1

2 I. Título
3
4 SOBREVIVENCIA A LA DESCONGELACION DE EMBRIONES IN VITRO
5 SOMETIDOS A CRIOPROTECTORES NO PERMEABLES DENTRO LA PAJILLA
6
7 II. Resumen del Proyecto de Tesis
8
9 El presente trabajo de investigación se llevara a cabo en el Laboratorio de
10 reproducción Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. El objetivo
11 principal será evaluar la sobrevivencia a la descongelación de embriones de vacunos
12 de producción in vitro, durante la descongelación los embriones serán sometidos a
13 crioprotectores no permeables dentro la pajilla. Se utilizaran 300 embriones de
14 bovinos de producción in vitro, la congelación de los embriones se realizara con el
15 método convencional, en pajillas de 0.25 mL, se colocara una columna de medio de
16 dilución al que se suplementara con sucrosa o galactosa en 0.1 o 0.2 M de acuerdo al
17 tratamiento. La evaluación se realizara post descongelación a las 6 horas registrando
18 su morfología, a las 24 y 48 post cultivo se observara el desarrollo embrionario. Los
19 resultados se someterán a la prueba de Chi-cuadrado dentro una tabla de
20 contingencia de 2 X 2. Los resultados del protocolo desarrollado se utilizaran para
21 congelar embriones de vacunos criollos que están en extinción por la mejora genética
22 que se está realizando en altiplano.
23
24 III. Palabras claves (Keywords)
25
26 Embrión in vitro, congelación, sobrevivencia, desarrollo.
27
28 IV. Justificación del proyecto
29
30 Los embriones de producción in vitro de los vacunos son menos criotolerantes que
31 los de producción in vivo, especialmente en estado de blastocito (Seidel, 2006). Una
32 de las razones para esta sensibilidad ha sido atribuida a la cantidad de lípidos que
33 están dentro el citoplasma. El número de gotas lipídicas dentro los embriones de
34 producción in vivo son numerosos en estados tempranos, pero declinan cuando pasa
35 al estado de blastocito, explicación que el embrión pierde la sensibilidad enfriamiento
36 (Abe et al., 2002).
37
38 Otro factor que influye en la criotolerancia de los embriones es la fase de
39 deshidratación de los embriones antes de la congelación y la rehidratación de los
40 embriones durante la descongelación. Muchos estudios indican que los agentes
41 crioprotectores se dividen en dos grupos: crioprotectotes intracelulares (glicerol,
42 etilenglicol, etc.) que penetran la membrana, deshidratan, reducen la concentración
43 de los electrolitos y previenen la contracción de la célula dentro soluciones
44 hipertónicas (Kristiansen et al., 1999). Los crioprotectores no permeables (sucrosa,
45 teralose, galactosa, etc.) actúan en la rehidratación de la célula y decrecen la
46 probabilidad de la excesiva rehidratación, previene la desnaturalización de las
47 proteínas dentro las soluciones de congelación y una cristalización eutéctica (Han
48 and Bishf, 2004).
49
50 Trabajos de investigación reportan el uso de los crioprptectores no permeables
51 colocando como una columna de solución descongelación dentro la pajilla en
52 diferentes concentraciones, de tal forma que en el momento de la descongelación ya
53 está actuando el crioprotector no permeable sobre la hidratación del embrión, de tal
54 forma que inmediatamente se realiza la transferencia de embriones. Entre los
55 reportes y en escaso número indican la colocación de 0.5 M de sucrosa (Nedambale
56 et al., 2004), 0.1 M de sucrosa (Inaba et al., 2011; Caamaño et a., 2014; Inaba et
57 al., 2016). También en la columna de descongelación colocaron 0.75 M de etilenglicol
1 1
2
 58 (Sanches et al., 2016), reportando resultados de sobrevivencia de los embriones
59 heterogéneos entre los autores.
60
61 Por esta razón el propósito de este estudio será suplementar en la columna de
62 descongelación de la pajilla diferentes concentraciones de crioprotecores no
63 permeables (sucrosa y galactosa), para comparar a la descongelación la proporción
64 de la sobrevivencia de los embriones de vacunos de producción in vitro.
65
66
67 V. Antecedentes del proyecto
68
69 Congelación convencional de embriones de vacunos de producción in vitro
70
71 Los artículos de investigación de congelación convencional o lenta para embriones de
72 producción in vitro en vacunos se tienen en escaso número. Debido a que los
73 embriones de producción in vitro son de escaza calidad y criotolerancia frente a los
74 embriones producidos in vivo (Papadopoulos et al., 2002; Cognié et al., 2003).
75
76 Martinez et al. (2006) aplicaron 2 protocolos de congelación convencional para
77 preservar embriones de producción in vitro de vacunos en estado de blastocito.
78 Protocolo 1 con glicerol con tres pasos de 0.5, 1.0 y 1.5 M en PBS suplementado con
79 20% de suero fetal y 1% de antibióticos, manteniendo 10 min en cada paso. Para la
80 congelación fue enfriado de 20oC a -6oC a una tasa de 1oC/min hasta -6oC, realizar el
81 seeding y mantener por 10 min a esta temperatura y la congelación se inicia con un
82 ritmo de -0.3oC hasta -30oC y de aquí a un ritmo de -0.1 oC hasta -33oC manteniendo
83 por 2 min y luego introducir al tanque de nitrógeno líquido. La descongelación
84 realizaron a temperatura de cuarto (25oC) manteniendo la pajilla por 10 s y luego en
85 baño maría de 27oC por 20 s. Los crioprotectores fueron removidos en tres pasos
86 (cada paso 5 min) con concentraciones decrecientes de 1,0.5 y 0 M de sucrosa.
87 El protocolo 2 la diferencia fue que el crioprotector etilenglicol y a la descongelación
88 realizaron cada paso por 10 min. Los resultados fueron de 54% y 50% de re-
89 expansion para el glicerol y etilenglicol respectivamente. Posterior al cultivo por 72 h
90 en medio de cultivo la eclosión fue de 20 y 40% para el glicerol y etilenglicol
91 respectivamente.
92
93 Resultados de congelación lenta para embriones de producción in vivo
94 (superovulacion). El protocolo de congelación lenta consistió en donde los embriones
95 (blastocitos) fueron inmersos por 5 min en la solución de congelación que consistió
96 en PBS (solución fisiológica fosfatada) suplementado con 0.4% de BSA mas el 1.5 M
97 de etilenglicol. 2 Embriones fueron cargados en la porción media de una pajilla de
98 0.25 mL (PBS, burbuja de aire, PBS, burbuja de aire, solución de congelación con los
99 embriones, burbuja de aire, PBS con 0.3 M de sucrosa), la pajilla fue sellada y
100 colocadas verticalmente dentro una congeladora programable a -6 oC por 3 min,
101 luego se realizó el seeding en forma manual, posterior al seeding las pajillas fueron
102 mantenidas por 5 min adicionales a -6 oC. El enfriamiento fue a una tasa de
103 0.5oC/min hasta -35oC, donde las pajillas fueron mantenidas a esta temperatura por
104 15 min adicionales, luego fueron introducidas al tanque de nitrógeno líquido y
105 almacenadas hasta su uso. La descongelación fue llevada a cabo a temperatura de
106 cuarto (25oC) exponiendo la pajilla por 10 s y seguido de un baño a 35 oC por 10 s,
107 luego la pajilla fue sacudida y mezclada mantenida por 5 min y finalmente fue
108 vertida a una placa petry que contenía el medio de mantenimiento (PBS + 4% de
109 BSA). Los resultados fueron medidos a la gestación después de realizar la
110 transferencia de embriones 68.4% a los 45 días y la parición también el 68.4%
111 (Bettencourt et al., 2009).
112
113 Voelkel and Hu (1992) reportan que la congelación de los embriones de vacunos de
114 producción in vivo, realizaron con un medio que no poseía ningún tipo de

3 2
4
115 crioprotector no permeable y las pajillas con los embriones utilizaran después de la
116 descongelación en transferencia directa, logrando obtener el 50% de gestaciones en
117 vacas receptoras.
118
119 Para congelar embriones de vacunos de producción in vitro, suplementaron en la
120 columna de descongelación (6 cm del total del largo de la pajilla) con 0.5 M de
121 sucrosa, utilizaron como crioprotector permeable glicerol en una proporción del 10%,
122 el protocolo de congelación y descongelación fue similar a los autores anteriores. Los
123 resultados fueron de 48% de re-expansion a las 6 h, 40% a las 24 h y 48 h el 31%
124 de embriones desarrollados (Nedambale et al., 2004).
125
126 Mientras que las diferentes investigaciones suplementaron 0.1 M de sucrosa como
127 crioprtector no permeable a la solución de congelación y descongelación, donde la
128 pajilla al momento del armado tuvieron una columna de descongelación, separado de
129 una columna de aire, seguido de la columna de congelación (1.4 M de etilenglicol) y
130 los embriones, seguido de otra columna de aire, otra pequeña porción del medio de
131 descongelación y finalmente el sellado de la pajilla y todo el protocolo de congelación
132 y descongelación fue similar a los autores anteriores con pequeñas modificaciones.
133 Reportando resultados de 88.6% de re-expansion a las 24 h y 75% de desarrollo a
134 las 48 h de cultivo (Inaba et al., 2011; Caamaño et a., 2014; Inaba et al., 2016).
135
136 VI. Hipótesis del trabajo
137
138 Ho: Que los embriones in vitro de vacunos sobreviven a la descongelación sometidos
139 a crioprotectores no permeables dentro la pajilla.
140
141 H1: Que los embriones in vitro de vacunos no sobreviven a la descongelación
142 sometidos a crioprotectores no permeables dentro la pajilla.
143
144 VII. Objetivo general
145
146 Evaluar la sobrevivencia de los embriones in vitro de vacunos a la descongelación
147 sometidos a crioprotectores no permeables dentro la pajilla.
148
149 VIII. Objetivos específicos
150
151 8.1. Determinar el porcentaje de re-expansión (6 h) de embriones in vitro de
152 vacunos posterior descongelación sometidos a 2 crioprotectores no permeable
153 s (sucrosa y galactosa) y 2 concentraciones dentro la pajilla (una columna).
154
155 8.2. Determinar el porcentaje de desarrollo (24 y 48 h) de los embriones in vitro de
156 vacunos posterior descongelación sometidos a 2 crioprotectores no permeables
157 y 2 concentraciones dentro la pajilla (una columna).
158
159
160IX. Metodología de investigación
161
162 Material
163 El laboratorio de Reproducción animal de la Facultad de Medicina Veterinaria
164 rutinariamente produce embriones in vitro de vacunos, ovinos y en menor cantidad
165 de camélidos con protocolos estandarizados. De esta producción de embriones se
166 utilizaran 300 embriones de vacunos de producción in vitro en estado de blastocito:
167
168
169
170
5 3
6
171
172 Cuadro. 1 Distribución de los embriones para descongelación con 0.1 M de sucrosa y
173 0.1 M de galactosa (una columna dentro la pajilla).
Parámetro Sucrosa 0.1 M Galactosa 0.1 M Control
N = 50 n = 50 n = 50
Re-expansión 6 h
Desarrollo 24 h
Desarrollo 48 h
174
175 Cuadro. 2 Distribución de los embriones para descongelación con 0. 2 M de sucrosa y
176 0.2 M de galactosa (una columna dentro la pajilla)
177
Parametro Sucrosa 0.2 M Galactosa 0.2 M Control
n = 50 n = 50 n = 50
Re-expansion 6 h
Desarrollo 24 h
Desarrollo 48 h
178
179
180 Protocolos
181
182 1. Congelación y descongelación
183
184 El protocolo que se usara el descrito por Inaba et al. (2011).
185
186 El medio de congelación se preparara en PBS (suero fisiológico fosfatado) libre de
187 cloruros de calcio y magnesio, se suplementara 0.3 mM de piruvato de sodio, 3.3.
188 mM de glucosa, 10 uL/mL de un antibiótico antimicótico y 20% de suero fetal bovino
189 (al que se denominara PBS1).
190
191 a) La solución de congelación será preparado de la siguiente manera: El medio PBS1
192 se suplementara el 0.4% de BSA (Seroalbumina bovina fracción V), 1.5 M de
193 etilenglicol y 0.1 M de sucrosa o galactosa.
194 b) Para el tratamiento 1: 0.1 M de sucrosa o de galactosa se colocara como
195 columna descongelación dentro la pajilla.
196 c) Para el tratamiento: 2 la columna de descongelación tendrá 0.2 M de sucrosa o
197 galactosa dentro la pajilla.
198 d) Para la equilibración 2 embriones serán introducidos en 500 uL de la solución de
199 congelación por 15 min.
200 e) Durante este tiempo de equilibracion los embriones serán cargados en pajillas de
201 0.25 mL donde los embriones y la solución de congelación queden en la mitad de
202 la pajilla de la siguiente manera: tapón de algodón, solución de descongelación,
203 columna de aire, columna de solución de congelación + embriones, columna de
204 aire, columna de solución de descongelación, columna de aire y sellado (Fig 1).
205 f) Pasado los 15 min de equilibracion las pajillas serán colocadas horizontalmente
206 dentro una congeladora que estará a -7oC por 1 o 3 min y luego se realizara el
207 seeding (colocar una pinza enfriada en las columnas de aire, que separan la
208 solución de congelación y embriones, esto para sembrar núcleos de cristales de
209 hielo.
210 g) Después del seeding la pajilla se mantendrá adicionalmente por 15 min a -7 oC
211 (para incrementar los núcleos de cristales).
212 h) Se iniciara la congelación a una tasa de enfriamiento de 0.3 oC/min, hasta -30oC,
213 donde se mantendrá a esta temperatura por 15 min antes de sumergirlo al
214 nitrógeno líquido del termo y almacenarlo hasta su evaluación.
215 i) La descongelación se llevara a cabo sacando la pajilla del termo, se expondrá por
216 10 s a una temperatura de cuarto (20 a 25 oC), seguido de un baño de agua a
217 30oC por 20 s, seguidamente la pajilla será sacudida con la finalidad de que los
7 4
8
218 embriones se mezclen y reciban el efecto del crioprotector no permeable por 5
219 minutos y finalmente los embriones serán lavados 2 veces con PBS1 para luego
220 pasar al medio de cultivo (mSOF).
221
Tapón de Solución de Column Embriones en la Column Solución de Col Sella
algodón descongelación 0.1 a Solución de a descongelaci um do
o 0.2 M de sucrosa De aire congelación De aire on 0.1 0.2 M na
o galactosa Sucrosa o ga aire
222 Fig. Pajilla armada antes de la congelación.
223
224 Evaluación a la descongelación
225
226 En los embriones descongelados de acuerdo a los tratamientos se evaluaran la re-
227 expansión del embrión a las 6 horas y las 24 y 48 horas de cultivo el desarrollo del
228 embrión, con ayuda de un microscopio esteroscopio a 200X.
229
230 Estadístico
231
232 Los resultados de % de re-expansión, desarrollo del embrión posterior a la
233 descongelación se evaluaran a través de la prueba de Chi-cuadrado dentro una tabla
234 de contingencia 2 X 2 siendo el modelo siguiente:
235
2
r k
(θ ij −eij )2
236 x =∑ ∑
i=1 j=1 eij
237 Donde:
238 θi=¿ Frecuencia observada.
239 e i=¿ Frecuencia esperada.
240 k =¿Numero de columnas.
241 r =¿Numero de filas.
242
243
244
245 X. Referencias
246 Abe, H., Yamashita, S., Satoh, T., Hoshi, H. 2002. Accumulation of cytoplasmic lipid
247 droplets in bovine embryos and cryotolerance of embryos developed in different
248 culture systems using serum free or serum-containing media. Mol Reprod Dev 61,
249 57-66.
250
251 Caamaño, J.N., Gomez, E., Trigal, B., Muñoz, M., Carrocera, S., Martin, D., Diez, C.
252 2014. Survival of vitrified in vitro-produced bovine embryos, after a one step
253 warming/in-straw crioprotectant dilution procedure. Theriogenology 181, 325-336.
254
255 Bettencourt, E. M., Bettencourt, C.M., Chagas e Silva, J., Ferreira, P., Pereira Matos,
256 C., Romao, R.J., Rocha, A., 2009. Fertility rates following the transfer of bovine
257 embryos cryopreserved using three protocols. Small Ruminant Research 82, 112-
258 116.
259
260 Cognié, Y., Baril, G., Poulin, N., Mermillod, P., 2003. Current status of embryo
261 technologies in sheep and goat. Theriogenology 59, 171–188.
262
263 Inaba, Y., Aikawa, Y., Hirai, T., Hashiyada, Y., Yamanouchi, T., Misumi, K., Ohtake,
264 M., Somfai, T., Kobayashi, S., Saito, N., Matoba, S., Konishi, K., Imaia, K., 2011. In-
265 straw cryprotectant dilution for bovine embryos vitrified using cryotop. J. Reprod.
266 Develp. Vol. 57, Nro. 4, 437-443.
267
268 Inaba, Y., Miyashita, S., Somfai, T., Geshi, M., Matoba, S., Dochi, O., Nagai, Takasi.
269 2016. Cryopreservation methods affects DNA fragmentation in trophectoderm and
9 5
10
270 speed of re-expansion in bovine blastocysts. Cryobiology 72, 86-92.
271
272 Han, B. and Bishof, J.C. 2004. Direct cell injury associated with eutectic
273 crystallization during freezing. Cryobiology 48, 8-21.
274
275 Kristiansen, E., Pedersen, S., Ramlov, H., Zachariassen, K.E. 1999. Current status of
276 embryos technologies in mammals. J. Comp. Physiol B 169, 55-60
277
278 Martinez, A.G., Valcarcel, A., Furnus, C.C., de Matos, D.G., Iorio, G., de la Heras,
279 M.A., 2006. Cryopreservation of in vitro-produced bovino embryos. Small Rumiant
280 Research 63, 288-296.
281
282 Nedambale, T.L., Dinnyes, A., Groen, W., Dobrinky, J.R. Tian, X.C., Yang, X. 2004.
283 Comparison on in vitro fertized embryos cultured in KSOM or SOF and cryopreserved
284 by slow freezing or vitrification. Theriogenology 62, 437-449.
285 Papadopoulos, S., Rizos, D., Duffy, P., Wade, M., Quinn, K., Boland, M.P., Lonergan,
286 P. 2002. Embryo survival and recipient pregnancy rates after transfer of fresh or
287 vitrified, in vivo or in vitro produced bovine embryos. Anim. Reprod. Sci. 74, 35–44.
288
289 Sanches, B.V., Lunardelli, P.A., Tannura, J.H., Cardoso, B.L., Colombo Pereira, M.H.,
290 Gaitkoski, D., Basso, A.C., Arnold, D.R., Seneda, M.M. 2016. A new direct transfer
291 protocol for cryopreserved IVF embryos. Theriogenology 85, 1147-1151.
292
293 Seidel, J.G.E. 2006. Modifyng oocytes and embryos to improve their
294 cryopreservation. Theriogenology 65, 228-235.
295
296 Voelkel, S.A. and Hu, Y.X. 1992. Use de ethylene glycol as cryoprotectant for bovine
297 embryos allowing direct transfer of frozen-thawed embryos to recipient females.
298 Theriogenology 37, 686-697.
299
300
301
302
303
304
305 XI. Uso de los resultados y contribuciones del proyecto
306
307 Los resultados del presente estudio contribuiría al mejoramiento de la especie en el
308 altiplano a partir de embriones congelados de animales elites que serían transferidos
309 a receptoras de menor calidad. Como también se puede formar bancos de
310 germoplasma con los embriones crioconservados de bovinos criollos que están en
311 procesos de desaparición.
312
313
314 XII. Impactos esperados
315
316 i. Impactos en Ciencia y Tecnología
317
318 Se estaría generando protocolos de criopreservacion de embriones de
319 bovinos, que servirían para la conservación en esta especie, académicamente
320 se actualizaría el conocimiento de los estudiantes de Medicina Veterinaria y
321 Zootecnia.
322
323
324
325
326
11 6
12
327
328 ii. Impactos económicos
329
330 Al utilizar esta técnica y procesar, se puede usar como embriones congelados
331 de vacas superiores y transferir a vacas de menor calidad, tendría a los pocos
332 años (3) vacas con alta producción y de este modo el mejoramiento de
333 bovinos seria rápido y la producción se incrementaría, y por venta de leche o
334 carne los productores recibirían ingresos mayores, que redundaría en el mejor
335 nivel de vida de la familia de los productores de leche.
336
337 iii. Impactos sociales
338
339 Los productores al ver el incremento de la producción de leche y carne y
340 poseer animales de gran valor genético, en las ferias y saliendo como
341 ganadores, recibirían premios y los productores serian respetados en el
342 mundo de la ganadería vacuna.
343
344 iv. Impactos ambientales
345
346 Los productos que utilizaran en esta técnica son bio-degradables y que al ser
347 eliminados al ambiente no provocan la alteración del medio ambiente, más
348 bien serviría de abonos por que los desechos son productos procesados de
349 origen animal (Suero de vaca en celo o ternero); por lo tanto son productos
350 biodegradables.
351
352 XIII. Recursos necesarios
353
354 Laboratorio
355 Microscopio estereoscopio
356 Tanque de Nitrógeno liquido
357 Baño María
358 Destilador de agua
359 Congeladora
360 Refrigeradora
361 Máquina fotográfica
362 Congeladora de embriones
363 Etilenglicol
364 Pajillas
365 Pipetas
366 Micropipetas
367 Polivinilo de cloruro
368 Lapiceros indelebles de punta fina
369 Nitrogeno liquido
370 Placas petry de 4 pozos
371 Placas petry de 6 pozos
372 Suero fetal
373 Termômetro Termocupla
374 Tips
375
376
377 XIV. Localización del proyecto
378
379 El presente estudio se llevara a cabo en el Laboratorio de Reproducción Animal de la
380 Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional del Altiplano,
381 cito en la avenida floral 1147, del barrio llavine, Ciudad de Puno.
382
13 7
14
383
384
385
386 XV. Cronograma de actividades
387
Actividad Meses
A S O N D
Elaboración y aprobación del Proyecto X
Experimento X X
Tabulación de datos y redacción X
Presentación y sustentación X
388
389 XVI. Presupuesto
390
Descripción Unidad de Costo Unitario Cantidad Costo total
medida (S/.) (S/.)
Nitrógeno liquido Kg 15 15 225
Glicerol mL 1.0 50 50
Etilenglicol mL 1.5 50 75
Pajilla unidad 0.3 100 30
Polivinilo de cloruro Gr 1.0 50 50
Suero fetal mL 1.5 50 75
Placas petry placa 5.0 12 60
Tip Bolsa 20 1 20
Imprevistos 250
Total 835
391

15 8
16