PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

BIOQUÍMICA BASICA
SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS DE
LA LECHE
Angie Juliana Parra Rocha, Sebastián Cortes Becerra

INTRODUCCION:

Los métodos de separacion de proteinas aprovechan propiedades tales como la

carga, tamano y solubilidad, que varia entre una yotra proteina (Nelson y Cox,
2000).

Cuando las proteinas tienen su PH caracteristico a su carga neta se

le denomida punto isoelectrico, en este punto se encuentra el equilibrio en las
cargas tanto positivas como negtivas por lo que la proteina presenta
su maxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y
facilitar su agregacion.

La caseina es una proteina de la leche del tipo fosfoproteina, que se separa de

la leche por acidificacion y forma una masa blanca, esta se emplea para apresto
de tejidos, elaboracion de preparados farmaceuticos y de plasticos,
la caseina casera representa cerca del 77%

La curva es un método de química analítica empleado para medir la

concentración de una sustancia en una muestra por comparación con una serie
de elementos de concentración conocida. Se basa en la existencia de una
relación en principio lineal entre un carácter medible (por ejemplo la
absorbancia en los enfoques de espectrofotometría) y la variable a determinar
(la concentración). Para ello, se efectúan diluciones de unas muestras de
contenido conocido y se produce su lectura
FUNDAMENTO TEORICO

METOD RANGO SENSIBILI VENTAJAS APLICACIONE

O DAD (µg) S
Biuret 1000-10000  Muy especi Determinacion de
fico para prote proteinas en
inas leche

 Muestra
pocas
interferencias
 Economico

Método de Biuret
La reacción de Biuret es una reacción coloreada (violeta) debida a la formación
de un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen más de
un enlace peptídico

OBJETIVOS:

 Demostrar el efecto que tiene el pH y la fuerza iónica de las soluciones

sobre la solubilidad de las proteínas

METODOLOGIA:

Determinación de las proteínas totales en la leche.

Para este experimento primero se debe prepare 2 tubos de ensayo de la siguiente
manera:
 Tubo 1 (blanco): 2,5 mL de agua destilada + 2,5 mL Reactivo de Biuret.
  Tubo 2 (proteína total): 2,5mL de leche + 2,5 mL Reactivo de Biuret.
Mezclar bien. Incube a temperatura ambiente durante 10 min y mida la
absorbancia a 540 nm.
Elabore una curva de calibración con los datos de la (Tabla 1). Si la absorbancia
es mayor a los valores de la curva, haga diluciones hasta obtener un valor de
absorbancia en el rango de lectura de la curva de calibración. Para realizar las
diluciones use la fórmula V1C1=V2C2. No olvide tener en cuenta los datos de
las diluciones para calcular la concentración de las proteínas de la leche
(mg/ml).

Fraccionamiento de las proteínas de la leche.

Precipitación por pH
Tome 20 mL de leche en un vaso de precipitados y mida el pH en el pH metro.
Luego agregue lentamente pequeñas alícuotas de HCl 0,1 M y agite con
agitación magnética, hasta obtener un pH alrededor de 4,6. ¿Que observa?
Anote qué efecto tiene el cambio del pH sobre la solubilidad de las proteínas
presentes en la leche. Después Pese un papel de filtro y luego filtre la anterior
solución al vacío usando un embudo Büchner. Seque el filtrado con papel de
filtro en el horno a 60°C y determine el peso de las proteínas precipitadas Tenga
en cuenta éste peso para determinar la concentración de proteínas precipitadas
por ácido en la leche entera en % (p/v) y en mg/ml.
Determinación de la concentración de proteínas del sobrenadante ácido
Tomar 2,5 mL del sobrenadante y agregue 2,5 mL del reactivo de Biuret.
Mezcle bien. Incube a temperatura ambiente durante 10 min y mida la
absorbancia a 540 nm. Para hallar la concentración utilice la curva de
calibración de la Tabla 1. Si la absorbancia es mayor a los valores de la curva,
haga diluciones hasta obtener un valor de absorbancia en el rango de la curva
de calibración. No olvide tener en cuenta los datos de las diluciones para
calcular la concentración proteínas del sobrenadante (mg/mL) y en la leche
entera % (p/v)
Precipitación salina de las proteínas del sobrenadante ácido
Tomar 2,5 mL de la solución de sulfato de amonio saturada y mézclela con 2,5
mL del sobrenadante ácido. Después Centrifugue durante 3 min a 2500 g. ¿Qué
observa? Anote que efecto tiene el aumento de fuerza iónica de la solución sobre
la solubilidad de las proteínas. Luego tomar 2,5 mL de éste segundo
sobrenadante (salino) y agregue 2,5 mL del reactivo de Biuret. Mezcle bien.
Incube a temperatura ambiente durante 10 min y mida la absorbancia a 540 nm.
Para hallar la concentración utilice la curva de calibración de la Tabla 1. Si la
absorbancia es mayor a los valores de la curva, haga diluciones hasta obtener
un valor de absorbancia en el rango de la curva de calibración. No olvide tener
en cuenta los datos de las diluciones para calcular la concentración proteínas
del sobrenadante (mg/mL) y en la leche entera % (p/v).

RESULTADOS:

Tabla 1. Datos curva de calibración

Absorbancia 0,016 0,09 0,2 0,41 0,56 0,8 0,95
Concentración
(mg/ml) 0,5 2,5 5 10 15 20 25

x y
Concentración
Absorbancia
(mg/ml)
 curva de calibracion #1
1.2

0.8

absorbancia
0.6

0.4

0.2

0
0 5 10 15 20 25 30
concentracion (mg/mL)

0,5 0,016
2,5 0,09
5 0,2
10 0,41
15 0,56
20 0,8
25 0,95
pendiente 0,03857605
intersección 0,00243831
co.De
0,99868131
coleracion

Precipitación por pH

1,21𝑔
∗ 100 = 6,05%𝑚/𝑝
20𝑚𝐿
 1210𝑚𝑔
= 60,5𝑚𝑔/𝑚𝐿
20𝑚𝐿

Determinación de la concentración de proteínas del sobrenadante ácido

0,421 A = 2,5mL del sobrenadante + 2,5 mL del reactivo de Biuret.

10mg/mL
10𝑚𝑔 1
∗ ∗ 100 = 2%𝑝/𝑚
5𝑚𝐿 100

Precipitación salina de las proteínas del sobrenadante ácido

A=2,296=5mg/mL

5𝑚𝑔 1
∗ ∗ 100 = 0,5%𝑝/𝑣
10𝑚𝐿 100

Informe de resultados
1. Cálculos para determinar la concentración de las proteínas totales de la
leche entera en mg/ml y en % (p/v)

60,5𝑚𝑔 10𝑚𝑔 5𝑚𝑔

+ + = 75,5𝑚𝑔/𝑚𝐿
𝑚𝐿 𝑚𝐿 𝑚𝐿
𝑚 𝑚 𝑚
6,05% + 2% + 0,5% = 8,55%𝑚/𝑣
𝑣 𝑣 𝑣

2. ¿Qué clase de proteínas se precipitaron al cambiar el pH de la leche?

Cálculos para determinar su concentración en mg/ml y en la leche entera
(% p/v).
Precipitación por pH

1,21𝑔
∗ 100 = 6,05%𝑚/𝑝
20𝑚𝐿
 1210𝑚𝑔
= 60,5𝑚𝑔/𝑚𝐿
20𝑚𝐿

3. Cálculos para determinar la concentración de las proteínas en el

sobrenadante ácido de la leche en (mg/ml)

0,421 A = 2,5mL del sobrenadante + 2,5 mL del reactivo de Biuret.

10mg/mL
10𝑚𝑔 1
∗ ∗ 100 = 2%𝑝/𝑚
5𝑚𝐿 100

4. ¿Qué clase de proteínas se precipitaron al cambiar la fuerza iónica de la

solución? ¿Cuáles quedaron en el sobrenadante 2 (salino)?

A=2,296=5mg/mL

5𝑚𝑔 1
∗ ∗ 100 = 0,5%𝑝/𝑣
10𝑚𝐿 100

5. Análisis del efecto de la adición de sales a una solución de proteínas

Una proteína es sensible a la concentración de sal en el medio, al agregar las
proteínas en una solución de concentración alta esta rompe los enlaces y al
meterla en una centrifugador las proteínas se separan y se puede identificar
diferentes proteínas.
6. Descripción clara del proceso de desnaturalización de una proteína

La desnaturalización de proteínas es consecuencia de algún factor externo como

acidez del medio, temperatura, etc. Es importante saber que la desnaturalización
de una proteína no afecta a lo que se conoce cómo estructura primaria, esto es,
la secuencia de aminoácidos base de la proteína.
Hay casos excepcionalmente raros en los que una proteína desnaturalizada no
pierde su función biológica
Agentes desnaturalizantes
Los agentes desnaturalizantes son aquellos factores químicos o físicos que
producen la desnaturalización de las proteínas. Entre los más comunes podemos
citar:
- Temperatura
- Ph
- polaridad del disolvente
- fuerza iónica
El ejemplo más famoso para ilustrar la desnaturalización de proteínas es la
cocción del huevo. La clara del huevo está compuesta en gran parte por agua y
albúminas, un tipo de proteínas. Al aumentar la temperatura las proteínas de la
clara

7. Descripción de la composición proteica de la leche y compararlos con sus

resultados

Las proteínas están formadas por aminoácidos, que son como los eslabones que
componen una cadena que sería la proteína.

Según la combinación y proporción de estos aminoácidos existen varios tipos

de proteínas
Proteínas obtenidas
Caseina
Lactoalbumina

8¿Cuál es el uso de las caseínas y la lactoalbúmina en la industria de

alimentos?
CASEINA
́ caseus = queso) es la proteína presente en mayor
CASEÍNA (del latin
proporción en la leche (en torno al 3%), junto con la lactoalbúmina y
lactoglobulina que se encuentran en menor porcentaje y que juegan
un rol diferente desde el punto de vista bioquímico e inmunológico.
LACTOALBUINA

Contiene los aminoácidos esenciales, es decir, aquellos que nuestro

organismo no sintetiza, y ofrece una serie de beneficios para la salud,
 como brindar propiedades antioxidantes, mejorar nuestro estado anímico,
fortalecer el sistema inmunológico.
La composición química porcentual de la leche:
Caseína ..................................... 2,90
Lactoalbúmina .......................... 0,52
La caseina y su uso como producto
elaboración de productos alimentarios (derivados lácteos y cárnicos,
panes y productos de repostería, etc.)

La caseína se emplea en la industria para la fabricación de pinturas

especiales y en el apresto de tejidos, la clarificación de vinos, la
elaboración de preparados farmacéuticos, la fabricación de plásticos
(botones, peines) y de adhesivos. La pintura de caseína ha sido usada
desde la antigüedad por los egipcios.
En la alimentación especial, la caseína sirve para la elaboración de
preparados médicos y concentrados proteicos destinados a la
alimentación de deportistas

lactosuero y su uso como producto

El lactosuero de queso es un residuo abundante obtenido durante el

procesamiento de quesos y su disposición en el ambiente produce varios
inconvenientes. Contiene principalmente lactosa, proteínas como sustancias de
importante valor nutritivo, minerales, vitaminas y grasa. Su composición y tipo
de lactosuero varía dependiendo del tipo de leche, tipo de queso elaborado y el
proceso de tecnología empleado.
 Entre los productos de exitosa aceptación debido a sus bajos costos de
producción, grado de calidad alimenticia y aceptable sabor, se encuentran
las bebidas refrescantes, bebidas fermentadas, y alcohólicas, proteína
unicelular, biopelículas, producción de ácidos orgánicos, concentrados
de proteínas, derivados de lactosa entre otros (Londoño, 2008).

ANALISIS DE RESULTADOS

En los primeros resultados se obtienen gracias al proceso de la separación de

proteínas por pH, gracias al aplicar HCl a la leche y pasar esto por destilado, y
queso un precipitado en el papel para filtro y un sobrenadante.

Para hallar la concentración del precipitado esto se lleva a secar después de esto
se pesa y se resta el peso del precipitado con el peso del papel y me da el
resultado del peso de la proteína como lo podemos ver en los resultados en la
parte de arriba y para hallar la concentración en mg/mL se divide el peso de la
muestra sobre los mililitros de la solución y se multiplican por el factor de
dilución y por 100 para hallar el porcentaje de masa/volumen.

En la segunda parte se hace la preparación correspondiente y gracias a la tabla

# 1 y la gráfica de la curva de calibración #1 se puede hallar la concentración
de la muestra interpolando la absorbancia antes obtenida en el
espectrofotómetro.

Con la tercera y última parte se hace lo mismo con la tabla # 1 y la gráfica # 1

se interpola la absorbancia de la muestra y se realiza el mismo procedimiento
que en punto dos para poder hallar la concentración en las medidas de mg/mL.
CONCLUCIONES

 Al cambiar al pH de la leche con la aplicación de HCl, esta genera un

precipitado que por el procedimiento de destilación se pueden separar las
proteínas que contiene.
 Gracias a los métodos de separación de las proteínas se puede purificar
una sustancia en cada una de las proteínas que tiene.
 Al obtener la caseina de la leche y al hacerle reaccionar con reactivo
biuret se torna una solución color violeta debido a que el reactivo biuret
contiene Cu

BIBLIOGRAFIA

 D. Voet, JG Voet, CW Pratt. “Fundamentos de Bioquímica”. Editorial

Médica Panamericana. 2ª Ed.Bioquímica, Madrid, 2007.