografia

12.4 Agentes trombolíticos

Cuadro 12.5 Agentes trombolíticos aprobados para uso médico general

Activasa (rh-tPA) Genentech

Retavase (rtPA; ver Ecokinase) Boehringer Manheim / Centocor

un r: recombinante; rh: humano recombinante.

12.4.1 Activador de plasminógeno tisular

dominio tPA Función

proteasa (dominio P) proteolítica específica del plasminógeno Se une a los receptores

12.4.2 Activador del plasminógeno tisular de primera generación

de una hemorragia grave.

12.4.3 Activador de plasminógeno tisular diseñado

Cromatografía de afinidad Solubilización de

Intercambio iónico Eliminación de baja

• oclusiones arteriales (obstrucción de una arteria);

• infarto agudo del miocardio.

Plasmina libre Plasminógeno libre

• eliminación de partículas en la fosa nasal / nasofaringe;