PRÁCTICA DE LABORATORIO 2 y 3

IDENTIFICACION CUALITATIVA DE BIOMOLECULAS

(CARBOHIDRATOS, LIPIDOS, AMINOÁCIDOS, PROTEÍNAS)
Profesor : Clara Andrea Rincón Cortés

Correo electrónico : clrincon@udca.edu.co

INTRODUCCION:

Las biomoléculas se encuentran compuestas básicamente de carbono, el cual realiza diferentes grupos funcionales orgánicos y
se organizan de forma jerárquica en las células. Dado a la versatilidad de los átomos de carbono para formar enlaces covalentes
sencillos y dobles principalmente, es de gran importancia biológica porque a partir de ellos se establecen unidades monoméricas que
se enuncian a continuación:
- Carbohidratos: estas biomoléculas son los compuestos orgánicos más abundantes de la biosfera y a su vez los más diversos.
Normalmente se encuentran en partes estructurales de los vegetales y también en los tejidos animales, como glucosa o glucógeno.
Estos sirven como fuente de energía para todas las actividades celulares vitales. De acuerdo a su estructura se pueden dividir en
dos grupos; los monosacáridos con función aldehído, denominados aldosas y los monosacáridos con función cetona o cetosas.
D e a c u e r d o l a cantidad de carbonos en su cadena, se distinguen entre aldo - y cetotriosas (3-Carbonos), aldo- y cetotetrosas
(4-Carbonos), aldo- y cetopentosas (5-Carbonos) y las aldo-cetohexosas (6-Carbonos). Por otro lado gracias a la polimerización
de estas unidades monoméricas primarias permite la aparición de un segundo nivel de complejidad al que pertenecen
macromoléculas como son los polisacáridos, caracterizados por ser las fuentes, más importantes y como materia prima para la
obtención de energía. Los más importantes de este grupo son el almidón y el glucógeno. En los vegetales el almidón constituye
el polisacárido de reserva más abundante, sintetizándose en los cloroplastos de las células fotosintéticas y en los amiloplastos de
las células del parénquima de almacenamiento y el glicógeno es la forma principal de almacenaje de carbohidratos en los animales,
se encuentra en proporción mayor en el hígado (hasta 6%) y en el músculo, donde rara vez excede de 1%. Sin embargo, debido
a su masa mayor, el músculo almacena tres a cuatro veces la cantidad de glucógeno que tiene el hígado como reserva.
- Lipidos: También se les denomina grasas, se caracterizan por ser fuentes de energía para las épocas de carencia en el cuerpo humano,
así como muchos otros organismos, otra y no menos importante es su poca afinidad por el agua ó soluciones acuosas. Evolutivamente,
el cuerpo humano es “almacenador de energía”, es decir, está diseñado para acumular parte de la energía que absorbe por los
alimentos para épocas de ayuno. La forma más eficaz de almacenar esta energía es en forma de grasas, que son muy ligeras por lo
que en poco peso de grasa se puede acumular mucha energía. Los lípidos se clasifican en dos grupos principales: simples y complejos.
Los lípidos simples más importantes son las grasas formadas por ácidos grasos y glicerol, dentro de este grupo se encuentran los
triglicéridos; y los lípidos complejos se pueden mencionar los fosfolípidos, entre otros, y como compuesto derivado de los lípidos se
encuentra el colesterol. El cual se encuentra presente en todas las células del organismo. Se presenta en altas concentraciones en la
médula espinal, páncreas y cerebro pero se sintetiza principalmente en el hígado y en el intestino delgado. Aproximadamente el 50%
de las necesidades de colesterol son sintetizadas en el hígado mientras que el resto se obtiene de los alimentos de origen animal
presentes en la dieta.
- Proteínas: En bioquímica es muy común aislar y purificar moléculas para estudiar su composición, su estructura y de ser posible su
función, como es el caso de las proteínas. Para dicha purificación se emplean métodos basados en sus propiedades de solubilidad. En
el caso particular de las proteínas, cada una de éstas tiene una composición de aminoácidos específica que las hace diferentes unas
de otras y, por lo tanto, su comportamiento en disoluciones también es diferente. Por lo general las proteínas fibrosas son insolubles
en agua y resistentes a la degradación enzimática, sin embargo, con soluciones de cierta fuerza iónica se pueden solubilizar. Las
proteínas globulares son relativamente más solubles en agua y en soluciones de baja fuerza iónica, aunque algunas coagulan cuando
se calientan.
- Ácidos Nucleicos: estas biomoléculas junto con algunas enzimas dirigen la biosíntesis de las proteínas celulares, son responsables
tanto de la replicación de las células, para dar células hijas idénticas, como de las mutaciones naturales o inducidas en la constitución
genética de un organismo y de la inmensa variedad de organismos individuales dentro de una especie. Los dos tipos de ácidos
nucleicos encontrados en todos los organismos vivientes son el ácido ribonucléico (RNA) y el ácido desoxirribonucléico (DNA). Los
ácidos nucleicos tienen como unidades monoméricas los nucleótidos. Estos se componen de una base nitrogenada heterocíclica,
derivada de purina o de pirimidina, una pentosa y ácido fosfórico, unidos entre sí mediante enlaces fosfodiéster a través de la pentosa.
Las bases nitrogenadas se unen en forma covalente al esqueleto azúcar-fosfato.

Clara Andrea Rincón Cortés

Lic. Química MsC Biología –Bioquímica
Prácticas de laboratorio Bioquímica
 MATERIALES:

- 10 Tubos de ensayo - 1 Gradilla

- Beaker - 1 Pinza para tubos de ensayo
- Termómetro - 1 Mortero y mazo
- Goteros - Papel filtro
- Erlenmeyer - Embudo
- Tubos de centrifuga - Gasa
- Papa, leche de diferente clase (entera, descremada, deslactosada, cruda, materna) y huevo

REACTIVOS:
- Solución de Molish -Solución de Benedict
-Solución de Lugol -Solución Seliwnof -Ácido sulfúrico
-Hidróxido de sodio -ácido molíbdico -Ácido ascórbico
-colesterol - Etanol:éter -Acetona
-Solución de albumina - Solución lecitina -Solución de biuret
-Solución de nihidrina -Solución de caseína -Soluciones de aminoácidos
-Agua destilada

EQUIPOS:
-Centrifuga -Baño de maría -Espectrofotometro

METODOLOGÍA

Preparación de extracto:
Pele una papa de tamaño mediano y ráyela con un rallador de queso para obtener una pulpa fina (esto debe hacerse lo más rápido posible
para evitar las reacciones de oscurecimiento). A la pulpa obtenida agregue más o menos el doble de su volumen de agua destilada, agite
fuertemente unos minutos. Posteriormente filtre con una gasa, para eliminar la parte gruesa del tejido. Deje que el filtrado se decante, lo
que se deposita en el fondo es el almidón. Una vez que haya terminado de decantarse, separe el sobrenadante y el precipitado márquelo
como M1.

1. Reconocimiento de monosacáridos y polisacáridos:

i. Prueba de Molish: Agregue en un tubo de ensayo 1mL de solución de glucosa, posterior a este agregue 4 gotas de reactivo de
Molish. Mezcle cuidadosamente y con el tubo inclinado agregar 1mL de H2SO4 concentrado de manera que se forme una capa
de ácido debajo de la fase acuosa. No agitar y observe el anillo formado en la interfase. Realice el mismo procedimiento pero
esta vez con 1mL de la solución de almidón y con el extracto de papa o muestra M1.
ii. Prueba de Benedict: Agregue en un tubo de ensaye 1mL del reactivo de Benedict y 1mL de solución de glucosa. Caliente
en baño de maría y deje enfriar a temperatura ambiente. Realice el mismo procedimiento pero esta vez con 1mL de la
solución de almidón. Un precipitado cuya coloración varía desde amarillo hasta rojo, con decoloración de la solución,
indica prueba positiva.
iii. Prueba de Lugol: Agregue en un tubo de ensayo limpios 2mL de la solución de almidón y agregue dos gotas de la solución de
Lugol. (observe lo ocurrido). Posteriormente caliente el tubo hasta ebullición por dos minutos, deje el tubo de ensayo en
reposo hasta que se enfríe. Realice el mismo procedimiento pero esta vez con 1mL de la solución de glucosa.
iv. En 5 tubos de ensayo agregue 1mL de leche de cada una de las clases de leche (por separado) y realice los puntos i, ii y
iii.
v. En 2 tubos de ensayo agregue 1mL extracto de papa y realice los puntos i, ii y iii (por separado).

2. Reconocimiento de Lípidos:

Obtención de las muestras:

Separe la clara de la yema de huevo. La clara se utiliza para obtener proteínas (albúminas principalmente) y la yema para obtener lípidos y
proteínas. Separe la yema y retire la membrana. Tome 1mL de yema (aproximadamente) y adicione 10mL de agua destilada. Agite
suavemente. Centrifugue a 5000 rpm durante 5 minutos. Separe el sobrenadante del precipitado. En el sobrenadante marcarlo como M1,
es donde se encuentran sustancias solubles en agua (como proteínas, vitaminas hidrosolubles, carbohidratos, etc) y guárdelo en la nevera
para posteriores ensayos. Los lípidos se encuentran en la fracción insoluble o precipitado. Tome el precipitado y disuélvalo en 5mL de una
mezcla etanol: éter (2:1). Homogenice hasta no ver precipitado. Adicione 2mL de acetona y mezcle nuevamente. Centrifugue a 5000 rpm
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 por 5 minutos. Separe el sobrenadante (márquelo como M2) del precipitado (márquelo como M3).
- La fracción M2 sepárela en 3 tubos de ensayo. Al N° 1 realice la prueba de saponificación, separando la fracción saponificable (residuo
sólido) de la insaponificable (residuo líquido). A este residuo insaponificable adicione agua destilada y deje en reposo por 5 minutos.
Determine si hay formación de más de una fase. Al tubo N° 2 realice la prueba de fosfatos y al tubo N°3 realice la prueba de colesterol.
- La fracción M3 disuélvala nuevamente en 2mL de etanol: éter (2:1), divida la fracción en dos tubos y realice las pruebas de
saponificación, fosfatos y colesterol.

Pruebas de reconocimiento para lípidos:

1. Prueba de Salkowski (patrón Colesterol): Marque tres tubos de ensayo del 1 al 3. En el tubo N°1 adicione 1mL de colesterol, en el
N°2 1mL de la fracción M2del tubo N°3, de acuerdo a las indicaciones anteriores y en el N°3 1mL de la fracción M3. En cada tubo
agregar 1mL de cloroformo, luego lentamente, por al paredes del tubo, adicione 1mL de ácido sulfúrico concentrado. Mezcle
suavemente y deje reposar por 3minutos. Observe la coloración y compare los resultados entre las tres muestras.
2. Saponificación (Patrón Lecitina): A 1mL de cada fracción (M2 tubo N° 1 y M3), agregar 3 mL de NaOH al 15 %. Colocar en la boca del
tubo una esfera de vidrio o papel de aluminio y reflujar al baño maría durante 20 min. Añadir 2mL de éter y filtrar los jabones
resultantes. Tener en cuenta las indicaciones de obtención de muestra.
3. Fosfatos: A 1mL del filtrado obtenido en la saponificación el tubo N°2 de la fracción M2 y de la fracción M3, agregar 10 gotas de ácido
molíbdico, mezclar y dejar en reposo 5 min. En seguida adicionar 10 gotas de solución de ácido ascórbico. Observe la coloración. Si
no se desarrolla color colocar el tubo en el baño maría por 5 min.

3. Reconocimiento de Aminoácidos:

1. Adicione 1mL de los patrones de aminoácidos en un tubo de ensayo, mas 1mL de solución de nihidrina, por ultimo caliente las
muestras en baño de maría hasta observar cambios en las soluciones.
2. Repita el procedimiento anterior, pero esta vez empleando 1mL de la fracción M1 del reconocimiento de lípidos, 1mL de clara
de huevo, 1mL de cada tipo de leche.

4. Reconocimiento de Proteínas:

Obtención de las muestras:

Colocar la clara de huevo en un vaso de precipitados y tomar 2mL aproximadamente en un tubo de ensayo. Adicione 20 gotas de ácido
acético 1M y agitar suavemente. Filtrar la mezcla obtenida con gasa (2 capas).Filtrar la albúmina acidificada a través de cuatro capas de
gasa, para separar el precipitado del sobrenadante obtenido. Mida el volumen del sobrenadante obtenido. A este último adicione
lentamente un volumen igual de solución de sulfato de amonio (780g/L) agitando suavemente. Deje reposar por 15 minutos en un baño
de hielo. Centrifugue a 3000 rpm por 5 minutos. Separe el sobrenadante del precipitado. Al sobrenadante adiciónele 2mL de agua
destilada (márquela como M4) y realice las pruebas de proteínas.

Pruebas de reconocimiento para proteínas:

1. Prueba de Millon: Con 0,5mL de las muestra patrón (albumina y caseína, cada una en tubos independientes) agregar 5 gotas de
reactivo de Millon; calentar durante unos minutos al baño maría; observar el precipitado. Repetir el mismo procedimiento con 0,5
de las muestras: M1, M4, leches de las diferentes clases.
2. Prueba de Ninhidrina: Con 1mL de las muestra patrón (albumina y caseína, cada una en tubos independientes) agregar 1mL de
solución de ninhidrina al 0.2%. Calentar al baño maría durante 10 minutos; observar el color. Repetir el mismo procedimiento con
0,5 de las muestras: M1, M4, leches de las diferentes clases.
3. Prueba de Biuret: Con 0,5mL de las muestra patrón (albumina y caseína, cada una en tubos independientes) agregar 1mL de reactivo
de Biuret. Mezclar. Esperar 10 minutos y observar el color. Repetir el mismo procedimiento con 0,5 de las muestras: M1, M4,
leches de las diferentes clases.
4. Prueba de Xantoproteica: Con 0,5mL de las muestra patrón (albumina y caseína, cada una en tubos independientes) agregar 1mL de
ácido nítrico concentrado, enfriar y observar el color. Agregar cuidadosamente 10 gotas de NH 4OH. Observar la interfase. Repetir
el mismo procedimiento con 0,5 de las muestras: M1, M4, leches de las diferentes clases

CUESTIONARIO:

1. En la leche se encuentra un disacárido, llamado lactosa, ¿Cuál es la composición de este disacárido y como se puede
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 comprobar su presencia en los alimentos que la contienen?
2. Investigue las técnicas empleadas para la determinación de glicógeno en tejidos animales.
3. Cuál es la importancia de los monosacáridos y polisacáridos en la dieta humana y que implicaciones o enfermedades se
desarrollan por la falta y/o el exceso en el consumo de estos compuestos.
4. Investigue las diferentes técnicas para la determinación de proteínas y lípidos de forma cuantitativa en la clara de huevo y en la
yema de huevo.
5. Cuál es la principal fuente proteica y lipídica utilizada por las células animales y vegetales.
6. Cuál es la importancia de los lípidos y proteínas en la dieta humana y que implicaciones o enfermedades se desarrollan por
la falta y/o el exceso en el consumo de estos compuestos.

BIBLIOGRAFIA:

BOHINSKY R. Bioquímica. Quinta edición. Editorial ADDISON-WESLEY IBEROAMENRICANA. 1991.

KARP, G. Biología Celular y Molecular. Editorial McGraw-Hill Interamericana. 1998.
MATHEWS, C., HOLDE, K., AHERN, K. Bioquímica. Tercera Edición. Editorial Addison Wesley. 2002.
MELO, V., CUAMATZI, O. Bioquímica de los Procesos Metabólicos. Editorial REVERTE, S.A. 2006.
Martínez J. C. Guías de Análisis Orgánico. Universidad Nacional de Colombia., 1996
Shriner R.L. Fuson R.C. Identificación sistemática de compuestos orgánicos. Limusa Noriega editores 1995.
Vogel’s A. Textbook of practical Organic Chemistry. Fourth Ed., 1978
Durst H.D. Gokel G.W. Química Orgánica experimental. Ed. Reverté, 1985

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