MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
FUNDAMENTO DESCRIPCIÓN
El fundamento de la
espectrofotometría es que cualquier
solución que contenga moléculas
suspendidas permite el paso de un haz
de luz a través de ella en proporción
inversa a la cantidad de moléculas que
contiene.
ESPECTROFOTOMETRÍA
VENTAJA
Los nucleótidos de ADN y ARN
presentan la absorción máxima a
una longitud de onda de 260 nm
(luz ultravioleta, UV); por lo tanto,
los espectrofotómetros son los
aparatos más utilizados para
determinar la concentración de
ácidos nucleicos en solución. En la
celda del espectrofotómetro un
haz de luz atraviesa la solución de
ácidos nucleicos y, cuando ha
pasado por la muestra, un
fotodetector mide la intensidad de
luz absorbida. Mientras más luz
absorba la muestra (absorbancia)
mayor será la concentración de
ácidos nucleicos.
DESVENTAJA IMAGEN DEL MÉTODO
Algunos equipos permiten la Se requieren volúmenes
lectura directa del ácido relativamente grandes de
nucleico, como el solución para cubrir la
espectrofotómetro capacidad de las celdas de los
NanoDropTM, usando espectrofotómetros, suelen
volúmenes micrométricos (1 manejarse diluciones 1:100 a
a 2 μM), donde la muestra 1:1000 del stock de ADN, en
no se diluye sino que se una solución en fosfato de
aplica directamente en el sodio dibásico, 1.5 μM a pH 5.2
aparato. (Na2HPO4), que permite leer
los nucleótidos sin
interferencia.
 Consiste en la utilización del
fenómeno de fluorescencia para el
estudio de ciertos tejidos, órganos o
funciones, es decir, consiste en la
medida de la fluorescencia que
emiten los compuestos cuando se
exponen a la luz ultravioleta u otras
energías radiantes intensas.
FLUOROMETRÍA
Esta metodología se basa en la
unión específica de colorantes
fluorescentes al ácido nucleico,
que absorbe luz de una
determinada longitud de onda y
emite luz de una longitud de onda
superior (de menor energía). La
relación entre la concentración del
ácido nucleico y la intensidad de
emisión fluorescente es
directamente proporcional.
Es menos susceptible a las La cuantificación de ADN o
interferencias por ARN por fluorometría es 1000
proteínas y contaminantes veces más sensible que la
presentes en la solución. espectrofotométrica.
La desventaja principal de
esta técnica es que no
proporciona información de
la pureza (como el índice
A260:A280), ni de la posible
degradación del ARN o ADN,
por lo que se requiere realizar
una electroforesis para
comprobar la integridad del
ácido nucleico.