GREEN

 FLUORESCENT  PROTEIN  
GEN  DE  INTERÉS   FUSIÓN  GEN-­‐GFP  
 Espectro electromagnético: distribución energética del conjunto de las ondas electromagnéticas

Espectrometría



ü  Estudio de la interacción entre la radiación y la materia como función de
la longitud de onda (λ).

ü  Se utiliza para medir concentración de especies determinadas en una

solución.

ü  El instrumento que realiza esas mediciones (normalmente, energía

absorbida o producida) se denomina espectrometro

 Espectrometría de absorción

ü  Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida.

ü  Toda moléculas pueden absorber energía radiante en un determinado

espectro de absorción.

ü  La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución es el

fundamento de la espectrometría.

Ley de Lambert:

La cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la distancia recorrida por la
luz.

Ley de Beer:

La cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la concentración en la
solución.

Ley de Beer-Lambert:













A = ε.d.c

A: la absorbancia de la muestra

c: concentración

d: distancia recorrida por la radiación

ε: absortividad (coeficiente de extinción)

b  

Para cada especie y longitud de onda, ε es una constante conocida como absortividad
molar o coeficiente de extinción. Esta constante es una propiedad molecular en un
solvente dado, a una temperatura y presión particular.

ü  Método de análisis óptico que permite determinar concentraciones
desconocidas por comparación entre la absorción de una solución incógnita y
soluciones de concentración conocida.

 Espectrometría de Fluorescencia

ü  También llamada Fluorimetría, es un tipo de espectroscopía

electromagnética que analiza la fluorescencia de una muestra.

ü  Un haz de luz, por lo general luz ultravioleta, excita los

electrones de las moléculas de ciertos compuestos y provoca que
emitan luz de una menor energía.

ü  La muestra emite en todas las direcciones, sin embargo, la luz emitida se
detecta mejor en ángulo recto con respecto al haz de excitación ya que
se evitan problemas de dispersión de la luz y también el haz de luz
excitante que es de mucha mayor intensidad que el haz de luz emitida.

Flourimetría en tiempo real

Real Time PCR

Real Time PCR

SYBR  Green  
 Transferencia  de  Energía  por  Resonancia  
 
La  excitación  de  un  fluoroforo  puede  transferirse  a  otro  cercano,  siempre  y  cuando,    
la  distancia  entre  los  mismos  se  encuentre  dentro  de  los  100Å  

Fluorescence  resonance  energy  transfer  

Aceptor   Dador  

Adaptado  de  http://zeiss-­‐campus.magnet.fsu.edu/articles/spectralimaging/spectralfret.html  

 BRET  
(Bioluminescence  Resonance  Energy  Transfer)  
FRET   BRET  
 FISH  
(Fluorescent  in  situ  Hibridization)  
 FRAP  
(Fluorescence  Recovery  
 After  Photobleaching)  
 Complementación  Bimolecular  Fluorescente  
 
 
Esta  basada  en  la  asociación  de  fragmentos  no  fluorescente  de  una  proteína  fluorescente  
 

Kerppola  TK.,  Nat  Protoc.  2006  ;  1(3):  1278–1286.