MYRIAM S SILVA MARÍN. MsC., Esp.

GUÍA DE LABORATORIO DE ESPECTROFOTOMETRÍA VIRTUAL

OBJETIVOS

• Conocer y aplicar los fundamentos de la espectrofotometría.

• Determinar la concentración de p-nitrofenol en una muestra problema.
• Determinar la concentración de proteínas en una muestra problema.

INTRODUCCIÓN
La espectrofotometría es una técnica analítica que se basa en la ley de Lambert-Beer.
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Esta ley dice que la cantidad de energía absorbida por una sustancia (absorbancia, A) depende
linealmente de la cantidad o concentración de esta (c), cuando el tamaño de la celda es constante
(recorrido de la radiación, b) y se trata de la misma sustancia (absortividad molar, ɛ). Por tanto, si se
tienen patrones de concentración conocida y se mide su absorbancia en un espectrofotómetro, es
posible realizar una recta de calibración. Al medir la sustancia de concentración desconocida se
obtiene su absorbancia y por interpolación en la recta de calibración, se puede determinar su
concentración. Esta técnica se usa para cualquier sustancia que absorba luz en el rango UV (190-
400nm) o en el visible (400-700nm), o incluso sustancias que no absorben en el rango mencionado
pero que mediante una reacción producen un derivado coloreado que absorbe en el visible.

Lo anterior es cierto si se cumple que la radiación incidente sea de solo una longitud de onda
(monocromática) y las especies de la muestra actúen independientemente unas de otras durante la
absorción. De lo contrario, el comportamiento no es lineal y hablamos de desviaciones de la ley de
Beer, las cuales se presentan cuando:

• La concentración del analito es muy alta o demasiado baja.

• Si los cambios en la concentración influyen en el índice de refracción, entonces ɛ se ve afectado

• Hay desviaciones de origen químico: cuando un analito se disocia, se asocia o reacciona con un
disolvente para dar lugar a un producto con un espectro de absorción diferente al del analito.

• La radiación debe ser totalmente monocromática

• Presencia de radiación parásita

La longitud de onda a la que se deben hacer las mediciones debe corresponder al pico máximo del
espectro de absorción para maximizar la sensibilidad y minimizar los errores. Un espectro de absorción
es una representación gráfica de la absorbancia del analito en función de la longitud de onda de la
radiación incidente, y puede determinarse en un espectrofotómetro mediante toma de la absorbancia
a diferentes longitudes de onda que normalmente se conoce como barrido.

En bioquímica la espectrofotometría se usa para cuantificar metabolitos, ácidos nucleicos y proteínas.

Para la cuantificación de proteínas existen diferentes métodos, uno de ellos es la medición a 280nm,
ya
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que los aminoácidos aromáticos absorben luz de esta longitud de onda, sin embargo, este método no
es tan preciso ya que depende de la cantidad de aminoácidos aromáticos presentes en la proteína y
durante un proceso de purificación normalmente se presentan interferencias por los ácidos nucleicos
presentes que absorben a 260nm. Por ello otros métodos son más usados como el Bradford, Biuret,
Lowry y del ácido bicinconinico, entre otros, cada uno tiene ventajas y desventajas que deben ser
analizadas para escoger el método adecuado de acuerdo a las condiciones experimentales.

ACTIVIDADES PRELABORATORIO

Consulte y responda en su preinforme las siguientes preguntas:

1. ¿En qué consiste la espectrofotometría, cual es el fundamento físico, que es absorbancia y para que
se usa esta técnica? ¿Cuál es la ecuación de la ley de Lambert-beer y cuál es su interpretación?

2. ¿Cuál es el instrumento usado para espectrofotometría? Pegue una ilustración de este.

3. ¿Qué es una curva de calibración en química y para qué sirve?

4. ¿En qué consiste la prueba de Bradford y por qué esta es usada como método de cuantificación de
proteínas?

5. ¿Cuál es la longitud de onda de máxima absorción para la determinación de proteína por Bradford?

6. ¿Qué otros métodos para cuantificación de proteínas existen? Explíquelos brevemente.

MATERIALES

Computador con acceso a internet.

PROCEDIMIENTO

I. Laboratorio virtual

Entra a la página http://biomodel.uah.es/lab/inicio.htm#abs, allí ingresa por la puerta donde dice

“Acceso al laboratorio virtual” o da click al link http://biomodel.uah.es/lab/abs/espectro.htm. Lee las
instrucciones mientras vas realizando lo que dice allí para familiarizarte con el uso de la plataforma.
Luego ingresa a la actividad 1.

ACTIVIDAD 1 RELACIÓN ENTRE ABSORBANCIA Y CONCENTRACIÓN

1. Lee sobre que materiales se van a usar e identifícalos a la derecha de tu pantalla.

2. Realiza el ajuste del cero o “calibración”, tal como se indica en las instrucciones. No olvides ajustar la
longitud de onda a 405nm.

3. Toma el espectro de absorción del p-nitrofenol, para ello toma en una celda, 3 mL de p-
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nitrofenol e introdúcela en el espectrofotómetro. Da click en el i cono del espectrofotómetro que

dice “registra un espectro”. Al finalizar da click en la cámara para descargar el espectro como una
imagen y guárdala en tu computador para el informe.

4. Ahora realiza las mediciones para construir una curva de calibración tal como se indica en “diseño
del experimento”. No olvides anotar los resultados en la tabla de esta guía, sección resultados.
Completa la tabla del laboratorio virtual en “Análisis cuantitativo de resultados”

5. Realiza el “análisis cuantitativo de resultados” del laboratorio virtual hasta determinar la

concentración de la muestra problema.

ACTIVIDAD 2 FUNDAMENTO DE UN ENSAYO DE CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

1. Lee sobre que materiales se van a usar e identifícalos a la derecha de tu pantalla.

2. Realiza el ajuste del cero o “calibración”, tal como se indica en las instrucciones. No olvides ajustar la
longitud de onda a 595nm.

3. Toma el espectro de absorción de la mezcla proteína-Bradford, para ello toma en una celda, 3 mL de
proteína-Bradford (frasco azul) e introdúcela en el espectrofotómetro, registra el

dato a 595nm. Luego da click en el icono

del espectrofotómetro que dice “registra

un espectro”. Al finalizar da click en la cámara

para descargar el espectro como una

imagen y guárdala en tu computador para el informe.

4. Ahora realiza las mediciones para construir una curva de calibración tal como se indica en “diseño
del experimento”. No olvides volver a ajustar la longitud de onda a 595nm y anotar los resultados en la
tabla de esta guía, sección resultados. Completa la tabla del laboratorio virtual en “Medida”

5. Realiza el “análisis cuantitativo de resultados” del laboratorio virtual hasta determinar la

concentración de la muestra problema.

RESULTADOS

I. SIMULACIÓN

Muestra las imágenes de los espectros obtenidos. Y construye una tabla con los datos que muestran el
espectro (A260nm, A280nm y A260/A280).

Laboratorio Virtual
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ACTIVIDAD 1

Muestra la imagen del espectro de absorción del pNF.

Completa la siguiente tabla

1 mL 2 mL 3 mL -
2 mL 1 mL 0 mL

0.523 nm 1.062 nm 1.588 nm 0.293 nm

26.667 um 53.334 um 80 um 15,042 um

Con la información construya la curva de calibración y determine la concentración de proteína en la

muestra de partida teniendo en cuenta que se mezcla 1 mℓ de una muestra problema con reactivo de
Bradford, para un volumen total de 3 mℓ y su absorbancia a 595nm es la obtenida en el laboratorio virtual
y que está registrada en la tabla 1 (si necesita ayuda sobre cómo construir la curva de calibración en Excel
ingrese a https://www.youtube.com/watch?v=ZA1lzPMyCMU). Indique cuál es esta concentración y haga
una muestra de cálculos de la
determinación.

PROCEDIMIENTO PARA
CALCULAR LA
CONCENTRACION DE
LA MUESTRA
PROBLEMA
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Actividad 2

Muestra la imagen del espectro de absorción de la mezcla proteína-Bradford

Completa la siguiente tabla:

Cubeta 1 ó Cubeta Cubeta Cubeta con solo Cubeta con
Blanco 2 3 proteina-Brandford muestra

Vol. de proteina -
Brandford 0 1 2 3

Vol. de reactivo -
Brandford 3 2 1 0
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Absorbancia 0.194 0.369 0,543 0.473

   0,000

Concentración de
proteína 0 266.66 533.33 779.78 678.70

Con la información construya la curva de calibración y determine la concentración de proteína en la

muestra de partida teniendo en cuenta que se mezcla 1 mℓ de una muestra problema con reactivo de
Bradford, para un volumen total de 3 mℓ y su absorbancia a 595nm es la obtenida en el laboratorio virtual
y que está registrada en la tabla 1 (si necesita ayuda sobre cómo construir la curva de calibración en Excel
ingrese a https://www.youtube.com/watch?v=ZA1lzPMyCMU). Indique cuál es esta concentración y haga
una muestra de cálculos de la determinación.
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ACTIVIDADES PRE-LABORATORIO ESPECTROFOTOMETRÍA

Consulte y responda en su preinforme las siguientes preguntas:

1. ¿En qué consiste la espectrofotometría, cual es el fundamento físico, que es absorbancia y para
que se usa esta técnica? ¿Cuál es la ecuación de la ley de Lambert-beer y cuál es su
interpretación?

 La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la

concentración de un compuesto en solución.
 Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones electromagnéticas y a su vez que la
cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentración.
 La absorbancia (A), también conocida como densidad óptica (DO), es la cantidad de luz
absorbida por una solución.
 La medida de absorbancia se usa con frecuencia en química analítica y en bioquímica, ya
que la absorbancia es proporcional al camino óptico de la muestra y a la concentración de
la sustancia en ésta, en contraste con la transmitancia I / I0, que varía exponencialmente
con el grosor y con la concentración.
 la ley de Lambert-Beer, que se resume con la ecuación: A = ε b c , donde c se expresa en
mol/L, b es la longitud del camino óptico (anchura de la célula que contiene la disolución
de la sustancia) y se expresa en cm, y ε es la absortividad molar, propiedad característica
de cada sustancia correspondiente a la cantidad de radiación que absorbe a una longitud
de onda determinada por unidad de concentración, siendo sus unidades L mol-1 cm-
1(téngase en cuenta que la absorbancia no tiene unidades). Para poder aplicar la ley de
Lambert-Beer es necesario seleccionar previamente una longitud de onda puesto que
tanto A como ε varían con ella. Para ello se obtiene previamente el espectro de absorción
de la sustancia, que consiste en una representación de los valores de absorbancia frente a
la longitud de onda expresada en nanometros (nm). Del espectro de absorción puede
seleccionarse el valor de longitud de onda para el cual la absorbancia es máxima.
 la ley de Lambert-Beer indica que a una representación gráfica de la absorbancia frente a
la concentración le correspondería una línea recta, esto sólo tiene lugar para disoluciones
diluidas, por ello, no es conveniente utilizar la expresión matemática directamente, sino
construir en cada caso la recta de calibrado que confirme que la ecuación de Lambert-
Beer se cumple en el intervalo de concentraciones en el que se trabaja. Esta recta se
construye midiendo la absorbancia de una serie de disoluciones de concentración
perfectamente conocida.
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2. ¿Cuál es el instrumento usado para la espectrofotometría? Pegue una ilustración de este.

 El espectrofotómetro es un instrumento usado en la física óptica que sirve para medir, en

función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud
fotométrica relativos a dos haces de radiaciones.

3. ¿Qué es una curva de calibración en química y para qué sirve?

 curva de calibración es la representación gráfica que relaciona una señal instrumental en

función de la concentración de un analito y define un intervalo de trabajo en el cual, los
resultados a informar tienen una precisión y exactitud conocida que ha sido documentada
en la validación de cada método.

4. ¿En qué consiste la prueba de Bradford y por qué esta es usada como método de cuantificación
de proteínas?

 La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en la cuantificación

de la unión de un colorante, el Azul de Coomassie G-250, a la proteína, comparando esta
unión con la de diferentes cantidades de una proteína estándar (Albúmina de Suero
Bovino (BSA). Para poder realizar esta metodología es necesario un espectrofotómetro,
que no es precisamente barato (unos 2.000 euros aproximadamente), así que no es algo
que se pueda ejecutar desde casa. Esta máquina es capaz de proyectar un haz de luz
monocromático a través de una muestra, con la finalidad de medir la cantidad de luz que
es absorbida por los compuestos de interés. Así, el investigador recibe información sobre
la naturaleza de las moléculas en la solución en cuestión y, de paso, también es capaz de
calcular la concentración de dicha molécula.

5. ¿Cuál es la longitud de onda de máxima absorción para la determinación de proteína por

Bradford?

 La forma roja cambia a azul cuando se une a una proteína, con un cambio en la longitud
de onda del máximo de absorción de 465 nm a 595 nm.
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6. ¿Qué otros métodos para cuantificación de proteínas existen? Explíquelos brevemente.

 ENSAYOS DE ABSORBANCIA UV
La utilización de la absorbancia ultravioleta (UV) para medir la concentración de proteínas
es un análisis de cuantificación de proteínas relativamente sencillo. Los aminoácidos con
cadenas laterales aromáticas (triptófano, tirosina, etc.) proporcionan a las proteínas su
absorbancia UV distintiva a 280 nm. Dado que esos aminoácidos absorben la luz UV a 280
nm, puede obtenerse la absorbancia a esta longitud de onda concreta a través de un
espectrofotómetro y utilizarse para estimar las concentraciones proteicas de las muestras.

 INMUNOANÁLISIS
Algunos análisis pueden no ser adecuados para una cuantificación precisa de las proteínas
si hay múltiples proteínas en una muestra o si las cantidades están por debajo del umbral
de detección. Potentes tecnologías de inmunoanálisis, en las que se utilizan diversos
métodos de detección, proporcionan un método alternativo para la cuantificación precisa
de las proteínas de una variedad de tipos de muestra. Por ejemplo, los análisis multiplex
permiten a los investigadores cuantificar simultáneamente múltiples proteínas en una
muestra. Además, la tecnología de recuento de moléculas individuales puede medir
concentraciones de proteínas a niveles de femtogramos para ayudar a identificar y
cuantificar bajas concentraciones de proteínas en muestras pequeñas. Las aplicaciones de
estas tecnologías en investigación abarcan la medición de biomarcadores en tejidos sanos
o los asociados con progresión de la enfermedad para entender mejor ciertos estados
mórbidos.

Bibliografía
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1. Abril Díaz N, Antonio Bárcena Ruiz J, Fernández E, Cejudo A, Novo J, Peinado J, et al. 8.
Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación colorimétrica de biomoléculas
[Internet]. Available from:
https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/08_ESPECTROFOTOMETRIA.pdf

2. Método de Bradford: qué es y cómo funciona [Internet]. psicologiaymente.com. Samuel

Antonio Sánchez Amador 29 marzo, 2021 - 20:33; 2021. Available from:
https://psicologiaymente.com/cultura/metodo-bradford

3. Artedinamico. QUÉ ES Y USOS DEL ESPECTROFOTÓMETRO [Internet]. Equipos y

laboratorio de Colombia. Copyright Equipos y Laboratorio de Colombia S.A.S. 2011 - 2021;
Available from: https://www.equiposylaboratorio.com/portal/articulo-ampliado/quE-es-y-
usos-del-espectrofotometro

4. PRÁCTICA 4 COLORIMETRÍA. LEY DE LAMBERT-BEER OBJETIVOS [Internet]. Available from:

http://www.qfa.uam.es/labqui/practicas/practica4.pdf

5. 【 Espectrofotómetro 】 ¿Qué es, Para qué sirve, Cómo funciona? 【 2020 】 [Internet].
Materiales de Laboratorio. 2019. Available from:
https://materialeslaboratorio.com/espectrofotometro/