UNIVERSIDAD COLEGIO MAYOR DE CUNDINAMARCA

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

INMUNOLOGÍA GENERAL- LABORATORIO
PRÁCTICA N°6-FAGOCITOSIS

1. OBJETIVO GENERAL
Conocer el proceso de fagocitosis, realizado por los PMNs, con el fin de evaluar la inmunidad
celular inespecífica.

2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
 Determinar las etapas de la micro técnica de fagocitosis utilizando Cándida albicans.
 Aprender a diferenciar cándidas fagocitadas y muertas de las fagocitadas vivas.
 Interpretar los reportes tras el desarrollo de la prueba de fagocitosis in vitro.
 Identificar la activación y función del complemento durante el proceso de fagocitosis.

3. GLOSARIO
 COMPLEMENTO
Sistema amplificador de la respuesta humoral, conformado por 30 proteínas del suero, se
activan una a una de modo regulado como una cascada enzimática, facilitando la
eliminación del antígeno y generando una respuesta inflamatoria.
La mayoría de sus componentes se sintetizan en el hígado, excepto C1q, que es sintetizado
por las células epiteliales y el factor D por el adipocito.

 FAGOCITOSIS
Del griego phagein, "comer" y kytos, 'célula', es un proceso de endocitosis en el cual las
células como los fagocitos y protistas rodean con su propia membrana citoplasmática
partículas sólidas y las introducen al interior celular y por medio de enzimas las degradan.

 MACRÓFAGO
Fagocito, responsable de detectar, engullir y destruir patógenos y células apoptóticas. Se
producen como monocitos, que se convierte en macrófagos cuando salen de la sangre.

 CÁNDIDA ALBICANS
Hongo di mórfico perteneciente al Phylum Ascomycota, presenta pseudohifas, hifas y
blastoconidias, coloniza la vagina, tractos digestivo y respiratorio humanos, puede infectar
piel, uñas y membranas mucosas, se disemina en pacientes inmunodeprimidos.

MARTHA PATRICIA ISAZA CORTES

4. MARCO TEÓRICO
4.1 FAGOCITOSIS
Proceso que consiste en introducir patógenos, cuerpos extraños o agresores en el citoplasma de
células polimorfo nucleares (PMN), eosinófilos (fagocitan complejos inmunes) y basófilos que
fagocitan partículas víricas.
En circulación duran de 6-8 horas, se acercan al endotelio atraídos por las selectinas, se fijan por
interacción integrina-ICAM y se internan al tejido.
Durante el proceso de maduración en la medula ósea, hay síntesis de proteínas de acción enzimática
y proteolítica que son empacadas en lisosomas, en el citoplasma se organizan grandes cantidades
de micro túbulos que son necesarios para la activación del rodaje (ROLLING), la internalización de
las partículas al macrófago y proceso de fagocitosis, en los fagosomas hay gránulos con alto
contenido de glucógeno utilizada en actividad energética.

4.2 PROTEÍNAS CONTENIDAS EN LOS PMN

Las proteínas de los PMN que están contenidas en lisosomas se agrupan en tres tipos de gránulos:
 GRANULOS PRIMARIOS:
Proteínas inductoras de la permeabilidad de la membrana bacteriana (GRAM-)
Mieloperoxidasa
Proteínas neutras
 Elastasas
 Captesina G y D
Hidroxilasas acidas
 Fosfatasa acida
 Alfa monoxidasa
 Beta glucoronidasa
Proteínas catiónicas
Defensinas; HNP1, HNP2, HNP3

 GRANULOS SECUNDARIOS
Lisozima
Fosfatasa alcalina
Colagenasa
Lactoferrinas
Proteína ligadora de la vitamina B12

 GRANULOS TERCIARIOS
Gelatinasa
Colagenasa
Molécula de adhesión.

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4.3 MONONUCLEAR (MACROFAGOS)
Originado en la medula ósea por inducción de las proteínas GM-CSF y M-CSF, estos factores son
producidos por la célula madre y por linfocitos T activados.
Terminando el proceso inflamatorio, la producción de mononucleares se controla por una
molécula producida por los neutrófilos, llamada factor inhibidor de la actividad de colonias (CIF).
MONOCITO: Tiene la capacidad de dividirse, multiplicarse y transmitir a su descendencia la
función que venían realizando. En tejidos se transforman en células fagocitarias fijas y hacen
parte del sistema Retículo Endotelial (Especie de retículo o malla alrededor de los vasos), de
acuerdo al sitio tiene funciones diferentes y procesos metabólicos diferentes.
En estado normal, sin inflamación, los macrófagos se fijan a los tejidos por fibras de colágeno y
proteoglicanos, en procesos inflamatorios se fijan a partículas de fibrina.

4.4 DIFERENTES TIPOS DE MACRÓFAGOS

Macrófagos peritoneales: Tienen metabolismo anaerobio.
Células de Kupffer: Se fijan en células endoteliales hepáticas y del sistema porta, elimina
partículas provenientes del tracto gastrointestinal.
Macrófagos alveolares: Tienen metabolismo aerobio, fagocitan partículas provenientes del
Sistema Respiratorio.
Microglia: Producen una barrera alrededor de los vasos sanguíneos del S.N.C.
Osteoclastos: Fagocitan hueso dentro del proceso normal del reciclaje óseo.
Células Sinoviales tipo A y células gigantes: Son células multinucleadas (5 – 30 núcleos) que se
forman por fusión de macrófagos.

4.5 FUNCIONES DE LOS MACRÓFAGOS

 Cito tóxica: destruir células tumorales por citotoxicidad mediada por anticuerpos.
 Función secretora produce más de cien sustancias diferentes, e interviene en el
metabolismo de los lípidos.
 Función de regulación homeostática, el Sistema Retículo Endotelial (S.R.E), destruye 20 ml
de eritrocitos cada 24 horas, diariamente remueven surfactante de los alveolos.
 Remodelación de tejidos, destruyen, remueven y reemplazan tejidos envejecidos.
 Después de fagocitar regenerar su componente enzimático y vuelven a fagocitar.
 Conserva la capacidad de reproducirse en los tejidos.
 Puede dividir el núcleo y no el citoplasma y producir células gigantes.
 Por procesos metabólicos bajo la acción de citosinas, INF Gamma produce óxido Nítrico para
destruir mycobacterium.

4.6 PROCESO DE LA FAGOCITOSIS

La fagocitosis por PMN se puede dividir en las siguientes etapas:
1. QUIMIOTÁXIS: Atracción de PMN y macrófagos al sitio de la lesión o agresión.

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2. RESPUESTA QUIMIO TÁCTICA: La selectinas inducen en los leucocitos el rodaje sobre los
endotelios por atracción eléctrica. La interacción integrina-ICAM actúa una adenilciclasa que a
su vez activa el AMPc, y este activa la condensación submembrana de moléculas de actina, la
interacción actina-miosina y polimerización de tubulina. El resultado es un movimiento
unidireccional a través del endotelio hacia el epicentro de la lesión en el tejido.
3. RECONOCIMIENTO DEL ANTÍGENO: Hay más de 40 receptores para reconocer moléculas del
complemento, Inmunoglobulinas y lectinas. A estos mecanismos de acercamiento se le llama
OPSONIZACIÓN.
4. INGESTIÓN: Después del contacto por medio de receptores, se produce la adherencia en la
cual la célula fagocítica rodea por completo al germen o célula, quedando en una vacuola
interna, la enzima NAD pasa de la membrana a la vacuola, se reduce a NADH y activa el proceso
de destrucción del germen.
5. DE GRANULACIÓN: Los lisosomas del fagocito se adhieren al fagosoma y vierten los gránulos
al interior del fagosoma. Esta fusión de membrana está mediada por el calcio.
6. MUERTE Y DIGESTIÓN DEL ANTÍGENO: mecanismos como: O2 dependientes e
independientes y el óxido nítrico, producen decarboxilación de aminoácidos: acción Bactericida.

FIIGURA: https://thumbs.dreamstime.com/x/fagocitosis-79205517.jpg

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 FIGURA: http://www.biodic.net/blog/wp-content/uploads/2015/06/Fagocitosis.gif

4.7 MECANISMOS DE EVACIÓN DE LA FAGOCITOSIS

Muchos microorganismos evaden el proceso de destrucción por los macrófagos:
 Impiden ser fagocitados
 Inactivan NAD
 Bloquean la granulación de lisosomas
 Desactivan radicales del O2

5. TÉCNICA DE LA FAGOCITOSIS
FUNDAMENTO
La función primaria del neutrófilo en la resistencia del individuo es la muerte intracelular de los
microorganismos, esta etapa depende del armamento antimicrobiano del neutrófilo,
compuesto por pH ácido del fago lisosoma, lisozima, lactoferrinas, defensina, catepsina G,
mieloperoxidasa, halogenacion, singlete de oxígeno, obviamente un defecto en la muerte
celular podría ser el resultado de la combinación de estos sistemas.

6.1 MATERIALES
 Laminillas, láminas y Cámara de Neubauer
 Aros de plastilina.
 Pipeta Pasteur.
 Incubadora a 37º C.
 Cámara húmeda.
 Microscopio.

6.2 REACTIVOS
 Solución salina 0.85%.
 Pool de suero humado fresco.
 Azul tripán al 2% en solución salina.

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 Suspensión de cándida: 18 horas antes, cultivar en medio de Sabouraud una cepa de
Cándida albicans a temperatura ambiente, tomar una porción del cultivo y re suspenderla
en solución salina, 0.15 ml y lavar 3 veces con solución salina.
 Azul de Metileno 0.03%. Agua destilada.

6.3 PROCEDIMIENTO METODO EN LÁMINA.

1. Obtenga 5 gotas de sangre (0.15 ml de sangre) directamente de la jeringa y déjala caer sobre
el aro de plastilina colocado en la lámina.
2. Deje la placa 40 minutos en cámara húmeda a 37º C, permitiendo la adherencia de los
neutrófilos a la lámina o 60 minutos a temperatura ambiente.
3. Con S.S a 37º C, lave cuidadosamente la lámina 3 a 5 veces para retirar el coágulo de sangre.
4. Añada 50 ul de la solución de Cándida fresca en solución salina (2 x 10 3 Cándidas por ml) y
20 del pool de suero humano fresco.
5. Deje la lámina 20 minutos a 37º C en cámara húmeda.
6. Añada 50 ul de Azul de metileno al 0,1% y déjelo actuar por 10 minutos de incubación.
7. Retire el aro de plastilina y coloque una laminilla, coloque aceite de inmersión.
8. Observe al microscopio en objetivo de 100x.
9. Realice los respectivos recuentos.

6.4 RESULTADOS
 Determine el porcentaje de células fagocitadas: contando 100 PMN vivos y diferenciando
cuales han fagocitado Cándida (cifra mayor de 75%).
 Índice de Cándida fagocitada por PMN, observar en cada célula cuantas cándidas han sido
fagocitadas (cifra normal 2,7 promedio de Cándida fagocitada por célula).
 Índice de muerte intracelular de las Cándidas fagocitadas, mirar cuantas hay muertas y
cuantas vivas (las Cándidas muertas se tiñen de azul, las vivas se observan refringentes)
(Cifra normal-25-40% porcentaje de Cándidas muertas en relación al promedio de Cándidas
fagocitadas.)

7. POS LABORATORIO
 Mencione y explique patologías o circunstancias en las cuales se vea involucrada una
alteración en el proceso de la fagocitosis.
 Explique cómo se activa la fagocitosis durante el proceso de la Artritis reumatoide.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
 Flannagan, R. S., Jaumouillé, V. & Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev.
Pathol. 7, 61–98 (2012).
 Freeman, S. A. & Grinstein, S. Phagocytosis: Receptors, signal integration, and the
cytoskeleton. Immunology. Rev. 262, 193–215 (2014).
 Madigan M., Martinko J., Dunlap P., Clark D. (2009). Brock. Biología de los microorganismos.
Duodécima edición. Pearson Educación.

ELABORADO POR:
MARTHA PATRICIA ISAZA CORTES
DOCENTE