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UNIVERSIDAD CONTINENTAL DE CIENCIAS E INGENIERIAS MICROBIOLOGIA

“Año de la Integración Nacional y el Reconocimiento de Nuestra Diversidad”

UNIVERSIDAD CONTINENTAL DE CIENCIAS E


INGENIERIA

ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE INGENIERÍA


AMBIENTAL

INFORME : COLUMNA DE WINOGRADSKY

ASIGNATURA : MICROBIOLOGIA

DOCENTE : CORDERO AZABACHE JORGE

ESTUDIANTE : CHAVEZ GAMARRA CARLOS 2008104452

: CONSUELO GUTIERREZ FLORES 2009102886

SEMESTRE: V

HUANCAYO – PERÚ

2012

PRACTICA DE MICROBIOLOGIA INFORME


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INTRODUCCION

La columna de Winogradsky es un sistema acuático en el que se le ayuda a


los microorganismos a establecerse en regiones diferenciadas según su
metabolismo y constituye un modelo de ecosistema, similar a los tapetes
microbianos que se hallan en aguas dulces o saladas, donde proliferan
microorganismos del medio acuático y de los sedimentos

Esta técnica fue desarrollada inicialmente por el microbiólogo ruso Sergei


Winogradsky en el año 1856 – 1953, quién hizo la columna para estudiar
los microorganismos del suelo. La columna de Winogradsky es un sistema
que permite observar en el laboratorio el proceso evolutivo de los
microorganismos, es decir, el proceso de adaptación a los diferentes
ambientes empleando diferentes estrategias para la obtención de energía.

Una vez que se prepare la columna y se exponga a la luz solar, se


desarrolló una sucesión de comunidades bacterianas interrelacionadas
metabólicamente, de un modo similar a lo que ocurre en la naturaleza, que
se pondrán fácilmente por si distinta coloración. Además, la columna es un
sistema anoxico en miniatura que puede usarse como suministro a largo
plazo de bacterias para cultivo de enriquecimiento.

En este informe también se mira el ciclo del azufre, se aprecia ciclos


biogeoquimicos equivalentes a (nitrógeno, carbono u otros elementos)

OBJETIVO:

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OBJETIVO GENERAL

 Aprender a como hacer una ecología microbiana


 Saber los procesos que se realizan para cultivar microorganismos

OBJETIVOS ESPECIFICOS

 Observar el crecimiento bacteriano, según la distribución y la


implantación que se hizo en el columna

 Realizar un medio de cultivo desde la distribución y elaboración de la


columna donde se desarrollara.

 Observar el crecimiento bacteriano, según la distribución de los mismos,


luego del tiempo determinado para su desarrollo.

 Aislar microorganismos por los métodos de estriado, para saber si hubo


el crecimiento de los microorganismos que supusimos se iba ha
encontrar, si nos arroja datos en caso positivo o negativo

 Saber el desarrollo del Ph cada cierta temporada así poder


monitoreando

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a) COLUMNA DE WINOGRADSKY

Una vez establecida la columna, se pueden diferenciar tres zonas


características en base a su concentración relativa de oxigeno:
 Zona aerobia.- Es la mas superficial, dispone de una alta
concentración de oxigeno
 Zona microaerofila.- Que es una debajo del anterior con una menor
concentración de oxigeno
 Zona anaeróbica.- es esta constituida por el lecho del lodo.

Las algas y cianobacterias forman una capa superficial del color verde
brillante, y al producir oxigeno ayudan a mantener la aerobiosis en la zona
superior de la columna. Mientras que en el fondo de la columna, las
bacterias reductoras del sulfato producen sulfuro, que provoca el
crecimiento de bacterias rojas y verdes del azufre (fototroficos
anoxigenicos).

De modo que se establecen dos gradientes en la columna, uno de oxigeno


y otro de sulfuro de hidrogeno en su formula (H2S)
Las bacterias quimiorganotrofas crecen a lo largo de toda la columna, los
microorganismos aerobios y microaeerofilos en la parte superior, los
anaerobios en las zonas donde hay sulfuro de hidrogeno.

http://es.scribd.com/doc/59281261/Columna-de-Winogradsky

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DIBUJO DE LA COLUMNA

LUZ SOLAR

O 2
ZONA
O 2
ALGAS CIANOBACTER

ZONA BACTERIAS OXIDADORAS DEL AZUFRE


MICROAEROFILA Beggiatoa, thiobacillus, thiotrix

BACTERIAS ROJAS NO DE AZUFRE


Rhorospirillum, Rhodopseudomonas

HS2
BACTERIAS ROJAS DEl AZUFRE
Chromatium

ZONA
ANAEROBIA

BACTERIAS VERDES DEL AZUFRE


Chlorobium

-2
SO
BACTERIAS REDUCTORAS DEL SULFATO
Desulfovibrio

4 BACTERIAS FERMENTADORAS DE
CELULOSA (Clostidrium)

BACTERIAS METANOGENICAS Y
QUIMIOLITOTROFOS DEL AZUFRE

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ZONA AERÓBICA

Esta es la parte de la columna más rica en oxígeno y más pobre en azufre.


El agua de la parte superior de la columna contiene abundantes
poblaciones de microorganismos aerobios, que aparecen normalmente en
hábitats acuáticos ricos en materia orgánica (estanques poco profundos,
arroyos, etc.). Suelen ser microorganismos flagelados, lo que les permite
moverse y establecerse en nuevas áreas, así como microorganismos
fotosintéticos: algas (diatomeas) y cianobacterias filamentosas. El oxígeno
que producen estos productores primarios difunde desde la superficie,
creando condiciones similares a las que existen en un lago con sedimentos
ricos en nutrientes.

ZONA MICROAERÓFILA

Es la zona en la que solapan ambos gradientes, el de oxígeno y el de


sulfuro de hidrógeno. Aparecen bacterias oxidadoras del azufre como
 Beggiatoa
 Thiothrix
 Thiobacillus
Que usan como fuente de carbono la materia orgánica, y oxidan el H2S
que llega por difusión desde las capas inferiores a azufre elemental. La
reacción química que se lleva a cabo es la siguiente (reacción de Bunsen):

O2+ H2S → H20 + S0

Son, por lo tanto, microorganismos mixótrofos. Estos géneros acumulan


gránulos de azufre en sus citoplasmas por oxidación del H2S. Si se deja
evolucionar el sistema, cuando la concentración de H2S es muy baja, los
gránulos de azufre elemental intracitoplasmático presentes en estas
bacterias empiezan a desaparecer por oxidación total a sulfato
(H2S → S0→SO42 –)

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ZONA ANAERÓBICA
Esta zona contiene H2S (procedente del fondo), en la zona anaeróbica
superior predominan las bacterias fotosintéticas anaerobias, y en la
columna se observan una serie de bandas de colores rojo y verde:
Bacterias rojas no del azufre:

 Rhodospirillum
 Rhodomicrobium
 Rhodopseudomonas
Son bacterias anaerobias fotoorganótrofas, que sólo pueden realizar la
fotosíntesis en presencia de una fuente de carbono orgánico. Forman una
capa de color rojo-anaranjado. Las bacterias verdes no del azufre son
termófilas y, por lo tanto, no crecen en la columna a temperatura ambiente.

Bacterias rojas del azufre:


 Chromatium
 Thiospirillum
 Thiocapsa
Forman una capa de color rojo-púrpura) y bacterias verdes del azufre
 Chlorobium
 Pelodyctium
Estas bacterias son fotolitótrofas y realizan una fotosíntesis anoxigénica, no
producen oxígeno ya que no utilizan H2O como elemento reductor sino
H2S, generando en este proceso sulfatos (SO42 –). La reacción que tiene
lugar es la siguiente: 2 H2S + CO2 → [CH2O] + H2O + 2 S

Estos microorganismos aparecen como zonas decrecimiento en el lodo de


la columna, pero también pueden desarrollarse en el agua si los fotótrofos
oxigénicos son escasos.
Bacterias reductoras del sulfato (BRS):
 Desulfovibrio
 Desulfobacter
 Desulfotomaculum
 Desulfomonas

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Usan el sulfato, u otras formas parcialmente oxidadas de azufre como el


tiosulfato, y generan grandes cantidades de H2S en el proceso. La reacción
de reducción bacteriana del sulfato es la siguiente:
SO42 – + 8 H+ →2S + 2H2O + 2 OH –. Este H2S reaccionará con el hierro
presente en el sedimento, produciendo sulfuro de hierro

Que precipita y da el color negro. Es por esto que, en la naturaleza, los


sedimentos acuáticos son frecuentemente negros. La reacción sería la
siguiente:

Sin embargo, no todo el H2S reacciona con el hierro (II), parte de éste
difunde hacia arriba a lo largo de la columna de sedimentos y es utilizado
por las bacterias verdes y rojas del azufre que crecen en las zonas
superiores.
Bacterias fermentadoras: utilizan la celulosa del papel aportado como
fuente primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del género
Clostridium.
Son anaerobias estrictas, y no empiezan a crecer hasta que el oxígeno
desaparece del sedimento. Estas bacterias degradan la celulosa hasta
residuos de glucosa y, a continuación, fermentan la glucosa para obtener la
energía que necesitan, produciendo una serie de compuestos orgánicos
simples (etanol, ácido acético, ácido láctico, ácido succínico, etc.) como
productos finales de esa fermentación.
Estos compuestos orgánicos serán, a su vez, respirados por las bacterias
reductoras del sulfato. Cuando la celulosa se agote, usarán la materia
orgánica producida por el resto de bacterias.
También pueden aparecer bacterias metano génicas que generan CH4,
que se observa como burbujas de gas en el fondo de la columna.

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PARTE II: MATERIALES Y MÉTODOS

b) PARTE EXPERIMENTAL:

INSTRUMENTAL DE LABORATORIO

MATERIALES

 Probeta de 500ml
 Lodo procediente de la superficie del lago o charco
 Agua procedente de lago o charco
 Restos organicos de diferentes tiras de papel, aserrín, restos de raíces
de plantas
 5 Gramos de SO4Ca y CO3Ca

EQUIPOS

 PH Metro

REACTIVO

 5 Gramos de SO4Ca
 5 Gramos de CO3Ca

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PROCEDIMIENTOS

1.-Se usa una columna grande de cristal (una probeta de 100 ml) o de plástico
transparente (una botella).

2.-Se añade una fuente de carbono y energía para la cadena trófica microbiana, en
este caso es celulosa, que puede administrarse en forma de tiras de papel de filtro o
de periódico, hierba, serrín, etc. Es importante que la celulosa permanezca en el fondo
o en la zona intermedia, pero no en la zona superficial, ya que las bacterias que
degradan la celulosa son anaeróbicas. Deben evitarse los sustratos fácilmente
fermentables, que pueden producir una formación excesiva de gas.

3.-Se llena la columna con lodo, de una charca o del fondo de un río, ricos en materia
orgánica, hasta 1/3 de su volumen.

4.-Se añade a la mezcla una fuente de sulfato (sulfato de calcio, CaSO4, o yeso) y un
agente tamponador del pH (carbonato cálcico, CaCO

3.- El lodo también puede mezclarse con el contenido de un huevo, como fuente de
azufre. Se añade también bicarbonato sódico (NaHCO3), cloruro de amonio (NH4Cl) y
tampón fosfato pH 7,3

5.-La mezcla se compacta para forzar la salida de las burbujas de aire, hasta obtener
una capa de unos 10 cm.

6.-Se añade agua, de la propia charca o río donde se haya recogido el fango, hasta
rellenar casi completamente la columna (hay que dejar con aire unos 5 cm de la
misma). Si no se dispone de suficiente agua de río, se puede terminar de rellenar la
columna con agua corriente.

7.-Se tapa la columna, con parafina o con papel de aluminio, para evitar la
evaporación. Se coloca cerca de una ventana donde reciba luz solar atenuada, y se
deja durante varias semanas.

8.-Se examinará la columna periódicamente, anotando los cambios de color y grosor


de las diferentes capas (Fig. 1). Y se tomarán muestras de las capas para estudiar

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DISCUSION DE RESULTADOS

Para las columnas de Winogradsky se utilizaron muestras provenientes de la


región de Poopo, estas columnas fueron incubadas a temperatura ambiente
por un periodo de cinco semanas aproximadamente, en las cuales se
observó la separación por fases, en la que la parte inferior pertenece a la
región sulfato reductora (color negro). De ésta última se tomo una muestra
y se la repico en los medios Postgate y Pfennig con diferentes fuentes de
carbono. La Figura No. 3 muestra el desarrollo de los micro-ecosistemas en
las columnas. Se puede evidenciar la diferencia de color y claramente la
parte profunda demuestra actividad sulfato reductora por la formación de
precipitado negro de sulfuro ferroso.

En la Tabla No. 1 se detalla la produccion de sulfuro de hidrogeno por


consorcios crecidos en diferentes medios de cultivo. Los consorcios SA7 y
Go2 presentaron una concentración alta de sulfuro en etanol y glicerol como
fuentes de carbono a pHs extremos. Sin embargo es importante resaltar
que la produccion de sulfuro de hidrogeno por el consorcio MM10 a partir de
la utilización de AGVs como fuente de carbono a un pH de 4, favoreceria el
futuro establecimiento de sistemas de remediación de metales pesados en
DAMs aprovechando el proceso de digestión anaerobica de la materia

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organica (residuos solidos municipales y/o agrícolas) 2. Sin embargo el hecho


de utilizar vitaminas en el medio encareceria el sistema de biorremediacion.

En la Tabla No. 2 se muestra que en el medio Pfennig se presenta


concentraciones de sulfuro de hidrogeno que pueden ser aprovechadas
principalmente en celulosa por los consorcios Soc a pH 6 y Mr a pH 4, ya
que representa una fuente de carbono económica para el proceso de
biorremediación, pero teniendo como desventaja que la composición de este
medio por si solo encarece el proceso. De igual manera pueden ser
aprovechables los AGVs, los mismos que pueden ser obtenidos a partir de la
digestión anaeróbica de la materia orgánica. En este sentido, el consorcio
Soc crecido a pH 4 constituye una excelente alternativa para el
establecimiento de procesos de remediación en un solo paso.

Por otra parte en el medio Postgate que presenta una menor cantidad de
sales puede llegar a abaratar el proceso de biorremediación, así podemos
decir que seria muy bien aprovechados los consorcios Lodo (pH6) y Mr
(pH4) con celulosa, y Soc y lodo (ambos a pH6) para AGVs,
respectivamente.

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En ambos medios de cultivo se obtuvo muy buenas concentraciones de


sulfuro utilizando como fuente de carbono etanol, pero debemos tomar en
cuenta que esta fuente de carbono elevaría los costos para la
biorremediación.

Trabajos anteriores muestran concentraciones de 1mM [6] hasta 18mM [2],


por lo que nuestra producción de sulfuro se encuentra dentro de
concentraciones óptimas para la precipitación de metales pesados.

No se llegaron a aislar cepas de BSR, por lo que se utilizaron directamente


los consorcios de BSR, y tomando en cuenta las concentraciones mas altas
en cuanto a la producción de sulfuro para proceder a encapsular en perlas
de agar-agar.

Conociendo ya estos resultados, se pretende obtener concentraciones mas


adecuadas y a la vez optimizar el crecimiento bacteriano. De esta manera
se podrían establecer biorreactores en un solo paso que permitan la
precipitación eficiente de metales pesados, alcalinizar el pH del efluente y
disminuir la concentración de sulfatos del mismo. Asi también se dará
protección al consorcio frente a la acidez extrema del DAM, atraves de la
encapsulación en perlas de agar-agar, las cuales se encontrarán al interior
del biorreactor.

FUENTE DE APOYO
http://www.scielo.org.bo/scielo.php?pid=S1813-53632007000100002&script=sci_arttext

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RESULTADOS:
Hemos diferenciado los diversos estratos que constituyen los microorganismos
según su tipo de alimentación:
La población microbiana se va repartiendo en zonas.
Los productos de la fermentación (Clostridium) y los sulfuros (Desulfovibrio)
migran hacia arriba desde la zona inferior reductora, favoreciendo, en la zona
superior de la columna, con oxígeno el crecimiento de quimiolitótrofos
(BeggiatoayThiothrix). En este gradiente de HS, como fuente de e-, los
fotoautótrofos (Chlorobium, verde, y Chromatium, roja) se desarrollan como
color verde oliva y púrpura. Por encima crecen bacterias púrpuras no del azufre
(Rhodospirillum) que utilizan ya materia orgánica como dador de e- en zona
anaeróbica. El oxígeno difunde desde la superficie, creando condiciones
similares a las que existen en un lago con sedimentos ricos en nutrientes. Con
luz se reproduce la penetración de la luz solar en la región inferior anaeróbica,
para facilitar el desarrollo de los microorganismos fotosintéticos anoxigénicos.
En la zona más alta se pueden ver diatomeas y cianobacterias. o La T° y la
Presión controlan la cantidad de oxígeno disponible por los microorganismos

CONCLUSIÓN:

Hemos conseguido nociones básicas como que en la columna se desarrollan


diversos organismos:

En la zona inferior de los de desarrollan organismos que desarrollan procesos


fermentativos que producen alcohol y ácidos grasos como subproducto de su
metabolismo. Estos productos de desecho son a su vez sustrato para el
desarrollo de bacterias reductoras de sulfato. Como resultado se liberan
sulfuros que difunden a la zona superior oxigenada crenado un gradiente en el
que se desarrollan bacterias fotosintéticas que utilizan el azufre. Por encima de
esta zona pueden desarrollarse las bacterias purpura que no utilizan el azufre.
Cianobacterias y algas crecen en la parte superior y liberan oxigeno que
mantiene aerobia esta zona.

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La columna de Winogradsky es también una clásica demostración de cómo los


microorganismos ocupan micrositios muy específicos de acuerdo a su medio
ambiente y sus tolerancias de carbono y las necesidades de energía

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CUESTIONARIO DE COLUMNA WINOGRADSKY


1. ¿Cuál es el principal objetivo de la columna de WINOGRADSKY?
La columna de Winogradsky es una demostración clásica de cómo los microorganismos
ocupan "microespacios" altamente específicos de acuerdo con sus tolerancias
medioambientales y sus necesidades vitales (requerimientos de carbono y energía) y
que, además, ilustra cómo diferentes microorganismos desarrollan sus ciclos, y la
interdependencia que llega a existir entre ellos (las actividades de un microorganismo
permite crecer a otro y viceversa). Esta columna es un sistema completo y autónomo de
reciclamiento, mantenido sólo por la energía de la luz.

2. ¿Por qué se adiciona el sulfato de calcio a la muestra de sedimento?


Se adiciona sulfato de calcio para fermentación para su respiración anaerobia.

3. ¿Cuál es la función de los restos de hojas, plantas, aserrín. en la columna?

En condiciones estrictamente anaerobias al cabo de unas semanas, y utilizando la carga


de celulosa aportada por los restos de papel incorporados en el sedimento como fuente
primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del género Clostridium.

4. ¿Qué niveles de luz, oxígeno y sulfuros hay en cada capa de la columna?

5.
¿Qué

organismos predominan en cada una de las capas? ¿De qué fuentes obtiene carbono y
energía cada clase de organismo?

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Aparecen varios grupos diferentes de bacterias:


En el fondo de la columna, dependiendo del tipo de barro utilizado, puede aparecer una capa de
color rosado formada por bacterias púrpura del azufre portadoras de vesículas de gas. Una
especie característica es Amoebobacter.
En esta misma zona, en condiciones estrictamente anaerobias al cabo de unas semanas, y
utilizando la carga de celulosa aportada por los restos de papel incorporados en el sedimento
como fuente primaria para su metabolismo, aparecen las bacterias del género Clostridium.
Todas las especies de este género son anaerobias estrictas porque, aunque sus esporas
pueden sobrevivir en condiciones aerobias, las células vegetativas mueren si están expuestas al
oxígeno. Por eso no empiezan a crecer hasta que éste desaparece del sedimento. Estas
bacterias degradan la celulosa a glucosa y, a continuación, fermenta la glucosa para obtener la
energía que necesitan, produciendo una serie de compuestos orgánicos simples (etanol, ácido
acético, ácido succinico, etc) como productos finales de esa fermentación.
Un poco por encima, las bacterias reductoras del azufre, que se visualizan como una profunda
capa negra y están representadas por Desulfovibrio, pueden utilizar estos subproductos de la
fermentación para su respiración anaerobia, usando sulfato, u otras formas parcialmente
oxidadas de azufre como el tiosulfato, generando grandes cantidades de SH2 en el proceso.
Este SH2 reaccionará con cualquier hierro presente en el sedimento, produciendo sulfuro
ferroso, que da color negro. Es por esto que los sedimentos acuáticos son frecuentemente
negros.
Sin embargo, no todo el SH2 es utilizado. Como veremos un poco más adelante, ciertas
cantidades difunde hacia arriba a lo largo de la columna de agua y son utilizados por otros
organismos que crecen en las zonas superiores.
Este crecimiento se visualiza bajo la forma de dos bandas estrechas, brillantemente coloreadas,
inmediatamente por encima del sedimento: en una primera franja, las bacterias verdes del azufre
(como Chlorobium) procesan los sulfatos a azufre y aparecen en una franja verdosa. En otras
zonas cercanas, bacterias como Gallionella procesan el Hierro formando una capa negra que se
forma justamente por debajo de la anterior. Un poco más arriba, algo más alejadas por tanto de
las altas concentraciones de sulfídrico se desarrolla una zona de bacterias púrpuras del azufre,
como Chromatium, caracterizada por su color rojo-púrpura.
Estas bacterias del azufre, verdes y púrpuras, obtienen energía de las reacciones luminosas y
producen sus materiales celulares a partir de CO2. En gran medida, de manera muy similar a
cómo lo hacen las plantas aunque, sin embargo, hay una diferencia esencial: no producen
oxígeno durante la fotosíntesis porque no utilizan H2O como elemento reductor sino SH2. Las
ecuaciones simplificadas que siguen muestran el paralelismo de ambos procesos:
6 CO2 + 6 H20 C6H12O6 + 6 O2 (fotosíntesis de las
plantas)
 
6 CO2 + 6 SH2 C6H12O6 + 6 S (fotosíntesis de las
bacterias anaerobias)
Un poco por encima de esta zona nos encontramos una franja de bacterias púrpuras no del
azufre, como Rhodospirillum y Rhodopseudomonas, que adquiere un color rojo-anaranjado. Su
mayor o menor abundancia dependerá de la cantidad de sulfhídrico que se haya producido y de
la cantidad que, no utilizada por otros organismos, difunda hacia arriba, ya que su presencia
inhibe a estas bacterias. Son anaerobios fotoorganotrofos que sólo pueden realizar la
fotosíntesis en presencia de una fuente de carbono orgánico.

6. Si hacemos una columna y lo sometemos a oscuridad que organismos creen ustedes


que crecerían.

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Crecerian otras bacterias que su habitad es la oscuridad

7. Principales variables que existen en la construcción de la columna y qué sucede si estas


no se mantienen como deben?

La columna aquí descrita se enfoca sobre todo al ciclo del azufre, pero se podría
desarrollar igualmente la reproducción de otros ciclos biogeoquímicos equivalentes para
nitrógeno, carbono y otros elementos.

8. Cuáles son las características qué deben de cumplir los componentes de la columna y
cuáles serían los efectos en el desarrollo de la misma si dichas características no se
respetan?
Consta de un cilindro ancho de cristal que se llena con lodos ricos en materia orgánica
hasta 1/3 de su volumen. Se añaden restos orgánicos de diferente orígen (tiras de papel
de periódico, aserrín, restos de raices de plantas, carne piada, etc). Se añade a la
mezcla un suplemento compuesto de SO4Ca y CO3Ca (que actúan como fuente de
sulfato y tampón respectivamente). La mezcla, bien apretada para que no queden
burbujas de aire, se cubre con agua procedente de un lago, estanque, acequia (o alguna
fuente similar), se cubre con papel de aluminio y se deja en una ventana donde reciba la
luz del sol.

9. Esquematiza los ciclos del azufre y del nitrógeno indicando los procesos que se llevan a
cabo y
el
nombre
de los

mismos.

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BIBLIOGRAFIA:

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioBiodiversidad.htm

http://www.danival.org/notasmicro/micro_winogradsky.html

BIBLIOGRAFÍA

Brock Biología de los microorganismos. 10ª edición (2003). J. Parker,


J.M. Martinko,M.T. Madigan. Pearson Education.

Manual Práctico de Microbiología. 3ª edición (2005). R. Díaz, C.


Gamazo, I. López-Goñi.
Elsevier-Masson.

Otros:
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/microbiology.html
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/LabMicroExpGpo01_12308.pdf

http://www.scielo.org.bo/scielo.php?pid=S1813-
53632007000100002&script=sci_arttext

http://es.scribd.com/doc/59281261/Columna-de-Winogradsky

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