ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA
Es un tipo de espectroscopia electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra. Se trata de utilizar
un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, que excita los electrones de las moléculas de ciertos compuestos
y provoca que emitan luz de una menor energía, generalmente luz visible (aunque no necesariamente).
Cuando la molécula se encuentra en el
nivel vibracional más bajo del estado
electrónico excitado, puede perder el
exceso de energía para volver al estado
fundamental, emitiendo un fotón de
radiación ultra violeta o visible
FLUORESCENCIA
La fluorescencia implica transiciones
desde el nivel vibracional inferior del
primer singlete a distintos niveles
vibracionales del estado fundamental.
Una consecuencia es que los fotones
fluorescentes van a tener menor
energía, y por tanto, mayor longitud de
onda que los fotones absorbidos para
producir el estado excitado.
Singlete: Orbital
molecular ocupado por
un par de electrones
APLICACIONES
Los métodos de fluorescencia son más
sensibles, selectivos y aplicables a
intervalos de concentración más bajos
que los espectrofotométricos, pero la
exactitud y precisión de los métodos
fotoluminiscentes es normalmente
peor que la de los
espectrofotométricos.
* Fluorómetros de filtro: Utilizan filtros para aislar la luz incidente
* Espectrofluorómetros: Usan monocromadores de retículo de difracción para aislar la luz incidente y la luz
En la espectroscopia de fluorescencia, Variables que afectan la fluorescencia
primero se excita la muestra mediante
la absorción de un fotón de luz, desde Rendimiento y tipo de
su estado electrónico basal a uno de transición
los distintos estados vibracionales del
estado electrónico excitado. Las
colisiones con otras moléculas causan Razón entre el número de
que la molécula excitada pierda moléculas que se desactivan
energía vibracional hasta que alcanza por emisión de fluorescencia y
el estado vibracional más bajo del el número total de moléculas
estado electrónico excitado. excitadas.
Factores estructurales
La molécula desciende luego a uno de
los distintos niveles de vibración del
estado electrónico basal, emitiendo un
fotón en el proceso. Como éstas  Extensión del sistema
electrónico.
pueden caer a cualquiera de los
diferentes niveles de vibración en el  Efecto de los
sustituyentes
estado basal, los fotones emitidos
tendrán diferentes energías y, por lo  Efecto de la rigidez
estructural
tanto, diferentes frecuencias. Y,
mediante el análisis de las diferentes  Efecto del
frecuencias de luz emitida impedimento
por espectrometría de fluorescencia, estérico
junto con sus intensidades relativas, se
puede determinar la estructura de los
Factores ambientales
diferentes niveles de vibración.
 Efecto de la
 Determinación de trazas temperatura
tanto de compuestos  Efecto del disolvente
inorgánicos, como orgánicos o  Efecto del pH
biológicos.  Efecto del Oxígeno
 Reacciones basadas en la disuelto y de los
formación de complejos iones
metálicos. paramagnéticos
INSTRUMENTACIÓN
 Seguir reacciones catalizadas  Relación entre la
por enzimas y determinar la intensidad de la
Se utilizan dos tipos actividad
generalesde la
de enzima
instrumentos: fluorescencia y la
 Detección fluorescente x
en y la luz fluorescente. concentración
cromatografía de papel y capa
fina
fluorescente.
 Fuente Filtros Celdas portamuestras Detectores Dispositivo de salida
de detectores o
registradores
En los fluorímetros se Los monocromadores Se usan tanto cubetas Para amplificar la
emplea una lámpara utilizan filtros de cilíndricas como señal se usan tubos
de arco de Hg y en los interferencia y rectangulares de 1 fotomultiplicadores. El instrumento de
espectrofluorímetros absorción en cm de lado, puede En lectura más simple es
se usa una lámpara fluorímetro y ser de cuarzo o sílice espectrofluorímetros un medidor que se
de arco de Xe, siendo cromatografía en fundida. Para el también se han usado emplea en
el espectro de esta espectrofluorímetros. ultravioleta ya que el detectores con fluorímetros.
lámpara continuo cuarzo presenta una diodos alineados.
desde 300 a 1300 nm. fluorescencia nativa
por encima de 320
nm, es mejor usar
vidrio Pyrex

La luz de una fuente de excitación pasa a través de un filtro o monocromador, e incide sobre la muestra. Una
parte de la luz incidente es absorbida por la muestra, y algunas de las moléculas de la muestra producen una
fluorescencia. La luz fluorescente es emitida en todas las direcciones. Parte de esta luz fluorescente pasa a
través de un segundo filtro o monocromador y llega a un detector, el cual muy a menudo se encuentra a 90°
con respecto al haz de luz incidente para minimizar el riesgo de que la luz incidente reflejada o transmitida
llegue al detector.