Teg Francisco Rivas PDF

UNIVERSIDAD DE CARABOBO
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
DESARROLLO DE UN MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN DE CLORURO DE CETILPIRIDINIO Y

CLORHIDRATO DE LIDOCAINA EN UNA FORMULACIÓN FARMACÉUTICA POR
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA EFICIENCIA
Trabajo Especial De Grado
Valencia, Noviembre de 2017


AUTOR: Francisco J. Rivas P.
TUTOR ACADÉMICO: Dra. Ygmar Jiménez
TUTOR EMPRESARIAL: Dr. José Pérez
Valencia, Noviembre de 2017


AUTOR: Francisco Rivas
RESUMEN
Se desarrolló un método simple, rápido y selectivo para la determinación simultánea

de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio en la forma farmacéutica de
caramelos. Se logró una separación cromatográfica efectiva en una columna X-Terra RP-8 de
4,6*250 mm y un tamaño de partícula de 5 µm con elución en gradiente usando una fase
móvil compuesta de ácido fosfórico 0,05 M y acetonitrilo. La elución en gradiente comenzó
con 25%(v/v) de acetonitrilo manteniéndose en esta proporción hasta los 4 minutos,
aumentó linealmente hasta el 45%(v/v) en 1 minutos manteniéndose en esta proporción
por 1 minuto luego de lo cual aumento linealmente hasta el 65%(v/v) en 1 minuto,
manteniéndose en esta proporción por 7 minutos, para luego disminuir linealmente a
25%(v/v) en 2 minutos y permanecer constante hasta el final de la corrida. La fase móvil se
bombeó a un flujo de 1,0 ml/min. El detector se estableció a las longitudes de onda 205 nm
y 265 nm, y la cuantificación de los analitos se basó en la medición del área de sus picos. Los
tiempos de retención para el Clorhidrato de Lidocaína y el Cloruro de Cetilpiridinio fueron
de aproximadamente 3,9 y 11,2 min respectivamente. La fiabilidad y el rendimiento
analítico del método analito propuesto se validaron estadísticamente con respecto a la
I
linealidad, veracidad, precisión, especificidad, robustez, y estabilidad de las soluciones. Las
curvas de calibración fueron lineales en el rango de 21-39 µg/ml y 28-52 µg/ml para el
Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio respectivamente, con coeficientes de
correlación mayores a 0,999.
II

AUTOR: Francisco Rivas
ABSTRACT
A simple, rapid and selective method was developed for simultaneous

determination of Lidocaine Hydrochloride and Cetylpyridinium Chloride presented as a
pharmaceutical candy. Effective chromatographic separation was achieved on an XTerra RP8
(4,6*250 mm and a particle of 5 μm) column with a gradient elution using a mobile phase
composed of 0,05 M phosphoric acid and acetonitrile. Elution in gradient started with
25%(v/v) of acetonitrile and it was constant for 4 minutes, ramped up linearly to 45%(v/v)
in 1 min and it was constant for 1 min, before ramped up linearly to 65%(v/v) in 1
minute and it was constant for 7 min, before it decrease linearly until 25%(v/v) in 2
minutes and it was constant until end of the run. Mobile phase was pumped at a flow rate
of 1,0 ml/min. The multiple wavelength detector was set at 205 and 265 nm, and
quantification of the analytes was based on measuring their peak areas. The retention times
for Lidocaine Hydrochloride and Cetylpyridinium Chloride were about 3,9 minutes y 11,2
minutes, respectively. The reliability and analytical performance of the proposed method
were statistically validated with respect to linearity, veracity, precision, specificity,
robustness, and stability of the solutions. Calibration curves were linear in the range of 21-
III
39 μg/ml and 28-52μg/ml for Lidocaine Hydrochloride and Cetylpyridinium Chloride,
respectively, with correlation coefficients >0,999.
IV
CONTENIDO
Capítulo 1. EL PROBLEMA ........................................................................................................1

1.1. Planteamiento y justificación del problema .............................................................1
1.3. Objetivo General ...........................................................................................................2
1.3.1. Objetivos específicos ..............................................................................................2
1.4. Factibilidad y alcance ....................................................................................................2
Capítulo 2. MARCO TEORICO ...................................................................................................4
2.1. Cromatografía ..........................................................................................................4
2.2. Validación de métodos analíticos ..................................................................................5
2.3. Parámetros de validación ..............................................................................................6
2.3.1. Especificidad...........................................................................................................7
2.3.2. Linealidad ...............................................................................................................8
2.3.3. Límites de detección y de cuantificación ................................................................9
2.3.4. Exactitud.................................................................................................................9
2.3.5. Veracidad .............................................................................................................10
2.3.6. Precisión ...............................................................................................................11
2.3.7. Incertidumbre ......................................................................................................13
2.3.8. Robustez ...............................................................................................................15
2.3.9. Aptitud del Sistema o Test de Adecuabilidad .......................................................15
2.3.10. Estabilidad ..........................................................................................................17
2.3.11. Aplicabilidad .......................................................................................................17
2.4. ANOVA ........................................................................................................................17
2.4.1. Verificación de los supuestos ANOVA ..................................................................21
2.5. Clorhidrato de Lidocaína .............................................................................................27
2.6. Cloruro de Cetilpiridinio ..............................................................................................27
Capítulo 3. ANTECEDENTES ....................................................................................................29
Capítulo 4. MARCO METODOLÓGICO ....................................................................................31
4.2. Ajuste del método .......................................................................................................32
V
4.2.1. Condiciones cromatográficas ...............................................................................32
4.2.2. Preparación de muestra y estándar .....................................................................34
4.3. Parámetros de validación ............................................................................................34
4.3.1. Adecuabilidad.......................................................................................................34
4.3.2. Especificidad.........................................................................................................35
4.3.3. Linealidad .............................................................................................................37
4.3.4. Veracidad .............................................................................................................38
4.3.5. Repetibilidad ........................................................................................................38
4.3.6. Estabilidad de las soluciones ................................................................................38
4.3.7. Precisión intermedia ............................................................................................39
4.3.8. Evaluación de la robustez .....................................................................................40
Capítulo 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................41
5.1. Adecuabilidad..............................................................................................................41
5.2. Especificidad................................................................................................................45
5.3. Linealidad ....................................................................................................................53
5.4. Veracidad ....................................................................................................................56
5.5. Precisión y estabilidad las muestras ............................................................................57
5.6. Determinación de la Incertidumbre ............................................................................62
Capítulo 6. CONCLUSIONES ....................................................................................................68
Capítulo 7. RECOMENDACIONES ............................................................................................69
Capítulo 8. APENDICE .............................................................................................................70
Capítulo 9. BIBLIOGRAFÍA.......................................................................................................79
VI
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 2.1: Parámetros de validación a evaluarse dependiendo del tipo de método ................6
Tabla 4.1 Condiciones cromatográficas establecidas para la determinación de Clorhidrato de
Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio mediante HPLC .............................................................33
Tabla 4.2 Gradiente de fase móvil para la determinación de Clorhidrato de Lidocaína y
Cloruro de Cetilpiridinio mediante HPLC ................................................................................33
Tabla 4.3: Condiciones de degradación empleadas. (Duque, Lara, & Perez, 2015) ................35
Tabla 4.4 Esquema metodológico del ensayo de especificidad ..............................................36
Tabla 4.5 Esquema metodológico del ensayo de linealidad ...................................................37
Tabla 4.6 Esquema metodológico del ensayo de exactitud ...................................................38
Tabla 4.7 Esquema metodológico del ensayo de repetibilidad y estabilidad de soluciones ..39
Tabla 4.8 Esquema metodológico del ensayo precisión intermedia. ....................................39
Tabla 4.9: modificaciones aplicadas al método analítico en el ensayo de robustez ...............40
Tabla 5.1: Parámetros cromatográficos obtenidos en el estudio de la adecuabilidad ...........42
Tabla 5.2: Ángulos de pureza y ángulos de los picos cromatográficos del Cloruro de
Cetilpiridinio y Clorhidrato de Lidocaína sometidos a diferentes condiciones de degradación
y en la forma farmacéutica ....................................................................................................45
Tabla 5.3: Resolución de los picos de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio en
la solución estándar sin degradar y bajo condiciones de degradación forzada ......................46
Tabla 5.4: Parámetros obtenidos en el estudio de la linealidad del método para la
determinación de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio mediante HPLC ........53
Tabla 5.5: Pruebas estadística para la verificación de la varianza constante y normalidad en
la prueba de linealidad del método de determinación de Cloruro de Cetilpiridinio y
Clorhidrato de Lidocaína ........................................................................................................56
Tabla 5.7: Parámetros obtenidos en el estudio de la precisión y estabilidad de las muestras
del método para la determinación de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio
mediante HPLC .......................................................................................................................58
Tabla 5.8: Comparación de medias y varianzas entre la Repetibilidad, la precisión intermedia
y la estabilidad del método para la determinación de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de
Cetilpiridinio mediante HPLC .................................................................................................59
VII
Tabla 5.9: Valores p obtenidos de la prueba de Shapiro-Wilks para normalidad en los
estudios de Repetibilidad, precisión intermedia y estabilidad del método para la
Tabla 5.10: Comparación de la desviación estándar relativa estimado por la ecuación de
Horwitz y el obtenido de los datos de la repetibilidad y la precisión intermedia del método
para la determinación de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio mediante HPLC
...............................................................................................................................................61
Tabla 5.11: Estimación de la incertidumbre del método para la determinación de la
concentración relativa del Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio mediante
HPLC .......................................................................................................................................62
Tabla 5.12: Efecto de la variable bloque (preparación de muestras independientes) en la
determinación del clorhidrato de lidocaína y cloruro de Cetilpiridinio ..................................64
Tabla 5.13: Coeficiente de determinación y prueba de ajuste para los modelos ajustados
para la determinación de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio .....................65
Tabla 5.14: Prueba de Durbin-Watson para verificación del supuesto de independencia .....65
Tabla 8.1: Área y concentración de Cloruro de Cetilpiridinio (CCP) y Clorhidrato de Lidocaína
(LD) obtenido en el estudio de linealidad en el orden en que fueron medidos .....................70
Tabla 8.2 Concentración adicionada, concentración recuperada y porcentaje de recobro
obtenido en el ensayo de veracidad para el Clorhidrato de Lidocaína ...................................71
obtenido en el ensayo de veracidad para el Cloruro de Cetilpiridinio ...................................71
Tabla 8.4 Concentración relativa recuperada obtenida en los estudios de repetibilidad,
precisión intermedia y estabilidad para el Clorhidrato de Lidocaína .....................................72
precisión intermedia y estabilidad .........................................................................................72
Tabla 8.6: Concentración recuperada obtenida en el studio de robustez obtenida en cada
tratamiento para el Cloruro de Cetilpiridinio y Clorhidrato de Lidocaína ..............................73
VIII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 2.1 Lidocaína ..............................................................................................................27

Figura 2.2 Cloruro de Cetilpiridinio .......................................................................................28
Figura 4.1: Esquema general de la metodología ...................................................................31
Figura 4.2: Esquema de la preparación de muestra y estándar ............................................34
Figura 5.1: Análisis espectral para el estándar de a) Clorhidrato de Lidocaína y b) Cloruro de
Cetilpiridinio...........................................................................................................................42
Figura 5.2: Cromatograma de estándar de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de
Cetilpiridinio a 205 nm ...........................................................................................................43
Cetilpiridinio a 265 nm ...........................................................................................................44
Figura 5.4: Cromatograma de inyección del blanco a 205 nm...............................................44
Figura 5.5: Cromatograma de inyección del blanco a 265 nm...............................................45
Figura 5.6: Cromatogramas de la solución de excipientes a) Sin degradar, b) Degradación
acida, c) Degradación básica d) Degradación reductiva y e) Degradación oxidativa a 205 nm
...............................................................................................................................................47
acida, c) Degradación básica d) Degradación reductiva y e) Degradación oxidativa a 265 nm
...............................................................................................................................................48
Figura 5.8: Cromatogramas del estándar de Clorhidrato de Lidocaína a) Sin degradar, b)
Degradación acida, c) Degradación básica d) Degradación reductiva y e) Degradación
oxidativa a 205 nm .................................................................................................................49
Figura 5.9: Cromatogramas del estándar del Clorhidrato de Lidocaína a) Sin degradar, b)
oxidativa a 265 nm .................................................................................................................50
Figura 5.10: Cromatogramas del estándar de Cloruro de Cetilpiridinio a) Sin degradar, b)
oxidativa a 205 nm .................................................................................................................51
oxidativa a 265 nm .................................................................................................................52
IX
Figura 5.12: Gráfico del modelo ajustado para la determinación de Cloruro de Cetilpiridinio
por HPLC ................................................................................................................................54
Figura 5.13: Gráfico del modelo ajustado para la determinación de Clorhidrato de Lidocaína
por HPLC ................................................................................................................................54
Figura 5.14: Gráfico de residuos contra orden de ejecución para el Cloruro de Cetilpiridinio
...............................................................................................................................................55
Figura 5.15: Gráfico de residuos contra orden de ejecución para el Clorhidrato de Lidocaína
...............................................................................................................................................55
Figura 5.16: Gráfico de probabilidad normal para los residuos para el a) Cloruro de
Cetilpiridinio y b) Clorhidrato de Lidocaína ............................................................................57
Figura 5.17: Gráfico de medias para la comparación de los resultados obtenidos en el
estudio de la Repetibilidad, precisión intermedia y estabilidad de las soluciones para a) el
cloruro de Cetilpiridinio y b) el clorhidrato de lidocaína ........................................................59
Figura 5.18: Gráfico de residuos vs predichos para a) el Cloruro de Cetilpiridinio y b) el
Figura 5.19: Gráfico de residuos vs observaciones (secuencia) para a) el cloruro de
Cetilpiridinio y b) el clorhidrato de lidocaína .........................................................................60
Figura 5.20: Diagrama de Pareto de los efectos para la determinación del clorhidrato de
lidocaína .................................................................................................................................63
Figura 5.21: Diagrama de Pareto de los efectos para la determinación del cloruro de
Cetilpiridinio...........................................................................................................................63
Figura 5.22: Gráfico de residuos contra orden de ejecución para a) el Cloruro de
Cetilpiridinio y b) el Clorhidrato de Lidocaína ........................................................................66
Figura 5.23: Gráfico de residuos contra predichos para a) el Cloruro de Cetilpiridinio y b) el
Cetilpiridinio y b) Clorhidrato de Lidocaína ............................................................................67
X
Capítulo 1. EL PROBLEMA
1.1. Planteamiento y justificación del problema
Laboratorios Elmor S.A. es una empresa farmacéutica dedicada al diseño,

manufactura y comercialización de fármacos destinados al tratamiento y prevención de
enfermedades, por lo que debe garantizar un impacto positivo de sus productos sobre la
salud humana, y esto lo logra a través de unas buenas prácticas de manufactura y
parámetros de calidad altamente rigurosos.
En su catálogo de productos se encuentra la Lafarcaina que es un caramelo de

Clorhidrato de Lidocaína 1,5 mg/caramelo y Cloruro de Cetilpiridinio 2,0 mg/caramelo,
indicado para alivio temporal de las infecciones bucofaríngeas y dolores leves asociados a la
faringitis.
El método actualmente utilizado para la cuantificación del Clorhidrato de Lidocaína

consiste en la disolución de la muestra en una solución de hidróxido de sodio desde la cual
se extrae el activo con cloroformo, posteriormente se extrae desde el cloroformo con ácido
clorhídrico, evaluando su concentración por espectroscopia UV-visible en la solución acida,
mientras que para el Cloruro de Cetilpiridinio la muestra se disuelve en una solución de
ácido sulfúrico diluida, a esta solución se le adiciona anaranjado de metilo como indicador y
cloroformo, se titula con Lauril sulfato estandarizado el mismo día hasta que la fase orgánica
se decolore.
El uso de cloroformo en ambos métodos los hace peligrosos para la salud de los
analistas debido a los efectos tóxicos del cloroformo, aunado a esto el análisis requiere
muchas horas de trabajo hombre lo cual no es recomendado para un laboratorio de control
de calidad donde se busca tiempos de respuesta rápidos. Es debido a esto que se hace
necesario el desarrollo de un nuevo método que resulte más rápido, preciso y con menores
riesgos para la salud de los analistas, siendo una buena alternativa un método por
1
cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC por sus siglas en ingles) en fase reversa,
debido a la inocuidad de sus solventes, tratamiento de la muestras sencillo en la mayoría de
los casos, reproducibilidad entre análisis y rápido tiempo de respuesta.
1.3. Objetivo General
Desarrollar un método analítico para el análisis de cloruro de cetilpiridinio y

clorhidrato de lidocaína en caramelos, por cromatografía líquida de alta eficiencia, en un
laboratorio de control de calidad de una empresa farmacéutica.
1.3.1. Objetivos específicos
1. Ajustar las condiciones experimentales del método, estableciendo el procedimiento

de trabajo.
2. Establecer los parámetros analíticos de validación y sus criterios de aceptabilidad.
3. Validar el método analítico para el análisis de Cloruro de Cetilpiridinio y Clorhidrato
de Lidocaína
4. Evaluar que los resultados obtenidos en la validación del método analítico cumplen
los criterios establecidos.
1.4. Factibilidad y alcance

El presente trabajo está enfocado a determinar los parámetros de validación
especificados en la Farmacopea de los Estados Unidos de América (Farmacopeia de los
Estados Unidos de América 35, 2011).
 Especificidad
 Linealidad
 Exactitud
 Precisión
 Robustez
 Estabilidad de soluciones
2
Respecto a la precisión, se determinará únicamente la repetibilidad y la precisión
intermedia (distintos días y distinto analista dentro del mismo laboratorio), dejando por
fuera la reproducibilidad que requiere el apoyo de otros laboratorios de ensayo con los que
no es posible contar para este trabajo.
La especificidad es otro punto limitado. Según la USP (Farmacopeia de los Estados

Unidos de América 35, 2011) es necesario determinar la separación de principios activos,
componentes de la matriz, impurezas y productos de degradación, sin embargo, este
trabajo se va a limitar a componentes de la matriz del medicamento y principio activo,
dejando de lado los posibles productos de degradación e impurezas debido al alto costo que
requiere adquirirlos.
Por último, no es posible contar con un patrón primario del principio activo y
componentes de la matriz, sin embargo se dispone de patrones secundarios con
concentraciones certificadas por cada proveedor.
3
Capítulo 2. MARCO TEORICO
2.1. Cromatografía
El término cromatografía designa varias técnicas similares que permiten la

separación de diferentes especies moleculares de una mezcla, las especies moleculares
sujetas a la separación existen en una muestra, y esta se compone de analitos y matriz, los
analitos son las especies moleculares de interés y la matriz es el resto de los componentes
en la muestra, para la separación cromatográfica, la muestra es introducida en el flujo de
una fase móvil que pasa por una fase estacionaria, la fase estacionaria retiene fuerte o
débilmente las diferentes especies moleculares que pasan separándolas en el tiempo antes
de devolverlas a la fase móvil, cuando la fase móvil es una gas la cromatografía es llamada
cromatografía de gases, y cuando es un líquido es llamada cromatografía de líquidos.
(Moldoveanu & David, 2013)
En la cromatografía líquida de alto rendimiento o presión (HPLC), la fase estacionara esta

generalmente formada de una columna empacada con partículas porosas que tienen
diámetros de 1 a 5 µm de diámetro, la fase móvil líquida o efluente es movida a través de la
columna por una bomba de elevada presión, los solutos son inyectados en la fase móvil
como un pequeño volumen al inicio de la columna cromatográfica, las diferentes moléculas
eludidas pueden ser detectadas valiéndose de alguna de sus propiedades fisicoquímicas
como lo son la absorción UV, índice de refracción, fluorescencia, masa molecular,
fragmentación en un espectrofotómetro de masa, entre otras, finalmente una señal
eléctrica asociada con la detección de una molécula es graficado contra el tiempo en que
fue eluido, este tipo de gráfico es conocido como cromatograma. (Moldoveanu & David,
2013)
Los componentes separados de una mezcla eluyen a diferentes tiempos, conocidos como
tiempos de retención, diferentes picos en el cromatograma corresponden a diferentes
componentes de la mezcla. (Moldoveanu & David, 2013)
4
En HPLC los analitos son separados entre ellos así como de la matriz tanto como sea posible,
la zona ocupada por un analito específico en un cromatograma puede ser muy angosta o
ancha, el ancho de esta zona afecta la separación , para dos analitos con diferentes tiempo
de retención, la separación es mejor cuando las zonas de elución son más angostas, la altura
de estos picos o su área depende de factores como la cantidad de componente en la mezcla,
la cantidad inyectada y la sensibilidad de método de detección, debido a esto pueden
usarse para la cuantificación del componente en cuestión luego de una apropiada
calibración. (Moldoveanu & David, 2013)
El proceso de separación en HPLC se basa en un equilibrio establecido entre las moléculas

presentes en la fase móvil y las retenidas en la fase estacionaria, la diferencia en la
concentración de una especie molecular en una fase y la otra determina que especie es
eluida o retenida can la fase móvil, cuando la concentración del analito es más alta en la
fase móvil que en la estacionaria el analito es eluido más rápidamente en la columna
cromatográfica, en cambio cuando es más alta su concentración en la fase estacionaria que
en la fase móvil, este es más fuertemente retenido y por lo tanto es eluido en un periodo de
tiempo mayor. (Moldoveanu & David, 2013)
2.2. Validación de métodos analíticos
La validación se define como el establecimiento de pruebas de laboratorio,

debidamente documentadas, que aportan un alto grado de seguridad de que un proceso
planificado se efectuará uniformemente en conformidad con los resultados previstos
especificados, es decir, que dicho proceso será apropiado para el uso propuesto. Los
estudios de validación son aplicables a los métodos analíticos no codificados en las
Farmacopeas, a los equipos tanto de producción como analíticos, a las computadoras,
programas y sistemas, así como a los servicios del establecimiento y a los procesos. (Volonté
& Quiroga, 2013)
Los objetivos de una validación son otorgar Confiabilidad, Seguridad y Efectividad al

proceso que se está validando. (Volonté & Quiroga, 2013)
5
Las validaciones pueden ser retrospectivas cuando combinan nuevos criterios con la
experiencia adquirida anteriormente o prospectivas cuando se inicia desde un comienzo
una validación. La revalidación se realiza cuando procedimientos o métodos ya validados
han sufrido alguna modificación o cambios en la droga o en la composición del producto y
por lo tanto se deben volver a validar. También se debe realizar cuando la matriz o la
concentración de analito son distintas a las originalmente analizadas. (Volonté & Quiroga,
2013)
2.3. Parámetros de validación
Todos los ensayos o mediciones realizadas en la validación se llevan a cabo con el fin
de poder realizar las pruebas de parámetros de validación los cuales son la selectividad,
linealidad, sensibilidad, límites, exactitud, precisión, robustez y aplicabilidad, en la tabla 2.1
se muestra que parámetros deben evaluarse dependiendo del tipo de método. (Instituto de
Salud Pública Chile, 2010)
Tabla 2.1: Parámetros de validación a evaluarse dependiendo del tipo de método
Parámetro a Método Método cuantitativo

evaluar cualitativo Normalizado Modificado Nuevo
Especificidad Si No Si Si
Linealidad No Si Si Si
Sensibilidad No Si o No Si Si
Límites Si Si o No Si Si
Precisión No Si Si Si
Veracidad No Si o No Si o No Si
Robustez No No Si o No Si
Aplicabilidad Si Si Si Si
(Instituto de Salud Pública Chile, 2010)
6
2.3.1. Especificidad
La especificidad es la capacidad de evaluar inequívocamente el analito en presencia

de componentes, que se puede esperar que estén presentes. Típicamente, éstas pueden
incluir impurezas, productos de degradación, matriz, etc. (Jimidar, Heylen, & De Smet, 2007)
Los picos del blanco deben estar de preferencia ausentes o, si están presentes, no
deben interferir con los picos de interés. Los picos de los excipientes, así como los
correspondientes a productos de degradación e impurezas deben separarse de los picos
correspondientes a los componentes de interés. (Jimidar, Heylen, & De Smet, 2007)
La pureza de pico de los componentes principales debe evaluarse preferentemente

mediante una técnica ortogonal y no debe dar lugar a nuevas impurezas por encima del
umbral de notificación. La técnica ortogonal puede ser otro método cromatográfico o un
método específico de identificación de análisis espectral como, por ejemplo, detección de
fotodiodos en serie (UV-DAD) o detección de espectroscopia de masas. (Jimidar, Heylen, &
De Smet, 2007)
En el caso de detección con fotodiodos en serie un algoritmo analiza los espectros

de absorbancia a través del pico, los cuales se comparan con el espectro ápice, que se utiliza
como punto de referencia interno, si hay diferencias espectrales, implica que hay dos o más
compuestos eluyendo en ese pico cromatográfico cada uno siendo espectralmente
diferente, un detector de fotodiodos en serie determina la homogeneidad espectral a través
del pico, lo cual no es prueba de pureza química debido a que la impureza debe de ser
espectralmente diferente al analito, debe de existir alguna resolución entre el analito y la
impureza, además de que la impureza debe de estar presente en una concentración mayor
al límite de detección. (Waters Corporation, 1996)
La falta de especificidad puede ser compensada por otros métodos analíticos de

apoyo, pero finalmente el método o métodos de ensayo deben ser capaces de asegurar la
identidad de un analito (métodos para pruebas de identificación), asegurarse de que el
7
método permite una declaración exacta del contenido de impurezas (métodos para prueba
de pureza), proporcionan un resultado exacto, que permite una declaración precisa sobre el
contenido o la potencia del analito en la muestra (métodos para cuantificación de
contenido). (Jimidar, Heylen, & De Smet, 2007)
2.3.2. Linealidad
La linealidad de un método analítico es su capacidad de producir resultados

directamente proporcionales a la concentración de analito, dentro de un intervalo de
concentración. En algunos casos puede ser necesaria la aplicación de transformaciones
matemáticas para obtener una recta. El intervalo se refiere al rango de concentraciones de
analito que pueden ser determinadas con precisión y exactitud. Normalmente se expresa
con las mismas unidades que los resultados del ensayo. (Volonté & Quiroga, 2013)
La linealidad debe establecerse a lo largo del intervalo de concentraciones del

método analítico. Se debe establecer por medio de un método estadístico adecuado, por
ejemplo regresión por mínimos cuadrados. Deben informarse el coeficiente de correlación
(r), el coeficiente de determinación (r2) la ordenada al origen (a) y la pendiente (b) de la
recta de regresión. (Volonté & Quiroga, 2013)
Se evalúa la linealidad por el método de regresión de los cuadrados mínimos, de tal

manera de obtener la ecuación de una recta:
𝒚 = 𝒂 + 𝒃𝒙 Ecuación 2.1
La ordenada (a) evalúa la proporcionalidad entre la señal y la concentración, si hay

errores aleatorios, la recta no pasa por cero. (Volonté & Quiroga, 2013)
∑ 𝒚𝒊 −𝒃 ∑ 𝒙𝒊
𝒂= Ecuación 2.2
𝒏
La pendiente (b) evalúa la sensibilidad del método. (Volonté & Quiroga, 2013)
8
∑ 𝒙𝒊 ∑ 𝒚𝒊
∑ 𝒙𝒊 𝒚𝒊 −
𝒏
𝒃= 𝟐 Ecuación 2.3
𝟐 (∑ 𝒙𝒊)
∑ 𝒙𝒊 −
𝒏
El coeficiente de regresión lineal (r) mide el ajuste al modelo lineal. (Volonté &
Quiroga, 2013)
∑ 𝒙𝒊 ∑ 𝒚𝒊
∑ 𝒙𝒊 𝒚𝒊 −
𝒏
𝒓= Ecuación 2.4
𝟐 𝟐
(∑ 𝒙𝒊) (∑ 𝒚𝒊)
√(∑ 𝒙𝟐𝒊 − )(∑ 𝒚𝟐𝒊 − )
𝒏 𝒏
El valor r=1 indica una recta perfectamente lineal, un valor r=0 indica la no
correlación entre x e y. (Volonté & Quiroga, 2013)
2.3.3. Límites de detección y de cuantificación
El límite de detección (LOD) es la cantidad o concentración más pequeña de analito

que puede detectarse. El método más sencillo para calcular LOD es determinar la cantidad o
concentración de un analito que produce una altura de pico con un valor de relación señal /
ruido (S / N) de 3. (Dong, 2006)
El lımite de cuantificación (LOQ) es el nivel más bajo que un analito puede

cuantificarse con cierto grado de certidumbre, por ejemplo, con una precisión de ± 5%. El
método más simple para calcular la LOQ es determinar la cantidad o concentración de un
analito que produce un pico con una relación señal / ruido de 10. (Dong, 2006)
La determinación LOQ o LOD sólo se requiere para los métodos de alta sensibilidad
que implican componentes de trazas tales como métodos de impureza o métodos de
validación de limpieza. (Dong, 2006)
2.3.4. Exactitud
La ‘exactitud’ de medición expresa la proximidad de un único resultado a un valor

de referencia. La validación de métodos trata de investigar la exactitud de los resultados
evaluando los efectos sistemáticos y aleatorios sobre resultados individuales. Por lo tanto,
9
normalmente la exactitud se estudia como dos componentes: ‘veracidad’ y ‘precisión’.
Además, una expresión cada vez más común de exactitud es "incertidumbre de medición', la
cual proporciona un solo valor. (Morillas & colaboradores, 2016)
2.3.5. Veracidad
La veracidad de medición es una expresión de la proximidad de la media de un

número infinito de resultados producidos con el método a un valor de referencia. Puesto
que no es posible realizar un número infinito de mediciones, no se puede medir la
veracidad. Sin embargo, podemos realizar una evaluación práctica de la veracidad. Por lo
general, esta evaluación se expresa cuantitativamente en términos de 'sesgo'. (Morillas &
colaboradores, 2016)
Una determinación práctica del sesgo se basa en la comparación de la media de los

resultados (x) del método candidato con un valor de referencia adecuado (xref). (Morillas &
colaboradores, 2016)
El sesgo puede expresarse en términos absolutos
𝒃 = 𝒙 − 𝒙𝒓𝒆𝒇 Ecuación 2.5
O en términos relativos en porcentaje
𝒙−𝒙𝒓𝒆𝒇
𝒃(%) = 𝟏𝟎𝟎 Ecuación 2.6
𝒙𝒓𝒆𝒇
O como recuperación relativa o aparente
𝒙
𝑹(%) = 𝟏𝟎𝟎 Ecuación 2.7
𝒙𝒓𝒆𝒇
Los sesgos deben ser tan pequeños como sea posible para que el valor medio
experimental se aproxime al de referencia o verdadero, si no fuera así y según su
significancia los aceptaremos o reformularemos el protocolo de aplicación del método, para
minimizarlos o adaptarlos a los requerimientos exigidos para cada método analítico, en lo
que a errores se refiere. (Volonté & Quiroga, 2013)
10
La exactitud debe evaluarse mediante el diseño que emplea un mínimo de nueve
determinaciones sobre un mínimo de tres niveles de concentración que cubran el intervalo
especificado para linealidad, por ejemplo tres concentraciones al 70, 100 y 130% del valor
esperado, al que se le agregan los excipientes del producto, ensayo de recuperación, con
tres repeticiones completas del método para cada una de las concentraciones. Puede
utilizarse un test t de Student, efectuando varias determinaciones de la muestra de
concentración conocida y calculando el t experimental, tob, que se compara con el t de tabla
para (n-1) grados de libertad en el nivel de confianza escogido, generalmente p = 0,05.
(Volonté & Quiroga, 2013)
H0: no hay error sistemático o el sesgo no es significativo
|𝒙−𝒙𝒓𝒆𝒇 |
𝒕𝒐𝒃 = 𝑺 Ecuación 2.8
√𝒏
Siendo S la desviación estándar y n el número de mediciones independientes.

(Volonté & Quiroga, 2013)
2.3.6. Precisión
La precisión de un método es el grado de cercanía entre los resultados de pruebas

independientes y se suele expresar en términos de desviación estándar. Generalmente
depende de la concentración del analito, y esta dependencia debe ser determinada y
documentada. Se puede expresar de diferentes maneras dependiendo de las condiciones en
que se calcula. (CITAC and EURACHEM, 2002)
La repetibilidad es un tipo de precisión relacionado con mediciones realizadas en

condiciones repetibles, es decir el mismo método, mismo material, mismo operador mismo
laboratorio, periodo de tiempo corto entre mediciones. (CITAC and EURACHEM, 2002)
11
La reproducibilidad es un concepto de precisión relativo a mediciones realizadas en
condiciones reproducibles, es decir el mismo método, operador diferente, diferentes
laboratorios, equipos diferentes, período de tiempo largo entre mediciones. (CITAC and
EURACHEM, 2002)
Nótese que estas afirmaciones de precisión se refieren al análisis cuantitativo. El

análisis cualitativo puede ser tratado de una manera ligeramente diferente. El análisis
cualitativo es efectivamente una medición de sí / no a un valor límite de un analito
determinado. (CITAC and EURACHEM, 2002)
La razón de Horwitz (HorRat) es un parámetro de rendimiento normalizado que

indica la aceptabilidad de los métodos de análisis con respecto a la precisión entre
laboratorios (reproducibilidad) e inter laboratorio (precisión). Es más o menos
independiente del analito, matriz, método y tiempo de publicación. Actualmente es uno de
los criterios de aceptabilidad de muchos de los métodos químicos de análisis recientemente
adoptados por AOAC (Association of Official Analytical Chemists) INTERNATIONAL, la Unión
Europea y otras organizaciones europeas que se ocupan del análisis de alimentos como el
Comité Europeo de Normalización y el Comité Nórdico Analítico. Es la proporción de la
desviación estándar relativa observada calculada a partir de los datos reales de rendimiento,
RSDR (%), a la correspondiente desviación estándar relativa prevista calculada a partir de la
ecuación de Horwitz (Horwitz & Albert, 2006)
PRSDR(%) = 2C-0,15 Ecuación 2.9
Donde C es la concentración encontrada o añadida, expresado como una fracción

de masa. (Horwitz & Albert, 2006)
𝑹𝑺𝑫𝑹
𝑯𝒐𝒓𝑹𝒂𝒕 = Ecuación 2.10
𝑷𝑹𝑺𝑫𝑹
Transforma la RSD encontrada en una fracción de la RSD esperada por la aplicación

de la ecuación exponencial a la concentración, por lo tanto la precisión encontrada es
expresada como una fracción de la precisión calculada a partir de las estimaciones de la
12
concentración experimental, esta es igual a 1 para correspondencia exacta, la precisión es
mejor de lo esperado si la relación es menor que 1 y más pobre si es mayor que 1, el rango
aceptable empírico es de 0,5 a 2,0. (Horwitz & Albert, 2006)
Las desviaciones consistentes de la relación en el lado bajo (valores <0,5) pueden

indicar un promedio no declarado o una excelente formación y experiencia, las desviaciones
consistentes en el lado alto (valores> 2) pueden indicar la no homogeneidad de las muestras
de ensayo, la necesidad de optimización adicional del método o entrenamiento, operando
por debajo del límite de determinación, o un método insatisfactorio. (Horwitz & Albert,
2006)
2.3.7. Incertidumbre
Es un parámetro, asociado con el resultado de una medición, que caracteriza la

dispersión de los valores que podrían atribuirse razonablemente al mensurando, este
parámetro puede ser, por ejemplo, una desviación estándar o un múltiplo dado de ella, o la
mitad de ancho de un intervalo que tenga un nivel de confianza establecido. (ISO/TC 69/SC
6, 2002)
La incertidumbre de la medición comprende, en general, muchos componentes.

Algunos de estos componentes pueden evaluarse a partir de la distribución estadística de
los resultados de una serie de mediciones y pueden caracterizarse por desviaciones
estándar experimentales. Los otros componentes, que también pueden caracterizarse por
desviaciones estándar, se evalúan a partir de distribuciones de probabilidad supuestas
basadas en la experiencia u otra información. (ISO/TC 69/SC 6, 2002)
Es posible estimar la incertidumbre de una determinación química a partir de los

resultados obtenidos para la repetibilidad, reproducibilidad y veracidad, el modelo
estadístico utilizado es el siguiente: (ISO/TC 69/SC 6, 2002)
𝒚 = 𝜹 + 𝒄𝒙 + 𝒆 Ecuación 2.11
13
Donde y es la concentración relativa del analito, 𝛿 representa el sesgo intrínseco del
𝑑𝑦⁄
método, e el término del error, x el área del pico del analito y c el coeficiente lineal 𝑑𝑥 ,
el cual puede ser estimado del estudio de linealidad. (ISO/TC 69/SC 6, 2002)
Teniendo el modelo de la ecuación 5.3, la incertidumbre estándar combinada u(y)

asociada con una observación puede ser estimada como: (ISO/TC 69/SC 6, 2002)
𝒖(𝒚) = 𝑺𝟐𝑹 + 𝒖(𝝁

̂ )𝟐 + 𝒄𝟐 𝒖(𝒙)𝟐 Ecuación 2.12
Donde 𝑆𝑅2 es la desviación estándar observada en el ensayo de reproducibilidad,

𝑢(𝜇̂ ) la incertidumbre de la estimación de 𝛿, la cual puede ser determinada como la
desviación estándar observada en el ensayo de veracidad y 𝑢(𝑥) la incertidumbre sobre el
valor de x, (ISO/TC 69/SC 6, 2002) estimada de la desviación estándar en el área de la
inyección del mismo estándar 5 veces seguida.
El factor de cobertura (k) es un multiplicador elegido sobre la base del nivel de

confianza deseado que se asociará con el intervalo definido por (Desimoni & Brunetti, 2011)
𝑼 = 𝒌𝒖(𝒚) Ecuación 2.13
Donde U es la incertidumbre expandida, con frecuencia, k está en el rango de 2 a 3.

Cuando se aplica la distribución normal y u(y) es una estimación confiable de la desviación
estándar del mensurando, un valor de k igual a 2 define un intervalo que tiene un nivel de
confianza de aproximadamente el 95% (más exactamente, un nivel de confianza del
95,45%), y k igual a 3 define un intervalo que tiene un nivel de confianza de
aproximadamente el 99% (más exactamente, un nivel de confianza de 99.73%. (Desimoni &
Brunetti, 2011)
Cuanto mayor sea el valor de U mayor será la proporción de las muestras que se
juzgará incorrectamente. Cuanto menor sea el valor de U, en general, mayor será el costo
del análisis. Por lo tanto, lo ideal es que se elija para minimizar los costos de análisis más los
costos de las decisiones. Sin embargo, la información necesaria para hacer esto rara vez está
14
disponible. En algunos casos, donde la especificación establece límites superior e inferior, el
tamaño máximo permitido de U se da como una fracción de la diferencia entre estos límites.
(EURACHEM/CITAC, 2007)
2.3.8. Robustez
La robustez de un método analítico es la resistencia al cambio en los resultados

producidos por un método analítico cuando se hacen pequeñas variaciones de las
condiciones experimentales descritas en el procedimiento. Los límites para los parámetros
experimentales deben ser prescritos en el protocolo del método, y tales desviaciones
permisibles, por separado o en cualquier combinación, no deben producir ningún cambio
significativo en los resultados producidos. Los aspectos del método que son susceptibles de
afectar los resultados deben ser identificados y su influencia en el rendimiento del método
evaluado por medio pruebas de robustez. (THOMPSON, ELLISON, & WOOD, 2002)
Para evaluar la robustez primero se identifican las variables que podrían tener un
efecto significativo en el desempeño del método, por medio de un diseño de experimentos
se evalúa el efecto de cada cambio de condición en los resultados de la medida, se clasifican
las variables según el mayor efecto sobre el desempeño del método, se realizan pruebas de
significación para determinar si los efectos observados son estadísticamente significativos.
(Morillas & colaboradores, 2016)
2.3.9. Aptitud del Sistema o Test de Adecuabilidad
Es una herramienta cuya aplicación permite verificar que determinados parámetros

instrumentales se mantienen bajo control, confirmando que nuestro sistema en particular
brinda resultados dentro de los límites especificados, es útil ya que son habituales las
variaciones en la estabilidad de los reactivos, equipos y analistas. (Volonté & Quiroga, 2013)
Los parámetros de aptitud del sistema se determinan para el pico de las sustancias
de interés, uno de estos parámetros es la resolución (R) que es una medida combinada de la
15
separación de dos compuestos e incluye la dispersión de picos y alguna forma de
selectividad. La resolución se define como
𝒕 −𝒕
𝑹 = 𝟐 𝒘𝟐 +𝒘𝟏 Ecuación 2.14
𝟐 𝟏
Donde t2 y t1 son los tiempos de retención y w1 y w2 son los anchos de pico en la

línea base para los dos compuestos a los que se le desea calcular la resolución.
Otro de los parámetros de adecuabilidad es el Número de Platos Teóricos (N) que es

la medida del grado de dispersión de picos en una columna particular lo que es un indicativo
de la eficiencia de la columna cromatográfica.
𝒕 𝟐
𝑵 = 𝟏𝟔 (𝒘𝒓 ) Ecuación 2.15
Donde tr es el tiempo de retención del analito y w el ancho del pico en la línea base.
El factor de asimetría (As) o tailing es una medida de la simetría del pico, el cual también es
un parámetro de aptitud del sistema, es 1 para los picos perfectamente simétricos y su valor
aumenta a medida que la asimetría es más pronunciada, en algunos casos, pueden
observarse valores menores de la unidad, como consecuencia de la asimetría del pico, la
integración y la precisión se tornan menos confiable. (Volonté & Quiroga, 2013)
𝑾𝟎,𝟎𝟓
𝑨𝒔 = Ecuación 2.16
𝟐𝒇
Dónde:
As: factor de asimetría
W0,05: ancho del pico al 5% de la altura
f: la distancia entre el borde simétrico del pico y el centro del mismo medida al 5%
de la altura
Para evaluar si se cumplen los requisitos de aptitud del sistema se realizan

inyecciones repetidas de la Preparación estándar empleada en la Valoración u otra Solución
16
estándar, para calcular la desviación estándar relativa (RSD) o Coeficiente de Variación (CV),
se emplean los datos de cinco inyecciones repetidas del estándar si el requisito es 2,0% o
menor, y seis inyecciones repetidas si el requisito de la desviación estándar relativa es
mayor de 2,0% . (Volonté & Quiroga, 2013)
2.3.10. Estabilidad
Para validar un método debe demostrarse en qué medida los analitos se mantienen
estables durante todo el procedimiento de análisis, incluido su almacenamiento antes y
después de éste. En general, la medición se hace comparando patrones recién preparados
con una concentración conocida con patrones similares almacenados durante diferentes
períodos de tiempo y en diferentes condiciones. (Oficina de las Naciones Unidas contra la
Droga y el Delito, 2010)
2.3.11. Aplicabilidad
La aplicabilidad consiste en una declaración de las especificaciones del rendimiento

del método, que se entrega en el informe de validación y que normalmente incluye la
identidad de la sustancia analizada, el intervalo de concentraciones cubierto por la
validación, una especificación de la gama de las matrices del material de prueba cubierto
por la validación, la aplicación prevista y de sus requisitos de incertidumbre críticos.
(Instituto de Salud Pública Chile, 2010)
2.4. ANOVA
El análisis de varianza (ANOVA) es la técnica central en el análisis de datos

experimentales. La idea general de esta técnica es separar la variación total en las partes
con las que contribuye cada fuente de variación en el experimento. (Gutiérrez Pulido & de la
Vara Salazar, 2008)
Notación de puntos
17
Sirve para representar de manera abreviada cantidades numéricas que se pueden
calcular a partir de los datos experimentales, donde 𝑌𝑖𝑗 representa la j-ésima observación en
el tratamiento i, con i = 1, 2,…, k y j = 1, 2,…, ni. Las cantidades de interés son las siguientes:
(Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
𝑌𝑖• = Suma de las observaciones del tratamiento i.
𝑌̅𝑖• = Media de las observaciones del i-ésimo tratamiento.
𝑌•• = Suma total de las N = n1 + n2 +…+ nk mediciones.
𝑌̅•• = Media global o promedio de todas las observaciones.
El punto indica la suma sobre el correspondiente subíndice. Así, algunas relaciones

válidas son, (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
𝒏
𝒀𝒊• = ∑𝒋=𝟏
𝒊
𝒀𝒊𝒋 Ecuación 2.17
𝒏𝒊 𝒀
∑𝒋=𝟏 𝒊𝒋
̅ 𝒊• =
𝒀 Ecuación 2.18
𝒏𝒊
𝒏
𝒀•• = ∑𝒌𝒊=𝟏 ∑𝒋=𝒊
𝒊
𝒀𝒊𝒋 Ecuación 2.19
̅ •• = 𝒀••
𝒀 Ecuación 2.20
𝑵
Donde 𝑁 = ∑𝑘𝑖=1 𝑛𝑖 es el total de las observaciones.
El objetivo del análisis de varianza es probar la hipótesis de igualdad de los

tratamientos con respecto a la media de la correspondiente variable de respuesta:
(Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
𝑯𝟎 : 𝝁𝟏 = 𝝁𝟐 = ⋯ = 𝝁𝒌 = 𝝁 Ecuación 2.21
𝑯𝑨 : 𝝁𝒊 ≠ 𝝁𝒋 para algún 𝒊 ≠ 𝒋 Ecuación 2.22
La cual se puede escribir en forma equivalente como:
𝑯𝟎 : 𝝉𝟏 = 𝝉𝟐 = ⋯ = 𝝉𝒌 = 𝟎 donde 𝝉𝒊 = 𝝁𝒊 − 𝝁 Ecuación 2.23
18
𝑯𝑨 : 𝝉𝒊 ≠ 𝟎 para algún i Ecuación 2.24
Donde 𝜏𝑖 es el efecto del tratamiento i sobre la variable de respuesta. Si se acepta

H0 se confirma que los efectos sobre la respuesta de los k tratamientos son
estadísticamente nulos, iguales a cero, y en caso de rechazar se estaría concluyendo que al
menos un efecto es diferente de cero. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
Para probar la hipótesis dada mediante la técnica de ANOVA, lo primero es

descomponer la variabilidad total de los datos en sus dos componentes: la variabilidad
debida a tratamientos y la que corresponde al error aleatorio. (Gutiérrez Pulido & de la Vara
Salazar, 2008)
Una medida de la variabilidad total presente en las observaciones es la suma total

de cuadrados (SCT) dada por (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
𝒏𝒊
𝑺𝑪𝑻 = ∑𝒌𝒊=𝟏 ∑𝒋=𝟏 ̅ •• )𝟐
(𝒀𝒊𝒋 − 𝒀 Ecuación 2.25
̅ 𝒊• − 𝒀
𝑺𝑪𝑻 = ∑𝒌𝒊=𝟏 𝒏𝒊 (𝒀 ̅ 𝒊• )𝟐
̅ •• )𝟐 + ∑𝒌𝒊=𝟏 ∑𝒏𝒊 (𝒀𝒊𝒋 − 𝒀 Ecuación 2.26
𝒋=𝟏
Donde el primer componente de la ecuación 2.10 es la suma de cuadrados de

tratamientos (SCTRAT) y el segundo es la suma de cuadrados del error (SCE). Al observar con
detalle estas sumas de cuadrados se aprecia que la SCTRAT mide la variación o diferencias
entre tratamientos, ya que si éstos son muy diferentes entre sí, entonces la diferencia
𝑌̅𝑖• − 𝑌̅•• tenderá a ser grande en valor absoluto, y con ello también será grande la SC TRAT.
Mientras que la SCE mide la variación dentro de tratamientos, ya que si hay mucha variación
entre las observaciones de cada tratamiento entonces 𝑌𝑖𝑗 − 𝑌̅𝑖• tenderá a ser grande en
valor absoluto. En forma abreviada, esta descomposición de la suma total de cuadrados se
puede escribir como: (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
𝑺𝑪𝑻 = 𝑺𝑪𝑻𝑹𝑨𝑻 + 𝑺𝑪𝑬 Ecuación 2.27

𝑛𝑖
Como hay un total de 𝑁 = ∑𝑖=1 𝑛𝑖 observaciones, la SCT tiene N – 1 grados de
libertad, hay k tratamientos o niveles del factor de interés, así que SC TRAT tiene k – 1 grados
de libertad, mientras que la SCE tiene N – k. Los grados de libertad que corresponden a los
19
términos de la ecuación 2.11 cumplen una relación similar dada por: (Gutiérrez Pulido & de
la Vara Salazar, 2008)
𝑵 − 𝟏 = (𝒌 − 𝟏) + (𝑵 − 𝒌) Ecuación 2.28
Las sumas de cuadrados divididas entre sus respectivos grados de libertad se llaman
cuadrados medios. Los dos que más interesan son el cuadrado medio de tratamientos y el
cuadrado medio del error, que se denotan por (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
𝑺𝑪𝑻𝑹𝑨𝑻
𝑪𝑴𝑻𝑹𝑨𝑻 = Ecuación 2.29
𝒌−𝟏
𝑺𝑪𝑬
𝑪𝑴𝑬 = Ecuación 2.30
𝑵−𝒌
Los valores esperados de los cuadrados medios están dados por
𝑬(𝑪𝑴𝑬 ) = 𝝈𝟐 Ecuación 2.31
∑𝒌
𝒊=𝟏 𝒏𝒊 𝝉𝒊
𝑬(𝑪𝑴𝑻𝑹𝑨𝑻 ) = 𝝈𝟐 + Ecuación 2.32
𝑵−𝒌
En estas expresiones se aprecia que cuando la hipótesis nula es verdadera, ambos

cuadrados medios estiman la varianza 𝜎 2 , ya que el segundo término de la expresión para el
E(CMTRAT) sería igual a cero. Con base en este hecho se construye el estadístico de prueba
como sigue: se sabe que SCE y SCTRAT son independientes, por lo que SCE /𝜎 2 y SCTRAT /𝜎 2 son
dos variables aleatorias independientes con distribución ji-cuadrada con N – k y k – 1 grados
de libertad, respectivamente. Entonces, bajo el supuesto de que la hipótesis H 0 es
verdadera, el estadístico (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
𝑪𝑴𝑻𝑹𝑨𝑻
𝑭𝟎 = Ecuación 2.33
𝑪𝑴𝑬
Sigue una distribución F con (k – 1) grados de libertad en el numerador y (N – k)

grados de libertad en el denominador. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
Así, para un nivel de significancia 𝛼 prefijado, se rechaza H0 si 𝐹0 > 𝐹𝛼,𝑘−1,𝑁−𝑘 ,

donde 𝐹𝛼,𝑘−1,𝑁−𝑘 es el percentil (1 − 𝛼)100 de la distribución F. También se rechaza H0 si el
20
valor-p < 𝛼, donde el valor-p es el área bajo la distribución 𝐹𝛼,𝑘−1,𝑁−𝑘 a la derecha del
estadístico F0, es decir, el valor-p = P(F > F0). (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
2.4.1. Verificación de los supuestos ANOVA
La validez de los resultados obtenidos en cualquier análisis de varianza queda

supeditada a que los supuestos del modelo se cumplan. Estos supuestos son: normalidad,
varianza constante (igual varianza de los tratamientos) e independencia. Esto es, la
respuesta (Y) se debe distribuir de manera normal, con la misma varianza en cada
tratamiento y las mediciones deben ser independientes. Estos supuestos sobre Y se
traducen en supuestos sobre el término error (e) en el modelo. (Gutiérrez Pulido & de la
Vara Salazar, 2008)
Es una práctica común utilizar la muestra de residuos para comprobar los supuestos
del modelo, ya que si los supuestos se cumplen, los residuos o residuales se pueden ver
como una muestra aleatoria de una distribución normal con media cero y varianza
constante. Los residuos (𝑒𝑖𝑗 ) se definen como la diferencia entre la respuesta observada
(𝑌𝑖𝑗 ) y la respuesta predicha por el modelo (𝑌̂𝑖𝑗 ), lo cual permite hacer un diagnóstico más
directo de la calidad del modelo, ya que su magnitud señala qué tan bien describe a los
datos el modelo. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
̂ 𝒊𝒋 = 𝒀𝒊𝒋 − 𝒀
𝒆𝒊𝒋 = 𝒀𝒊𝒋 − 𝒀 ̅ 𝒊• Ecuación 2.34
Los supuestos del modelo en términos de los residuos, son:
1. Los 𝑒𝑖𝑗 siguen una distribución normal con media cero.
2. Los 𝑒𝑖𝑗 son independientes entre sí.
3. Los residuos de cada tratamiento tienen la misma varianza 𝜎 2 .
Para comprobar cada supuesto existen pruebas analíticas y gráficas, por sencillez,
muchas veces se prefieren las pruebas gráficas, aunque estas tienen el inconveniente de
21
que no son “exactas”, pero aun así, en la mayoría de las situaciones prácticas proporcionan
la evidencia suficiente en contra o a favor de los supuestos. El uso de las pruebas gráficas
requiere una fuerte evidencia visual para concluir que el supuesto en cuestión no se cumple,
ya que se requiere que la evidencia en contra de un supuesto esté soportada por más de
dos puntos. Cuando son uno o dos los puntos que se salen del comportamiento esperado de
las gráficas se puede tratar de un problema de puntos aberrantes, no de violación del
supuesto en cuestión. Se puede utilizar una prueba analítica para subsanar las
ambigüedades que surjan en la interpretación visual de las gráficas. (Gutiérrez Pulido & de
la Vara Salazar, 2008)
2.4.1.1. Normalidad
Un procedimiento gráfico para verificar el cumplimiento del supuesto de

normalidad de los residuos consiste en graficar los residuos en papel o en la gráfica de
probabilidad normal, esta gráfica del tipo X-Y tiene las escalas de tal manera que si los
residuos siguen una distribución normal, al graficarlos tienden a quedar alineados en una
línea recta; por lo tanto, si claramente no se alinean se concluye que el supuesto de
normalidad no es correcto. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
Cabe enfatizar el hecho de que el ajuste de los puntos a una recta no tiene que ser
perfecto, dado que el análisis de varianza resiste pequeñas y moderadas desviaciones al
supuesto de normalidad. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
2.4.1.2. Prueba de Shapiro-Wilks para normalidad
Consideremos una muestra aleatoria de datos x1, x2,…, xn que proceden de cierta
distribución desconocida denotada por F(x). Se quiere verificar si dichos datos fueron
generados por un proceso normal, mediante las hipótesis estadísticas: (Gutiérrez Pulido &
de la Vara Salazar, 2008)
H0: Los datos proceden de una distribución normal (F(x) es normal)
22
HA: Los datos no proceden de una distribución normal (F(x) no es normal)
Los pasos para la prueba de Shapiro-Wilks son: 1) Se ordenan los datos de menor a
mayor. Denotemos los datos ordenados por X(1), X(2), …, X(n). 2) De tablas para este
procedimiento se obtienen los coeficientes a 1, a2, …, ak, donde k es aproximadamente n/2.
3) Se calcula el estadístico W definido como: (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
𝟏 𝟐
𝑾 (𝒏−𝟏)𝑺𝟐 [∑𝒌𝒊=𝟏 𝒂𝒊 (𝑿(𝒏−𝒊+𝟏) − 𝑿(𝒊) )] Ecuación 2.35
Donde S2 es la varianza muestral. 4) Por último, si el valor del estadístico es mayor

que su valor crítico al nivel 𝛼 seleccionado, se rechaza la normalidad de los datos. (Gutiérrez
Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
2.4.1.3. Varianza constante
Una forma de verificar el supuesto de varianza constante (o que los tratamientos

tienen la misma varianza) es graficando los predichos contra los residuos (𝑌̂𝑖𝑗 vs. 𝑒𝑖𝑗 ), por lo
general 𝑌̂𝑖𝑗 va en el eje horizontal y los residuos en el eje vertical. Si los puntos en esta
gráfica se distribuyen de manera aleatoria en una banda horizontal, sin ningún patrón claro
y contundente, entonces es señal de que se cumple el supuesto de que los tratamientos
tienen igual varianza. Por el contrario, si se distribuyen con algún patrón claro y
contundente, como por ejemplo una forma de “corneta o embudo”, entonces es señal de
que no se está cumpliendo el supuesto de varianza constante. Un claro embudo en los
residuales indicará que el error de pronóstico del modelo tiene una relación directa (positiva
o negativa) con la magnitud del pronóstico (predicho). (Gutiérrez Pulido & de la Vara
Salazar, 2008)
Otra gráfica que ayuda a verificar el supuesto es la gráfica de niveles de factor

contra residuos. En el eje X de esta gráfica se ponen los tratamientos o los niveles de un
factor, y en el eje vertical se agregan los residuos correspondientes a cada tratamiento o
nivel de factor. Si se cumple el supuesto de varianza constante, se espera que la amplitud de
la dispersión de los puntos en cada nivel de factor tenderá a ser similar; y no se cumplirá el
23
supuesto si hay diferencias fuertes en esta amplitud, En la interpretación de estas gráficas
debe considerarse que, en estadística, las pequeñas diferencias por lo general no son
significativas, y también debe tomarse en cuenta la cantidad de observaciones hechas en
cada nivel del factor, puesto que este hecho puede impactar la dispersión aparente en cada
tratamiento. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
Otra interpretación de la gráfica de factor contra residuos es que cuando los

tratamientos o niveles muestran una dispersión diferente de sus residuales
correspondientes, es que el factor o los tratamientos tienen un efecto significativo sobre la
variabilidad de la respuesta. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
2.4.1.4. Prueba de Bartlett para homogeneidad de varianzas
Supongamos que se tienen k poblaciones o tratamientos independientes, cada uno

con distribución normal (𝑁(𝜇𝑖 , 𝜎𝑖2 ), i = 1, 2,…, k), donde las varianzas son desconocidas. Se
quiere probar la hipótesis de igualdad de varianzas dada por: (Gutiérrez Pulido & de la Vara
Salazar, 2008)
𝑯𝟎 : 𝝈𝟐𝟏 = 𝝈𝟐𝟐 = ⋯ = 𝝈𝟐𝒌 = 𝝈𝟐 Ecuación 2.36
𝑯𝑨 : 𝝈𝟐𝒊 ≠ 𝝈𝟐𝒋 para algún 𝒊 ≠ 𝒋 Ecuación 2.37
Mediante un diseño completamente al azar se obtienen k muestras aleatorias de

tamaños ni (i = 1, 2,…, k) de dichas poblaciones, de modo que el total de mediciones es N =
n1 + n2 + … + nk. El estadístico de prueba para la hipótesis está dado por (Gutiérrez Pulido &
𝒒
ℵ𝟐𝟎 = 𝟐, 𝟑𝟎𝟐𝟔 Ecuación 2.38
𝒄
Donde
𝒒 = (𝑵 − 𝒌)𝒍𝒐𝒈𝟏𝟎 𝑺𝟐𝒑 − ∑𝒌𝒊=𝟏(𝒏𝒊 − 𝟏)𝒍𝒐𝒈𝟏𝟎 𝑺𝟐𝒊 Ecuación 2.39

𝟏
𝒄=𝟏+ (∑𝒌𝒊=𝟏(𝒏𝒊 − 𝟏)−𝟏 − (𝑵 − 𝒌)−𝟏 ) Ecuación 2.40
𝟑(𝒌−𝟏)
24
∑𝒌 𝟐
𝒊=𝟏(𝒏𝒊 −𝟏)𝑺𝒊
𝑺𝟐𝒑 = Ecuación 2.41
𝑵−𝒌
Donde 𝑆𝑖2 es la varianza muestral del tratamiento i. Bajo la hipótesis nula de

igualdad de varianza, el estadístico ℵ20 sigue una distribución ji-cuadrada con k – 1 grados de
libertad, por lo que se rechaza H0 cuando ℵ20 es más grande que ℵ2(𝛼,𝑘−1) . Observe que el
estadístico q, en el numerador del estadístico ℵ20 , es grande en la medida de que las

varianzas muestrales 𝑆𝑖2 son diferentes y es igual a cero cuando éstas son iguales. (Gutiérrez
Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
La prueba de Bartlett es sensible a la falta de normalidad de las poblaciones de

interés, por lo que debe comprobarse el cumplimiento de este supuesto. (Gutiérrez Pulido &
2.4.1.5. Independencia
La suposición de independencia en los residuos puede verificarse si se grafica el

orden en que se colectó un dato contra el residuo correspondiente. De esta manera, si al
graficar en el eje horizontal el tiempo (orden de corrida) y en el eje vertical los residuos, se
detecta una tendencia o patrón no aleatorio claramente definido, esto es evidencia de que
existe una correlación entre los errores y, por lo tanto, el supuesto de independencia no se
cumple. Si el comportamiento de los puntos es aleatorio dentro de una banda horizontal, el
supuesto se está cumpliendo. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
La violación de este supuesto generalmente indica deficiencias en la planeación y

ejecución del experimento; asimismo, puede ser un indicador de que no se aplicó en forma
correcta el principio de aleatorización, o de que conforme se fueron realizando las pruebas
experimentales aparecieron factores que afectaron la respuesta observada. Por ello, en caso
de tener problemas con este supuesto, las conclusiones que se obtienen del análisis son
endebles y por ello es mejor revisar lo hecho y tratar de investigar por qué no se cumplió
con ese supuesto de independencia, a fin de reconsiderar la situación. (Gutiérrez Pulido &
25
2.4.1.6. Prueba de Durbin-Watson
Esta prueba permite diagnosticar la presencia de correlación (auto correlación)

entre los residuos consecutivos (ordenados en el tiempo), que es una posible manifestación
de la falta de independencia. La auto correlación se presenta en experimentos en los cuales
cada medición tiene alguna contaminación de la medición inmediata anterior, lo cual
contradice el supuesto de independencia. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
Sea 𝜌 el parámetro que representa la correlación entre residuos consecutivos
𝑪𝒐𝒓𝒓(𝒆𝒕 , 𝒆𝒕−𝟏 ) = 𝝆; 𝒕 = 𝟏, 𝟐, 𝟑, … , 𝒏 Ecuación 2.42
La hipótesis en la prueba de Durbin-Watson es:
𝑯𝟎 : 𝝆 = 𝟎 Ecuación 2.43
𝑯𝑨 : 𝝆 > 𝟎 Ecuación 2.44
Donde la alternativa se toma en el sentido mayor (>) porque la auto correlación

positiva es la más frecuente en la práctica. El estadístico de Durbin-Watson es:
∑𝒏
𝒊=𝟐(𝒆𝒊 −𝒆𝒊−𝟏 )
𝟐
𝒅= ∑𝒏 𝟐 Ecuación 2.45
𝒊=𝟏(𝒆𝒊 )
Donde los 𝑒𝑖 , i = 1, 2, ..., n, son los residuos ordenados en el tiempo. La decisión

sobre la hipótesis, consiste en la siguiente regla:
Si 𝒅 < 𝒅𝑳 se rechaza H0 Ecuación 2.46
Si 𝒅 > 𝒅𝑼 no se rechaza H0 Ecuación 2.47
Si 𝒅𝑳 ≤ 𝒅 ≤ 𝒅𝑼 Sin decisión Ecuación 2.48
Donde dL y dU son cotas que se leen en tablas. Para entrar a las tablas se requiere el
número de residuos n, el nivel de significancia prefijado 𝛼 y el número de variables
explicativas o regresoras en el modelo, p. (Gutiérrez Pulido & de la Vara Salazar, 2008)
26
En caso de interesar la hipótesis de auto correlación negativa (𝐻𝐴 : 𝜌 < 0) secutiliza
el estadístico d’ = 4 – d, donde d se calcula con la ecuación 2.29. En caso de interesar la
hipótesis bilateral con alternativa 𝐻𝐴 : 𝜌 ≠ 0, se combinan las dos pruebas unilaterales de
tamaño a de manera que la prueba bilateral tenga el tamaño deseado 2𝛼. (Gutiérrez Pulido
& de la Vara Salazar, 2008)
2.5. Clorhidrato de Lidocaína
El Clorhidrato de Lidocaína, de formula química clorhidrato de 2-(dietilamino)-N-

(2,6-dimetilfenil) acetamida es un anestésico local de tipo amida con varios usos
terapéuticos, incluyendo anestesia de infiltración, bloques nerviosos regionales, anestesia
superficial y tratamiento de arritmias ventriculares. (Sweetman, 2009)
Figura 2.1 Lidocaína
2.6. Cloruro de Cetilpiridinio
El Cloruro de Cetilpiridinio de formula química cloruro de 1-hexadecilpiridinio es un

antiséptico y tensioactivo catiónico de piridinio cuaternario, este se disocian en solución
acuosa en un catión grande y complejo que es responsable de la actividad superficial y un
anión inactivo más pequeño, además de las propiedades emulsionantes y detergentes, tiene
actividad bactericida frente a Gram-positivos y, a mayor concentración, contra algunas
bacterias Gram-negativas, es ineficaz contra las esporas bacterianas, tiene actividad anti
fúngica variable, y es eficaz contra algunos virus, es más eficaz en solución neutra o
27
ligeramente alcalina y su actividad bactericida se reduce apreciablemente en medio ácido,
su actividad se ve potenciada por los alcoholes. (Sweetman, 2009)
Se utiliza principalmente como pastillas o soluciones para el tratamiento de

infecciones menores de la boca y la garganta. También se utiliza tópicamente para el
tratamiento de infecciones de la piel y los ojos. (Sweetman, 2009)
Figura 2.2 Cloruro de Cetilpiridinio
28
Capítulo 3. ANTECEDENTES
(Belal, Shaalan, & Haggag, 2011)
Desarrollaron y validaron un método para la determinación de Cloruro de

Cetilpiridinio y Clorhidrato de Lidocaína en forma de gel oral por cromatografía líquida de
alta eficiencia, para esto emplearon un detector de arreglo de diodos, una columna Zorbax
SB-C8 (4,6x250 mm con partículas de 5 µm), elución en gradiente usando una fase móvil
compuesta de ácido fosfórico 0,05 M y acetonitrilo, la elución en gradiente inicia con
25%(v/v) de acetonitrilo, ascendiendo linealmente a 85% en 5 minutos y permaneciendo
constante hasta el final de la corrida, el flujo de fase móvil es de 1,2 ml/min y la
cuantificación de los analitos se realiza a 214 y 258 nm basado en la medición de área de los
picos, los tiempos de retención para el clorhidrato de lidocaína y el cloruro de Cetilpiridinio
fueron 3,4 y 7,3 min respectivamente, el rango lineal para la lidocaína fue 5-200 µg/ml
mientras que para el cloruro de cetilpiridinio fue de 10-400 µg/ml con coeficientes de
correlación mayores al 0,999, con porcentajes de recuperación mayores al 97,9%, con
desviaciones estándar relativas para la repetibilidad y precisión intermedia menores a 2,0%,
de este trabajo se tomó la composición fase móvil, el gradiente utilizado, la fase
estacionaria y longitud de la columna como punto de partida para el desarrollo del método,
además de utilizarlo como referencia para comparar los resultados obtenidos en cada
parámetro de validación.
(PCHGS, P.Shanmugasundaram, & P.Y.Naidu, 2013)
Desarrollaron y validaron un método por UPLC para determinar lidocaína y sus

impurezas, utilizaron una columna Agilent eclipse plus C18 (100x4,6 mm, y partículas de 1,8
µm), usando buffer fosfato a pH 4,5 y acetonitrilo en un programa de gradiente de 14
minutos, los compuestos son monitoreados a 230 nm, el flujo es de 1,0 ml/min y la
temperatura es mantenida a 40 C, obtuvieron resoluciones mayores a 2,0 para todos los
pares de componentes, la desviación estándar para los ensayos de repetibilidad y precisión
intermedia fue menor a 1,0%, investigaron la robustez del método al cambio de pH,
29
temperatura de la columna, flujo de fase móvil y composición de fase móvil, obteniendo
porcentajes de recuperación entre el 97-103% , de este trabajo se tomó el flujo de fase
móvil y el control de la temperatura de la columna cromatográfica como punto de partida
para el desarrollo del método.
(Williams, 2002)
Realizo una revisión de los llamados picos fantasmas encontrados en corridas de

HPLC con gradientes los cuales por lo general se deben a contaminantes en los solventes
utilizados, y discutió la manera de minimizar su aparición y efectos en los análisis, como lo
es usar solventes de buena calidad, evitar el almacenamiento de los solventes en recipientes
plásticos, verificar el buen estado del sistema cromatógrafo, inyectar blancos con
regularidad para verificar la idoneidad del sistema y la sustracción electrónica de la línea
base, de este trabajo se tomaron las sugerencias para eliminar los picos fantasmas y las
interferencias debido al gradiente que podrían afectar la determinación de los analitos de
interés.
30
Capítulo 4. MARCO METODOLÓGICO
Repetibilidad
Condiciones cromatograficas Especificidad Precision
Tratamiento de muestra Linealidad Robustez
Preparacion de los Veracidad Estabilidad de muestras y
estándares estándares
Figura 4.1: Esquema general de la metodología
Equipos
El principal equipo utilizado fue un HPLC Alliance 2696 Waters el cual consta de una
bomba cuaternaria marca Waters, un sistema de inyección automática marca Waters, un
horno para columna, un detector con arreglo de fotodiodos, y una columna X-Terra RP-8 de
4,6*250 mm y un tamaño de partícula de 5 µm , este se encuentra conectado a una
computadora con el software de adquisición de datos Empower 2, también se contó con
otro HPLC Alliance 2696 Waters de igual características que el anterior, solo que este está
equipado con un detector de longitud de onda variable de dos canales y una balanza
analítica AND de precisión ±0,0001 g, para el análisis estadístico se utilizó el software
Statgraphics Centurion XVI en su versión de prueba.
Reactivos
31
Para la preparación de patrones de validación, se utilizó patrones de pureza
certificada de los principios activos Clorhidrato de Lidocaína (lote: P13053, potencia: 99,9%,
agua: 6,4%) y Cloruro de Cetilpiridinio (lote: P14204, potencia: 99,6%, agua: 5,2%).
Adicionalmente, se emplearon muestras de grado técnico en la elaboración de la solución
de excipientes (la cual contiene todos los ingredientes de la muestra con excepción del
principio activo).
Para la aplicación y evaluación del método se utilizo agua desionizada

(Conductividad < 1,5µS/cm), Acetonitrilo grado HPLC y ácido orto fosfórico al 85%
4.2. Ajuste del método
4.2.1. Condiciones cromatográficas
Se partió de las condiciones cromatográficas utilizadas por (Belal, Shaalan, &

Haggag, 2011) las cuales son elución en gradiente usando una fase móvil compuesta de
ácido fosfórico 0,05 M y acetonitrilo, la elución en gradiente inicia con 25%(v/v) de
acetonitrilo, ascendiendo linealmente a 85% en 5 minutos y permaneciendo constante hasta
el final de la corrida, así como un flujo 1,2 ml/min, estas se ajustaron en función de los
cromatogramas observados, simetría y tiempos de retención de los picos correspondientes
a los compuestos de interés, así como disminuir la absorbancia de fondo en las zonas de los
picos de interés, se utilizó un detector de fotodiodos en serie para determinar las longitudes
de máxima absorbancia.
En las tablas 4.1 y 4.2 se muestran las condiciones cromatográficas y el gradiente

establecido para el método analítico.
32
Tabla 4.1 Condiciones cromatográficas establecidas para la determinación de Clorhidrato
de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio mediante HPLC
Clorhidrato de lidocaína Cloruro de Cetilpiridinio
Columna X-Terra RP-8 (250 mm) o X-Terra RP-8 (250 mm) o

equivalente equivalente
Temperatura de columna 30 C 30 C
Volumen de inyección 25 µL 25 µL
Longitud de onda (λ) 205 nm 265 nm
Flujo 1,0 ml/min 1,0 ml/min
Tiempo de corrida 20 minutos 20 minutos
Tabla 4.2 Gradiente de fase móvil para la determinación de Clorhidrato de Lidocaína y

Cloruro de Cetilpiridinio mediante HPLC
Tiempo (min) Flujo (ml/min) %v/v Acetonitrilo % v/v H3PO4 0,05 M
0 1 25 75
4 1 25 75
5 1 45 55
6 1 45 55
7 1 65 35
14 1 65 35
16 1 25 75
20 1 25 75
33
4.2.2. Preparación de muestra y estándar
Muestra Estandar
Pesar 40,0 mg de Cloruro

Muestreo de los cramelos
de cetilpiridineo
Pesar 30,0 mg de Clorhidrato

Pesada del caramelo de Lidocaina
Colocar el caramelo en una Llevar a un balon aforado de

fiola de 100 ml 100,0 ml
Agregar 25 ml de agua Disolver con 70 ml de agua

desionizada desionizada
Dilucion del caramelo por

Ultrasonido por 5 minutos
agitacion mecanica
Agitacion magnetica por 45

Aforar con agua desionizada
minutos
Trasvasar 5,00 ml de la solucion

Ultrasonido por 5 minutos anterior a un balón de 50,0 ml
Trasvasar Aforar con agua desionizada

cuantitativamente a un
balón aforado de 50,0 ml
Filtrar por membrana de 0,45
µm
Aforar con agua desionizada
Filtrar por membrana de

0,45 µm
Figura 4.2: Esquema de la preparación de muestra y estándar
4.3. Parámetros de validación
4.3.1. Adecuabilidad
Una vez determinadas las condiciones cromatográficas, se evaluó inyectando por

quintuplicado la solución de los patrones secundarios de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro
de Cetilpiridinio.
Criterios de aceptación (Duque, Lara, & Perez, 2015):
34
• Platos teóricos ≥2000
• Desviación estándar relativa para el área del pico (RSD) ≤2,0
• Factor de asimetría ≤2,0
4.3.2. Especificidad
Se determinó la especificidad del método para los principios activos empleando la

prueba de pureza de pico cromatográfico con detección UV de fotodiodos en serie,
obteniendo cromatogramas en 3D (absorbancia vs tiempo vs longitud de onda) de una
muestra del producto terminado y se determinó la pureza del pico de interés. Así como
también la especificidad de estándares y solución de excipientes tanto degradada como sin
degradar, las condiciones de degradación se observan en la tabla 4.3 y un esquema general
de la determinación de la especificidad en la tabla 4.4.
Tabla 4.3: Condiciones de degradación empleadas. (Duque, Lara, & Perez, 2015)
Hidrólisis Reducción Oxidación
Ácida Básica HCl (0,01-3)N H2O2 30%

Temperatura
HCl (0,01-3)N NaOH (0,01-3)N + Zinc ambiente
Nota: aplicar temperatura entre 45 a 60°C y colocar condiciones más agresivas, de

ser necesario para obtener mínimo 5% de degradación.
35
Tabla 4.4 Esquema metodológico del ensayo de especificidad
Porcentaje de
Porcentaje de
Solución Cloruro de Criterio de
Lidocaína HCl Degradación
muestra Cetilpiridinio aceptación**
(%)*
(%)*
Ácida No existe elución de
Básica algún compuesto en el
Solución de Oxidativa tiempo de retención
0% 0%
excipientes promedio del analito a
Reductiva
la longitud de onda de
trabajo
Acida Angulo de pureza
Básica menor que el límite de
Lidocaína HCl 100% 0% Oxidativa pureza. La Resolución
Reductiva debe ser mayor igual
que 1,5
Acida Angulo de pureza
Básica menor que el límite de
Cloruro de Oxidativa
0% 100% pureza. La Resolución
Cetilpiridinio
Reductiva debe ser mayor igual
que 1,5
Angulo de pureza
Forma
100% 100% Sin degradar menor que el límite de
farmacéutica
pureza.
* Concentración relativa con respecto al valor declarado para el principio activo.

**Criterio de aceptación según protocolo de validación CCQ-VA-025 año 2015 (Duque, Lara,
& Perez, 2015)
Nota: el límite de pureza no tiene un valor específico, el criterio de aceptación es que este
sea mayor que el ángulo límite de pureza únicamente
36
4.3.3. Linealidad
Se determinó la linealidad del método en el intervalo que va desde 70% hasta 130%
del valor declarado de los principio activo, aplicando el método a los cinco patrones de
estándar preparados en ese rango de concentraciones (70%, 85%, 100%,115% y 130%), en la
tabla 4.5 se muestra el esquema metodológico empleado.
Tabla 4.5 Esquema metodológico del ensayo de linealidad
Conc de los Determinaciones

Solución
activos* Réplicas por replica Criterio de aceptación**
muestra
(%)
70 3 1
1. Existe una correlación lineal
significativa (r2≥0,99)
85 3 1
Lidocaína 2. La varianza es constante para
HCL y todas las concentraciones.
100 3 1
Cloruro de 3. Distribución aleatoria de los
Cetilpiridinio residuos(coeficiente de Durbin
115 3 1
Watson > 0,05)
130 3 1
* Concentración relativa con respecto al valor declarado para el principio activo

& Perez, 2015)
37
4.3.4. Veracidad
Se determinó la concentración de los principios activos aplicando el método tres

veces a soluciones de excipientes preparada con tres niveles de concentración de activos
(dos en los extremos de la linealidad y el 100% de la misma), cada una inyectada por
triplicado al equipo HPLC para un total de 9 determinaciones, en la tabla 4.6 se muestra el
esquema metodológico empleado.
Tabla 4.6 Esquema metodológico del ensayo de exactitud
Solución Conc Criterio de

Réplicas Prueba estadística
muestra (%)* aceptación**
70 3 % recobro (97,0-
Placebo t-Student
100 3 103,0)%
cargado
130 3 CV≤3,0%
* Concentración relativa con respecto al valor declarado para el principio activo

& Perez, 2015)
4.3.5. Repetibilidad
Se determinó la repetibilidad del método para los principios activos en términos del
coeficiente de variación aplicando el método seis veces al producto terminado, en la tabla
4.7 se muestra el esquema metodológico empleado.
4.3.6. Estabilidad de las soluciones
Se evaluó nuevamente las soluciones utilizadas en el ensayo de repetibilidad en un

período de 24 y 48 horas para el análisis de estabilidad, en la tabla 4.7 se muestra el
38
Tabla 4.7 Esquema metodológico del ensayo de repetibilidad y estabilidad de soluciones
Solución Conc Criterio de Prueba

Parámetro Réplicas
muestra (%)* aceptación** estadística
Producto Prueba F y t-
Repetibilidad 100 6 CV≤3,0%
terminado Student
Estabilidad de Producto
100 6
soluciones (24 h) terminado %D≤ 3,0% con
t-Student
Estabilidad de Producto respecto al ̅̅̅̅̅
%𝑅
100 6
soluciones (48 h) terminado
& Perez, 2015)
̅̅̅̅̅ )
%D: Porcentaje de diferencia con respecto al porcentaje de recuperación promedio (%𝑅
obtenido en el ensayo de repetibilidad
CV: Coeficiente de variación
4.3.7. Precisión intermedia
Se determinó la precisión intermedia del método para el principio activo dentro del
laboratorio en términos del coeficiente de variación aplicando el método seis veces al
producto terminado, por analistas, días y equipos distintos, en la tabla 4.8 se muestra el
Tabla 4.8 Esquema metodológico del ensayo precisión intermedia.
Analista Solución Conc Prueba

Réplica Criterio de aceptación**
(Equipo) muestra (%)* estadística
A Producto %D≤ 3,0% con respecto al
100 6
(HPLC 1) terminado ̅̅̅̅̅ obtenido en la
%𝑅 t-Student,
B Producto repetibilidad Fisher
100 6
(HPLC 2) terminado CV≤3,0%
39
& Perez, 2015)
̅̅̅̅̅ )
%D: Porcentaje de diferencia con respecto al porcentaje de recuperación promedio (%𝑅
obtenido en el ensayo de repetibilidad
CV: Coeficiente de variación
4.3.8. Evaluación de la robustez
La determinación de la robustez del método analítico se realizó aplicando al

método las siguientes modificaciones:
Tabla 4.9: modificaciones aplicadas al método analítico en el ensayo de robustez
Condición modificada Nivel bajo Nivel alto
Concentración del ácido fosfórico 0,04 M 0,06 M

Temperatura 28 C 32 C
Longitud de onda -2 nm +2 nm
Volumen de inyección 24 µL 26 µL
4
Se empleó un diseño de experimento factorial 2 con cuatro puntos al centro
replicado seis veces para evaluar la robustez del método.
Criterio de aceptación (Morillas & colaboradores, 2016)
 Verificar mediante el ANOVA si existen o no efectos significativos(diagrama de

Pareto)
 Comprobar el cumplimiento de los supuestos del modelo
40
Capítulo 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1. Adecuabilidad
El desarrollo del método analítico se llevó a cabo tomando como punto de partida
las condiciones cromatográficas reportadas por el principal antecedente de este trabajo
(Belal, Shaalan, & Haggag, 2011), con el objeto de establecer las condiciones
cromatográficas que proporcionen un buen desempeño por parte de dicho método para la
detección y cuantificación de los compuestos activos Cloruro de Cetilpiridinio (CCP) y
Clorhidrato de Lidocaína (LD) en una forma farmacéutica de caramelo, cumpliendo a su vez
con los criterios de aceptación de las políticas y normas de validación de métodos analíticos
internas de la empresa farmacéutica para activos CCQ-VA-025.
Debido a que no se contaba en el laboratorio con la columna Zorbax SB-C8 (4.6x250

mm, 5 µm) se utilizó una columna del mismo tamaño y fase estacionaria X-Terra RP-8
(4,6x250 mm, 5 µm), las muestras y estándares se disolvieron directamente en agua, el
volumen de inyección se fijó en 25 µl, el gradiente del método fue modificado para mejorar
la línea base alrededor del tiempo que corresponde a la elución del Cloruro de Cetilpiridinio.
Para el desarrollo del método analítico se empleó un detector de fotodiodos en

serie el cual trabaja en la región 200-400 nm con este se obtuvo la figura 5.1, de la cual se
seleccionaron las longitudes de onda de trabajo para cada uno de los activos, las cuales
fueron 205 nm para el Clorhidrato de Lidocaína y 265 nm para el Cloruro de Cetilpiridinio.
41
0,50
0,45
0,40
0,35
a) 0,30
AU
0,25
0,20
b) 0,15
0,10
0,05
0,00
200,00
250,00
300,00
350,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes
Figura 5.1: Análisis espectral para el estándar de a) Clorhidrato de Lidocaína y b) Cloruro

de Cetilpiridinio
La tabla 5.1 presenta los parámetros cromatográficos obtenidos para ambos activos,
observándose que estos cumplen con los criterios de aceptación establecidos.
Tabla 5.1: Parámetros cromatográficos obtenidos en el estudio de la adecuabilidad
Parámetro Criterio de Clorhidrato de Cloruro de

aceptación Lidocaína Cetilpiridinio
Asimetría ≤2,0 1,2 1,2
Platos Teóricos >2000 5988 64779
Coeficiente de Área:1,1% Área:1,5%

≤2,0%
variación
42
Altura:1,5% Altura:1,2%
En las figura 5.2 y 5.3 se muestran los cromatogramas de los estándares de

Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio a 205 nm y 265 nm respectivamente
utilizando las condiciones de gradientes establecidas obteniendo de estos el tiempo de
retención promedio de 3,9 min para el Clorhidrato de Lidocaína y 11,2 min para el Cloruro
de Cetilpiridinio, mientras que las figuras 5.4 y 5.5 nos muestras los cromatogramas
obtenidos al inyectar agua (blanco) a 205 nm y 265 nm, obteniendo de éstos el tiempo
muerto de 2,5 min, es de destacar que en el cromatograma del blanco a 265 nm se observan
varios picos resultados del gradiente en la zona correspondientes a la elución del Cloruro de
Cetilpiridinio, pero estos son muy pequeños en comparación con el pico obtenido para el
mismo, por lo cual no son integrados por el sistema y no afectan la determinación del
mismo.
0,45
3,849
0,40
0,35
0,30
0,25
AU
0,20
11,262
0,15
10,649
12,514
12,292
0,10
0,05
0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes

Cetilpiridinio a 205 nm
43
0,080
11,260
0,070
0,060
0,050
AU
0,040
0,030
0,020
0,010
0,000
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes

Cetilpiridinio a 265 nm
10,612
0,050
12,028
11,327
12,456
14,273
0,040
13,229
14,532
14,761
11,667
16,950
11,064
10,355
0,030
AU
0,020
8,300
3,232
0,010
0,000
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes
Figura 5.4: Cromatograma de inyección del blanco a 205 nm
44
12,464
0,002
3,224
0,001
AU
0,000
-0,001
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes
Figura 5.5: Cromatograma de inyección del blanco a 265 nm
5.2. Especificidad
Se degradaron cada uno de los activos y la solución de excipientes por separado, ver
sección 4.4.2 para evaluar la especificidad del método analítico, investigándose la existencia
de coelución de algún producto de degradación o excipiente con el analito. Para ello, se
realizó el análisis que integra la información obtenida a diferentes longitudes de onda,
además del tiempo y la absorbancia. Según la Tabla 5.2, los resultados indican que el ángulo
de pureza se mantiene inferior al ángulo límite, lo cual implica que el pico del analito es
espectralmente puro, por lo que no hay evidencia de coelucion en ninguna de las
degradaciones de los activos, ni en la forma farmacéutica.
Tabla 5.2: Ángulos de pureza y ángulos de los picos cromatográficos del Cloruro de
Cetilpiridinio y Clorhidrato de Lidocaína sometidos a diferentes condiciones de
degradación y en la forma farmacéutica
Clorhidrato de Lidocaína Cloruro de Cetilpiridinio

Tratamiento Angulo de Angulo límite Angulo de Angulo límite
pureza pureza
Sin degradar 0,388 1,321 0,091 0,308
Degradación 0,548 1,905 0,102 0,391

acida
Degradación 2,211 7,787 0,088 0,311

básica
45
Degradación 0,322 0,640 1,585 2,845
oxidativa
Degradación 0,680 2,104 0,088 0,310

reductiva
Forma 0,268 0,910 3,357 11,657

farmacéutica
En la tabla 5.3 se observa la resolución de los picos debidos al Clorhidrato de Lidocaína y

Cloruro de Cetilpiridinio con los picos que se encuentran más cercanos, observándose en
todos los casos que esta resolución es mayor a 1,5, cumpliendo con el criterio de
aceptación, las figuras 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 5.10 y 5.11 nos muestran los cromatogramas
correspondientes a la degradación de activos y placebos a 205 nm y 265 nm, observándose
en todos los casos que los picos de los activos no se superponen con ningún otro, lo que
significa que no hay compuesto de degradación o componente de la solución de excipiente
que eluya en los tiempos que corresponden a los activos.
Tabla 5.3: Resolución de los picos de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio en

la solución estándar sin degradar y bajo condiciones de degradación forzada
Tratamiento Resolución para el Resolución para el Cloruro

Clorhidrato de Lidocaína de Cetilpiridinio
Sin degradar 3,18 3,41
Degradación acida 1,62 2,81
Degradación básica 2,20 2,54
Degradación oxidativa 2,45 2,45
Degradación reductiva 1,70 2,81
46
a)
2,748
b)
2,545
0,12
10,514
3,395
0,40
0,10
10,031
0,08 0,30
10,290
6,673
AU
AU
10,771
0,06
12,196
8,978
2,760
0,20
10,500
10,017
0,04
2,432
3,276
2,323
10,760
6,675
12,184
3,388
12,603
11,768
10,291
8,978
0,10
6,090
0,02
0,00 0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes Minutes
3,00
c) d)
2,476
2,752
0,12
10,513
2,50
0,10
2,00
3,785
0,08
10,287
9,223 9,374
AU
1,50
AU
10,773
0,06
12,196
12,619
10,033
11,762
9,820
1,00
2,439
0,04
2,572
8,995
3,278
6,685
10,499
7,214
12,197
12,616
10,353
11,942
10,963
11,620
10,039
9,502
0,50
2,830
6,101
6,452
3,271
8,474
0,02
0,00 0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,003,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes Minutes
2,740
2,50 e)
2,00
1,50
AU
1,00
10,617
10,142
11,329
0,50
10,392
10,869
12,438
12,262
11,543
3,382
4,275
6,831
3,533
9,098
2,512
0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes

acida, c) Degradación básica d) Degradación reductiva y e) Degradación oxidativa a 205
nm
47
0,070
a) 1,60
3,396
10,031
0,060
1,40 b)
0,050
1,20
3,391
0,040 1,00
AU
AU
6,673
0,80
0,030
0,60
0,020
10,515
3,281
2,320
0,40
8,978
9,749
10,017
2,521
10,502
6,675
2,480
0,010
4,632
8,977
2,904
0,20
0,000 0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes Minutes
0,020
10,032
c) d)
3,395
2,441
0,018
2,50
0,016
3,791
0,014
9,224
2,00
0,012
6,685
2,546 2,369
1,50 0,010
AU
3,283
AU
10,514
0,008
9,754
9,373
1,00 0,006
3,601
0,004
10,499
3,354
0,50
7,214
2,695
6,451
6,722
9,698
0,002
0,000
0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes Minutes
1,80
e)
2,734
1,60
1,40
1,20
1,00
AU
0,80
0,60
0,40
10,141
3,516
6,831
0,20
0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes

acida, c) Degradación básica d) Degradación reductiva y e) Degradación oxidativa a 265
nm
48
a)
0,45
2,540
3,522
0,50 3,499
0,40 b)
0,35
0,40
0,30
0,30 0,25
AU
AU
0,20
0,20
0,15
0,10
10,130
10,552
10,132
10,557
0,10
0,05
0,00 0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
Minutes Minutes
3,509
0,50
3,501
c) d)
0,50
0,40 0,40
0,30 0,30
AU
AU
0,20 0,20
2,509
2,366
10,118
10,119
11,905
0,10 0,10
2,601
8,222
8,094
3,283
0,00 0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
Minutes Minutes
3,00
e)
2,749
2,50
2,00
AU
1,50
1,00
3,852
10,621
11,346
10,467
12,468
12,262
0,50
3,433
0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes
Figura 5.8: Cromatogramas del estándar de Clorhidrato de Lidocaína a) Sin degradar, b)

oxidativa a 205 nm
49
0,012 0,010
a) b)
3,499
3,522
2,486
0,010
0,008
0,008
0,006
0,006
AU
AU
0,004
0,004
0,002
0,002
0,000 0,000
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
Minutes Minutes
0,012
c)
3,509
d)
3,501
0,010 0,010
2,365
0,008 0,008
0,006 0,006
AU
AU
0,004 0,004
0,002 0,002
0,000 0,000
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
Minutes Minutes
e)
1,80
2,749
1,60
1,40
1,20
1,00
AU
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes
Figura 5.9: Cromatogramas del estándar del Clorhidrato de Lidocaína a) Sin degradar, b)
oxidativa a 265 nm
50
0,12
a)
10,484
0,40
2,528
0,10 0,35 b)
0,30
0,08
0,25
AU
AU
0,06
0,20
10,471
0,04
10,108 0,15
0,10
10,097
0,02
0,05
0,00 0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
Minutes Minutes
10,484
c) d)
0,080
10,479
0,025
0,070
0,020
10,099
0,060
0,050
0,015
AU
AU
0,040
2,356
0,010
0,030
10,104
11,192
0,005 0,020
2,667
0,010
0,000
0,000
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
Minutes Minutes
3,00
e)
2,713
2,50
2,00
1,50
AU
1,00
11,224
10,613
0,50
12,445
3,400
0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes

oxidativa a 205 nm
51
0,070
0,090
a) b)
10,483
10,470
0,060
0,080
0,070 0,050
0,060
0,040
0,050
AU
AU
0,040 0,030
2,471
0,030 0,020
0,020
0,010
0,010
0,000 0,000
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
Minutes Minutes
0,016
0,060
c) d)
10,478
10,478
0,014
0,012 0,050
0,010
0,040
0,008
AU
AU
0,030
0,006
0,004 0,020
0,002
0,010
0,000
0,000
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00 22,00 24,00
Minutes
Minutes
1,80
e)
2,730
1,60
1,40
1,20
1,00
AU
0,80
0,60
0,40
11,217
0,20
0,00
2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
Minutes

oxidativa a 265 nm
(Belal, Shaalan, & Haggag, 2011) evaluaron la especificidad del método por medio de la
degradación de los activos en condiciones de hidrolisis acida, básica y degradación oxidativa,
además de la inyección una solución de 2,6-dimetilanilina el cual es una de las sustancias
relacionadas de la Lidocaína, para observar si no interfiere en el análisis, obteniendo en
todos los casos resoluciones mayores a 1,5 para los picos de ambos activos, también
evaluaron la pureza espectral de los picos de los activos por medio de un detector de
fotodiodos en serie, sin observar señales de coelucion, además de evaluar la pureza de pico
52
de los activos en sus formas farmacéuticas, en este aspecto este trabajo es más completo
debido a que no solo se evalúa la degradaciones de los activos, sino que también lo realiza
en la solución de excipientes, quedando solo sin realizar la prueba de resolución entre el
Clorhidrato de Lidocaína y su sustancia relacionada debido a que no se disponía de esta en
el laboratorio.
5.3. Linealidad
Esta se llevó a cabo a través de la metodología mostrada en el punto 4.4.3, en

donde se realizaron tres mediciones de cada solución en un mismo día, los resultados
obtenidos se muestran en la tabla 5.4

determinación de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio mediante HPLC
Analito Coeficiente de Coeficiente de Estadístico Durbin-

correlación determinación % Watson
Clorhidrato de 0,999819 99,9637 P= 0,5039

Lidocaína
Cloruro de 0,999726 99,9453 P= 0,4192

Cetilpiridinio
El coeficiente de determinación para ambos activos nos revela que el modelo

explica el 99,9% de la variabilidad en el área, mientras que el coeficiente de correlación nos
indica que hay una fuerte relación entre el área y el contenido para ambos activos.
En las figuras 5.12 y 5.13 se presenta el modelo ajustado para ambos activos, la cual
muestra que los puntos experimentales se aproximan a un ajuste lineal, también se indica la
ecuación de la recta, con su respectiva pendiente e intercepto.
53
Gráfico del Modelo Ajustado
area ccp = -6078,11 + 268140*concentracion ccp
(X 10000,0)
76
66
area ccp
56
46
36
1,3 1,6 1,9 2,2 2,5 2,8
concentracion ccp
Figura 5.12: Gráfico del modelo ajustado para la determinación de Cloruro de

Cetilpiridinio por HPLC
Gráfico del Modelo Ajustado
area lidocaina = -60808 + 1,99364E6*concentracion lidocaina
(X 1,E6)
4
3,6
area lidocaina
3,2
2,8
2,4
2
1 1,2 1,4 1,6 1,8 2
concentracion lidocaina
Figura 5.13: Gráfico del modelo ajustado para la determinación de Clorhidrato de

Lidocaína por HPLC
El supuesto de independencia se verificó por medio del estadístico de Durbin-

Watson (tabla 5.4) que nos indica que tanto para el Cloruro de Cetilpiridinio como para el
Clorhidrato de Lidocaína no hay relación significativa con un nivel de confianza del 95%
entre el orden en que se presentan los datos con los residuos en el análisis de regresión,
esto mismo podemos observarlo en el gráfico de residuos vs número de fila (orden de
ejecución) figuras 5.14 y 5.15, donde los puntos se encuentran dispersos aleatoriamente.
54
Gráfico de Residuos
area ccp = -6078,11 + 268140*concentracion ccp
2
Rediduo Estudentizado
1
-1
-2
-3
0 3 6 9 12 15
número de fila
Figura 5.14: Gráfico de residuos contra orden de ejecución para el Cloruro de Cetilpiridinio
Gráfico de Residuos
area lidocaina = -60808 + 1,99364E6*concentracion lidocaina
2
Rediduo Estudentizado
-1
-2
-3
0 3 6 9 12 15
número de fila
Figura 5.15: Gráfico de residuos contra orden de ejecución para el Clorhidrato de

Lidocaína
Por su parte el supuesto de normalidad se verificó por medio del estadístico de

Shapiro-Wilk, mientras el supuesto de varianza constante se comprobó por medio de la
prueba de Barlett, puesto que los valores-P en ambas pruebas para ambos activos son
mayores que 0,05 (tabla 5.5) no existe una diferencia estadísticamente significativa entre las
desviaciones estándar y los datos se ajustan a una distribución normal, con un nivel del
95,0% de confianza.
55
Tabla 5.5: Pruebas estadística para la verificación de la varianza constante y normalidad
en la prueba de linealidad del método de determinación de Cloruro de Cetilpiridinio y
Clorhidrato de Lidocaína
Valor p Shapiro-Wilk 0,129583 0,127063
Valor p Barlett 0,172911 0,208112
Los valores del coeficiente de correlación obtenido para el método desarrollado (>0,999)
son comparables a los reportados por (Belal, Shaalan, & Haggag, 2011) para el análisis de
Cloruro de Cetilpiridinio y Clorhidrato de Lidocaína en la forma farmacéutica de gel oral por
cromatografía líquida con detección UV (>0,999).
5.4. Veracidad
Para la evaluación de está se aplicó la metodología mostrada en el punto 4.4.4,

obteniendo los resultados de la tabla 5.6

Parámetro Clorhidrato de Lidocaína Cloruro de Cetilpiridinio
% recobro promedio 100,2% 100,3%
CV 0,7 2,2
Intervalo de confianza 95% [99,6-100,7]% [98,6-102,0]%
Valor p Shapiro-Wilk 0,8037 0,8185
Valor p prueba de media 0,483203 0,708943
Como se observa en la tabla 5.6 los criterios de aceptación establecidos para el

recobro y coeficiente de variación (Recobro 97,0-103,0%, CV≤3,0%) (Duque, Lara, & Perez,
56
2015) fueron cumplidos, también se probó la hipótesis en la que se plantea si hay diferencia
significativa entre el recobro promedio y el valor esperado de 100%:
̅ = 𝟏𝟎𝟎 Ecuación 5.1

𝑯𝟎 : 𝑿
̅ ≠ 𝟏𝟎𝟎 Ecuación 5.2
𝑯𝟏 : 𝑿
Debido a que los valores p para ambos activos son superiores a 0,05, tabla 5.6, se
acepta la hipótesis nula con un nivel de confianza del 95% por lo que se puede concluir que
no hay evidencia de sesgo en el método analítico
También se verificó que los datos para ambos activos cumplen con una distribución
normal por medio del estadístico de Shapiro-Wilk, tabla 5.6, y los gráficos de probabilidad
normal figura 5,16
Gráfico de Probabilidad Normal Gráfico de Probabilidad Normal
99,9 99,9
n:9 n:9
a) b)
99 99
Mediana:100,1 Mediana:100,2
Sigma:2,59259 Sigma:0,740741
95 95
W:0,962524 W:0,961085
P:0,8185 80 P:0,8037
80
porcentaje
porcentaje
50 50
20 20
5 5
1 1
0,1 0,1
96 98 100 102 104 99 99,4 99,8 100,2 100,6 101 101,4
Recobro CCP Recobro LD
Cetilpiridinio y b) Clorhidrato de Lidocaína
Los porcentajes de recuperación obtenidos para el método desarrollado ([99,6-

100,7]% para el Clorhidrato de Lidocaína y [98,6-102,0]% para el Cloruro de Cetilpiridinio)
son comparables a los obtenidos por (Belal, Shaalan, & Haggag, 2011) en la determinación
de Cloruro de Cetilpiridinio y Clorhidrato de Lidocaína en forma farmacéutica de gel oral
mayores a 97,9% para ambos activos en los dos productos que evaluaron.
5.5. Precisión y estabilidad las muestras
La precisión del método se evaluó en función de la repetibilidad y precisión

intermedia por medio de la metodología indicada en los puntos 4.4.5 y 4.4.7, mientras la
estabilidad de las muestras se evaluó por medio de la metodología mostrada en los puntos
4.4.6 obteniendo los resultados mostrados en la tabla 5.7
57
Tabla 5.7: Parámetros obtenidos en el estudio de la precisión y estabilidad de las
muestras del método para la determinación de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de
Cetilpiridinio mediante HPLC
Parámetros Clorhidrato de Cloruro de

Lidocaína Cetilpiridinio
Repetibilidad CRP 100,0% 103,8%
CV 1,1% 1,6%
Precisión intermedia CRP 99,0% 105,8%
CV 2,3% 2,3%
D 1,0% 2,0%
Estabilidad de CRP 100,1% 104,0%

soluciones 1 día
CV 1,5% 1,7%
D 0,1% 0,2%
Estabilidad de CRP 98,3% 105,2%

soluciones 2 días
CV 1,1% 1,6%
D 1,7% 1,3%
Estos resultados cumplen con los criterios de aceptación establecidos en los puntos 4.4.5,
4.4.6 y 4.4.7
Se realizó una comparación estadística de medias, donde se tiene como hipótesis

nula que la media para el estudio de repetibilidad, precisión intermedia y estabilidad son
iguales, los resultados se observan en la tabla, debido a que los valores p son mayores 0,05,
tabla 5.8, no existe una diferencia estadísticamente significativa entre las medias de las 4
variables con un nivel confianza del 95,0%, esto también se puede concluir de la figuras
5.17, donde se presentan los gráficos medias con su intervalo de confianza, observándose
que los intervalos de confianza se traslapan por lo que las cuatro medias son
estadísticamente iguales para los dos activos con un nivel de confianza del 95,0%
58
Tabla 5.8: Comparación de medias y varianzas entre la Repetibilidad, la precisión
intermedia y la estabilidad del método para la determinación de Clorhidrato de Lidocaína
y Cloruro de Cetilpiridinio mediante HPLC
Analito Valor P para la Valor P para comparación

comparación de medias de varianzas
Clorhidrato de Lidocaína 0,1879 0,337134
Cloruro de Cetilpiridinio 0,2390 0,808675
Medias y 95,0% de Fisher LSD

Medias y 95,0% de Fisher LSD
107
102
106
a) 101 b)
105 100
Media
Media
104 99
103 98
102 97
Repetibildad CCP Intermedia CCP CCP 1 dia CCP 2 dias Repetibilidad LD Intermedia LD LD 1 dia LD 2 dias
Figura 5.17: Gráfico de medias para la comparación de los resultados obtenidos en el

estudio de la Repetibilidad, precisión intermedia y estabilidad de las soluciones para a) el
cloruro de Cetilpiridinio y b) el clorhidrato de lidocaína
El supuesto de varianza constante para la comparación de media de los estudios de

repetibilidad, precisión intermedia y estabilidad de las soluciones se comprobó por medio
de las figuras 5.18, la cual nos presenta los gráficos de residuos vs predicho, debido a que no
se ve ningún patrón definido en la distribución de los puntos, es evidencia de que se cumple
el supuesto, además de esto se realizó la verificación de varianza por medio de la prueba de
Barlett para homogeneidad de varianzas obteniendo los valores p observados en la tabla
5.8, los cuales al ser mayores que 0,05 nos indican que no existe una diferencia
estadísticamente significativa entre las varianzas, con un nivel del 95,0% de confianza.
59
Gráfico de Residuos Gráfico de Residuos
3 3
2 a) 2 b)
1 1
residuos
residuos
0 0
-1 -1
-2 -2
-3 -3
103 103,5 104 104,5 105 105,5 106 98 98,4 98,8 99,2 99,6 100 100,4
valor predicho valor predicho
Figura 5.18: Gráfico de residuos vs predichos para a) el Cloruro de Cetilpiridinio y b) el

La suposición de independencia se verificó por medio de la figura 5.19, que nos

presenta los gráficos de residuos vs secuencia u observación en los cuales al obtenerse un
patrón aleatorio de puntos para ambos activos nos indica el cumplimiento de este supuesto.
Gráfico de Residuos Gráfico de Residuos
3 3
2 a) 2 b)
1 1
residuos
residuos
0 0
-1 -1
-2 -2
-3 -3
0 4 8 12 16 20 24 0 4 8 12 16 20 24
observación observación
Figura 5.19: Gráfico de residuos vs observaciones (secuencia) para a) el cloruro de

Cetilpiridinio y b) el clorhidrato de lidocaína
El supuesto de la normalidad se verificó por medio de la prueba de Shapiro-Wilks

para normalidad, cuyos valores p se pueden observar en la tabla 5.9, debido a que ninguno
de esto valores es menor que 0,05 las respuestas obtenidas, concentración relativa
promedio (CRP), de los estudios de repetibilidad, precisión intermedia y estabilidad para los
dos activos provienen de distribuciones normales con un 95% de confianza.
60
Tabla 5.9: Valores p obtenidos de la prueba de Shapiro-Wilks para normalidad en los
estudios de Repetibilidad, precisión intermedia y estabilidad del método para la
Estudio Clorhidrato de Lidocaína Cloruro de Cetilpiridinio
Repetibilidad 0,220958 0,629072
Precisión intermedia 0,273365 0,176078
Estabilidad 1dia 0,0664584 0,945397
Estabilidad 2 días 0,789553 0,481719
Como se observa en la tabla 5.10 los resultados obtenidos para la repetibilidad,

precisión intermedia y estabilidad de las soluciones cumplen con el parámetro de
rendimiento de Horwitz debido a que la desviación estándar relativa observada es menor
que la estimada por la ecuación de Horwitz (ecuación 2.41) siendo 9,1% para el Clorhidrato
de Lidocaína y 9,5% para el Cloruro de Cetilpiridinio.
Tabla 5.10: Comparación de la desviación estándar relativa estimado por la ecuación de

Horwitz y el obtenido de los datos de la repetibilidad y la precisión intermedia del método
para la determinación de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio mediante
HPLC
RSDr (Repetibilidad) 1,1% 1,6%
RSDr (precisión intermedia) 2,3% 2,3%
RSDr (estabilidad 1 día) 1,5% 1,7%
RSDr (estabilidad 2 dia2) 1,1% 1,6%
RSDr: Desviación estándar relativa

(Belal, Shaalan, & Haggag, 2011) realizaron un estudio de estabilidad de soluciones
más completo que el realizado en este trabajo, debido a que no solo la evaluaron a 24 horas
a condiciones ambientes, sino que además la evaluaron por dos semanas en condiciones de
refrigeración a 4ºC donde no observaron ningún cambio en la área de los picos de interés,
61
en cuanto a la a precisión del método obtuvieron valores de desviación estándar relativa
menores a dos paras ambos activos realizando el estudio solo en condiciones de
repetibilidad en la forma farmacéutica de gel, equiparables a los obtenidos en este estudio.
5.6. Determinación de la Incertidumbre
La incertidumbre del método se estimó por medio de las ecuaciones 2.12 y 2.13 con
respecto a la concentración relativa de los analitos, pudiéndose observar ésta en la tabla
5.11, debido a que la concentración relativa de los activos debe de encontrarse en el
intervalo 80-120% (Duque, Lara, & Perez, 2015) para que el producto sea aprobado, lo que
corresponde a una tolerancia (T) de 40%, la relación T/2U para ambos activos es aceptable,
debido a que cumple la recomendación de encontrarse dentro del intervalo 3<T/2U<10
(Sánchez Pérez, de Vicente, & Prieto Esteban, 2012) .
Tabla 5.11: Estimación de la incertidumbre del método para la determinación de la

concentración relativa del Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio mediante
HPLC
Desviación estándar en
condiciones de 1,76659% 2,22928%
reproducibilidad
c 3,34308E-05 1,86359E-04
Incertidumbre sobre x 1207 1833
Incertidumbre sobre el sesgo 0,680074% 2,24023%
Incertidumbre estándar
1,893401456% 3,178837465%
combinada u(y)
Incertidumbre expandida U 3,786802913% 6,357674931%

(k=2)
T/2U 5,28150011 3,145804122
5.7. Robustez
Ésta se estudió según la sección 4.4.8, bajo un diseño de experimentos factorial con
un arreglo 24 con 4 puntos al centro replicado 6 veces, variándose la longitud de onda, la
concentración del ácido fosfórico, temperatura y volumen de inyección.
62
Como se observa en las figuras 5.20 y 5.21, la longitud de onda, volumen de
inyección y temperatura afectan significativamente con un nivel de confianza del 95% la
determinación del Clorhidrato de Lidocaína, mientras solo la concentración de ácido
fosfórico y el volumen de inyección afectan significativamente con un nivel de confianza del
95% la determinación del Cloruro de Cetilpiridinio por lo que es crítico el control de todas
estas variables, en el caso de las variables instrumentales, temperatura, longitud de onda y
volumen de inyección, se garantiza que están controladas al verificar periódicamente los
equipos, mientras en el caso de la concentración del ácido fosfórico se controla al garantizar
que cada analista prepare la solución de la misma manera, también se recomienda realizar
un estudio de robustez con estas mismas variables pero introduciendo menos variación en
cada una, para ver hasta qué nivel afectan significativamente la determinación de
Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio.
Diagrama de Pareto Estandarizada para Contenido LD
ABC
+
BC
-
AD
AB
D:Lonitud de onda
C:Volumen de inyeccion
B:Temperatura
ABD
ABCD
BCD
CD
BD
AC
A:Concentracion H3PO4
ACD
0 1 2 3 4 5 6
Efecto estandarizado
Figura 5.20: Diagrama de Pareto de los efectos para la determinación del clorhidrato de
lidocaína
Diagrama de Pareto Estandarizada para Contenido CCP
ABC
+
AC
-
A:Concentracion H3PO4
AB
BC
C:Volumen de inyeccion
ABCD
BCD
AD
D:Lonitud de onda
CD
ABD
BD
B:Temperatura
ACD
0 1 2 3 4 5
Efecto estandarizado
Figura 5.21: Diagrama de Pareto de los efectos para la determinación del cloruro de
Cetilpiridinio
63
Como se observa en la tabla 5.12 los efectos debido al bloque, que en este diseño
representan una muestra preparada de manera independiente si afecta significativamente
la determinación de ambos activos con un nivel de confianza del 95%, esto hace pensar que
es necesario un estudio más detallado de los factores que pueden afectar la preparación de
la muestra como lo son el tiempo de agitación, el tiempo en ultrasonido, y la homogeneidad
de peso entre caramelos.
Tabla 5.12: Efecto de la variable bloque (preparación de muestras independientes) en la

determinación del clorhidrato de lidocaína y cloruro de Cetilpiridinio
Valor p efecto bloque 0,0001 0,0000
En la tabla 5.13 se observa que los modelos ajustados (ecuaciones 5.3 y 5.4) explican
el 66,6% de la variabilidad observada para el Clorhidrato de Lidocaína y el 74,9% para el
Cloruro de Cetilpiridinio, esto nos indica que aún puede haber variables que pueden ser
criticas controlar además de las estudiadas, pero aun con esto valores no se ve afectada la
validez de este experimento debido a que el fin del mismo no es obtener un modelo
predictivo, sino evaluar cuál de las variables estudiadas afecta significativamente la
determinación de Cloruro de Cetilpiridinio y Clorhidrato de Lidocaína, por otro lado al ser los
valores p para la prueba de falta de ajuste mayores a 0,05 nos indica el modelo seleccionado
parece ser adecuado para describir los datos observados al nivel de confianza del 95,0%.
𝑦 = 23,4827 − 367,958 ∗ 𝐴 − 0,720208 ∗ 𝐵 − 0,905417 ∗ 𝐶 + 4,30667 ∗ 𝐷 + 12,1042 ∗ 𝐴 ∗ 𝐵

+ 15,1875 ∗ 𝐴 ∗ 𝐶 − 73,0625 ∗ 𝐴 ∗ 𝐷 + 0,0296875 ∗ 𝐵 ∗ 𝐶 − 0,145104 ∗ 𝐵 ∗ 𝐷
− 0,164375 ∗ 𝐶 ∗ 𝐷 − 0,5 ∗ 𝐴 ∗ 𝐵 ∗ 𝐶 + 2,44792 ∗ 𝐴 ∗ 𝐵 ∗ 𝐷 + 2,78125 ∗ 𝐴 ∗ 𝐶
∗ 𝐷 + 0,00557292 ∗ 𝐵 ∗ 𝐶 ∗ 𝐷 − 0,09375 ∗ 𝐴 ∗ 𝐵 ∗ 𝐶 ∗ 𝐷
Ecuación 5.3: Modelo ajustado en el estudio de robustez para la determinación del

𝑦 = −19,4449 + 381,958 ∗ 𝐴 + 0,678125 ∗ 𝐵 + 0,884167 ∗ 𝐶 − 5,55542 ∗ 𝐷 − 12,0208 ∗ 𝐴 ∗ 𝐵
− 15,7292 ∗ 𝐴 ∗ 𝐶 + 94,4375 ∗ 𝐴 ∗ 𝐷 − 0,0278125 ∗ 𝐵 ∗ 𝐶 + 0,183854 ∗ 𝐵 ∗ 𝐷
+ 0,224583 ∗ 𝐶 ∗ 𝐷 + 0,494792 ∗ 𝐴 ∗ 𝐵 ∗ 𝐶 − 3,14583 ∗ 𝐴 ∗ 𝐵 ∗ 𝐷 − 3,82292 ∗ 𝐴
∗ 𝐶 ∗ 𝐷 − 0,00744792 ∗ 𝐵 ∗ 𝐶 ∗ 𝐷 + 0,127604 ∗ 𝐴 ∗ 𝐵 ∗ 𝐶 ∗ 𝐷
Ecuación 5.4: Modelo ajustado en el estudio de robustez para la determinación del

Cloruro de Cetilpiridinio
Dónde:
64
y: contenido en mg/50 ml
A: Concentración de ácido fosfórico
B: Temperatura
C: Volumen de inyección
D: Longitud de onda
Tabla 5.13: Coeficiente de determinación y prueba de ajuste para los modelos ajustados
para la determinación de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio
R2 72,2078% 79,1412%
R2 ajustada 66,5933% 74,9273%
Valor p prueba falta de 0,9950 1,0000

ajuste
El supuesto de independencia se comprobó por medio del estadístico de Durbin-

Watson observado en la tabla 5.14, al ser los valores p mayores a 0,05 no hay indicación de
auto correlación serial en los residuos con un nivel de significancia del 5,0%, esto mismo se
puede observar en la figura 5.22, donde se presentan los gráficos de residuos contra orden
de ejecución obteniéndose una distribución de puntos aleatoria en el eje horizontal lo que
nos indica que se cumple el supuesto de independencia
Tabla 5.14: Prueba de Durbin-Watson para verificación del supuesto de independencia
Valor p Durbin-Watson 0,0593 0,6664
65
Gráfica de Residuos para Contenido CCP Gráfica de Residuos para Contenido LD
0,12 0,09
0,08 a) 0,06
b)
0,04 0,03
residuo
residuo
0 0
-0,04 -0,03
-0,08 -0,06
-0,12 -0,09
0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 100 120
número de ejecución número de ejecución
Figura 5.22: Gráfico de residuos contra orden de ejecución para a) el Cloruro de

Cetilpiridinio y b) el Clorhidrato de Lidocaína
El supuesto de varianza constante se corroboro por medio de la figura 5.23, donde

se presentan los gráficos de residuos contra predichos, obteniendo para los dos activos una
distribución aleatoria de puntos en a lo largo del eje horizontal, los que nos indica que se
cumple el supuesto de varianza constante
Gráfica de Residuos para Contenido CCP Gráfica de Residuos para Contenido LD
0,12 0,09
0,08
a) 0,06
b)
0,04 0,03
residuo
residuo
0 0
-0,04 -0,03
-0,08 -0,06
-0,12 -0,09
2 2,04 2,08 2,12 2,16 2,2 2,24 1,4 1,43 1,46 1,49 1,52 1,55 1,58
predichos predichos
Figura 5.23: Gráfico de residuos contra predichos para a) el Cloruro de Cetilpiridinio y b) el

El supuesto de normalidad se verificó con la figura 5.24, que nos presentan los
gráficos de probabilidad normal de los residuos para ambos activos, observándose algo de
desviación del comportamiento normal en los extremos para ambos activos, siendo estas
desviaciones mayores para el Cloruro de Cetilpiridinio, pero debido a que el análisis de
varianza resiste pequeñas y moderadas desviaciones del supuesto de normalidad, se
considera que el supuesto de normalidad se cumple para el presente análisis.
El cumplimiento de los supuestos asegura la confiabilidad de los resultados

obtenidos a partir del diseño de experimentos
66
Gráfica de Probabilidad Normal para Residuos Gráfica de Probabilidad Normal para Residuos
0,13 0,06
0,1 a) 0,03
b)
0,07
residuos
residuos
0
0,04
-0,03
0,01
-0,02 -0,06
-0,05
-0,09
0,1 1 5 20 50 80 95 99 99,9
0,1 1 5 20 50 80 95 99 99,9
porcentaje
porcentaje
Cetilpiridinio y b) Clorhidrato de Lidocaína
(Belal, Shaalan, & Haggag, 2011) evaluaron la robustez variando de un parámetro

por vez, siendo estos la concentración de ácido fosfórico (±0,0005 M), porcentaje de
acetonitrilo en el gradiente (±2%), fuente del acetonitrilo (Scharlau Chemie S.A., o SDS),
longitud de onda (±1 nm) y flujo de fase móvil (±0,1 ml/min), observando que las desviación
estándar relativa para la medición del área de los picos no excede el 2% con ninguna de
estas variaciones, en este aspecto este estudio es más completo debido a que gracias al uso
de diseño de experimentos se evaluó el efecto de cada variable además de sus
interacciones, además de que se evaluó la significancia del cambio de cada variable por
medio de un tratamiento estadístico, el ANOVA.
El presente método tiene como ventaja la confiabilidad que otorga un método

validado frente al método interno utilizado actualmente, el cual no se encuentra validado.
Además de ser más amigable con el ambiente y la salud de los analistas (eliminando el uso
de Cloroformo) utiliza como único solvente orgánico Acetonitrilo, y, sólo en el gradiente de
la fase móvil; también presenta como ventaja la simplicidad de preparación de la muestra,
además de proporcionar tiempo de respuestas más rápidos (sólo de 20 minutos por corrida
cromatográfica), pudiéndose completar el análisis del producto completo en alrededor de 4
horas mientras que en el método anterior debía evaluarse cada activo por separado y con
preparaciones de muestras completamente distintas entre sí, tomando alrededor de ocho
horas completar todo el análisis.
67
Capítulo 6. CONCLUSIONES
En este estudio, se desarrolló un método analítico simple, selectivo y confiable para
la determinación de Clorhidrato de Lidocaína y Cloruro de Cetilpiridinio en la forma
farmacéutica de caramelo utilizando elución en gradiente.
La simplicidad del método fue ilustrada por los requisitos mínimos de químicos y
disolventes, ya que el acetonitrilo es el único disolvente orgánico usado en el
procedimiento, mientras que todas las soluciones de estándar y de muestra se prepararon
en agua, esto sugiere que el método propuesto es rentable y favorable al medio ambiente.
La selectividad se demostró mediante la separación de los dos analitos de los

productos de degradación forzada y aditivos de formulación además de utilizar el detector
de fotodiodos en serie como una herramienta para la confirmación de la pureza espectral.
La confiabilidad está garantizada por los resultados de la prueba de los diversos

parámetros de validación del método y la aplicación exitosa a la formulación comercial.
El método fue probado tanto con detección de fotodiodos en serie como con
detección UV de longitud de onda variable, que es la técnica más popular en los laboratorios
de control de calidad, por lo tanto, el método propuesto se puede recomendar para el
análisis de rutina y para verificar la calidad durante los estudios de estabilidad del fármaco.
68
Capítulo 7. RECOMENDACIONES
Realizar el estudio de especificidad incluyendo las impurezas y compuesto de
degradación del Cloruro de Cetilpiridinio y Clorhidrato de Lidocaína.
Ampliar el estudio de estabilidad a periodos mayores de tiempo e incluyendo

muestras refrigeradas.
Incluir en el estudio de robustez otras variables que podrían afectar

significativamente la determinación de los activos como lo son, flujo de fase móvil,
porcentaje de acetonitrilo en el gradiente, tiempo de agitación magnética y en el
ultrasonido de la muestra.
Utilizar el método en otro laboratorio para probarlo en condiciones de

reproducibilidad.
69
Capítulo 8. APENDICE
Tabla 8.1: Área y concentración de Cloruro de Cetilpiridinio (CCP) y Clorhidrato de
Lidocaína (LD) obtenido en el estudio de linealidad en el orden en que fueron medidos
Numero de Concentración de Área de CCP Concentración de Área de LD

inyección CCP (mg/50mL) LD (mg/50mL)
1 1,3944 373324 1,0559430 2071886
2 1,6932 445704 1,2822165 2486650
3 1,9920 527306 1,5084900 2936577
4 2,2908 609913 1,7347635 3405181
5 2,5896 687787 1,9610370 3847405
6 1,3944 368611 1,0559430 2046714
7 1,6932 444837 1,2822165 2489344
8 1,9920 526815 1,5084900 2924964
9 2,2908 609892 1,7347635 3408246
10 2,5896 686384 1,9610370 3842551
11 1,3944 366075 1,0559430 2034733
12 1,6932 443845 1,2822165 2494406
13 1,9920 531394 1,5084900 2942153
14 2,2908 612052 1,7347635 3418817
15 2,5896 686906 1,9610370 3849079
70
obtenido en el ensayo de veracidad para el Clorhidrato de Lidocaína
Concentración Adicionada Concentración Recuperada % Recobro

(mg/50mL) (mg/50mL )
1,0713360 1,0865000 101,4
1,0713360 1,0781000 100,6
1,0713360 1,0796000 100,8
1,5304800 1,5197000 99,3
1,5304800 1,5332000 100,2
1,5304800 1,5334000 100,2
1,9896240 1,9874000 99,9
1,9896240 1,9801000 99,5
1,9896240 1,9816000 99,6

obtenido en el ensayo de veracidad para el Cloruro de Cetilpiridinio
Concentración Adicionada Concentración Recuperada % Recobro

(mg/50mL) (mg/50mL)
1,4056000 1,4556000 103,6
1,4056000 1,4301000 101,7
1,4056000 1,4066000 100,1
2,0080000 1,9718000 98,2
2,0080000 1,9724000 98,2
2,0080000 1,9443000 96,8
71
2,6104000 2,6527000 101,6
2,6104000 2,6106000 100,0
2,6104000 2,6738000 102,4

precisión intermedia y estabilidad para el Clorhidrato de Lidocaína
Repetibilidad % Precisión intermedia % Estabilidad 1dia % Estabilidad 2dias %
100,0 101,3 100,0 98,0
100,7 96,0 100,7 98,7
100,0 99,3 101,3 98,7
100,0 96,7 100,0 98,0
98,0 101,3 97,3 96,7
101,3 99,3 101,3 100,0

precisión intermedia y estabilidad
Repetibilidad % Precisión intermedia % Estabilidad 1dia % Estabilidad 2dias %
103,0 107,5 103,5 105,5
103,5 103 104,0 106,0
105,5 107,5 105,5 106,0
103,5 103 103,0 104,0
101,5 108,5 101,5 102,5
106,0 105,5 106,5 107,0
72
Tabla 8.6: Concentración recuperada obtenida en el studio de robustez obtenida en cada
tratamiento para el Cloruro de Cetilpiridinio y Clorhidrato de Lidocaína
BLOQUE Concentración Temperatura Volumen Longitud Contenido Contenido

H3PO4 de de onda CCP LD
(°C) inyección
(M) (nm) (mg/50mL) (mg/50mL)
(µL)
1 0,05 30 25 0 2,06 1,50
2 0,05 30 25 0 2,07 1,51
3 0,05 30 25 0 2,11 1,50
4 0,05 30 25 0 2,07 1,50
5 0,05 30 25 0 2,03 1,47
6 0,05 30 25 0 2,12 1,52
1 0,06 28 24 -2 2,10 1,50
1 0,06 28 24 2 2,10 1,51
2 0,06 28 24 -2 2,09 1,50
2 0,06 28 24 2 2,10 1,50
3 0,06 28 24 -2 2,13 1,54
3 0,06 28 24 2 2,12 1,54
4 0,06 28 24 -2 2,08 1,51
4 0,06 28 24 2 2,07 1,48
5 0,06 28 24 -2 2,05 1,49
5 0,06 28 24 2 2,04 1,47
6 0,06 28 24 -2 2,15 1,53
6 0,06 28 24 2 2,14 1,51
73
1 0,06 28 26 -2 2,07 1,51
1 0,06 28 26 2 2,07 1,51
2 0,06 28 26 -2 2,08 1,50
2 0,06 28 26 2 2,08 1,50
3 0,06 28 26 -2 2,11 1,52
3 0,06 28 26 2 2,11 1,51
4 0,06 28 26 -2 2,06 1,49
4 0,06 28 26 2 2,07 1,49
5 0,06 28 26 -2 2,04 1,47
5 0,06 28 26 2 2,04 1,47
6 0,06 28 26 -2 2,13 1,52
6 0,06 28 26 2 2,14 1,52
1 0,06 32 24 -2 2,10 1,51
1 0,06 32 24 2 2,09 1,51
2 0,06 32 24 -2 2,10 1,50
2 0,06 32 24 2 2,10 1,50
3 0,06 32 24 -2 2,13 1,52
3 0,06 32 24 2 2,13 1,51
4 0,06 32 24 -2 2,09 1,49
4 0,06 32 24 2 2,09 1,49
5 0,06 32 24 -2 2,06 1,47
5 0,06 32 24 2 2,06 1,47
74
6 0,06 32 24 -2 2,16 1,52
6 0,06 32 24 2 2,15 1,52
1 0,06 32 26 -2 2,08 1,50
1 0,06 32 26 2 2,09 1,50
2 0,06 32 26 -2 2,10 1,49
2 0,06 32 26 2 2,11 1,50
3 0,06 32 26 -2 2,12 1,51
3 0,06 32 26 2 2,14 1,52
4 0,06 32 26 -2 2,09 1,48
4 0,06 32 26 2 2,10 1,48
5 0,06 32 26 -2 2,06 1,46
5 0,06 32 26 2 2,07 1,46
6 0,06 32 26 -2 2,15 1,50
6 0,06 32 26 2 2,16 1,51
1 0,04 28 24 -2 2,10 1,51
1 0,04 28 24 2 2,07 1,56
2 0,04 28 24 -2 2,12 1,47
2 0,04 28 24 2 2,08 1,53
3 0,04 28 24 -2 2,13 1,50
3 0,04 28 24 2 2,10 1,56
4 0,04 28 24 -2 2,08 1,48
4 0,04 28 24 2 2,05 1,53
75
5 0,04 28 24 -2 2,06 1,46
5 0,04 28 24 2 2,02 1,51
6 0,04 28 24 -2 2,15 1,53
6 0,04 28 24 2 2,12 1,57
1 0,04 28 26 -2 2,15 1,47
1 0,04 28 26 2 2,13 1,50
2 0,04 28 26 -2 2,16 1,41
2 0,04 28 26 2 2,16 1,48
3 0,04 28 26 -2 2,14 1,47
3 0,04 28 26 2 2,20 1,50
4 0,04 28 26 -2 2,14 1,45
4 0,04 28 26 2 2,14 1,48
5 0,04 28 26 -2 2,07 1,42
5 0,04 28 26 2 2,11 1,44
6 0,04 28 26 -2 2,20 1,46
6 0,04 28 26 2 2,21 1,49
1 0,04 32 24 -2 2,10 1,50
1 0,04 32 24 2 2,09 1,49
2 0,04 32 24 -2 2,12 1,47
2 0,04 32 24 2 2,12 1,50
3 0,04 32 24 -2 2,14 1,54
3 0,04 32 24 2 2,15 1,53
76
4 0,04 32 24 -2 2,09 1,50
4 0,04 32 24 2 2,09 1,49
5 0,04 32 24 -2 2,07 1,48
5 0,04 32 24 2 2,04 1,47
6 0,04 32 24 -2 2,15 1,54
6 0,04 32 24 2 2,15 1,53
1 0,04 32 26 -2 2,08 1,53
1 0,04 32 26 2 2,07 1,56
2 0,04 32 26 -2 2,15 1,41
2 0,04 32 26 2 2,08 1,52
3 0,04 32 26 -2 2,14 1,53
3 0,04 32 26 2 2,12 1,56
4 0,04 32 26 -2 2,09 1,52
4 0,04 32 26 2 2,07 1,54
5 0,04 32 26 -2 2,07 1,50
5 0,04 32 26 2 2,05 1,52
6 0,04 32 26 -2 2,20 1,56
6 0,04 32 26 2 2,15 1,58
1 0,05 30 25 0 2,15 1,52
2 0,05 30 25 0 2,06 1,44
3 0,05 30 25 0 2,15 1,49
4 0,05 30 25 0 2,06 1,45
77
5 0,05 30 25 0 2,17 1,52
6 0,05 30 25 0 2,11 1,49
1 0,05 30 25 0 2,07 1,50
2 0,05 30 25 0 2,08 1,51
3 0,05 30 25 0 2,11 1,52
4 0,05 30 25 0 2,06 1,50
5 0,05 30 25 0 2,03 1,46
6 0,05 30 25 0 2,13 1,52
1 0,05 30 25 0 2,11 1,47
2 0,05 30 25 0 2,12 1,48
3 0,05 30 25 0 2,12 1,48
4 0,05 30 25 0 2,08 1,47
5 0,05 30 25 0 2,05 1,45
6 0,05 30 25 0 2,14 1,50
78
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81

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UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DESARROLLO DE UN MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN DE CLORURO DE CETILPIRIDINIO Y

Trabajo Especial De Grado

Valencia, Noviembre de 2017

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DESARROLLO DE UN MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN DE CLORURO DE CETILPIRIDINIO Y

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DESARROLLO DE UN MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN DE CLORURO DE CETILPIRIDINIO Y

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Se desarrolló un método simple, rápido y selectivo para la determinación simultánea

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DESARROLLO DE UN MÉTODO DE CUANTIFICACIÓN DE CLORURO DE CETILPIRIDINIO Y

AUTOR: Francisco Rivas

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TUTOR EMPRESARIAL: Dr. José Pérez

A simple, rapid and selective method was developed for simultaneous

Capítulo 1. EL PROBLEMA ........................................................................................................1

Figura 2.1 Lidocaína ..............................................................................................................27

1.1. Planteamiento y justificación del problema

Laboratorios Elmor S.A. es una empresa farmacéutica dedicada al diseño,

En su catálogo de productos se encuentra la Lafarcaina que es un caramelo de

El método actualmente utilizado para la cuantificación del Clorhidrato de Lidocaína

1.3. Objetivo General

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1.3.1. Objetivos específicos

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