PRÁCTICA N°09

ACCIÓN DE AGENTES QUÍMICOS SOBRE LOS MICROORGANISMOS

OBJETIVOS.-
Inhibir el crecimiento microbiano por acción de las sustancias químicas.

A.- EL EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE IONES HIDRÓGENO (pH) EN LOS

MICROORGANISMOS

Se consideran los efectos de distintas concentraciones de iones hidrógeno con respecto a su capacidad para suprimir el
crecimiento microbiano. En este experimento los microorganismos se inoculan en un medio que es capaz de mantener el
crecimiento siempre y cuando el pH sea tolerable. La única diferencia entre las distintas probetas de medio inoculado radica
en el pH de los caldos en cuestión. Se observará el crecimiento y se extraerán conclusiones. Para que los resultados sean
válidos, es preciso que las observaciones de todas las probetas se realicen a un mismo tiempo.

MATERIALES.-

1.- Cultivos de E. coli y Saccharomyces cerevisiae.

2.- Probetas con caldo nutriente estéril previamente ajustadas con HCI 1.0 N y NaOH 1.0 N a valores de pH de 3.0, 5.0,
7.0, 9,0 y 11.0 (1 de cada una).
3.- Probetas con caldo de extracto de malta estéril ajustadas a los mismos valores de pH.

PROCEDIMIENTO.-

Inocule cada una de las probetas de caldo de nutrientes de distintos valores de pH con E. coli. Repita el procedimiento pero
ahora con las probetas de extracto de malta, inocúlelas todas con S. cerevisiae. Incube todas las probetas en su cajón y anote
sus observaciones, en términos de la cantidad de crecimiento, al primero, segundo y al quinto día. Emplee la siguiente
escala: 4+ para máximo crecimiento y O para nada de crecimiento; clasifique los crecimientos intermedios como 3+, 2+ ó 1 +.
En varios experimentos subsiguientes será menester juzgar la cantidad de crecimiento microbiano en un medio líquido dado.
Aunque este sistema de evaluar con la escala de 4+ a O es razonablemente exacto, es bastante fácil elaborar otro sistema
más cuantitativo. Si se mezcla cloruro de bario con ácido sulfúrico, se forma un precipitado de sulfato de bario. Ajustando las
concentraciones de los reactivos, es posible obtener cualquier cantidad de precipitado. La escala McFariand se da a
continuación, en ésta, la turbidez producida por cada mezcla de BaCI 2 y H2SO4 ha sido calibrada para aproximar un cierto
número de bacterias por unidad de volumen. En otras palabras, la turbiedad que resulta al agitar bien una de estas probetas se
aproxima a la turbiedad producida por un cierto número de bacterias en suspensión. Si usted prepara una serie de probetas
con las concentraciones de reactivos enumerados en la escala y los tapa bien, contar á usted con un conjunto permanente en
estándares de conteo para aproximar las densidades de la población microbiana en cultivo de las probetas. Usted podrá
estimar la cantidad de crecimiento microbiano simplemente mezclando bien una probeta patr ón con la probeta problema y
observando luego contra una luz fuerte. Alternativamente, si se cuenta con un espectrofotómetro, se puede usar este aparato
para obtener la misma información de un modo más exacto. Al usar el espectrofotómetro, asegúrese de usar una probeta con
caldo sin inocular para que sirva de testigo en relación con el desarrollo microbiano y una probeta con agua como testigo para
la probeta con sulfato de bario.
B.- ACCIÓN DE LOS COLORANTES

La acción de los colorantes sobre las bacterias es más bien bacteriostática (detiene la multiplicación de las mismas, sin
matadas). En general, todos los colorantes derivados del alquitrán de hulla (grupo TRIFENILMETANO) tienen este poder y
esta propiedad se ha empleado en el reconocimiento y diferenciación de muchas especies por su acción selectiva. Parece que
hay alguna relación entre la acción bacteriostática y el comportamiento de la bacteria frente a la coloración Gram. Es por este
motivo que resurtan más susceptibles a la acción de los colorantes los microorganismos Gram(+). Por otro lado, la actividad
bacteriostática de los colorantes ácidos o básicos se ve incrementada con la acidez o la alcalinidad respectiva del medio.

MATERIAL.-

1.- Cultivo en caldo de E. coli, B. subtilis, St aureus.

2.- 3 placas de agar y cristal violeta (concentraciones 10 -4, 10-5 y 10-6, respectivamente).

PROCEDIMIENTO.-

1.- Dividir cada una de las placas en 3 partes iguales.

2.- Sembrar en cada tercio de las placas, una cepa distinta: E. coli, B. subtilis y St. aureus respectivamente.
3.- Rotular datos e incubar a 37 °C por 24-48 hrs.

C.- ACCIÓN OLIGODINÁMICA DE LOS METALES PESADOS

Durante siglos se han venido fabricando utensilios de plata para servir la comida, tanto recubiertos como de plata s ólida. Esta
costumbre predata la teoría microbiana de la enfermedad. Ahora se sabe que esta costumbre denota inteligencia. El ion de
plata es uno de los iones metálicos de gran actividad inhibitoria sobre el crecimiento bacteriano, incluso en soluciones muy
diluidas. Sorprendente como parece, la plata de un platón o vaso libera en solución, suficientes iones plata para ejercer esta
actividad inhibitoria.
Lo mismo se aplica a otros iones metálicos, como el cobre, aunque la plata es el más activo. Puesto que en nuestros días ya
no quedan muchas monedas de plata emplearemos el cobre para demostrar este efecto.

MATERIALES.-

1 . Cultivos de E. coli y Staphyiococcus aureus.

2. Agar-nutriente para las cajas Petri.
3. Dos centavos bien limpios.
4. Cajas Petri (2).
5. Solución de alcohol 95% -HC11 N.
6. Agua destilada.
7. Probetas cortas con agar-nutriente (2).
8. Pinzas (1).
PROCEDIMIENTO.-

Prepare dos cajas Petri con agar-nutriente como de ordinario. Derrita el medio en las dos probetas cortas y enfr íelas a 45°C.
Inocule una de las probetas cortas con E. coli y la otra con Staphyiococcus aureus usando un par de asas llenas de
organismos por cada inoculo. Rote cada probeta entre sus manos para distribuir los organismos homog éneamente. Mantenga
estas probetas a 45°C mientras procede con el resto del experimento. Lave bien un centavo, primero con agua y jabón,
luego báñelo en la solución limpiadora de ácido-alcohol (use sus pinzas) y luego enjuáguelo bien en agua destilada.
Manipule el centavo únicamente con pinzas, las que debe haber flameado previamente. Deposite la moneda
firmemente en el centro de la caja con agar de tal forma que se adhiera a la superficie del agar. Luego tome la probeta
corta con agar derretido, enfriado e inoculado con E. coli, y viértalo sobre la moneda en el centro de la caja de tal
manera que se forme un segunda capa de agar sobre la primera. Tape la caja, rotúlela con el nombre del organismo y
póngala a incubar en posición invertida a 37°C por 24-48 horas. Repita el mismo procedimiento con el otro organismo
en la segunda placa Petri. Observe los resultados y haga un dibujo ilustrando la actividad del cobre en el experimento.

RESULTADOS.-
Tabla I: ACCIÓN DE LOS IONES HIDROGENO
pH 3.0 pH 5.O pH7.0 pH9.0 pH 11.0
Caldo nutricio 3.O

Extracto de malta

Tabla II: ACCIÓN DE LOS COLORANTES

COLORANTE DILUCIÓN ESPECIES MICROBIANAS

E. coli B. subtílis St aureus

CRISTAL 10-4
VIOLETA icr5
icr6

Tabla III: ACCIÓN OLIGODINAMICA DE LOS METALES

ACTIVIDAD DEL COBRE
E. coli

St. aureus