UNIDAD 3.

APLICACIÓN DE TÉCNICAS BASADAS EN

LA REACCIÓN Ag-Ac SECUNDARIAS

CONTENIDOS
- Las técnicas secundarias
- Técnicas de aglutinación
- Técnicas de precipitación
- Técnicas de fijación del complemento

1.- Las técnicas secundarias

Este conjunto de técnicas no valora directamente los complejos inmunes sino que lo
hacen de forma indirecta, atendiendo a cambios físicos que son visibles en el medio
donde se producen. Podemos destacar dos reacciones que producen cambios físicos
en el medio y que son el fundamento de muchas técnicas secundarias:
- Reacciones de aglutinación, en las que cada Ac puede unirse a varios Ag y
cada uno de éstos a varios anticuerpos. En consecuencia, se forma una red
de Ag y Ac que provoca una aglutinación en el medio.
- Reacciones de precipitación, algunas uniones Ag-Ac son complejos muy
grandes para mantenerse en disolución y precipitan en el medio.
Otro grupo de técnicas secundarias lo forman las de fijación del complemento que
utilizan los glóbulos rojos o hematíes como sistema revelador, observando, en este
caso, la lisis de los hematíes en el medio.

2.- Técnicas de aglutinación

Las técnicas de aglutinación se basan en la capacidad que tienen los antígenos
multivalentes (con varios epítopos) para unirse a sus Ac complementarios dando lugar
a inmunocomplejos visibles a simple vista.
Llamamos aglutinógeno a la partícula o Ag que va a generar la aglutinación y
aglutininas a los Ac que van a unirse al Ag o aglutinógeno.
La IgM (aglutinina completa) es el Ac con mayor poder aglutinante debido a su
estructura pentamérica, por ello es el más eficaz para entrecruzar epítopos dispuestos
sobre partículas próximas. Mientras que la IgG al ser bivalente son aglutininas
incompletas y no producen aglutinación cuando están en una situación desfavorable.
La aglutinación ocurre cuando las concentraciones de Ag y Ac son equivalentes. Si
existe desequilibrio, tanto por exceso de Ag como por exceso de Ac, se produce un
fenómeno de zona, y el resultado es un falso negativo.
Otro factor que influye en la reacción de aglutinación es la temperatura. Aunque la
mayoría de estas reacciones se efectúan correctamente a temperatura ambiente (unos
20ºC), los aglutinógenos bacterianos suelen reaccionar mejor a 37ºC.
Dependiendo de que un Ag sea particulado o haya necesidad de insolubilizarlo
mediante fijación sobre un soporte (partículas o células), existen dos tipos de
reacciones de aglutinación: directas o indirectas.

Suspensión de bacterias, protozoos, esporas.

Aglutinación
Suspensión de hematíes (con Ag de grupos sanguíneos):
directa
Hemaglutinación directa.
Suspensión de partículas (bolitas de látex, bentonita, carbón activo)
Aglutinación con Ag soluble adsorbido.
indirecta Suspensión de hematíes sensibilizados con Ag: Hemaglutinación
indirecta.

2.1 Técnicas de aglutinación directa

Se basan en detectar la reacción de aglutinación que provoca la formación de algunos
inmunocomplejos. Se utiliza una suspensión de antígenos particulados (bacterias,
protozoos, esporas) que en sus membranas o paredes celulares expresan los
epítopos. Cuando esta suspensión antigénica se enfrenta a un suero problema que
contiene anticuerpos frente a estos epítopos, se producirá la correspondiente
aglutinación. La lectura es inmediata dado que a simple vista se aprecia la formación
de esos agregados insolubles. La forma de visualizarlos depende del soporte sobre el
que se realice la reacción:
- Si se realiza sobre soporte plano (portaobjetos, tarjeta), la reacción
positiva implica la formación de grumos que son los patógenos unidos entre
sí por los Ac formando agregados macroscópicos.

- Si se realiza en una placa de microtitulación, el positivo se evidencia por

la formación de un velo en la superficie del pocillo correspondiente. Si no
hay aglutinación los antígenos sedimentan en el fondo de los pocillos, en
forma de botón.

Las técnicas de aglutinación pueden ser cualitativas o semicuantitativas si se efectúan

diluciones del suero y se determina el título. Las técnicas directas gracias a su
simplicidad y su sensibilidad se utilizan para el diagnóstico de procesos infecciosos.
Un ejemplo de técnica de aglutinación directa es la prueba rápida de aglutinación en
placa que utiliza una suspensión de bacterias del género Brucella teñidas con rosa de
Bengala como Ag y que se emplea para el diagnóstico de brucelosis. Permite,
mediante una sencilla reacción de aglutinación, hallar anticuerpos específicos frente a
Brucella.

HEMAGLUTINACIÓN DIRECTA
Es un tipo especial de aglutinación directa. Esta técnica se aplica a la determinación
de grupos sanguíneos del sistema ABO y Rh.
- Antígenos ABO: los anticuerpos contra los Ag ABO son isohemaglutininas,
pues los antígenos son de origen humano y se descubren ordinariamente
por una reacción de aglutinación con células de un tipo ABO conocido. En
 otras palabras, el suero que contiene Ac contra los Ag A y B hace que se
aglutinen los eritrocitos en cuya superficie existen dichos Ag.

- Antígenos Rh: los Ag Rh (o Ag D) de los grupos sanguíneos reciben este

nombre por haberse identificado en eritrocitos del mono Rhesus. Los
eritrocitos que poseen el Ag se denominan Rh+ y los que no lo presentan
son Rh-.

Para determinar que Ag y por tanto a que grupo sanguíneo pertenece la sangre, ésta
se pone en contacto con Ac monoclonales contra los Ag A o Ag B, o el Ag Rh, y la
aparición de una aglutinación demuestra la existencia de ese Ag en los hematíes.

2.2 Técnicas de aglutinación indirecta

A diferencia de la aglutinación directa, en esta se emplean antígenos inicialmente
solubles que hay que insolubilizar mediante fijación a un soporte sólido, inerte (bolas
de látex, partículas de bentonita, carbón activo o gelatina), o a una célula (eritrocitos).
Al proceso mediante el cual las partículas son recubiertas con aglutinógenos que no le
son propios se le denomina sensibilización.
Hay una clase especial de prueba de aglutinación indirecta llamada inversa en la que
el aglutinógeno está libre en la muestra problema y reacciona con la aglutinina que
está fijada a la superficie de la partícula. Ejemplo de esta aglutinación es la originada
al hacer reaccionar el Ag de superficie de la hepatitis B, contenido en suero problema,
con una suspensión de partículas de látex recubiertas con anticuerpos anti-antígeno
de superficie de la hepatitis B.
Las técnicas más habituales de aglutinación indirecta son la aglutinación de látex en
placa, la hemaglutinación indirecta y la inhibición de la hemaglutinación.

AGLUTINACIÓN DE LÁTEX EN PLACA

Es una de las técnicas más usadas. La reacción positiva se evidencia por la aparición
de un moteado (grumos) característico, ausente en la reacción negativa.
Generalmente esta técnica es cualitativa con resultado positivo o negativo.
Las partículas de látex son pequeñas esferas suspendidas en un tampón sobre las
que se pueden unir antígenos o anticuerpos solubles mediante interacciones
hidrofóbicas entre estas moléculas y las partículas de látex. Así quedan sensibilizadas
pudiéndose utilizar para la detección de anticuerpos o antígenos, según el caso.
La técnica es muy sencilla, efectuando la lectura por observación de la formación de
agregados visibles en los positivos. Una reacción de aglutinación en látex de uso
frecuente en laboratorio clínico es la determinación de anticuerpos antiestreptolisina O.
La determinación de anticuerpos ASO en el suero de un paciente se aplica al
diagnóstico de fiebre reumática, glomerulonefritis aguda y otras infecciones de
estreptococos.
HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA
En lugar de partículas inertes como en látex, se usa como soporte de los antígenos a
hematíes convenientemente tratados frente a los que se buscan anticuerpos
específicos. Por lo tanto, no se trata de antígenos de los propios hematíes como
ocurría en la directa para determinación de grupos sanguíneos.
La técnica se efectúa en placa de microtitulación con diluciones seriadas de los
sueros. Para la lectura, la aparición de un velo rosáceo en el pocillo supone un
resultado positivo, dado que los hematíes están agregados por los anticuerpos. En
cambio la presencia de un anillo o botón de color rojo se interpreta como resultado
negativo, no existiendo anticuerpos específicos y generando este hecho la
sedimentación de los hematíes.
Estas técnicas requieren un control negativo para comprobar que no haya
hemaglutininas en el suero problema. En el pocillo para el control negativo se deposita
suero problema, y sobre él se añaden hematíes no sensibilizados. Si se obtiene un
resultado positivo, ello indicará que los hematíes han sido agregados por anticuerpos
naturales (hemaglutininas).
Un ejemplo de esta técnica sería la utilizada para realizar una determinación
cuantitativa de anticuerpos frente a Toxoplasma gondii.

INHIBICIÓN DE LA HEMAGLUTINACIÓN
Variante de la técnica anterior. La hemaglutinación se debe a la capacidad que tienen
algunos virus y bacterias de unirse a receptores de membrana de hematíes de
mamíferos y aves. Esto se puede aprovechar para detectar en un suero problema
anticuerpos específicos frente a estos virus o bacterias.
En ausencia de anticuerpos específicos, los antígenos del patógeno provocarían la
aglutinación de los eritrocitos. Por el contrario, si se incuban esos patógenos con el
suero de un paciente que tenga anticuerpos específicos (por ejemplo, frente al virus de
la rubeola), los anticuerpos neutralizarían los antígenos bacterianos o víricos,
inhibiendo así su capacidad para aglutinar hematíes.
La lectura es, por lo tanto, lo contrario de las pruebas de hemaglutinación.

2.3 Valoración de la aglutinación

Las reacciones de aglutinación presentan las ventajas de su alto grado de sensibilidad
y de la gran cantidad de antígenos y anticuerpos que se pueden detectar mediante
estas pruebas, pero tienen el inconveniente de que con ellas, es difícil cuantificar, es
decir, determinar la concentración de la sustancia investigada. Por lo tanto, la mayoría
de las veces son pruebas meramente cualitativas, es decir, solo establecen presencia
o ausencia de sustancia buscada.
Una forma aproximada de establecer la concentración de la sustancia buscada en la
muestra problema (semicuantificar) consiste en preparar diluciones seriadas de la
muestra problema, de forma que la sustancia investigada esté en concentraciones
decrecientes. Practicaremos el ensayo de aglutinación con cada una de las diluciones
preparadas, de esta forma llegará un momento en el que la concentración de la
sustancia problema sea tan pequeña que la prueba sea negativa.
Se llama título de la prueba a la inversa de la máxima dilución con la que la reacción
ha dado positiva.

3.- Técnicas de precipitación

Se basan en la reacción de la precipitación que ocurre cuando un antígeno soluble
multivalente se une con su anticuerpo específico (Ig G o Ig M) dando lugar a
inmunocomplejos que precipitan en el medio de reacción. Es necesario trabajar con
concentraciones equivalentes de antígeno y anticuerpo. Esto se puede comprobar
fácilmente ya que al ir añadiendo el antígeno a la solución se alcanza una
concentración óptima, después de la cual se forma menos precipitado. Tanto el exceso
de anticuerpo como el exceso de antígeno generan una disminución en la
concentración de inmunocomplejos formados.

3.1 Técnicas de precipitación en medio líquido

Se basan en medir la turbidez que produce la precipitación de inmunocomplejos en un
medio líquido. Se puede realizar mediante dos técnicas analíticas, la turbidimetría y
nefelometría, que se basan en la dispersión de un haz de luz incidente. En la
actualidad estas técnicas han sido desplazadas por las reacciones de precipitación en
gel.
TURBIMETRÍA
Se aplica a la determinación cuantitativa de Ig A, Ig G e Ig M en suero humano, para lo
que se utilizan antisueros contra estas inmunoglobulinas, dándose inmunocomplejos
que generan una turbidez medible a 365 nm. La cantidad de inmunocomplejos
formados es proporcional a la concentración de inmunoglobulina presente en la
muestra.
NEFELOMETRÍA
Se suele utilizar cuando la muestra contiene pequeñas concentraciones de partículas
dispersantes. Los complejos antígeno-anticuerpo formados se cuantifican mediante el
gradiente de difracción del rayo láser que producen aunque su principal limitación
radica en la interferencia que pueda causar la propia turbidez de la muestra. Esto
puede ser controlado mediante la utilización de un “blanco” de muestra. Es un método
sensible reproducible y rápido gracias a los nefelómetros disponibles actualmente en
el mercado.

3.2 Técnicas de precipitación en gel

Son más utilizadas en la actualidad. Para ello, es necesario preparar el soporte que es
un gel de agar o agarosa. Los componentes de la reacción se depositan en los
pocillos, difunden a través del gel y en las zonas donde existen concentraciones
equiparables de antígeno y anticuerpo se forman inmunocomplejos que se hacen
visibles a simple vista.
La velocidad de difusión del antígeno o anticuerpo depende de varios factores: la
concentración, la temperatura, el tamaño de las moléculas y la viscosidad del medio.
Por lo tanto, si tenemos una mezcla de diferentes anticuerpos o antígenos el número
de bandas de precipitación representa el número de complejos antígeno-anticuerpo
formados.
DOBLE DIFUSIÓN O REACCIÓN DE Ouchterlony
Los dos componentes de la reacción (antígeno y anticuerpo) difunden libremente por
el gel. La reacción más sencilla consiste en utilizar una disolución de agarosa sobre la
que se excavan dos pocillos en cada extremo del gel. Se dispone una solución
antigénica en uno de ellos y el suero en el que buscamos anticuerpos en el otro.
A medida que los dos componentes van difundiendo libremente se irá formando un
gradiente de concentraciones. En el momento en el que los reactivos se encuentren en
su reacción de equivalencia se formará un precipitado sobre el gel que se detectará
como una banda visible a simple vista. Aunque se trata de una técnica cualitativa, la
distancia a la que se forman las bandas de precipitación nos permite deducir la
estructura o concentración relativa de los componentes de la reacción, ya que la
banda se formará más próximo al pocillo que contenga el componente menos
concentrado y/o de mayor tamaño molecular.
Entre las aplicaciones de la doble difusión están los estudios de identidad entre
antígenos. Se puede determinar la existencia o no de determinantes comunes entre
antígenos estudiando las bandas de precipitación formadas. La identidad será total, es
decir, los antígenos comparten todos los determinantes antigénicos, cuando las
bandas de precipitación se fusionan.
INMUNODIFUSIÓN RADIAL O TÉCNICA DE Mancini
Se basa en la difusión libre de uno de los componentes de la reacción (antígenos o
anticuerpos) por un gel que lleva incorporado el otro componente. En este caso la
formación de los complejos da lugar a la formación de un anillo de precipitación cuyo
diámetro es proporcional a la concentración del componente que difunde por el gel. La
difusión ocurre en todas las direcciones a partir del pocillo, llegará un momento en que
se encuentre con la concentración equivalente del componente incorporado en el gel.
En consecuencia el resultado no será una línea sino un anillo de precipitación. Si en
los pocillos excavados en un gel con anticuerpo incorporado se dispensa una serie de
diluciones de un antígeno se puede establecer una recta patrón representando
gráficamente el diámetro de los anillos frente a la concentración de antígeno en cada
pocillo. Este procedimiento permite conseguir una determinación cuantitativa de un
antígeno en una muestra problema. Esta técnica resulta muy útil para cuantificar
inmunoglobulinas u otras proteínas presentes en un suero problema, para lo cual
existen kits comerciales en muchos casos.
INMUNOELÉCTROFORESIS
Combina la separación proteica por electroforesis y la inmunodifusión y sus principales
aplicaciones son:
- la identificación de fracciones proteicas específicas en una mezcla antigénica
- hallar anticuerpos específicos frente a un antígeno
Los componentes de la mezcla se separan primero aplicando una corriente eléctrica y
a continuación se lleva a cabo una difusión libre en gel de las fracciones obtenidas. Es
una técnica cualitativa cuya principal ventaja es la especificidad, puesto que la
separación previa permite observar bandas o arcos de precipitación exclusivamente
frente a una determinada fracción antigénica. Aunque actualmente está en desuso,
permite la separación de proteínas presentes en suero y otras muestras biológicas,
pudiendo por ejemplo, estudiar que anticuerpos son mayoritarios en un suero.
CONTRAINMUNOELECTROFORESIS (CIEF)
Consiste en una doble difusión forzada mediante la aplicación de un campo eléctrico.
Tiene la ventaja de que permite disminuir el tiempo de incubación y aumentar la
sensibilidad de la técnica, ya que los componentes dispuestos en el pocillo, migran en
sentidos opuestos sin perderse hacia los extremos del portaobjetos o placa donde no
se encuentran el componente complementario. Es una técnica cualitativa. Se practica
en geles de agar eligiendo el pH de forma que los anticuerpos tengan carga positiva o
neutra y el antígeno carga negativa. Aplicando un voltaje, el antígeno y anticuerpo se
mueven uno hacia el otro hasta que se encuentran en el punto de equivalencia, donde
se forman los complejos inmunes y por tanto las líneas de precipitación.
ELECTROINMUNODIFUSIÓN
Se trata de una inmunodifusión radial forzada por la aplicación de corriente eléctrica, lo
que, al igual que en el caso anterior, hace a la técnica más rápida y sensible. Se
conoce también como electroforesis “en cohete”. Los antígenos son sometidos a
electroforesis en un gel que lleva incorporado el anticuerpo o suero. El pH del gel se
elige en el punto isoeléctrico de los anticuerpos, por lo que éstos no migrarán. Se
forman precipitados en forma de cohetes que tienen una altura proporcional a la
concentración del antígeno presente en el pocillo, de forma que los valores
desconocidos se determinan por interpolación en una curva patrón. Es por tanto, una
técnica cuantitativa.

4.- Técnicas de fijación del complemento

Proporcionan una medida indirecta de anticuerpos que no dan reacciones visibles. Se
basa en que la formación de inmunocomplejos activa el sistema del complemento y
produce complejos que lesionan las membranas de eritrocitos y otras células.
4.1 Sistema del complemento
Conjunto de proteínas plasmáticas que se activan durante la respuesta inmunológica.
Entre las acciones destacan la inducción del proceso inflamatorio, la opsonización, y
fagocitosis y la lisis de membranas celulares.
4.2 Reacción de fijación del complemento
La lisis de membranas celulares por el complemento es una de las consecuencias de
su activación. Si el anticuerpo se une a antígenos de membrana de eritrocitos, al
unirse y activarse el complemento, se produce la hemolisis. Esta reacción se puede
utilizar para medir los niveles de anticuerpos en el suero. Esta técnica se utilizó por
primera vez en 1906 en el diagnóstico de la sífilis, y se conoce como reacción de
Wassermann. Tiene la desventaja de que es una prueba compleja, aunque es una
técnica que se aplica a la detección de anticuerpos en un suero utilizando el
correspondiente antígeno como reactivo conocido de la reacción. Se usa por ejemplo
para el diagnóstico serológico de brucelosis.
El procedimiento básico es el siguiente:
- Incubar el suero problema con el antígeno y el complemento.
- Añadir un sistema indicador (hemolítico) constituido por hematíes de la
especie y anticuerpos contra los hematíes de esa especie que forma
complejos antígeno-anticuerpo.
- Interpretación de los resultados. Si se observa lisis de eritrocitos el
resultado es negativo, es decir, no hay anticuerpos en el suero. Si no se
observa lisis el resultado es positivo, es decir, hay anticuerpos específicos
que se han unido al complemento en el suero problema. Estos anticuerpos
han provocado la formación de inmunocomplejos y la fijación del
complemento. Por lo tanto, esa fijación ha impedido que el sistema del
complemento sea activado y se produzca la lisis de las células, este caso
los glóbulos rojos.